Molekularna biologija

prokariota

II Molekularne osnove procesa:

Mehanizama reparacije oštećenja na molekulu
DNK kod prokariota
Reparacija DNK
 Od vitalnog je značaja očuvati integritet nasledne informacije
→ kod svih organizama oštećenja na molekulu DNK se
moraju ukloniti (ostali molekuli se mogu zameniti, ponovo
sintetisati)
 Raznovrsni reparacioni sistemi razvijeni tokom evolucije su
rezultat raznovsnosti oštećenja koja nastaju na DNK
 Većina reparacionih mehanizama se oslanja na
komplementarnost baza i ne greši– error free
 Mali broj mehanizama greši – error-prone
 Održavanje života – strogi balans procesa reparacije DNK i
mutageneze – dinamička ravnoteža koja učestalost mutacija
održava na niskom nivou → balans očuvanja genetičke
informacije i evolutivnih procesa
 Mehanizmi DNK reparacije kod prokariota
1. Direktna reverzija oštećenja
Dealkilacija - demetiluje O6-metilguanin
Fotoreaktivacija – monomerizuje pirimidinske dimere
2. Eksciziona reparacija
- Ekscizija (isecanje) baza (BER) ispravlja oštećene ili
neodgovarajuće baze u DNK (uracil, hipoksantin, alkilirane ili oksidovane
baze)
- Ekscizija (isecanje) nukleotida (NER) ispravlja velike strukturne
promene baza, pirimidinske dimere, prepoznaje distorziju heliksa
- „Mismatch repair“ (MMR) ispravlja greške u toku replikacije,
pogrešno sparene baze
3. Mehanizmi tolerancije oštećenja
- rekombinacija (rekombinaciona reparacija, ispravlja prekide u DNK)
- DNK Pol II zavisan „bypass“ (premošćivanje) oštećenja, inducibilan proces
- DNK Pol IV i Pol V zavisna replikacija oštećenja, translezijska sinteza,
inducibilna “error-prone” reparacija
Oštećenja DNK i reparacioni sistemi

Postoji delimično
preklapanje mehanizama:
 Isti reparacioni
mehanizam ispravlja
različite tipove oštećenja
 Veći broj reparacionih
sistema ispravlja jedan tip
(česta) oštećenja
Dealkilacija
 Alkilirajući agensi (MMS, EMS, MNNG)
 Enzim O6-metilguanin DNK metiltransferaza (produkt ada
gena) preuzima metil grupu sa O6-metilguanina, što ga
inaktivira (nije enzim po strogoj definiciji)

Neispravljen: G:C → A:T

 Fotoreaktivacija
 UV (254 nm) dovodi do dimerizacije
pirimidina (ciklobutanski pirimidinski
dimeri i 6-4 fotoprodukti)
 Enzim fotoliaza sa kofaktorom FADH2
prepoznaje pirimidinski dimer i vezuje se
 Kompleks apsorbuje kvant svetlosti (300-
500 nm) i koristi energiju za razdvajanje
dimera
 Fotoliaza se oslobađa

