Professional Documents
Culture Documents
Bài giảng PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
Bài giảng PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
1
MỤC LỤC
Chương 1: Đối tượng vi sinh vật và các chỉ tiêu trong thực phẩm………….3
Chương 2: Kỹ thuật cơ bản trong phân tích vi sinh vật……………………..17
Chương 3: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp truyền thống...39
Chương 4: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp hiện đại……...85
Chương 5:Đánh giá vệ sinh công nghiệp…………………………………….95
2
Chương I
ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT VÀ CÁC CHỈ TIÊU TRONG THỰC PHẨM
1.1GIỚI THIỆU
Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên,
trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây
ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguôn gốc từ vi
sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra
bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm. Ngày nay, an toàn, nhất là về
phương diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cầu không thể thiếu đối với
chất lượng thực phẩm.
Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy
hải sản, thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho hơn 80 triệu dân, thực phẩm
và thủy sản của nước ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới (Châu Âu, Bắc
Mỹ, Nhật Bản…), mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước, giải quyết việc làm cho một
số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng
được nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự
tăng cường về quản lý của Nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng,
yêu cầu nghiêm ngặt về chỉ tiêu vi sinh của thị trường thế giới, việc phân tích vi sinh
vật gây bệnh, thực hiện các biện pháp nhằm đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt
tiêu chuẩn an toàn và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm
đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biến
thực phẩm nội địa quan tâm thực hiện. Tuy nhiên không phải vì thế mà ngộ độc thực
phẩm, số vụ ngộ độc thực phẩm, mức độ ngộ độc thực phẩm khi con người tiêu thụ
thực phẩm được thuyên giảm.
Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặc
nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tố vi sinh vật, độc tố hoá học hoặc
chứa các vi sinh vật gây bệnh. Có rất nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi
sinh vật hiện diện trong nước và thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm thường được hiểu là
các triệu chứng gây ra bởi độc tố của vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm và nhiễm
bệnh bởi vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử dụng thức ăn
chứa các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên hiện nay, khái niệm ngộ độc thực phẩm còn
bao gồm trường hợp thức ăn có chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở mức độ rất
thấp trong nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong quá trình chế biến vì trong quá trình chế
biến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tố của chúng có thể tăng nhanh đến mức
độ gây ngộ độc.
Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệu
chứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau
phụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người. Các
triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau
nhức người, sốt, đau đầu. Triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tuỳ
thuộc vào tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tố do vi sinh vâtk tạo ra và tiết
vào thực phẩm (trường hợp này được gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc tố nằm trong tế
bào vi sinh vật (nội độc tố).
Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được quan tâm cần kiểm soát là các
vi sinh vật gây ngộ độc và gây bệnh. Các vi sinh vật gây ngộ độc hay gây bệnh ở
3
người khi bị đào thải khỏi cơ thể bằng đường phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bị
nhiễm phân này. Nước trở thành môi trường phân tán, lan truyền mầm bệnh cho người
khi sử dụng mà không được tinh sạch đúng quy cách. Nước là môi trường sống, môi
trường nuôi trồng của các loài thuỷ sản nên khi nước bị ô nhiễm thì vi sinh vật gây
bệnh có thể nhiễm vào các loài thuỷ hải sản, làm nhiễm nguồn nguyên liệu của các
thực phẩm thuỷ hải sản chế biến. Đó là một trong những con đường nhiễm vi sinh vật
gây bệnh vào thực phẩm. Mặt khác, trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, vi
sinh vật gây bệnh cũng có thể nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặt
thiết bi, công nhân. Mặc dù có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh vật hiện diện
hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn. Tuy mật
độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc trong thực phẩm có thể rất
thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của
vi sinh vật trong quá trình chế biên hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được
nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại. Do
vậy, mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong
đa số các trường hợp là bằng không.
1.2. TÌNH HÌNH CÁC VỤ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG CẢ NƯỚC VÀ Ở
TP. HỒ CHÍ MINH TRONG THỜI GIAN VỪA QUA
Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người
(chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan
đến thực phẩm.
Hàng năm Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực phẩm, gây
thiệt hại hơn 200 triệu USD. Đây là con số được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra
trong một hội thảo về an toàn thực phẩm - dantri.com.vn - 18:02 15-04-2011.
Theo số liệu thống kê tại Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, từ 1997 tới 2004 đã
có 2.237 vụ ngộ độc thực phẩm với 43.655 người mắc và 429 người tử vong. Nguyên
nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (42,2%), sau đó là hoá chất
(24,9%) và độc tố tự nhiên trong thực phẩm (25,2%), còn lại không xác định được
nguyên nhân. 4 lý do chưa thể xác định được nguyên nhân các vụ ngộ độc là: Lấy
mẫu chậm, không lấy được mẫu, không có cách nào điều tra được hoặc còn phải xét
nghiệm.
………
Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ
độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử
vong. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử
vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ
ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người
nhập viện. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện
giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực
phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số
người đi viện giảm 174 người.
Theo TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục
ATVSTP, trong năm 2010, hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác
định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác
hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Mặc dù
vậy, TS. Hùng cho hay, ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ
4
ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc, điều đó cho thấy, các vụ
ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình chưa có xu hướng giảm. Do đó,
người dân cần phải nâng cao ý thức trong việc thực hiện ATVSTP ngay chính tại bếp
ăn của gia đình mình.
Nếu như năm 2000, ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật (chiếm 70%) thì tới năm 2010,
ngộ độc vi sinh vật thấp đi (<50%), ngộ độc chủ yếu do hóa chất, chiếm tới trên 60%.
Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do
độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn
từ 30 người trở lên. Xu thế ngộ độc cho hóa chất càng ngày càng tăng lên, ngộ độc do
vi sinh vật có xu hướng kiểm soát tốt hơn nhưng không có nghĩa là nguy cơ giảm đi.
So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186
người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực phẩm có
quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi viện
giảm 174 người.
Năm 2010, số vụ ngộ độc do hóa chất là chủ yếu, chiếm trên 60%.
TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục ATVSTP -
nhận xét: Các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và
xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn. Công tác quản lý ngộ
độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Đặc biệt, thời gian vừa qua, không
có vụ ngộ độc nào xảy ra trong suốt thời gian diễn ra Đại lễ 1.000 năm Thăng Long –
Hà Nội.
Mặc dù vậy, ông Hùng cũng khuyến cáo người dân trước tình trạng ngộ độc thực
phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt
là ngộ độc cá nóc. Điều đó cho thấy: Các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ
gia đình có xu hướng tăng, ý thức người dân chưa cao trong việc thực hiện ATVSTP.
Trong khi đó, theo kết quả điều tra của Cục ATVSTP, nhận thức của người dân về vấn
đề ATVSTP đều được nâng cao hơn từ 2005-2008. Theo đó, nhận thức của người sản
xuất sản phẩm thực phẩm tăng từ 47,8% lên 55,7%; nhận thức của người kinh doanh
5
thực phẩm tăng từ 38,6% lên 49,4%; nhận thức của người sử dụng thực phẩm tăng từ
38,3% lên 48,65%.
Nhờ đó, số vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước vẫn cao (8 triệu người/năm) nhưng
đã bắt đầu có chiều hướng giảm. Số người mắc ngộ độc thực phẩm năm 2005 đã giảm
gần một nửa (43,34%) so với năm 1994, số ca tử vong cũng giảm 28,17%.
Các cơ sở đảm bảo ATVSTP tăng mạnh. Năm 2006, cả nước chỉ có 1.106 cơ sở đạt
yêu cầu. Nhưng chỉ sau 2 năm, con số này đã lên tới 17.592 cơ sở.
Theo báo cáo của Bộ Trưởng Bộ Y tế Nguyễn Quốc Triệu, trong năm 2010, tỷ lệ
người kinh doanh thực phẩm có hiểu biết đúng đắn về VSATTP đã tăng từ 65%
(2008) lên 73% (2010); người tiêu dùng có hiểu biết đúng tăng từ 65,5% (2009) lên
84,5% (2010); người sản xuất và chế biến thực phẩm có hiểu biết đúng tăng từ 44,4%
(2009) lên 79,4% (2010). Trưởng Ban chỉ đạo, Phó Thủ tướng Nguyễn Thiện
Nhân đánh giá sự chuyển biến trong nhận thức của người dân là một trong những
điểm sáng của công tác VSATTP.
Năm 2011 : trong quý I/2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử
vong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010).
Trong 3 tháng đầu năm 2011, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442
người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người. So với
cùng kỳ năm ngoái, số vụ ngộ độc giảm 10 vụ (giảm 50%), số người mắc giảm 321
người, số tử vong giảm 11 trường hợp (giảm 75%). Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an
toàn thực phẩm trong 6 tháng đầu năm 2011 toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với
1.776 nạn nhân, trong đó có 9 trường hợp tử vong. Nguyên nhân gây ngộ độc do vi
sinh vật (17 vụ), do hóa chất (10 vụ), do độc tố tự nhiên (17 vụ)...
1.3. ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT–TÁC NHÂN CHÍNH GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
Các quá trình hư hỏng của thực phẩm thường do vi sinh vật gây nên. Trong đó
rất nhiều trường hợp các vi sinh vật này còn tạo ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Chính vì vậy việc tìm hiểu về các vi sinh vật gây bệnh để từ đó tìm ra
các biện pháp khống chế chúng là việc làm cần thiết.
Có 2 dạng gây bệnh có nguồn gốc từ vi sinh vật:
- Vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của các độc tố này trong thực phẩm là
nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Clostridium botulinum tiết ra độc tố gây nên bệnh
botulism (chứng ngộ độc thịt); Staphylococcus aureus gây nên bệnh tụ cầu khuẩn
- Vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người.
Sự hiện diện của chúng hoặc của các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các
chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Salmonella spp., Vibrio
parahaemolyticus, Escherichia coli,…
Tuy nhiên có nhiều vi sinh vật mang đặc tính của cả 2 dạng gây bệnh này. Ví dụ
Clostridium perfringens và Bacillus cereus.
1.3.3. Salmonella
7
Nếu phân loại theo mức độ gây bệnh của Salmonella ta có các loại sau:
- Loại chỉ gây bệnh cho người (vd: S. typhi gây sốt thương hàn tại người)
- Loại chỉ gây bệnh cho động vật (vd: S. typhimurium gây sốt thương hàn tại
chuột)
- Loại gây bệnh cho cả người và động vật (chiếm đa số)
Salmonella là trực khuẩn gram (-), không tạo bào tử, có tiên mao (trừ S.
gallinarum), có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 m. Giống như nhiều loài vi
khuẩn khác Salmonella có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng từ
6 đến 45.60C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C. Salmonella phát triển trong
khoảng pH từ 4.1 – 9.0. Trong các món salad có độ pH khoảng 5.5 – 5.7 không nhận
dạng được sự thay đổi mùi vị khi Salmonella phát triển. Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển
của Salmonella là 0.93 – 0.95.
Salmonella xâm nhập vào cơ thể bằng hai con đường: từ phân người hoặc động
vật; từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng của
chúng và nhất là phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn.
Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là những tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella
lan rộng hơn khi chúng truyền phân vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ.
Trong quá trình giết mổ cũng cần phải đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực
hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm.
Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn.
Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng
được biểu hiện là 12-36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2-7 ngày.
