Principi rada sa

eksperimentalnim ivotinjama
Prof. Zoran Todorovi

Institut za farmakologiju, kliniku

farmakologiju i toksikologiju
Medicinski fakultet, Univerzitet u
Beogradu

Eksperiment na ivotinjama:
... bilo koji postupak u kome se ive ivotinje
koriste za proveru naunih hipoteza,
prikupljanja informacija, izolovanje ili ispitivanje
supstanci ili razjanjenje efekata nekog
postupka, kao i korienje ivotinja u
bihejvioralnim eksperimentima...
(Swiss Animal Protection Act; www.roche.com)

Principi rada sa eksperimentalnim

ivotinjama

Istorijat
Sistemi u eksperimentalnom radu; bioloki ogled
Zakonodavstvo
Uzgoj, vrste, najea oboljenja, dobrobit
eksperimentalnih ivotinja
Bol i patnja eksperimentalnih ivotinja
Primena lekova
Anestezija, hirurke tehnike
Odabrani in vivo modeli

Istorijat
Eksperimenti na ivotinjama:

Egipat, Kina, Indija

5. vek p.n.e. prvi zabeleeni
4. vek p.n.e. - Aristotel
2. vek n.e. formirani prvi standardi
Galen iz Pergamona (disekcija ivotinja) Vesalius (disekcija ljudi)

17. vek krvotok: William Harvey, Jan de Wales; Descartes

maine koje ne oseaju bol
18. vek Voltaire
19. vek - Claude Bernard (An Introduction to the Study of
Experimental Medicine); Schopenhauer; Hume;
Jeremy Bentham: Nije pitanje da li ivotinje mogu rasuivati
ili govoriti, ve da li mogu (fiziki) patiti.
Charles Bell & Francois Magendie funkcija perifernih nerava,
neanestetisane ivotinje

Istorijat
Eksperimenti na ivotinjama:
1824. Prvo udruenje koje spreava surovost prema
ivotinjama
1835. pod patronatom princeze Viktorije
1854. dva psa eksperimentalno izazvana epilepsija
burna reakcija (British Medical Association Meeting)
~1875. udruenja protiv vivisekcije + peticija (Darwin,
Jenner, Owen)
1926. University of London (Udruenje za dobrobit
ivotinja)
1971. 5,5 miliona ivotinja u UK
2003. 2% porast broja eksp. procedura (na 2,8 miliona),
2,4% porast broja korienih ivotinja uopte i 21% porast
broja eksperimenata na primatima (izuzev oveka)

Bioloki ogled
Bioloki ogled - merenje potentnosti leka ili nepoznatog
medijatora na osnovu intenziteta biolokih efekata koje
on izaziva
Poreenje nepoznatog preparata sa standardom (esto
nepouzdano, varira od laboratorije do laboratorije), na
osnovu krive dozaodgovor
Bioloki odgovor - kvantalan (procenat testova sa
efektom sve-ili-nita) ili stupnjevit
Nivoi bioloke organizacije - razliiti pristupi sistemu
merenja

molekularne i hemijske tehnike

testovi na ivotinjama in vitro i in vivo
klinika ispitivanja na dobrovoljcima i pacijentima
merenje efekata lekova na socioekonomskom nivou

Nivoi
bioloke
organizacije

Rang et al., 2003

Sistemi u eksperimentalnom radu

- Prednosti Delovi
membrana

Pojedinane
elije

elijske
kulture

Izolovana In vivo
tkiva
(umrtvljeni refleksi)

Kontrolisana koncentracija leka

Merenje
afiniteta
leka za
receptor

Refleks ne utie
na odgovor

In vivo
(intaktna iv.)
Integrisan
odgovor

Pojaavanje signala
Merenje primarnog odgovora
Merenje relativne efikasnosti

Kenakin T. Pharmacologic Analysis of

Drug-Receptor Interaction (3rd ed).
Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997

Bioloki ogled
Nove supstance
Endogeni medijatori
Toksikoloka ispitivanja

Prednosti i nedostaci
ivotinjskih modela (1)
ivotinjski modeli
znaajni za otkrivanje novih lekova
reprodukuju samo neke aspekte humanih
bolesti
modeli psihijatrijskih oboljenja - naroito
problematini

Prednosti i nedostaci
ivotinjskih modela (2)

ivotinjski model treba da lii na humano

oboljenje po sledeim parametrima
1. slian fenotip (manija? migrena?)
2. uobiajeni uzrok (Alzheimerova bolest?
parkinsonizam?)
3. patofizioloka slinost (depresija, anksioznost?)
4. odgovor na terapiju (novi lekovi?)