Postoji kod mnogih bakterija, biljaka i

nekih životinja (ne postoji kod
placentalnih sisara)
 Ekscizija baza - BER
 Oksidativna deaminacija baza (C u
U), hidroksimetiluracil, 5-
metilcitozin, hipoksantin, 8-oxoG
 Specifične DNK glikozilaze –
uklanjaju bazu, hidrolizuju N-
glikozidnu vezu (nastaje AP mesto)
 AP endonukleaze - raskidaju
fosfodiestarsku vezu koja se nalazi 5'
(najčešće) ili 3' od AP mesta
 Nukleotidi uklonjeni egzonukleazom
se zamenjuju reparativnom sintezom
(DNK Pol I) i ligacijom
 Ekscizija nukleotida -
NER
 UvrABC endonukleaza + UvrD
helikaza
 Prepoznavanje oštećenja (dimera) i
vezivanje proteinskog kompleksa
 Dve incizije na oštećenom lancu (5' i
3' od mesta oštećenja)
 Uklanjanje oligonukleotida (12 nt) sa
oštećenjem
 Popunjavanje nastalog prekida DNK
polimerazom I i ligacija
 „Transcription-coupled TC-NER”
(ispravka na transkripciono aktivnom
lancu) i globalna NER reparacija
(ispravka oštećenja na oba lanca)
 Reparacija pogrešno sparenih baza - MMR
 Editorska funkcija DNK polimeraze zakaže:
postojanje pogrešno sparenih baza (npr. A:C)
 Najčešći razlog nastanka: tautomerija baza
 Obe baze su ispravne, ali pogrešno sparene
→ mora postojati signal koji lanac treba
ispravljati: Metilacija GATC sekvenci Dam
metilazom (razlikovanje roditeljskog i
novosintetisanog lanca)
 MutS protein prepoznaje pogrešno sparen
bazni par
 MutH endonukleaza prepoznaje
hemimetilovanu GATC sekvencu
 Formira se MutS/MutL/MutH kompleks
 MutH endonukleaza iseca nemetilovanu
GATC sekvencu
 Lanac se degraduje egzonukleazama (dužina
fragmenta i do 2000 nt)
 DNK Pol III popunjava prekid
 DNK ligaza povezuje lanac
 Postreplikativna rekombinaciona reparacija

Mehanizam za toleranciju oštećenja:

 popunjavanje jednolančanih prekida u
novosintetisanom lancu (daughter-
strand gaps - DSG)

RecA zavisan mehanizam za ispravku:

 jednolančanih prekida (single-strand
breaks – SSB i DSG)
 dvolančanih prekida (double-strand
breaks - DSB)
Translezijska sinteza - TLS
 Inducibilni mehanizam uključen u
toleranciju oštećenja
 Replicira lanac koji sadrži
oštećenje
 Jedan je od niza odgovora ćelije
na oštećenje DNK (SOS odgovor)
 Biološki smisao SOS odgovora je
povećanje kapaciteta reparacije i
preživljavanja
 TSL povećava preživljavanje, ali i
genetičku varijabilnost
 Model SOS indukcije kod E. coli
 LexA represor sprečava
ekspresiju gena SOS regulona
 Zaustavljanjem replikacije na
oštećenju formira se signal za
SOS indukciju (ssDNK).
 RecA protein se vezuje za ssDNK
i aktivira se (RecA*)
 RecA* ima koproteaznu ulogu,
pomaže autokatalitičku razgradnju
LexA represora
 Povećava se ekspresija inhibitora
ćelijskih deoba i nekih proteina
koji učestvuju u NER i
rekombinacionoj reparaciji
 Eksprimiraju se polB (Pol II),
dinB (Pol IV), i umuDC operon
(Pol V)
 RecA* omogućava post-translacionu
obradu UmuD proteina u aktivnu
formu UmuD’
Pol V TLS
 Kompleks UmuD’2C je DNK Pol V
koja vrši translezijsku sintezu
 Pol V nema editorsku funkciju
(egzonukleaznu funkciju), ne može
da ukloni pogrešan nukleotid

 Replizom (Pol III) se zaustavlja na

oštećenju
 Zamena replizoma mutazomom (Pol
V)
 Translezijska sinteza, ugrađivanje
nekomplementarnih nukleotida
naspram oštećenja
 Ponovno uspostavljanje replikacije
 Pol II i Pol IV reparativni mehanizmi

Pol II: Pol IV

 ima editorsku funkciju
 omogućava nastavak
replikacije nekoliko minuta
posle njenog zaustavljanja
na oštećenju
 „replication restart“
mehanizmom “chickenfoot”
 nema editorsku funkciju –
reparacija error-prone
 replicira AP mesta i velike
adukte, npr. indukovane sa
derivatima B(a)P
 ne može da ugrađuje nukleotide
naspram pirimidinskih dimera
Pol II replication restart

 Regresija replikativne viljuške

pomoću RecA + RecFOR
kompleksa
 Pol II kopira neoštećeni
novosintetisani lanac –
struktura “chickenfoot”
 RecG vraća replikativnu
viljušku na početnu poziciju
 PriA omogućava nastavak
replikacije pomoću Pol III
 Mutageneza

Nastanak i vrste mutanata

Izolovanje mutanata
Fenotipska i genotipska promenljivost

 Fenotipska promenljivost – adaptacija na

uslove u kojima se jedinke nalaze, zahvata sve
jedinke u populaciji, ne nasleđuje se
 Genotipska promenljivost – promena u
genotipu, zahvata retke jedinke u populaciji i
nasleđuje se
 Genetička varijabilnost
Postojanje genetičke varijabilnosti u populaciji je neophodno
za adaptaciju na izmenjene uslove sredine, opstanak i
evoluciju živih organizama.