1.3.4. Coliforms
Đây là những vi sinh vật hình que, G -, không tạo bào tử, có khả năng lên men
latose và sinh khí trong quá trình lên men này. Phát triển trong khoảng nhiệt độ (từ – 2
đến 50oC), pH từ 4,0 đến 8.5, có thể sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Sau 12 – 16 giờ
trên môi trường thạch tạo ra những khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Coliform đi vào
thực phẩm từ nước hoặc nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân. Các loài tiêu biểu cho
Coliform: Escherichia coli và Enterobacter aerogenes. Tuy nhiên, ngoài ra còn có
khoảng 20 loài mang những tính chất đặc trưng cho Coliform, trong đó bao gồm cả các
Enterobacteriaceae khác và các loài thuộc Aeromonas.
Nhóm Coliform phân là những Coliform có khả năng phát triển trong môi trường
có nhiệt độ từ 44.5 – 450C (các Coliform khác có t0opt=370C). Đây cũng là đặc điểm
8
nhận biết và phân biệt Colifom phân. Tuy nhiên việc xác định này chỉ là giá trị dùng để
tham khảo cho việc xác định điều kiện sống của Coliform.
Dưới đây là một vài tính chất đặc trưng cho việc làm hư hỏng thực phẩm của
Coliform:
- Chúng có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất khác nhau: carbohydrate, các
chất hữu cơ sinh năng lượng, các hợp chất chứa nitơ đơn giản,..
- Có khả năng tổng hợp hầu hết các vitamin cần thiết.
- Có khả năng phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ từ 10 – 460C.
- Có khả năng tạo ra acid và sinh gas từ đường
- Sinh ra mùi vị hư hỏng, khó chịu
Escherichia coli:
Được phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1700. E. coli thuộc họ
Enterobacteriaceae. Các loài E. coli hiện diện diện rộng rãi trong môi trường bị ô
nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Các.
Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài, nhiễm vào
thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất chế biến.
Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit. Gây nhầy
nhớt, hư hỏng thực phẩm.
Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ
thể yếu gây nhiễm khuẩn máu; gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh; gây tiêu chảy.
1.3.5. Staphylococcus
Hiện nay tìm thấy 31 loài. Staphylococcus là cầu khuẩn, G+, các tế bào thường
liên kết thành hình chùm nho. Không di động, không tạo bào tử. Nhiệt độ tối ưu là
37oC. Chịu được khô hạn, hơi nóng (ở 50oC vẫn sống được trong 30 phút). Có khả năng
sống được trong nồng độ NaCl là 9-10%. pHopt= 6-7 ; aw opt = 0,83- 0,90.
Staphylococus có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường khác nhau nhất là trên
các môi trường chứa chất hữu cơ. Tuy nhiên phải có nitơ trong môi trường. Nguồn nitơ
sử dụng là acid amin. Trong tự nhiên Staphylococcus được tìm thấy trên da, mũi, tóc
hay lông của các động vật máu nóng. Staphylococcus sinh một số độc tố đường ruột
9
enterotoxin bền nhiệt và không bị phân huỷ ở 100 0C trong 30 phút. Khi ăn phải thực
phẩm có chứa độc tó này, sau 4-6 giờ người ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn
mửa kéo dài 6-8 giờ. Ngoài ra Staphylococcus còn tạo mụn nhọt, làm đông huyết
tương, từ đó gây nên các bệnh như viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận,
viêm tủy xương ở người. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem
tổng hợp, nước súp và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm vi
sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình
chế biến
Staphylococcus aureus
Đặc trưng nhất của loài nay là gây viêm ruột dẫn đến bệnh chảy máu ruột.
Mang tính chất đặc trưng của loài Staphylococcus, kết lại với nhau thành dạng
chùm nho hoặc thành từng chuỗi ngắn. Có một vài loài Staphylococcus aureus có khả
năng chịu mặc rất tốt (10 – 20% NaCl) và cũng chịu được tác động của nitrit. Chính vì
vậy phải rất kiểm tra sự hiện diện của Staphylococcus aureus đối với các sản phẩm thịt
như: xúc xích, dăm bông, lạp xưởng. Staphylococcus aureus cũng phát triển tốt trong
môi trường có nồng độ đường cao (50 – 60% đường). Chúng lên men và phân giải
đường nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm.
Nguồn gây nhiễm Staphylococci vào cơ thể người thường từ những người bị
viêm mũi gây nên viêm xoang, từ các ung nhọt, hoặc các vết thương bị nhiễm trùng, từ
da người tiếp xúc với người bệnh. Staphylococci còn gây nên chứng viêm vú bò dẫn
đến làm nhiễm sữa và các sản phẩm từ sữa. Riêng không khí không phải là nguồn gây
nhiễm đặc trưng trừ phi trong môi trường có quá nhiều Staphylococci.
Các sản phẩm thực phẩm thường có Staphylococci : thịt và các sản phẩm từ thịt,
cá và các sản phẩm từ cá, sữa và các sản phẩm từ sữa, salad, pudding, cream. Nếu
không được trữ lạnh đúng mức thì Staphylococci sẽ phát triển mãnh liệt và gây bệnh.
1.3.6. Vibrio
Có khoảng 28 loài. Trong đó có 4 loài thường gặp nhiều trong hải sản:
- Vibrio vulnificus
- V. cholerae
- V. parahaemolyticus
- V. alginolyticus
Vibrio là phẩy khuẩn. Phần lớn thuộc gram (-). Di động nhanh nhờ đơn mao ở
đầu. Không sinh nha bào, phản ứng oxydase dương tính. Thuộc loài hiếu khí tùy tiện.
10
Vibrio là loài vi khuẩn ưa mặn, trong môi trường sống yêu cầu có khoảng 1 – 3%
NaCl. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ muối đến 7.0%. Nhiệt độ phát
triển tối ưu là 35 – 370C, tuy nhiên vẫn phát triển được ở khoảng nhiệt độ từ 10 – 44 0C.
Khoảng pH mà Vibrio có thể phát triển từ 5.0 – 11.0. Vibrio cholerae tạo ra độc tố tả
cholerae-toxin có độc tính mạnh, chỉ cần 5g gây nhiễm qua đường miệng có thể gây
tiêu chảy cho người trưởng thành. Ngoài độc tố này, loài này còn tiết độc tố hemolysin
có độc tính tương tự tetrodotoxin của các nóc.
Thường có mặt ở hải sản, các sản phẩm hải sản, nước biển. Nguồn thực phẩm có
nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây và các sản phẩm sữa,
các loại thuỷ hải sản tươi sống. Tuy nhiên bị tiêu diệt dưới tác động của nhiệt độ. Nói
một cách khác, khi nấu chín thực phẩm thì không phải lo sợ sự tác động của Vibrio.
1.3.7. Shigella
Shigella thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gây bệnh lỵ trực trùng. Chỉ
gây bệnh cho người và linh trưởng. Sinh độc tố enterotoxin. Là trực khuẩn gram(-),
không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện. Phát triển trong khoảng nhiệt độ từ
10 – 40oC, t0opt = 370C, pH = 6 – 8, nồng độ muối 5 – 6%. Nhạy cảm với nhiệt.
11
Bao gồm 4 loài
– S. dysenteriae
– S. boydii
– S. plexnery
– S. sonnei
Shigella tạo độc tố gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng), kích thích
lên thành ruột, lên hệ thần kinh trung ương, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu
đường và acid amin ở ruột non. Nếu tác động lên hệ thần kinh thì có thể gây tử
vong. Khi bị nhiễm Shigella, chúng sẽ tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột
già, gây hoại tử, làm loét, xuất huyết. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng
dữ dội, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt, có máu. Liều lượng gây ngộ độc
thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/g sản phẩm. Không
được phép hiện diện trong 25g thực phẩm
Thường nhiễm vào cá, quả, rau, thịt, các loại salad từ nước hoặc phân người.
Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá
trình sản xuất, chế biến thực phẩm.
1.3.8. Yersinia
Hiện nay tìm thấy 11 loài. Là trực khuẩn gram(-). Trong một số trường hợp có
khả năng chuyển động. Thuộc loại kỵ khí tùy tiện, không tạo bào tử, không sinh nha
bào. Khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 – 32 oC. Bị tiêu diệt ở 60oC trong vòng 1 – 3
phút. Đại diện tiêu biểu là Yersinia enterocolitica. Yersinia enterocolitica phát triển
trên nhiều loại thực phẩm khác nhau: bò, heo, dịch trứng, pho mát mềm, sữa, cá, tôm,
cua, gà, đậu phụ,… Y. enterocolitica thường gây bệnh đường ruột, gây viêm dạ dày tại
người. Sau 24 – 36 giờ sau khi sử dụng thực phẩm có mầm bệnh thì triệu chứng của
bệnh bắt đầu xuất hiện như đau bụng, sốt, tiêu chảy, các vết loét dạ dày hình thành.
Nếu để lâu sẽ dẫn đến chảy máu dạ dày.
1.3.9. Clostridium
12
Hiện nay phát hiện ra hai chủng gây ngộ độc thực phẩm:
- Clostridium botulinum: tạo độc tố gây hại đến hệ thần kinh
- Clostridium perfringens: gây đau bụng, tiêu chảy và giải phóng nhiều khí. Khi
vi khuẩn hình thành bào tử tạo ra độc tố ruột, gây ngộ độc cho người.
Clostridium botulinum là trực khuẩn gram (+), không di động, yếm khí, tạo bào
tử. Bào tử rất chịu nhiệt. Nhiệt độ phát triển tối ưu là : 43 – 47 oC, pH từ 5 – 9, bị ức chế
bởi NaCl 5%, hoặc NaNO3 2,5%
C.botulinum là vi khuẩn sinh độc tố. Tế bào C.botulinum bị tiêu ở nhiệt độ 80 0C
đến 900C. Trong đa số trường hợp C.botulinum sinh gas và tạo mùi khó chịu. Từ đặc
điểm này ta có thể loại bỏ thực phẩm nhiễm C.botulinum một cách dễ dàng. Tuy nhiên
cần đề phòng một số trường hợp ngoại lệ, lúc này ta không nhận biết được bằng cảm
quan về sự nhiễm vi khuẩn C.botulinum của thực phẩm, do đó người sử dụng sẽ bị
nhiễm độc tố gây hội chứng botulism (ngộ độc thịt).
Sự ngộ độc thịt xảy ra không thường xuyên, nhưng nó thường gây tử vong. Theo
sự phát triển của khoa học, tỷ lệ tử vong do botulism ngày càng giảm. Ví dụ vào những
năm 1970 – 1973 chiếm khoảng 23%, vào năm 1899 – 1994 tỷ lệ này chiếm trên 60%
tại Mỹ. Theo như thống kê của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh tại Mỹ, thì các sản
phẩm được làm tại nhà dễ bị nhiễm C.botulinum hơn là các sản phẩm sản xuất trong
công nghiệp.
Hình 7. Clostridium botulinum và bào tử hình viên đạn (Chụp qua KHV điện tử)
Tùy theo từng loại C. botulinum mà triệu chứng bệnh xuất hiện sau khi sử dụng
thực phẩm chứa độc tố xuất hiện sau các khoảng thời gian khác nhau (từ 12 – 36 giờ).
Khi bị ngộ độc các triệu chứng đầu tiên xuất hiện là: nôn mửa, tiêu chảy, mệt mỏi,
chóng mặt và đau đầu. Sau đó là các triệu chứng táo bón, nhìn một thành hai. Rồi các
hiện tượng khó nuốt, khó phát âm xuất hiện. Người bệnh cảm nhận được sự khô
miệng, khó thở, lưỡi bị sưng và xuất hiện màng. Có thể lên cơn sốt hoặc không. Tiếp
theo là cơ bị tê cứng, rồi đến hệ thống hô hấp bị tê cứng và cuối cùng là tim ngừng
đập. Kết quả là người bị bị tử vong do tê liệt hệ thống hô hấp. Sự tử vong này thường
diễn ra sau 3 – 6 ngày sử dụng thực phẩm nhiễm độc tố.