Prednosti i nedostaci
ivotinjskih modela (3)

Genetski pristup
selektivno razmnoavanje (spontane
mutacije) npr. spontano hipertenzivni
pacovi
planirana genetska manipulacija
transgene ivotinje

Prednosti i nedostaci
ivotinjskih modela (4)
Transgene ivotinje - izazivanjem mutacija u jajnim
elijama (ili elijama spermatozoida) ivotinje (uglavnom
mieva), to omoguuje
uvoenje novih gena (knock in) ili
inaktiviranje ili mutaciju ve postojeih gena (knock-out) kod
kolonija priplodnih ivotinja

insercija ili delecija odreenih gena moe da izazove

fenotipske promene sline humanim oboljenjima
veliki broj takvih modela
izazvana mutacija deluje tokom celog ivota i razvoja ivotinje, a
moe biti i letalna.
uslovna mutageneze aktivacija i inaktivacija izmenjenog gena

Pacov (Rattus norvegicus)

- inbred sojevi Helen Dean King albino pacovi Wistar Institute,
Philadelphia, 1919.god.
Uzgoj Wistar i Sprague-Dawley soja
Publikacije sa eksp. na pacovima i mievima 1,5:1
(pre mol. biol. ere 2:1)

Pacov (Rattus norvegicus)

- Modeli KV bolesti
Metaboliki poremeaji
(npr. lipidi, DM)
Neuroloki poremeaji
(npr. epilepsija,
parkinsonizam,
neuropatski bol)
Bihejvioralni
poremeaji
Transplantacija organa

Autoimune bolesti (npr.

artritis, eksp. alerg.
encefalomijelitis)
Maligne bolesti
Poremeaji bubrega
Toksikologija...
+ Genetika!

Etinost
3 miliona u eksperimentima vs. x00 miliona
hrana i sl., ali:
na istraivanja teko uticati
u istraivanjima bol, patnja, poremeaji ili trajna
oteenja (muenje?)

Dilema u drutvu:
ivotinje su u podreenom poloaju
fizika patnja postoji kod ivotinja
korienje ivotinja moe dovesti do njihove patnje

Etinost
Dva pristupa:
odnos koristi (za ljude!) i tete (za ivotinje!)
vrednost ivota i prava ivotinja
zakoni interpretacija moralnih naela...
suprotni stavovi: Ren Descartes (preterana
sentimentalnost prema ivotinjama)

Etinost
Korist
polio vakcina in vivo test jedini pouzdan za utvrivanje
potencijalne virulentnosti serije
icv., majmuni
GM mievi sa receptorima za virus

tehnike dijalize i transplantacije bubrega i primena ciklosporina

kunii, psi

eludana sekrecija i H2-antihistaminici

pacovi, zamorci

cistina fibroza (CFTR protein; genomika i proteomika)

GM mievi

Etinost
Budua istraivanja na ivotinjama (modeli in
vivo) razvoj novih lekova
infekcije rezistentnim sojevima (GM mievi)
psihiki poremeaji i duevne bolesti (depresija,
shizofrenija, anksioznost)
bolesti zglobnih struktura i imunoloki poremeaji
uroeni poremeaji (Duchenne distrofija)
bolesti sa gubitkom vida i sluha
HIV infekcija i AIDS
demencije
...

Etinost
Pitanja:
Zato radite taj eksperiment?
korist/teta

Da li to to radite pokree pitanje etinosti?

bol, patnja, izolacija...