Mehanizmi genotipske promenljivosti

 Mutacije – promene u broju i redosledu nukleotida u
molekulu DNK
 Rekombinacije – stvaranje nove kombinacije gena
prenosom dela genetičke informacije iz jedne ćelije u drugu
(horizontalni transfer gena)
 Transpozicije – premeštanje jednog ili više gena sa jednog
mesta na drugo ili sa jednog replikona na drugi (sa
plazmida na hromozom ili obrnuto, sa jednog palzmida na
drugi isl.)
Mutacije

 Promene u broju ili redosledu nukleotida u

molekulu DNK
 Mutacije su redak i slučajan događaj i uglavnom
imaju negativan efekat
 Mali broj mutacija omogućava evolutivne
promene
Tipovi mutacija

 Tačkaste mutacije - zamene baznog para (tranzicije

ili transverzije) i promene okvira čitanja
 Delecije - gubitak baznih parova
 Adicije - dodavanje baznih parova
 Insercije - umetanje većeg broja baznih parova
 Inverzije - isecanje dela DNK i umetanje u obrnutom
smeru
 Duplikacije - oblik adicija kod kojih su dodati
nizovi baza identični
Zamene baznog para - efekat na strukturu proteina
Vanfazne - frameshift mutacije
 Upravne mutacije i reverzije

Upravne (forward) mutacije – u divljem soju, gubitak funkcije

Reverzije (povratne mutacije) – nove mutacije koje uspostavljaju
fenotip divljeg soja
 Prave reverzije – nova mutacija je na istom mestu gde i prethodna, wt stanje
se uspostavlja i na genotipskom nivou
 Supresije – nova mutacija je na drugom mestu ali poništava efekat prethodne,
na fenotipskom nivou se uspostavlja wt stanje
 Intragenske supresije – nova mutacija u istom genu, npr. frameshift

 Intergenske supresije – nova mutacija u drugom genu, npr. supresija

nonsense mutacije pomoću supresorskih tRNK
 Spontane mutacije

 Greške u replikaciji izazvane tautomerijom baza

 “Proklizavanje” DNK Pol III na monotonim nizovima nukleotida
 Replikacija ili „error prone“ reparacija endogenih oštećenja DNK
(oksidativna oštećenja, depurinacija, itd)

Glavni mehanizmi u ćeliji koji kontrolišu nivo spontanih mutacija:

 Selekcija baza i editorska funkcija DNK Pol III
 Reparacija pogrešno sparenih baza – MMR

 Redak događaj, u proseku 10-10 nukleotida

Indukovane mutacije
 Izazvane brojnim hemijskim, fizičkim i biološkim agensima,
mutagenima, koji mogu izazvati različita oštećenja u
molekulu DNK i povećati stopu mutacija
Glavni mehanizmi nastanka indukovanih mutacija:
 Zamena purinske ili pirimidinske baze (bazni analozi)
 Hemijska promena baze koja izaziva pogrešno sparivanje
(alkilacija, oksidativna deaminacija)
 Interkalacija (EtBr, akridin oranž)
 Hemijska promena baze koja izaziva potpuni gubitak
sposobnosti sparivanja (pirimidinski dimeri, adukti)
Mutagen Dejstvo Tip mutacija
Bazni analozi
5-Bromouracil Analog T, sparuje se sa G AT→GC, GC →AT
2-aminopurin Analog A, sparuje se sa C AT→GC, GC →AT
Modifikacija baza
Azotasta kiselina HNO2 Deaminacija A u H i C u U AT→GC i GC →AT
Hidroksilamin NH20H Reaguje sa C GC →AT
Alkilirajući i cross
linking agensi Metiluje G (G me-T) GC →AT
Metil metan sulfonat MMS Povezuju lance u dsDNK Tačakste, delecije
Mitomicin C
Interkalirajući agensi
Akridini
Ubacuju se između 2 bp Male insercije i delecije
Etidijum bromid EtBr
Zračenja
Ultravioletno UV-254 nm Formiranje dimera U toku ispravke može doći
Jonizujuća (X-) pirimidina do tačkastih mutacija ili
Slobodni radikali, prekidi delecija
lanaca
Fiksacija mutacija
 Proces od nastanka oštećenja do
nastanka mutacije
 Potrebne dve replikacije za
fiksaciju mutacija
 U prvoj replikaciji naspram
oštećenja dolazi do ugrađivanja
nekomplementarnog nukleotida
u novi lanac DNK
 U drugoj replikaciji dolazi do
kopiranja templeta sa pogrešnim
nukleotidom i stvara se mutirana
DNK
Posledice delovanja mutagena

 Ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji ne greše

 Replikacija oštećenja ili ispravka oštećenja reparacionim
mehanizmima koji greše - indukcija mutacija
 Smrt ćelije

 Manje od 1/1000 oštećenja će biti fiksirano u mutaciju

Mutanti
Jedinke kod kojih je došlo do mutacija i
koje se fenotipski razlikuju od roditelja
 Mutanti u morfologiji
 Mutanti u ishrani (auksotrofi)
 Mutanti rezistentni na antibiotike
 Mutanti u reparaciji DNK
 Uslovni mutanti
Izolovanje mutanata

 U morfologiji
Zasejavanjem na bogate podloge i posmatranjem morfologije kolonija
pr. Serratia marcescens (crvene kolonije nemutirane, mali br. belih
kolonija – mutanti)
 Rezistentnih na antibiotike
Zasejavanjem na podloge sa antibioticima (selektivne podloge –
selektivno rastu samo bakterije otporne na dati antibiotik)
Izolovanje auksotrofnih mutanata tehnikom kopiranja

bogata podloga mimimalna podloga

 Izolovanje mutanata

 U reparaciji DNK (primer: mutanti sa nefunkcionalnim NER mehanizmom)

„Replica plating“ tehniku koristimo da zasejemo bakterije na dve bogate
podloge, prvu tretiramo mutagenom (npr. ozračimo UV zracima), druga je
netretirana kontrola. One kolonije koje rastu samo na netretiranoj podlozi su
mutanti u reparaciji.
 Uslovnih mutanata (primer: mutanti osetljivi na temperaturu)
U permisivnim uslovima mutacija se ne ispoljava na fenotipskom nivou, u
nepermisivnim se ispoljava. Replica plating tehniku koristimo da zasejemo
bakterije na dve bogate podloge, prvu gajimo u nepermisivnim uslovima,
drugu u permisivnim. One kolonije koje rastu samo u permisivnim uslovima su
uslovni mutanti.
Fenotip Vrsta promene Detekcija mutanata
Auksotrofi Odsustvo biosintetičkih puteva Ne rastu na MM

Osetljivi na Promene u proteinima koji se Ne rastu na temperaturama na

temperaturu inaktiviraju na određenoj temp. kojima roditelji rastu

Rezistentni na Izmenjena propustljivost, izmenjeno Rastu na antibiotskim

antibiotike mesto vezivanja ili razgradnja podlogama
antibiotika
Bez kapsule ili LPS Odsustvo enzima za sintezu kapsule ili Male, grube (rough) i
LPS nepravilne kolonije

Gubitak flagela, Odsustvo enzima za sintezu flagelina Kompaktne kolonije

nepokretni
Gubitak pigmenta Odsustvo enzima za sintezu pigmenata Kolonije su drukčije boje ili
bezbojne
Ne fermentišu šećere Odsustvo enzima za razgradnju šećera Ne menaju pH podloge i boju
indikatora
Osetljivi na Odsustvo enzima za reparaciju DNK Ne rastu na podlogama koje
mutagene sadrže mutagen