Phương thức duy nhất để chữa trị là sử dụng các chất kháng độc tố. Tuy nhiên nó
chỉ hiệu nghiệm nếu sử dụng khi phát hiện ra các triệu chứng đầu tiên của bệnh. Còn
để khi các triệu chứng đặc trưng xuất hiện thì đã muộn rồi. Chính vì vậy việc xác định
13
bệnh là rất khó khăn. Kèm theo việc sử dụng chất kháng độc tố là phải giữ cho người
bệnh ở trạng thái yên tĩnh, sử dụng phương pháp thở nhân tạo, tạo sự cân bằng các
chất lỏng trong cơ thể,..
Để ngăn chặn sự nhiễm C.botulinum vào cơ thể cần chú ý thực thi các việc sau:
- Nên xử lý nhiệt các đồ hộp trước khi sử dụng.
- Loại bỏ các đồ hộp có triệu chứng phồng, méo mó.
- Không nếm các thực phẩm có mùi khó chịu.
- Không sử dụng các thực phẩm đã được nấu chín nhưng không được bảo quản
tốt và không được hâm nóng.
- Cần đun nóng lại thực phẩm nghi ngờ trong khoảng 15 phút.
- Đối với cảc sản phẩm xông khói thì cần chú ý một số điểm sau:
- Sản phẩm được giữ sạch, tay trước khi cầm sản phẩm được rửa sạch.
- Trrong quá trình xông khói cần giữ ít nhất ở 820C trong 30 phút.
- Làm lạnh nhanh sau khi đóng gói và bảo quản lạnh.
- Tất cả các bao bì sử dụng phải là loại được bộ Y tế cho phép và chịu lạnh tốt.
Streptococcus phân được sử dụng như là chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực
phẩm. Streptococcus phân là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, hình cầu hay
hình oval kéo dài, Gram dương, thường tụ tập thành hình đôi hay hình chuỗi, không di
động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các loài này sống hiếu
14
khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá trình
tăng trưởng.
Các loài này có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối NaCl, pH
ở 9,6 ở 450C.
1.4. CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ TRONG THỰC PHẨM
1.4.1. Chỉ tiêu vi sinh vật trong nước
* Nước dùng cho mục đích sinh họat và sản xuất
Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn
quốc gia Việt Nam (TCVN 5942 – 1995) quy định hai mức như sau:
- Loại A dùng là m nguồn cấp nước sinh họat nhưng phải qua quá trình xử lý,
giới hạn tối đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/100ml
- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliform cho phép là
10.000 MPN/100ml
* Nước uống
Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn). Tiêu
chuẩn (TCVN 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994) quy định về vi sinh vật của các dạng
nước này như sau:
- Nước uống đóng chai
1. Coliform (MPN/100ml) 0
2. Coliform phân (MPN/100ml) 0
3. E. coli (CFU/100ml) 0
4. Clostridium khử sulphat (CFU/100ml) 0
5. Streptococci phân (CFU/100ml) 0
15
- Nước giải khát có cồn
Chương II
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
2.1.LẤY MẪU
2.1.1.ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU THỰC PHẨM
16
Trong mẫu thực phẩm vi sinh vật hiện diện cở mật độ thấp và không có sự phân bố
đồng đều trong mẫu
Trong quá trình chế biến thực phẩm vi sinh vật trong nguyên liệu và bán thành phẩm
thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống do các biện pháp vật lý (nhiệt độ, ánh
sáng…), hóa học (chất ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao của muối, dung môi, …)
được sử dụng nhằm hạn chế thấp nhất sự hiện diện và tăng trưởng của vi sinh vật trong
quá trình chế biến. Sự tổn thương và sức sống yếu của các vi sinh vật cần phát hiện có
thể làm sai lệch kết quả các phản ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinh vật.
Do vậy, hầu hết các quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước và trong thực phẩm đều
có thêm các bước nuôi tăng sinh để phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn
thương và bước nuôi tăng sinh chọn lọc nhằm làm gia tăng mật độ tương đối của vi
sinh vật cần phát hiện, ức chế sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong
muốn khác.
2.1.2. PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU
Lấy mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm để xác định chất lượng bằng cảm quan
và phân tích trong phòng thí nghiệm (PTN) là khâu đầu tiên rất quan trọng trong công
tác phân tích, góp phần vào tính chính xác của kết quả kiểm nghiệm và xử lý thực
phẩm sau này. Trong kiểm nghiệm vi sinh, công đoạn lấy, vận chuyển và bảo quản
mẫu mặc dù được thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm nhưng lại là công đoạn rất
quan trọng trong quá trình thử nghiệm. Mọi sai sót trong công đoạn này đều có thể dẫn
tới những sai lệch nghiêm trọng kết quả thử nghiệm.
18
+ Chấp nhận (acceptable) (< m)
+ Ngưỡng lân cận giới hạn (Marginally acceptable) (> m and < M)
+ Không chấp nhận (Unacceptable) (> M);
Các loại kế hoạch lấy mẫu: Kế hoạch hai thuộc tính và kế hoạch ba thuộc tính.
* Kế hoạch hai thuộc tính
- Chỉ nêu ra m
- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử >m thì chấp nhận lô
hàng, nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m thì từ chối lô hàng
* Kế hoạch ba thuộc tính
- Đặt ra cả m và M
- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP
- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm và không
chấp nhận được
- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >m
và M thì chấp nhận lô sản phẩm. Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >
m và M hoặc có một mẫu >M thì từ chối lô sản phẩm
* Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu
Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm không được phép có trong
thực phẩm. Nếu cho phép một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể tích thì
thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính.
VD: Số mẫu phải kiểm tra và giới hạn vi khuẩn cho thịt tươi
Mẫu Test N C m M
Thịt tươi - Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình 5 3 106 107
gia súc - Samonella 5 0 0
Thịt gia - Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình 5 3 106 107
cầm
- Salmonella 5 0 0
20
vật quan tâm. Ngoài ra, môi trường cần có một hàm lượng nước thích hợp, có
độ pH xác định và kết cấu thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mục
tiêu.
- Mọi cơ thể sống đều được cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ. Các hợp chất hữu
cơ có cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O và N gọi là các nguyên tố thiết yếu của
sự sống. Nhìn chung các nguyên tố thiết yếu không thể thiếu trong quá trình
sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài các nguyên tố thiết yếu, trong
các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa lượng như: S và P, các nguyên tố
vi lượng như: Fe, Cu, Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I…Vì thế trong thành phần
dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm
nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ
thể thực vật, động vật hoặc VSV.
- Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 –
0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%.
- Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin,
các acid béo, các thành phần của màng tế bào... Nồng độ thích hợp của các gốc
kiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 g /ml. Nồng độ thích
hợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 g/ml (1 g = 10-6 g )
Chất hữu cơ
C 50
CO2
O Chất hữu cơ 20
N NH4+,NO3 - ,NO2- 14
H Chất hữu cơ 8
S SO42- 1
21
- Theo bản chất
- - Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồn
gốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xác
định.
- - Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết với
hàm lượng xác định
- - Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần của
môi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên.
- Theo trạng thái vật lý
- - Lỏng (Broth): không chứa agar trong thành phần môi trường. Môi trường lỏng
dùng để nuôi cấy tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá.
- - Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar. Môi trường rắn dùng để
phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượng
mật độ vi sinh vật.
- - Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp
- Theo mục đích
- - Môi trường tiền tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không chọn
lọc vi sinh vật. Ví dụ: nước pepton.
- - Môi trường tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối
tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm. Ví dụ: môi trường tetrathionate dùng tăng
sinh chọn lọc Salmonella
- - Môi trường chọn lọc: là môi trường rắn dùng để phân lập chọn lọc các khuẩn
lạc của vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân chọn lọc trong môi trường chọn lọc:
- + Chất kháng sinh (polymixin B, ampicillin, moxalactam, novobioxin,
oxytetracycline, D-cycloserine, vancomycin, trimethiprim, cycloheximide);
- + Chất chỉ thị màu như brilliant green, sodium selenite, bile salts, potassium
tellurite, sodium lauryl sulfate;
- + anaerobiosis bằng cách tạo điều kiện kỵ khí hoặc bổ sung những hóa chất ức
chế quá trình hô hấp như sodium azide, potassium cyanide (ức chế vsv sinh
catalase); phủ một lớp thạch lên trên mặt thạch (vd trong phân tích VK lactic);
- + pH, hoạt độ của nước, nhiệt độ.
- - Môi trường phân biệt :là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thị
giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối lượng vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân phân
biệt trong môi trường phân biệt:
- + Chỉ thị pH: Lên men đường tạo acid và làm giảm pH, decarboxyl amino acids
và thủy phân urea tạo ra ammonia amine khiến tăng pH. Chỉ thị pH thường
dùng là phenol red, methyl red và brom cresol purple.
- + Chỉ thị H2S: Một số vsv phân giải amino acid tạo H 2S. H2S được phát hiện
bằng cách sử dụng muối sắt như sắt citrate, ferric ammonium citrate… tạo ra
FeS có màu đen.
- + Phản ứng lòng trắng trứng: Một số vsv tạo lypolytic enzymes khiến môi
trường có chứa lòng trắng trứng xung quanh khuẩn lạc trở nên trong hơn.
22
- + Phản ứng phân huỷ hồng cầu máu: Để phân biệt một số VK độc hại như
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes.
- - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặc vài
đặc điểm sinh hoá của chủng vi sinh vật đã phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để
định danh chủng.
- Chỉ thị màu môi trường
- Trong rất nhiều các phản ứng sinh hoá dùng trong quá trình phân tích vi
sinh vật, thành phần môi trường của các thử nghiệm này thường có chứa những
chất chỉ thị màu. Các chất chỉ thị màu hoạt động theo nhiều nguyên tắc khác
nhau như làm cho tế bào vi sinh vật, khuẩn lạc của chúng có màu, làm cho môi
trường có màu hoặc thay đổi màu.... Trong các nguyên tắc đó, thì sự thay đổi
màu theo sự thay đổi của pH môi trường là phổ biến nhất ở các phản ứng sinh
hoá. Mỗi một chất chỉ thị màu thay đổi màu theo những giá trị pH khác nhau.
Do đó, ở mỗi phản ứng, cần căn cứ vào đặc tính của vi sinh vật khi phân tích,
môi trường nuôi cấy, đặc điểm cần nhận diện mà bổ sung những chất chỉ thị
màu cho phù hợp.
Bảng. Một số chất chỉ thị màu và ngưỡng pH thay đổi màu của chúng
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
23
-
24
cao áp 121oC trong 15-30 phút để diệt cả các thể sinh dưỡng lẫn các bào tử-nếu có- của
mọi vi sinh vật
Các bức xạ điện từ với bước sóng ngắn (như tia X hay tia gamma) có khả năng ion hóa
nhiều loại phân tử tạo nên những gốc tự do với hoạt tính hoạt hóa cực mạnh có thể phá
hủy các thành phần cũng như cấu trúc quan trọng như acid nucleic, màng lipoprotein,
các protein trong tế bào. Tia tử ngoại tuy không có khả năng ion hóa nhưng lại là một
tác nhân diệt khuẩn mạnh do khả năng tác động lên acid nucleic tạo đột biến gây chết
tế bào. Sóng viba (microwaves, dạng sóng điện từ có bước sóng từ khoảng 1-1000nm)
cũng được dùng phổ biến nhờ khả năng sinh nhiệt do kích thích các phân tử bất đối
xứng về điện tích dao động với tần số cao (trên 900 triệu lần/giây).