Alternative (Replacement)?
in vitro, in silico, matematiki modeli, ljudi, vrsta koja je nie na
filogenetskoj lestvici

Moete li koristiti manji broj ivotinja (Reduction)?

promena dizajna, faktorska analiza, uzajamno korienje iste ivotinje
za vie eksperimenata, inbred sojevi, ponovno korienje iste ivotinje
(nekada mogue uz dozvolu)

Usavravanje metode (Refinement)?

bolje hirurke tehnike (laparoskopija umesto laparotomije), promena
uslova uzgoja ili smanjenje doze/zapremine leka

10

Etinost
3 R (Russel & Burch, 1959)
Replacement
kulture elija, tkiva i organa
mikroorganizmi
hemijske i druge metode (transkranijalna magnetna
stimulacija TMS, privremeno remeti funkciju mozga)
in silico kompjuterski modeli
filmovi
modeli, statistika
ljudi

Etinost
3 R (Russel & Burch, 1959)
Reduction; npr.
izazivanje reverzibilnih lezija mozga (hladan FR) umesto
trajnog uklanjanja odreenih delova
nove tehnike vizuelizacije
nove hirurke tehnike (gubitak samo jednog kvadranta
vidnog polja ivotinja je sama sebi kontrola)

11

Etinost
3 R (Russel & Burch, 1959)
Refinement
korienje ivotinja kontrolisanog zdravstvenog stanja
vrsta i soj; inbred sojevi; GM
90% gena bolesti oveka prisutno kod mia
npr. SOD1 gen i ALS
obuka i veba
statistike metode; eksperimentalni dizajn
greka kod talidomida u dizajnu, a ne u pouzdanosti
animalnih modela!

Etinost
Neprekidno, tokom eksperimenta: Moe li se
smanjiti patnja ivotinja i poveati korist od
istraivanja?
Kontrola/Inspekcija!

12

Eksperimenti na ivotinjama
- Zakoni Privilegija izvoenja eksperimenta na
ivim ivotinjama u cilju zatite i
unapreenja zdravlja ivotinja i ljudi
Prilika i sposobnost da se unapredi nauka
za dobrobit oveanstva
Najvii mogui standardi za dobrobit
ivotinja, u skladu sa ciljevima istraivanja

Eksperimenti na ivotinjama
- Zakoni Principi eksperimentalnog rada na ivotinjama
(Marshall Hall, 1831.):
ne raditi eksperiment ako se podaci mogu dobiti
posmatranjem
eksperiment samo ako su ciljevi definisani i realni (dostini)
informacije o prethodnim istraivanjima izbei ponavljanje
patnja svedena na minimum (npr. nie vrste)
to jasniji rezultati istraivanja, tako da je potreban broj
ivotinja najmanji mogu

13

Eksperimenti na ivotinjama
- Propisi EC: 1985., 26 zemalja: Convention for the Protection
of Vertebrate Animals Used for the Experimental and
Other Scientific Purposes (ETS 123) nema snagu
zakona, ali je prihvaen (ratifikovan u nekim zemljama,
pa u EU 1998.)
Council Directive, 1986. - EU Directive for the
Protection of the Vertebrate Animals used for
Experimental and other Scientific Purposes
(86/609/EEC)
Council Directive, 2003. - 2003/65/EC

Eksperimenti na ivotinjama
- Propisi Eksperimenti na ivotinjama:
UK (animal lovers)
1986. The Animals (Scientific Procedures)
Act 1986

SAD, Kanada, Australija...

Animal Welfare Act (SAD)

Zakonska regulativa promene u korist

ivotinja i obrnuto

14

Zakonodavstvo - Srbija
Eksperimenti na ivotinjama:
2003/04. Pravilnik za rad sa
eksperimentalnim ivotinjama MF Univ. u
Beogradu (pre toga Univerz. u NS, VMA,
inicijativa FDJ...)
Zakon RS u pripremi

Pravilnik MF u Beogradu
Zatiene ivotinjske vrste:
ivi kimenjaci (osim oveka), ukljuujui sve stadijume razvoja,
od sredine gestacije (do trajnog prekida cirkulacije ili destrukcije
mozga)

Etike eksperimentalne procedure:

postupci sa eksperimentalnim ivotinjama koji imaju za cilj da
stvore nova znanja iz biomedicine, a mogu uzrokovati bol,
patnju, trajno oteenje
namerno rtvovanje eksperimentalnih ivotinja u cilju dobijanja
izolovanih organa ili usmrivanje na kraju eksperimenta

Obuenost istraivaa (dokaz! kurs, radovi)

Etiki komitet za rad na eksperimentalnim ivotinjama
MF
Dozvola za rad
Nepotovanje

15

Eksperimentalne procedure
Prema intenzitetu
oteenja:

neklasifikovane
blage
srednjeg intenziteta
teke

Prema nameni:
medicinska istraivanja
(ostala osnovna i
primenjena) nauna
istraivanja
zatita ivotne sredine
nastava
sudsko-medicinska
uzgoj
genetske manipulacije