Các dịch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước giới
hạn (< 0,75 µm), cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tất cả các vi sinh vật (trừ
mycoplasma có đường kính chỉ khoảng 0,2-0,3 µm và virus). Một số hóa chất như
ethylen oxyde, triethylglycol, chất diệt khuẩn, kháng sinh… có thể kiểm soát sự tăng
trưởng của vi sinh vật thường được dùng để khủ trùng hoặc ức chế sự sống cũng như
tăng trưởng của vi sinh vật.
2.4.2.Khử trùng dụng cụ, môi trường sau nuôi cấy
Môi trường sau nuôi cấy vi sinh vật và các dụng cụ bị nhiễm cần được khử trùng, tiêu
hủy hoặc làm sạch phù hợp. Nói chung việc khử trùng bằng nhiệt đóng vai trò quan
trọng trước khi làm sạch hoặc loại bỏ các vật liệu sau nuôi cấy. Việc khử trùng bằng
hóa chất thường chỉ được thực hiện với các dụng cụ có kích thước và cấu tạo nhỏ gọn
(như pipet, lam kính…)hoặc trong vài trường hợp đặc biệt.
Đối với các dụng cụ thủy tinh được dùng làm nhiều lần (như bình tam giác, ống
nghiệm…) có thể khử trùng bằng autoclave ở 121oC trong 30 phút. Vật liệu nuôi cấy
trong các dụng cụ chứa dùng một lần (như plastic) cũng có thể khử trùng ở nhiệt độ
tương tự trong các bao plastic có điểm nóng chảy cao. Sau khi vi sinh bị diệt có thể
loại bỏ các đĩa Petri hoặc bao bì nhựa cùng các thứ bên trong.
25
- Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi
đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ que
cấy.
- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.
- Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để
que cấy.
- Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy: ghi tên vi sinh vật và ngày gieo
cấy.
Chú ý : Khi cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm kia có thể cầm hai ống
nghiệm cùng một lúc trên cùng bàn tay trái.
Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm
thạch nghiêng
Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ môi
trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi lấy được sinh
khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào trong ống
nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên.
Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng
Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng. Các
bước tiến hành cũng tương tự như mục 1.1 và 1.2, nhưng có điểm khác như sau:
- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc
nhiễm khuẩn lúc gieo cấy.
- Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáy
ống nghiệm.
Lưu ý: Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút que cấy ra, chú ý phải giữ que cấy
thẳng, nhẹ nhàng và không làm cho môi trường bị nứt nẻ.
2.5.2.Phân lập vi sinh vật
VSV tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài VSV. Việc
phân lập 1 loài nhất định trong quần xã VSV dựa vào khả năng phân tách các tế bào ra
thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc.
Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật
pha loãng để phân tách tế bào VSV kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo ưu thế
tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau:
2.5.2.1.Kỹ thuật hộp ria (streak plate)
Là kỹ thuật phân tách hỗn hợp VSV bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao cho các tế
bào riêng rẽ nhau ra. Sau khi được ủ trong một thời gian, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng
thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành do sự sinh sản, phân chia từ
một tế bào ban đầu.
Trong kỹ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn hảo
tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau đây là môt số
kỹ thuật ria thường dùng:
26
Kỹ thuật ria chữ T (T streak) Kỹ thuật ria liên tục (continuous streak)
Kỹ thuật ria 4 góc (quadrant streak) Kỹ thuật ria tia (radiant streak)
Hình 3.1 Các kiểu ria trên môi trường thạch
Chú ý: Sau mỗi vùng ria, người ta phải tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
2.5.2.2.Kỹ thuật hộp trải : Môi trường được chuẩn bị trước trong các đĩa Pettri. Yêu
cầu bề mặt môi trường phẳng, không ướt. Nhỏ 0,1 hoặc 0,2 ml dịch mẫu đã được pha
loãng vào chính giữa đĩa môi trường. Dùng que trang vô trùng trải đều mẫu khắp bề
mặt đĩa. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.
2.5.2.3.Kỹ thuật hộp đổ : Hút 1 ml dịch mẫu đã được pha loãng vào chính giữa đĩa.
Đổ 15-20 ml môi trường đã tiệt trùng, đã để nguội khoảng 45-50 oC vào giữa đĩa. Dùng
tay xoay nhẹ sang trái và xoay nhẹ sang phải vài lần để dịch mẫu hòa để vào môi
trường. Để yên đĩa trên bề mặt phẳng cho đông. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ
phát triển thành một khuẩn lạc.
27
Tính giá trị log (N/ml) cho từng mức nồng độ pha loãng. Vẽ đồ thị biểu diễn log
(N/ml) (trục tung) theo các giá trị OD đặt trên trục hoành. Xác định khoảng tuyến tính
giữa log (N/ml) với OD.
2. Xác định lượng tế bào theo độ đục:
- Đo độ đục của huyền phù của tế bào vi sinh vật cần xác định.
- Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và
OD để xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu. Lưu ý N/ml = 10 a với a=log
(N/ml).
Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh
mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng. Trong
trường hợp không cần thiết giá trị tuyệt đối của tế bào vi sinh vật thì không cần phải
xây dựng biểu đồ tuyến tính giữa mật độ vi sinh vật và giá trị OD.
Phương pháp này cho kết quả nhanh, thường được dùng để theo dõi hoặc nghiên
cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặc
trong sản xuất, tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật
2.6.2.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠC
Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống trong mẫu.
Những tế bào sống mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường thích
hợp.
Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tuỳ thuộc vào môi
trường nuôi cấy.
Phương pháp này thực hiện như sau:pha loãng mẫu sao cho số lượng khuẩn lạc
xuất hiện trên một dĩa petri khoảng 25 – 250. Dưới mức 25 sẽ khó chính xác trên mức
250 rất khó phân biệt các khuẩn lạc khi đếm. Mẫu có thể được cấy bằng kỹ thuật cấy
ria hay cấy trải.
28
Với mỗi loại vi khuẩn đòi hỏi phải có thời gian nuôi cấy tối ưu. Sao cho các tế
bào sống đủ thời gian phát triển thành khuẩn lạc. Kết quả thu được là số trung bình của
2 – 3 đĩa petri với cùng điều kiện nuôi cấy. Kết quả cũng thường được trình bày dưới
dạng CFU (Colony Forming Unit) thay vì số tế bào/ml, vì rằng có nhiều tế bào hình
thành chung một khuẩn lạc.
Cứ tiếp tục, sẽ có các dung dịch với độ pha loãng tăng thêm 10 lần cho đến khi
tìm được độ pha loãng thích hợp, cho phương pháp đếm khuẩn lạc.
Nguyên tắc chung là 1 phần mẫu + 9 phần dung dịch pha loãng cho nên nếu là
0,1ml cần bổ sung 0,9ml dung dịch pha loãng.
Chuẩn bị môi trường thích hợp trên đĩa petri
Cách tính kết quả :
Ví dụ: kết quả số khuẩn lạc trung bình từ 2 đĩa petri thu được là 35, độ pha loãng
-4
10 , số lượng mẫu đưa vào đĩa petri là 0,1ml ta có: 35.10.10000 = 3500000 CFU/ml
Cách biểu diễn kết quả:
29
- Biểu diễn kết quả phù hợp phương pháp đang áp dụng
- Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
- Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10 n (n là số
mũ thích hợp của 10).
Ví dụ:
- Kết quả 3500000 CFU/ml viết thành 3,5.106 CFU/ml
- Kết quả 3572000 CFU/ml viết thành 3,6. 106 CFU/ml
- Kết quả 3532000 CFU/ml viết thành 3,5. 106 CFU/ml
2.6.3.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẲNG PHƯƠNG PHÁP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER) (SỐ CÓ KHẢ NĂNG CAO NHẤT –
SCKNCN)
Quy trình định lượng theo phương pháp này như sau:
Cho các ống nghiệm chứa môi trường dạng lỏng thích hợp với vi sinh vật cần
xác định với 3 mức nồng độ 1/10, 1/100, 1/1000 mỗi mức 3 ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ
với thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả nhìn thấy chứng minh sự tăng trưởng của vi
sinh vật cần kiểm định (thường là những hiện tượng như:sinh hơi, đổi màu, đục…) ghi
nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu
này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng
MPN/100ml hay số MPN/gam.
Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong
mỗi độ pha loãng.
2.6.4. ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT MÀNG LỌC
Phương pháp này được dùng để định lượng vi sinh vật trong các mẫu nước với
mật độ vi khuẩn thấp. Vì vậy phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật
có trong mẫu nước trên màng lọc. Việc xác định số lượng tế bào vi sinh vật dựa vào số
khuẩn lạc đếm được. Sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thật có thành phần dinh
dưỡng thích hợp. Theo nguyên lý một khuẩn lạc là một tế bào vi sinh vật.
Màng lọc có kích thước 0,2 – 0,45 m được chế tạo từ các sợi thủy tinh hay sợi
polypropylene.
Ngoài màng lọc thông thường, ngày nay còn dùng màng lọc kỵ nước
(Hydrophobic Grid Membrane). Các vạch chia ô làm bằng vật liệu ngăn cản sự mọc
lan của các khuẩn lạc. Số vi sinh vật được tính theo số khuẩn lạc mọc trong các ô.
- Từ số các ô vuông có khuẩn lạc suy ra mật độ vsv trong mẫu theo dạng số có
xác xuất lớn nhất (MPN): MPN = N. ln(N/(N-x)); trong đó N là tổng số các ô vuông, x
là số ô có khuẩn lạc mọc.
31
Hình 12. Bộ lọc vô trùng và màng lọc
32
Hình 10. Buồng đếm hồng cầu
Mẫu được pha loãng bằng dung dịch có thành phần:
Thành phần dung dịch pha loãng.
- Pepton 0,1%
- Laurylsulphate 0,1%
- Methyl blue 0,01%
Các dung dịch pha loãng sau khi chuẩn bị phải lọc qua trước khi sử dụng.
Điều chỉnh kính ở độ phóng đại 400 lần rồi tiến hành đếm. Đếm số lượng tế bào
trong 5 ô lớn nằm trên đường chéo của buồng đếm.
Cách tính số vi sinh vật. Gọi x 1, x2, x3, x4, x5 là số lượng vi sinh vật trong từng ô
lớn ta có :
x1 x 2 x3 x 4 x5
X =
5
Ta biết thể tích của 1 ô lớn bằng 1/250 mm3
Do đó số lượng tế bào vi sinh vật co trong 1 ml mẫu sẽ là:
Số vi sinh vật (trong 1 ml mẫu) = X .250.1000 = X .250000
2. Đếm trực tiếp bằng đường đếm Breed
Buồng đếm Breed có diện tích 1cm 2 được đánh dấu. Dùng bơm tiêm cho chính
xác 0,01ml dung dịch mẩu dàn trên mặt buồng đếm. Sấy khô bằng cách hơ nhẹ trên
đèn cồn bằng methyl blue.
Khi đếm phết một lớp dầu trên bề mặt cần đếm. Số lượng vi sinh vật /ml được
tính theo công thức:
N/ml=4a.10 4 /d2
a: số lượng tế bào vi sinh vật trong vùng đếm
d: đường kính của vùng đếm
3. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Khi nhuộm vi sinh vật bằng một số thuốc nhuộm phát huỳnh quang như:
- Acridin Cam (AODC)
- 4, 6 – dianidino – 2 – phenyl – indol (DAPT)
- Fluoresecin isothio cyanate (FITC)
Mật độ vi sinh vật có thể xác định trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Số đếm nhận được bằng phương pháp này có thể cao gấp 2 lần phương pháp
đếm khuẩn lạc. Sự sai khác này do các tế bào chết hoặc tổn thương không có khả năng
phát triển thành khuẩn lạc.
Kết quả số đếm vi sinh vật bằng kính huỳnh quang phản ánh số vi sinh vật có
thật trong mẫu.
2.7. THỬ NGHIỆM SINH HÓA
33
Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, sau khi phân lập, việc định danh vi sinh vật
là một vấn đề rất quan trọng. Việc định danh này được thực hiện dựa và các đặc điểm
về kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật.
Thông thường để thực hiện các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong ba
cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động.
Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thị quy
ước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): khoảng trên 70% là
dương tính và (-/+): khoảng trên 70% là âm tính.
Trong các thử nghiệm sinh hoá, để đảm bảo chính xác trong
việc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các
chủng đối chứng. Một số chủng đối chứng cho các thử nghiệm sinh
hoá thường dùng được trình bày trong bảng sau:
Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng thường sử dụng trong phân tích vi sinh vật
bao gồm như sau:
1. Thử nghiệm khả năng lên men
Thử nghiệm khả năng lên men là thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử
dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên
men. Tùy theo vi sinh vật và nguồn cơ chất muốn kiểm tra có thể bổ sung vào môi
trường nuôi cấy những nguồn cơ chất khác nhau. Sản phẩm tạo thành từ quá trình sống
này sẽ làm giảm pH của môi trường nuôi cấy và từ đó làm thay đổi màu của chất chỉ
thị màu được bổ sung vào môi trường.
Chất chỉ thị màu thường sử dụng trong thử nghiệm là phenol red.
2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men
Thử nghiệmkhả năng oxy hoá – lên men nhằm mục đích xác định vi sinh vật
biến dưỡng nguồn carbon hydrat theo con đường lên men hay hô hấp. Phản ứng được
xác định dựa trên sản phẩm tạo thành từ quá trình sống của vi sinh vật và có thể làm
chuyển màu của chất chỉ thị màu bổ sung vào môi trường theo những cách khác nhau.
Thử nghiệm tiến hành trên môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH là
bromothymol blue
3. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat
duy nhất của vi sinh vật. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối
amoniu. Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường Simmon citrate có nguồn carbon
duy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue.
4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy
nhất. Ở những chủng có đặc tính này, sẽ có khả năng dùng muối amonium. Thử
nghiệm được tiến hành trên môi trường malonate broth với chất chỉ thị màu
bromothymol blue.
35
Thử nghiệm dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí. Vi
sinh vật hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải H 2O2 (chất rất độc đối với
tế bào) thành H2O và O2. Phản ứng được nhận diện nhờ sự sủi bọt của giọt H 2O2 khi O2
bay lên.
6. Thử nghiệm decarboxylase
Thử nghiệm dùng để phân loại và định danh các loại vi khuẩn đường ruột, dựa
trên loại enzym decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải một acid amin đặc trưng,
tạo CO2 làm tăng pH môi trường.
7. Thử nghiệm coagulase
Thử nghiệm thường dùng để định danh Staphylococcus. Loài này có khả năng
tiết enzym coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần huyết tương, tạo khối đông
huyết tương.
8. Thử nghiệm urease
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng tạo enzym urease của một số chủng vi
sinh vật, nhất là nhóm Proteus. Enzym này xúc tác phản ứng phân giải urê thành NH 3
và CO2 làm tăng pH của môi trường.
9. Thử nghiệm gelatinase
Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatine
thành polypeptid và acid amin của các đối tượng vi sinh vật.
10. Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưu
huỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase.
11. Thử nghiệm khả năng sinh idol
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hoá các sản phẩm trung gian
của quá trình oxy hoá thành indol. Sản phẩm indol tạo thành được xác định nhờ phản
ứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon có màu
đỏ.
12. Thử nghiệm KIA, TSI
Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên môi
trường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau
(glucose, lactose, sucrose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật.
13. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat
thành nitrite và các sản phẩm khác. Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng
với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức
chất màu hồng.
14. Thử nghiệm oxidase
Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật.
Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện
của enzym, thuốc thử bị oxy hoá một hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
15. Thử nghiệm ONPG
36
Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym b-galactosidase tham gia vào
quá trình lên men lactose ở vi sinh vật. Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o-
nitrophenyl-D-galactopyranoside. Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng.
16. Thử nghiệm MR (Methyl Red)
Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo
và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men
glucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử methy red trong môi
trường. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, không làm
đổi màu thuốc thử.
17. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)
Phản ứng dùng phân biệt các loài trong họ vi khuẩn đường ruột
Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hoá acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành
diacetyl. Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine của
pepton tạo phức đỏ.
18. Thử nghiệm CAMP
Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus. Phản ứng CAMP là thực
hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và b-hemolysin được tiết ra
bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của b-hemolysin gây phá vỡ hồng cầu
(tan huyết)
19. Thử nghiệm tính di động
Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật.
Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường bán lỏng. Kết quả được xác định dựa vào
kích thước của vệt cấy vi sinh vật.
37
Hình 24. Các dạng KIT sinh hoá định danh vi sinh vật
CHƯƠNG III
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG
38
1.2.2.Môi trường và hóa chất
Bảng 2.2.. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 1
Môi trường Hóa chất
Saline Pepton Water (SPW) Cồn 90 và 70o
o
1.3.Thực hành
1.3.1.Quy trình phân tích
39
Định lượng mẫu
10 g hoặc 10 ml
Ủ mẫu
30 1 oC trong 72 giờ
41
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250, ví dụ ở
nồng độ 10-4 số đếm > 250 thì kết quả ghi: > 2,5 x 10-6 CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở
nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25 thì kết quả ghi: < 2,5 x 10-2 CFU/g.
Petri có > 250 khuẩn lạc Petri có 25 – 250 khuẩn lạc Petri < 25 khuẩn lạc Petri có khuẩn lạc mọc loang
Hình 1.2. Số khuẩn lạc đếm trên đĩa Petri
2.3.Thực hành
Ủ mẫu
30 1 oC trong 3 – 7 ngày
43
Bước 3. Chọn độ pha loãng phù hợp và hút 0,1 ml dịch VSV trải lên bề mặt thạch
của đĩa petri. Mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.
Bước 4. Ủ mẫu 30 oC từ 3 – 7 ngày.
Bước 5. Chọn đếm đĩa có từ 25 – 250 khuẩn lạc.
2.3.3. Tính kết quả
Tương tự cách tính tổng số vi khuẩn hiếu khí.
44
3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC
XUẤT LỚN NHẤT (MPN)
3.1.Nguyên tắc
Phương pháp phân tích trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh
Lauryl Sulphate Broth (LSB) vào test đoán chừng (presumptive test), sau đó dùng
canh Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) và ủ ấm ở 37oC/24-48 giờ.
Phương pháp MPN là phương pháp dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1
dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); mỗi nồng độ pha
loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại có ống Duharm. Theo dõi sự đục môi trường và
sinh hơi để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương
tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và
dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g
(hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
3.2.Dụng cụ, môi trường, hóa chất và thiết bị
3.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 3.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 3
Dụng cụ Thiết bị
Túi dập mẫu Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)
Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)
Ống Durham Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân kỹ thuật
Ống nghiệm
Pipette 1 ml, 10 ml
Water (SPW)
Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 10%
Môi trường BGBL (Brilliant Green NaOH 10%
Lactose Bile Salt)
45
3.3.Thực hành
Chuyển
Chuyển 1 ml1ml
dung dung
dịch phadịch
loãng 10 , 10-2
ở ba-1nồng độ, liên
10-3tiếpvào
vào
ống
ống 10ml canh LBS, mỗi nồng độ 3 ốngủ
nghiệm có 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống,
ở 37 1 oC, 48 giờ
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
46
3.4.Câu hỏi thảo luận
1.Trong Coliforms tổng có các giống vi sinh vật nào?
2. Nêu nguyên tắc của phương pháp MPN? Viết tắt của MPN?
3. Nêu vai trò của các thành phần trong môi trường LSB và BGB
Water(SPW)
Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 20%
Môi trường BGBL (Brilliant Green NaOH 20%
Lactose Bile Salt)
Moâi tröôøng Tryptic Soya Thuốc thử Kovac’s
Agar (TSA)
Moâi tröôøng EMB (Eosine Thuốc thử Metyl Red
Methylen Blue agar)/ Endo
Moâi tröôøng MRVP (Metyl Dd creatine 0,5 %
Red Voges Prokauer
Moâi tröôøng thaïch Simons Dung dòch - naphtol 5%
Citrat
48
Thuoác thöû Kovac
HCl 10%
NaOH 10%
4.3.Thực hành
4.3.1.Quy trình phân tích
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có các độ pha loãng
10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1 ml dung dịch pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp vào ống nghiệm có 10
ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống, ủ ở 37 1 oC, 48 giờ
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
Chuyển 1 ml từ LSB (+) sang canh EC, ủ 44,5 0,2 oC, 24giờ
Choïn khuaån laïc deït, hình dĩa, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính ≥
1mm ñeå caáy sang TSA/BHI, ủ 37 1 oC, 24 giờ
49
Đếm số canh EC (+) và IMViC(++--), tra bảng MPN
E.coli
Hình 4.1 : Các ống EC (+) Hình 4.2 : E.coli trên môi trường EMB
Bước 6.Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang
môi trường thạch đĩa EMB/ Endo . Ủ các đĩa 37oC, 24giờ.
Nhaân daïng khuaån laïc E.coli:
- Treân moâi tröôøng EMB: khuaån laïc maøu tím, aùnh kim,
troøn, bôø ñeàu, ñöôøng kính khoaûng 1mm
- Treân moâi tröôøng Endo: Khuaån laïc maøu ñoû, aùnh kim,
troøn, bôø ñeàu, ñöôøng kính khoaûng 1mm
Bước 7. Chọn khuẩn lạc E.coli giả định trên EMB/Endo cấy vào TSA/BHI, ủ qua đêm
50
Bước 8.Cấy chuyển từ môi trường TSA/BHI vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa
Trypton broth, MR- VP, SC. Ủ 44,5 0,2 oC, 24giờ.
Bước 9. Thöû phaûn öùng sinh hoùa .Thử nghiệm IMViC
Phaûn öùng Indol: Caáy khuaån laïc nghi ngôø vaøo oáng
nghieäm chöùa 5ml Trypton broth, uû 37 0C trong 24giôø. Cho
theâm 0,5ml thuoác thöû Kovac baèng caùch cho chaûy doïc
theo thaønh oáng nghieäm
+ Moâi tröôøng chuyeån maøu ñoû: indol (+)
+ Moâi tröôøng khoâng ñoåi maøu: indol (-)
Phaûn öùng MR (metyl red): Caáy khuaån laïc nghi ngôø
vaøo 2 oáng nghieäm, moãi oáng chöùa 5ml moâi tröôøng
MRVP ñeå ôû 370C töø 48 – 96 giôø. Moät oáng thöû phaûn
öùng Methyl red, moät oáng thöû phaûn öùng VP.
Cho vaøo moät oáng nghieäm vaøi gioït metyl red ôû pH
trung tính hoaëc kieàm yeáu
+ Moâi tröôøng chuyeån maøu ñoû: MR (+)
+ Moâi tröôøng khoâng ñoåi maøu: MR (-)
Phaûn öùng VP (Voges Proskauer) Cho vaøo oáng
nghieäm chöùa moâi tröôøng MRVP coøn laïi khoaûng 0,6ml
dung dòch - naphtol vaø 0,2ml dung dòch kalihydroxyt
40%, laéc ñeàu, ñeå yeân trong 2h.