Uginue

Bezbolno
Uz to bri gubitak svesti i samo rtvovanje
Pouzdanom, ireverzibilnom metodom
Uz minimalan stres za ivotinju i onoga ko
rtvuje
Bezbedno za onoga ko rtvuje
Kompatibilno sa eksperimentom
Jednostavno
Ekonomski prihvatljivo

16

Potvrda uginua

Trajan prekid cirkulacije

Iskrvarenje
Destrukcija mozga
Cervikalna dislokacija
Mrtvaka ukoenost (rigor mortis)
Razaranje celog organizma

Metode rtvovanja odraslih jedinki

Predoziranje anestetika
CO2
Cervikalna dislokacija
Kontuzija lobanje

17

Uzgoj...
Standardi (prostorije, osvetljenje, provetravanje,
pristup, smetaj, mikrobioloka kontrola,
ienje, transport)
Vrste
genetika podela: autbredni zapati, inbredni sojevi, F1
hibridi, koisogene i kongene ivotinje, nokaut i
transgene ivotinje
gnobiotika podela: aksenine, gnobiotike, SPF
(specific pathogen free), VAF (virus antibody free) i
konvencionalne ivotinje

Uzgoj...
Autbredni sojevi ivotinje u zatvorenim
kolonijama, nepoznatog genotipa
dobra fertilnost, rast i razvoj, otpornost,
preivljavanje, jeftinije

Inbredni sojevi dobijeni uzastopnim

sparivanjem u srodstvu ( 20 x), tako da
nastanu 99% homozigotne jedinke
smanjene - reproduktivna sposobnost,
preivljavanje, otpornost, masa i veliina
okota, a poveana agresivnost

18

Eksperimentalne ivotinje
iz registrovanih uzgajalita

Mi
Pacov
Hrak
Gerbil
Zamorac
Kuni
Pas
Maka
...

Praenje zdravstvenog stanja

ivotinja
Za dobrobit ivotinja
Za kvalitet naunih istraivanja
Za bezbednost osoblja i istraivaa

19

Patologija (1)
Mi
virusi adeno, CMV...
bakterije stafilokoke, streprokoke, Salmonella
enteritidis
paraziti Hymenolepis nana...

Pacov
virusi parvo, adeno, CMV...
bakterije P. aeruginosa (plua, slezina, bubreg)...
paraziti Hymenolepis nana...

Patologija (2)

Redosled praenja oboljenja kod

eksperimentalnih ivotinja
1. zoonoze
2. bolesti koje su u subklinikom obliku, a
mogu postati manifestne tokom
eksperimenta
3. bolesti koje mogu uticati na validnost
rezultata

20

Bezbednost
laboratorijskog osoblja
Alergije
alergeni
proteini urina, pljuvake, lojnih lezda, krzna...

Infekcije
Povrede

Bol, patnja, distres kod

eksperimentalnih ivotinja
- Opti skor

Izgled
Unos hrane i vode
Kliniki znaci
Spontano ponaanje
Indukovano ponaanje

21

Primena lekova kod

eksperimentalnih ivotinja
Putevi primene: p.o., i.v., i.d., i.p., i.m., s.c., p.r.,
direktno
Lokalni i sistemski efekti
Uzimanje uzoraka krvi (pacovi repna vena...)
Zapremine:
mi 0,2 ml (i.v.), 1-2 ml (i.p.), 0,4 ml (p.o.)...
pacov - 1 ml (i.v.), 2-4 ml (i.p.), 5 ml (p.o.)...
kuni - 4 ml (i.v.), 10-15 ml (i.p.), 10 ml (p.o.)...

Osnovne hirurke tehnike

- Halstead-ovi principi

Paljivo rukovanje tkivom

Dobra hemostaza
Ouvano snabdevanje krvlju ciljnog tkiva
Striktna asepsa
Minimalno tenzija tkiva
Odgovarajua apozicija tkiva, avovi
Obliteracija zaostalih upljina

22

Anestezija
Definicija - Reverzibilna inhibicija funkcije
CNS-a tokom koje se mogu obaviti
hirurke procedure uz
gubitak svesti
gubitak oseaja bola
gubitak refleksa, odbrambenih i nevoljnih
pokreta

Lokalna, opta

23