+ Moâi tröôøng ñoåi sang maøu ñoû eosin hoaëc coù veät
ñoû eosin phaùt trieån trong voøng 15 phuùt : VP (+)
+ Moâi tröôøng khoâng chuyeån maøu
ñoû: VP (-)
Phaûn öùng citrat: Caáy ria khuaån laïc
nghi ngôø leân maët nghieâng cuûa moâi
tröôøng simon citrat, ñeå ôû 37 0C trong
24h.
+ Moâi tröôøng ñoåi maøu luïc sang xanh
döông vaø coù khuaån laïc: citrat (+)
+ Moâi tröôøng khoâng ñoåi maøu, Hình 4.3. Phản ứng
khoâng moïc khuaån laïc: citrat (-) citrat
4.3.3.Kết quả
Ống nghiệm cho kết quả EC (+), và khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường
EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC (++-- ) là ống nghiệm có E.coli (+). Từ số
lượng các ống có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu tra bảng MPN để tính
ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay
MPN/ml
51
5. ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
5.1.Nguyên tắc
Salmonella ñöôïc phaùt hieän töø 1880, ñaïi
ña soá laø vi khuaån gaây ngoä ñoäc thöïc
phaåm vaø gaây beänh (soát thöông haøn).
Salmonella thuoäc hoï Enterobacteriaceae,
tröïc truøng gram aâm, hoâ haáp tuøy tieän,
coù khaû naêng di ñoäng, khoâng taïo baøo
töû, leân men glucose vaø mannitol sinh acid
nhöng khoâng leân men saccharose vaø
lactose, khoâng sinh indole, khoâng phaân Hình 5.1.
giaûi urea, khoâng coù khaû naêng taùch Salmonella
nhoùm amine töø tryptophane, haàu heát caùc chuûng ñeàu sinh
H2S. Caùc loaïi thöïc phaåm ñeàu yeâu caàu phaûi kieåm nghieäm
Salmonella vôùi tieâu chuaån khoâng phaùt hieän/25 g(ml)
Nhö vaäy vieäc xaùc ñònh thoâng thöôøng chæ döøng ôû möùc ñoä
ñònh tính, teân chuûng chæ ñöôïc xaùc ñònh trong nhöõng tröôøng
hôïp quan troïng. Caàn löu yù Salmonella laø nhoùm chöùa caùc
doøng gaây beänh nguy hieåm, do vaäy caàn tuaân thuû trieät ñeå
caùc bieän phaùp an toaøn khi laøm vieäc vôùi caùc chuûng ñoái
chöùng (+) cuõng nhö khi thao taùc treân caùc chuûng phaân laäp
ñöôïc. Caùc moâi tröôøng hay maãu vaät sau khi nuoâi caáy caàn
phaûi haáp khöû truøng caån thaän tröôùc khi röûa. Do trong thöïc
phaåm Salmonella thöôøng toàn taïi ôû soá löôïng ít, teá baøo coù
theå bò toån thöông do ñoù quy trình xeùt nghieäm thoâng thöôøng
goàm 4 böôùc: taêng sinh, taêng sinh choïn loïc, phaân laäp vaø
khaúng ñònh.
5.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường và hóa chất
5.2.1..Dụng cụ và thiết bị
52
5.2.2.Môi trường và hóa chất
Bảng 5.2.Môi trường và hóa chất chỉ tiêu5
Môi trường Hóa chất
Dung dòch Buffered Peptone Water Cồn 90o và 70o
(BPW)
Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV) Dd creatine 0,5 %
Selenit xystin / Tetrathionat (TT) Dung dòch - naphtol 5%
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%
Môi trường Hektoen Entric Agar (HE) Thuoác thöû Kovac
Moâi tröôøng Trypticase Soy Agar (TSA) HCl 10%
Moâi tröôøng Lysine Decacboxylase NaOH 10%
broth (LDC)
Moâi tröôøng KIA hoaëc TSI
5.3.Thực hành
5.3.1.Quy trình phân tích
-1 -2
Chuyển
Chọn các1ml
khuẩndung dịch
lạc đặc 10cấy
trưng , 10
sang 10-3BHI
,canh vào
o
ống 10ml
hoặccanh LBS,ủ mỗi
thạch TSA, nồng
qua đêm, 37độ C 3 ống
0
lặp lại, ủ ở 37 C, 48 giờ
5
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- KIA/TSI: đỏ/vàng, có /không H2S, sinh hơi/không
- Urea (-), Indol (-), VP (-)
- LDC (+),ONPG (-)
53
5.3.2.Các bước tiến hành
Bước 1. Tăng sinh
- Caân 25g maãu ñaõ nghieàn, hoặc hút 25 ml mẫu cho vaøo bình
ñaõ chöùa saün 225ml moâi tröôøng BPW, laéc ñeàu ñeå ôû 37 0C
trong 24 giờ.
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
- Huùt 1ml canh khuaån BPW sang moâi tröôøng RV, nuoâi
trong 24 giờ ôû 42oC.
- Huùt 1ml canh khuaån BPW sang moâi tröôøng Selenit-
cystin/TT, nuoâi trong 24 giờ ôû 37oC.
Hình 5.2. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD (trái), HE (phải)
Thử nghiệm VP
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào
các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02
giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm
02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi
trong vòng 15 phút là phản ứng dương tính
Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi
màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ VP (-) VP
trên bề mặt môi trường. (+)
55
Thử nghiệm indol
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường TW,
nuôi 37oC ± trong 24 giờ.
Sau nuôi, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs. Phản ứng dương tính khi có
vòng đỏ trên bề mặt môi trường.
56
Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng coi là dương tính.
LƯU Ý
Có thể sử dụng kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB để phát hiện sự có mặt của
các kháng nguyên Salmonella. Trên 98% các chủng Salmonella cho phản ứng ngưng
kết với một trong hai kháng huyết thanh OMA, OMB. Do vậy khi thấy có sự dính kết
với một trong hai kháng huyết thanh đa giá trên có thể kết luận là Salmonella.
5.3.4.Kết quả
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Salmonella được
phát hiện trong 25g mẫu
6.1.Nguyên tắc
Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, không
sinh bào tử, không di động, thường tụ thành chùm có khả
năng lên men và sinh acid từ succrose, mannitol và sinh sắc
tố vàng, chịu mặn (7,5% NaCl). và có khả năng đông tụ
huyết tương (phản ứng coagulase (+)).
Staphylococcus aueus được xác định trên cơ sở các đặc
điểm tăng trưởng trên môi trường Baird Parker Agar bằng
kỹ thuật hộp trải và phản ứng làm đông huyết tương. Dựa
Hình 6.1. Sta. aureus trên BPA
vào số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng Coagulase (+) suy
ra mật độ vi khuẩn này trong thực phẩm.
6.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất
57
6.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 6.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 6
Dụng cụ Thiết bị
Phieán kính, laù kinh Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)
Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Ống nghiệm
Water (SPW)
Moâi tröôøng Baird-Parker HCl 10%
Moâi tröôøng Trypticase Soy NaOH 10%
Agar (TSA)
Brain heart broth (BHI) KH2PO4
Huyết tương thỏ
6.3.Thực hành
6.3.1.Quy trình phân tích
o -1
Chuyển 1ml dung
Baird-Parker (37,0dịch
± 1,010C; ,2410– -248
, 10 -3
giờ) vào
ống 10ml canh LBS, mỗi nồng độ 3 ống
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng, 5 khuẩn lạc không đặc trưng
lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ
5
Canh BHI/thạch TSA
(37,0 ± 1,0oC, 24 giờ)
58
Phản ứng coagulase (37,0 ± 1,00C)
(0,1ml dịch BHI; 0,3 ml huyết tương thỏ)
6.3.2.Các bước tiến hành
Bước 1. Pha loãng mẫu theo nồng độ pha loãng thập phân: Cân/hút 10g/10ml mẫu
thực phẩm đã được chuẩn bị vào chai/bình tam giác có chứa sẵn 90ml dung
dịch đệm, lắc đều mẫu 2-3 phút được nồng độ pha loãng 10-1
Bước 2. Chuyển 1 ml dung dịch mẫu thử 10-1 sang ống nghiệm chứa sẵn 9 ml dung
dịch đệm, lắc đều mẫu 2-3 phút được nồng độ pha loãng 10 -2. Tiếp tục làm
tương tự, thu được mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4....
Bước 3. Chuyển 0,1 ml dung dịch mẫu thử ở các nồng độ pha loãng thu được vào
chính giữa đĩa môi trường BPA đã được chuẩn bị trước (bề mặt các đĩa môi
trường này không được ướt), dùng que trang trải đều mẫu trên mặt thạch. Cấy
vào 2 đĩa mỗi nồng độ.
Lưu ý: Nếu số lượng Staphylococcus aureus dương tính thấp, có thể nâng nồng độ
dịch mẫu lên 10 lần, nghĩa là cấy 1ml dịch mẫu sơ khởi (mẫu nguyên nếu là
chất lỏng, hoặc mẫu 10-1 nếu là chất rắn) vào 3 đĩa. Kết quả ở 3 đĩa này được
xử lý gộp như một đĩa khi đọc, khẳng định và báo cáo kết quả
Bước 4. Lật ngược các đĩa và ủ 37,0 ± 1,00C trong 24 ± 3 và 48 ± 4 giờ
Bước 5. Sau 24 ± 3 giờ, trên môi trường thạch Bair parker khuẩn lạc Staphylococcus
aureus dương tính có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng, lồi. Mỗi khuẩn lạc
có quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình được đánh
dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa. Sau 48 ± 4 giờ, khuẩn
lạc Staphylococcus aureus dương tính có đường kính 1,5-2,0mm, màu đen,
sáng và lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là vùng sáng,
trong rộng 2-4 mm. Ngoài ra còn có các khuẩn lạc không tạo vầng sáng bao
quanh, không tạo vùng đục sát khuẩn lạc, đó là các khuẩn lạc không điển
hình. Các khuẩn lạc không điển hình này cũng được đánh dấu ở mặt sau của
đĩa.
Bước 6. Cấy chuyển 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình từ Baird
Parker Agar sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trường BHI. Ủ 37,0 ± 1,0 oC
trong 24 ± 3 giờ.
Bước 7. Chuyển 0,1ml dịch nuôi cấy trong môi trường BHI
vào 0,3 ml huyết tương thỏ (hoặc theo hướng dẫn của
nhà sản xuất) trong các ống nghiệm nhỏ đã tiệt trùng
có kích thước 10mm x 75mm, để tủ ấm 37,0 ± 1,0 oC.
Chú ý làm mẫu blank( mẫu chứng). Kiểm tra sự đông
vón của huyết tương sau 4, 6, 8, 24giờ. Phản ứng làm
đông tụ huyết tương được coi là dương tính khi thể Hình 6.2. Đông tụ huyết tương thỏ
tích đông vón chiếm 3/4 toàn bộ thể tích chọn lựa
59
6.3.4.Keát quaû
Maät ñoä Staphylococcus aureus trong 1g maãu (CFU/g) =
10 (Nt H t Na H a )
F1 F2
Trong đó:
- F1 và F2 : 2 độ pha loãng liên tiếp
- Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2
- Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2
- Ht: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số
khuẩn lạc đặc trưng
- Ha: tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so
với số khuẩn lạc không đặc trưng
töû vaø baøo töû naûy maàm raát deã daøng. Treân moâi tröôøng
choïn loïc loaøi naøy taïo khuaån laïc raát to, moïc lan, rìa nhaên. Vi
khuaån naøy hieän dieän trong ñaát, buïi, caùc loaïi thöïc phaåm
(söõa, thòt, rau quaû, hoãn hôïp gia vò, saûn phaåm khoâ...).
B.cereus ñöôïc phaùt hieän vaø ñònh löôïng baèng moâi tröôøng
thaïch choïn loïc Manitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoaëc Cereus
Selective Agar (Mossel). Khuaån laïc B.cereus coù hình thaùi ñaëc
tröng treân caùc moâi tröôøng naøy. Caùc khuaån laïc naøy ñöôïc
tieáp tuïc khaúng ñònh döïa treân caùc thöû nghieäm sinh hoùa vaø
caùc ñaëc ñieåm nhö leân men glucose sinh acid trong ñieàu kieän
kî khí, khöû nitrat thaønh nitrit, thöû nghieäm VP(+), thuûy phaân L-
tyrosine, taêng tröôûng ñöôïc trong 0,001% lysozym
7.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất
7.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 7.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 7
60
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)
Micropipet Máy dập mẫu (Stomacher)
Que trang, que cấy vòng Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Kẹp inox Cân kỹ thuật
Đèn cồn Lò viba
Pipette 1 ml, 10 ml
7.3.Thực hành
7.3.1.Quy trình phân tích
61
Cấy trải 0,1ml mẫu lên môi trường MYP, ủ 300C, 24-48 giờ
Cấy 05 khuẩn lạc nghi ngờ lên TSA, ủ 300C qua đêm
62
Choïn vaø ñeám caùc ñóa coù töø 15 – 150 khuaån laïc ñaëc
tröng cuûa Bacillus aureus (deït, ñöôøng kính 2 – 3mm, bôø hình
raêng cöa, maøu ñoû hoàng, xung quanh coù voøng ñuïc). Chuyeån
5 khuaån laïc nghi ngôø naøy leân moâi tröôøng phuïc hoài TSA , uû
ôû 30oC qua ñeâm tröôùc khi tieán haønh caùc thöû nghieäm sinh
hoaù.
- Thöû nghieäm khaû naêng leân men glucose: caáy vi khuaån
töø moâi tröôøng TSA sang moâi tröôøng canh glucose, uû 35 oC
trong 24 giôø. Bacillus cereus cho phaûn öùng döông tính laøm ñoåi
maøu moâi tröôøng töø ñoû sang vaøng.
- Thöû nghieäm khaû naêng chuyeån hoùa nitrat thaønh nitrit:
caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang moâi tröôøng nitrat, uû
ôû 35oC trong 24 giôø. Bacillus cereus coù phaûn öùng döông tính
neân sau khi nhoû thuoác thöû vaøo canh khuaån chuyeån sang
maøu đoû cam trong 10 phuùt.
- Thöû nghieäm Voges – proskauer: caáy vi khuaån töø moâi
tröôøng TSA sang moâi tröôøng canh MR - VP, uû ôû 35 oC trong 48
giôø. Bacillus cereus cho phaûn öùng döông tính: moâi tröôøng
chuyeån sang maøu hoàng khi cho thuoác thöû -Naphthol vaøo
(tröôùc khi nhoû -Naphthol vaøo phaûi laøm kieàm hoùa moâi
tröôøng nuoâi caáy baèng KOH 40%).
- Thöû nghieäm Tyrosin: caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA
sang oáng thaïch nghieâng Tyrosin, uû 35 oC trong 48 giôø. Khuaån
laïc Bacillus phaân huûy tyrosin taïo khoaûng trong xung quanh
khuaån laïc.
- Thöû nghieäm Lysozyme: caáy vi khuaån töø moâi tröôøng
TSA sang oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng Nutrient Broth vôùi
0,001% lysozyme, uû 35oC trong 24 giôø. Bacillus phaùt trieån laøm
moâi tröôøng ñuïc ñeàu.
7.3.3. Đọc keát quaû:
N R
Soá Bacillus cereus treân 1g maãu = n V f
63
8. KIEÅM TRA VI KHUAÅN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
8.1.Nguyeân taéc:
Gioáng Clostridium laø caùc vi khuaån Gram döông, hình que,
kî khí, sinh baøo töû, phaàn lôùn di ñoäng. Clostridium perfringens
laø loaøi kî khí khoâng baét buoäc, taïo caùc khuaån laïc maøu ñen
trong moâi tröôøng phaân laäp quy ñònh
Clostridium perfringens là vi khuẩn chỉ sự ô nhiễm do phân người, động vật, bùn đất,
nước cống rãnh. Vi khuẩn có bào tử và có sức đề kháng cao. Nếu thực phẩm chế biến
không đảm bảo vệ sinh, nhiệt độ khử khuẩn, đun nấu không đủ diệt bào tử, vi khuẩn
vẫn còn tồn tại và phát triển, làm hư hỏng thực phẩm và gây ngộ độc thức ăn ( nhất là
thực phẩm đồ hộp)
Do tính chất của Clostridium perfringens là phát triển trong môi trường kỵ khí và có
khả năng phân giải Sodium sulfit hoặc phân giải protein tạo H2S.
Cấy trên môi trường có Sodium sulfit và phèn sắt ( môi trường thạch Tryptose Sulfide
Cycloserin:TSC), tạo khuẩn lạc màu đen, thử tính chất sinh hóa để định danh
8.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất
8.2.1.Dụng cụ và thiết bị
8.3.Thực hành
8.3.1. Quy trình phân tích
Lấy 01 ml mẫu vào đĩa, rót khoảng 20ml môi trường TSC,
xoay đều, đợi đông, phủ thêm lên bề mặt đĩa 10ml môi trường
TSC, ủ 370C ± 10C, 20 giờ trong bình kỵ khí
Chọn 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Cấy ria các
khuẩn lạc này lên môi trường thạch TSC cơ bản, phủ thêm 10
ml môi trường TSC cơ bản, ủ 370C ± 10C, 20 giờ trong bình kỵ
khí
65
Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình:
Thử nghiệm tính di động, thử nghiệm sự có mặt của nitrit, thử
nghiệm sự hóa lỏng geletin, lên men lactose
Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc đen ở môi trường TSC, không
di động, khử nitrat thành nitrit, sinh acide và khí từ lactose, hóa
lỏng geletin trong 48 giờ được coi là Clostridium perfringens
8.3.2. Các bước thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có các độ pha loãng 10 -1,
10-2, 10-3…
Bước 2:Dùng pipet vô trùng để lấy ở mỗi nồng độ pha loãng 1 ml dung dịch huyền
phù ban đầu hoặc 1 ml mẫu thử ( nếu mẫu là chất lỏng) cho vào giữa đĩa Petri, mỗi
nồng độ 02 đĩa.
Bước 3: Rót 15-20 ml môi trường TSC vào đĩa Petri và trộn đều bằng cách xoay nhẹ.
Bước 4: Khi môi trường đã đông chặt, rót thêm một lớp 10 ml môi trường TSC phủ
lên trên.
Bước 5: Để đông và xếp các hộp Petri nắp ở phía trên vào bình kỵ khí, Bước 6: Đếm
và ghi lại số lượng khuẩn lạc điển hình ở các đĩa. Khuẩn lạc Clostridium perfringens
có màu đen
Xác nhận
Chọn tổng số 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Nếu không có khả năng tách
riêng rẽ tốt các khuẩn lạc điển hình thì nuôi 10 khuẩn lạc điển hình đó trong môi
trường lỏng thioglycolate, nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24
giờ.
Cấy ria các khuẩn lạc này trên môi trường thạch cơ bản TSC, phủ thêm một lớp 10 ml
môi trường TSC cơ bản. Để đông và nuôi yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ.
Tách ở mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc điển hình và dễ tách biệt. Xác nhận tính sinh hóa
Thử nghiệm tính di động : Làm môi trường thạch đứng Mannitol Mobility
Nitrate. Cấy sâu khuẩn lạc đã phân lập vào môi trường . Nuôi dưỡng trong điều kiện
yếm khí 370C ± 10C, 18-24 giờ.
Kiểm tra ống môi trường để xem dạng sinh trưởng dọc theo đường cấy sâu. Sự
sinh trưởng khuyếch tán vào môi trường từ vết cấy sâu thể hiện rõ tính di động
của vi sinh vật nuôi cấy
Thử nghiệm sự có mặt của nitrit: Thêm 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit
vào mỗi ống môi trường nitrat di động (tiến hành trong tủ HOP). Sự hình thành
66
màu đỏ xác nhận phản ứng khử nitat thành nitrit. Nếu trong 15 phút mà màu đỏ
không hình thành thì thêm một lượng nhỏ bột kẽm. Để yên 10 phút, nếu màu đỏ
được hình thành sau khi thêm bột kẽm thì không có phản ứng nitrat thành nitrit.
Xác định sự hóa lỏng geletin:
Cấy các khuẩn lạc đã phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường gelatin-lactose.
Nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ. Kiểm tra ống môi
trường xem có sự sinh khí và có chuyển màu vàng không ( tạo acide) cho biết
sự lên men của lactose. Làm lạnh 1 giờ ở 5 0C và kiểm tra sự hóa lỏng của
geletine. Nếu môi trường vẫn rắn, nuôi cấy thêm 24 giờ và kiểm tra sự hóa lỏng
của geletine.
Tham khảo quy trình phân tích Clostridium ( không dùng bình kỵ
khí)
68
9.2.2. Môi trường và hóa chất
Bảng 9.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 9
Môi trường Hóa chất
Ancalin Peptone Water (APW) Cồn 90 và 70o
o
Triple Sugar Iron agar –TSI/ Klingler Iron Agar NaOH 10%
-KIA
NaCl
Canh thang muối trypton ( trypton 1%) có dải Que thử Oxidase
nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký
hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và
T1N10).Chú thích: các ống môi trường phải được nút chặt
trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi
nồng độ muối
69
Canh thang bromcresol ( Môi trường cơ bản) Dung dịch nước muối sinh lý
(symolcitrat)
Cấy ria vào môi trường TCBS thạch . ủ 37,0 0C ± 1,00C trong
18 - 24 giờ
Ria cấy 03 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường TSA 2% NaCl,
ủ 37,00C ± 1,0oC trong 18 - 24 giờ
70
Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu.
71
Bước 4. Thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh
a. Thử nghiệm sinh hoá sơ bộ
Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi
trường không chọn lọc TSA 2% NaCl . Ủ ở nhiệt độ 37,0 0C ± 1,0oC trong 18 - 24 giờ.
Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh
hoá.
* Thử nghiệm trên môi trường TSI/KIA
Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI
( hoặc KIA . Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0 0C
± 1,00C trong 18 - 24 giờ.
Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của
môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H 2S. Trên môi trường
KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và
không sinh H2S.
* Thử nghiệm với các canh thang trypton muối
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có dải
nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % . Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0 ± 1,0 0C trong 18 - 24
giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong
ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 1%, 3% và làm đục môi trường.
* Thử nghiệm lên men - oxy hoá
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson
glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2
ống. ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37,0 ± 1,0 0C trong 1 - 2 ngày. V. cholerae lên men
glucoza làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường
O/F từ màu xanh thành vàng.
* Thử nghiệm oxidaza
Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza /que
thử oxidaza. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc
que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử
oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây .
Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này.
* Nhuộm gram
V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.
b. Thử nghiệm sinh hoá khẳng định
* Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C
Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl . Ủ ở nhiệt độ
42,0 C ± 0,20C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42 0C làm môi
0
trường bị đục.
* Thử nghiệm cacbonhydrat
72
Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các
loại cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D-
mannoza . Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37,0 0C ± 1,00C. Phản ứng dương tính khi
môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.
V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza,
cellobioza, arabinoza âm tính.
* Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza
Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và
ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng .
Ủ các ống ở nhiệt độ 37,00C ±1,0 0C trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi
trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh
thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).
V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm
tính.
* Thử nghiệm urê
Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê , ủ ở nhiệt độ 37,0 0C ± 1,00C trong 18
- 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng.
* Thử nghiệm ONPG
Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ
vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm
và đọc kết quả như trên. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có
màu vàng.
* Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat
Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl . Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg
hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ
37,0 ± 1,00C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi
Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129.
* Thử nghiệm kháng huyết thanh
Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý
lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA
lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện
tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt
nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực
hiện.
Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 1 và Bảng 2.
74
10. ĐỊNH TÍNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM
10.1.Nguyên tắc
Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy tiện, cho thử nghiệm
catalase (+) (trừ Shigella dysenteriae), oxidase (-), lên men glucose không sinh hơi,
hầu hết các loài không lên men và tạo acid từ latose, dulcitol, không sinh H 2S,
không có enzyme lysine decarboxylase.
Shigella có thể được phát hiện bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi
trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc.
Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 loại môi
trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra
bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
10.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường và hóa chất
10.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 10.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 10
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)
Que trang, que cấy vòng Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Pipette 1 ml, 10 ml Lò viba
75
Tergitol-7 Agar (T7A) Dung dòch - naphtol 5%
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%
Môi trường Hektoen Entric Agar (HE)
Deoxycholate Citrat Agar (DCA) HCl 10%
Thạch Mac Conkey (MAC) NaOH 10%
Moâi tröôøng Trypticase Soy Agar (TSA) Thuốc thử catalase
Moâi tröôøng Lysine Decacboxylase Que thử oxydase
broth (LDC)
Moâi tröôøng KIA hoaëc TSI
RSU
10.3.Thực hành
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn
lọc phân biệt (T7A,MAC,XLD,HE,DC…), ủ 370C , 24
– 48giờ
Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Thử nghiệm sinh hóa Kết quả
Urea - Adonitol -
Malonate - Dulcitol -
MR + Inositol -
VP -
78
Thử nghiệm urea
Thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU chứa chỉ thị đỏ
phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH
6,8 - 8,4). Có thể sử dụng môi trường urea thạch cơ bản có bổ
sung urea.
Lấy đầy một que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào
ống chứa 3ml-5ml môi trường RSU vô trùng, lắc nhẹ ống để Urea (-) Urea
trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37oC trong 48 giờ.
(+)
Shigella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi Hình5.4. Thử nghiệm
trường; nếu phản ứng dương tính, việc phân giải ure sẽ giải Urea
phóng NH3 làm đổi màu phenol red sang màu hoa hồng và sau đó chuyển sang màu đỏ
tím.
Thử nghiệm VP
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào
các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02
giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm
02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi
trong vòng 15 phút là phản ứng dương tính
Shigella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi màu
trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề VP (-) VP
mặt môi trường (+)
10.3.4.Kết quả
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Shigella được phát
hiện trong 25g mẫu
79
11. ĐỊNH TÍNH FAECAL STREPTOCOCCUS TRONG THỰC PHẨM
11.1.Nguyên tắc
Khi được nuôi cấy trong môi trường chứa acid tetrazolium chứa triphenyl
tetrazolium chloride, khuẩn lạc Streptococcus phân có màu hồng đến màu đỏ đậm do
sự khử triphenyl tetrazolium chloride. Các loài này không có catalase, không có
cytocrom c, có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối chứa NaCl, pH
9,6 ở 45oC.
80
HCl 10%
NaOH 10%
Thuốc thử catalase
Que thử oxydase
11.3.Thực hành
11.3.1.Quy trình phân tích
81
Bước 3. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đậm, kích thước khoảng
0,5-3mm, có thể có vòng không màu xung quanh khuẩn lạc.
Bước 4. Thử phản ứng sinh hóa
Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng, chuyển qua TSA, ủ qua đêm ở 370C. Thử sinh
hóa qua môi trường BHI 6,5% NaCl, BHI pH 9,6, thử nghiệm catalase, oxydase.
Enterococcus phân có phản ứng catalase (-), oxydase (-), phát triển được trong môi
trường BHI 6,5% NaCl, BHI pH 9,6.
11.3.4.Kết quả
Tính tỷ lệ khẳng định và mật độ theo CFU/g hay CFU/g
CHƯƠNG IV
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI
82
Phương pháp ELISA (Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme) dựa trên
nguyên tắc là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc
hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết
dính của kháng nguyên-kháng thể hoặc bằng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng
chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym).
ELISA được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đó đã trở thành một phương
pháp được sử dụng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong nghiên cứu, chẩn đoán
và xét nghiệm bởi vì nó có khả năng phát hiện nhạy bén với một lượng vật chất rất
nhỏ.
ELISA đã thay thế một số kỹ thuật huyết thanh “cổ điển“ phức tạp, cồng kềnh
tốn nhiều thời gian hơn và mở rộng phạm vi phương pháp phát hiện virus cũng như
các marker liên quan đến sự nhiễm của chúng.
Xét nghiệm ELISA có thể được tiến hành với một số phương pháp như ELISA
“trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ và “cạnh tranh“.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hoà tan trong
dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene). Quá trình
này có thể là trực tiếp hoặc thông qua một kháng thể. Khi huyết thanh được thêm
vào, các kháng thể có thể kết hợp với kháng nguyên ở pha đặc (solid phase).
Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm,
chứa 8x12 giếng. Mỗi giếng có chiều cao khoảng 1cm và đường kính là 0,7cm.
Hình 15: Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA
Các kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme bằng
liên kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết
với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên
sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme
được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất làm thay đổi màu do hoạt tính của
enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra
lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.
Tính nhạy của ELISA là do sự khuyếch đại bởi hoạt tính enzyme.
Mỗi một phân tử enzyme bám vào kháng thể có thể tạo ra hàng ngàn phân tử màu do
hoạt tính enzyme. Trước khi các kháng thể gắn enzyme có thể được sử dụng rộng rãi,
83
các kháng thể phóng xạ đã được sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch phóng
xạ (radio immuno assays-RIA). Kỹ thuật RIA như là một đột phá có ý nghĩa và người
sáng tạo ra nó là Rosalyn Yalow đã được nhận giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học vào
năm 1977.
84
Hình 17. Quy trình thực hiện phương pháp ELISA
Trong phương pháp này, các kháng thể đơn dòng được phủ bên ngoài những đĩa
giếng. Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này
sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách
sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym như horseradish peroxidase hay alkaline
phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzym vào giếng, enzym xúc tác
phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Thông qua
việc theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.
ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hoá chất (kit) thương mại. Hiện
nay, đã có các bộ kit dùng cho Salmonella, E. coli gây bệnh, Listeria, Staphylococcus.
Độ nhạy của các bộ kit này khoảng 10 4 CFU/ml, và vẫn cần thực hiện tăng sinh hoặc
tăng sinh chọn lọc khi thực hiện phương pháp này. Ngoài ra còn có các sản phẩm khác
như TECRA (Australia) dựa trên nguyên tắc này để định danh độc tố của
Staphylococci trong thịt .
Hình 18. Máy rửa và máy đọc trong quy trình ELISA
4.3.PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Hybridization)
Phương pháp lai phân tử còn được gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Phương pháp
sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện
một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai
phân tử . Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi
nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (T m ) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các
đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong
hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tế bào vi sinh vật) được cố
định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi
đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp
nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn T m ít nhất vài độ. Sự
lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng
rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA của môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng,
kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường.
85
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp in vitro để
tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số
lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym
polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này được Karl
Mullis (Mỹ) phát minh vào 1985.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA
riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có
mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của
DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các
suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở
nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm
biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt
này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100 oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng
thẳng) sẽ bị biến tính.
4.4.1. Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR
a. DNA mẫu (DNA template)
Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối
ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA
thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng
giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100ng).
Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra. PCR còn cho
phép khuyếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị
phân hủy từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay
của người chết....
b. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng
dây chuyền tổng hợp DNA . Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ
sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều
ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse
primer).
Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản
ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:
+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần
như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ.
+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base) để quá
trình lai xảy ra tốt hơn.
+ Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được
khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
+ Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự đối
xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định
do đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu.
+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng sản phẩm
primer dimer (Hình 3.7).
86
+ Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt
độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3 liên kết
hydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn.
+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng
đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi
khi đã bám vào DNA khuôn là 150-500 base.
c. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Enzyme ssử dụng trong phản ứng PCR là enzyme DNA polymerase từ
Thermus aquaticus (Tag-polymerase) không biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA
polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị
trường là Tag-polymerase. Hiện nay có nhiều enzyme chịu nhiệt khác được sử dụng là:
Vent- polymerase (Tli-polymerase), Pfu- polymerase, rTth...Các hoạt tính của chúng
được trình bày ở bảng:
1 21=2
2 22=4
4 2 =16
4
10 2 =1.024
10
15 2 =32.768
15
20 2 =1.048.576
20
25 2 =33.554.432
25
30 230=1.073.741.824
... ...
n 89 2n
Bảng . Số bản sao của phân tử DNA mẫu tạo thành qua các chu kỳ của phản ứng PCR
Hình 21. Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân
Ưu điểm của phương pháp PCR
+ Thời gian (6-48 giờ)
+ Phát hiện vsv khó nuôi cấy
+ Hóa chất dễ tìm và dễ bảo quản hơn so với huyết thanh học
+ Có thể tự động hóa
Hình 22. Mô hình máy PCR (Polymerase chain reaction) và máy PCR realtime của
Bio-Rad
Nhược điểm
+ Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase
90
+ Mật độ vsv trong mẫu thấp, đôi khi cần tăng sinh
+ Không phân biệt được tế bào sống và chết, có thể dẫn đến dương tính giả (tuy
vậy, có thể phát hiện bào tử, tế bào đã chết của vsv gây độc)
+ Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus
Thông thường khi thực hiện phương pháp PCR, trình tự được tiến hành như sau:
- Tăng sinh: vi sinh vật được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường chọn lọc (TSB)
10-20 giờ.
- Tách chiết DNA vi sinh vật
- Thực hiện phản ứng PCR
- Điện di trên gel agarose 1,5%, đọc kết quả trên đèn UV.
91
Hình 14. Quy trình phân tích vi sinh vật dùng Petrifilm
CHƯƠNG V
ĐÁNH GIÁ VỆ SINH CÔNG NGHIỆP
QUY ĐỊNH KIỂM SOÁT VI SINH
MÔI TRƯỜNG, THIẾT BỊ, VỆ SINH TAY, BAO BÌ
92
5.Baûo hoä lao - Swab 1 vuøng dieän tích100cm 2 - Coliform:
ñoäng: treân quaàn /aùo /noùn ngay sau khoâng coù
Quaàn/aùo/noùn khi hoøan taát coâng ñoïan saáy - E.coli: khoâng
khoâ coù
- Naám men/
moác : khoâng
coù
[1]. Bài giảng: Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm
-Trần Quốc Huy, Nguyễn thúy Hương,2010
[2]. Lê Đình Hùng, Nguyễn Đức Hùng, Huỳnh Lê Tâm, Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh
thực phẩm thủy sản, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2004
[3]. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2006
[4]. TCVN 4830-1:2005(ISO 6888-1:1999) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn gia
súc - phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với
coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch. Phần 1: Kỹ
thuật sử dụng môi trường thạch Baird-Parker.
[5]. Thomas A. Mc Meekin, Detecting pagothens in food,
Woodhead Publishing Limited (ISBN 1-85573-704-3) and CRC
Press LLC (ISBN 0-8493-1756-8), 2003
[6]. Shabbir Simjee, Foodborn Diseases, Humana Press (ISBN:
978-1-59745-501-5), 2007
93