Rezistentni na viruse Gubitak receptora za viruse Rastu u prisustvu virusa

 Testovi za detekciju mutagena
 Ames test, test na bakteriji S. typhimurium
 Najpoznatiji, rutinski se koristi za ispitivanje mutagenog efekta
različitih supstanci
 Osnovni princip: Bakterije gajimo u prisustvu i odsustvu test
supstance u uslovima koji dozvoljavaju uočavanje i brojanje
mutanata. Upoređivanjem broja mutanata zaključujemo da li je
test supstanca mutagena (i koliko je mutagena) ili nije.
 Realizacija osnovnog principa:
 Sojevi su mutanti u histidinskom operonu i ne mogu da rastu na podlozi bez
histidina
 Pratimo reverzije, reverznim mutacijama nastaju ćelije koje mogu da
sintetišu histidin
 Gajenjem bakterija na podlogama bez histidina (minimalna podloga)
selektujemo mutante
 Upoređujemo broj mutanata koji se formira bez tretmana i nakon tretmana
test supstancom
Mutagen

His– Reverzne mutacije His+

bakterije bakterije

Medijum
sa Ne rastu
MM
histidinom na MM
 Ekstrahromozomalni
genetički elementi

Plazmidi i epizomi
Insercione sekvence i transpozoni
Invertibilni genetički elementi
 Plazmidi
 Mali DNK molekuli van hromozoma, najčešće cirkularni (izuzetak su linearni
plazmidi Streptomyces i Borrelia)
 Ako imaju sposobnost integracije u hromozom – epizomi
 Imaju sopstveni ori, autonomno se repliciraju i regulišu broj kopija u ćeliji (F
faktor – br kopija 1-2, ColE1 – br kopija oko 50, postoje plazmidi sa ~100
kopija po ćeliji)
 Mehanizam replikacije: cirkularni molekuli (θ replikacija, mehanizam
kotrljajućeg obruča); linearni molekuli (za 5’ kraj svakog lanca se vezuje
proteinski prajmer, jednolančani krajevi vezani kovalentno u strukturu
ukosnice – zaštita od ćelijskih nukleaza i obezbeđivanje prajmera)
 Enzimi uključeni u relikaciju su kodirani sa hromozoma, ali plazmid
obezbeđuje informaciju za inicijaciju replikacije i pravilnu distribuciju kopija
u kćerke ćelije)
 Nose genetičke informacije neesencijalne za domaćina (domaćin može da
preživi i bez plazmida, ne kodiraju esencijalne životne funkcije)
 Povećavaju kompetitivnost, u specifičnim uslovima daju domaćinu selektivnu
prednost nad bakterijama koje ih ne poseduju (bolje preživljavanje)
Osobine bakterija kodirane plazmidima
 Proizvodnja antibiotika (Streptomyces)
 Proizvodnja bakteriocina (E.coli, Bacillus)
 Konjugacija (E.coli, Staphylococcus, Streptococcus)
 Rezistencija na antibiotike i teške metale (enterične
bakterije, Neisseria, Staphylococcus, Pseudomonas)
 Specifični katabolički putevi (Clostridium, Rhizobium,
Pseudomonas – degradacija oktana, naftalena ili kamfora)
 Faktori patogenosti (Salmonella, Staphylococcus,
Streptococcus, Agrobacterium, enteropatogene E.coli,)
Podela plazmida
 Prema veličini, broju kopija, sposobnosti za samostalni
transfer konjugacijom i mehanizmima replikacije
 Konjugativni (veliki, mali broj kopija, repliciraju se sinhrono
sa hromozomom domaćina, imaju mehanizme za distribuciju u
ćerke ćelije)
 Nekonjugativni plazmidi (mali, veliki broj kopija, repliciraju
se nezavisno od replikacije hromoza)
 Horizontalan transfer plazmida (prenos kroz populaciju sa
ćelije na ćeliju: konjugacijom, nekonjugativni – transdukcijom
ili transformacijom, ili ih konjugativni mobilišu
 Svrstavaju se u inkompatibilne grupe u zavisnosti od gena
uključenih u kontrolu replikacije (inc geni). Dva plazmida iste
inkompatibilne grupe su u kompeticiji kada se nađu u istoj
ćeliji domaćinu – ne mogu opstati zajedno, nakon određenog
broja deoba jedan od njih se gubi.
F plazmid

Konjugacija kod E. coli

 R plazmidi

 R100 plazmid - 89,3 kbp

 Rezistencija na streptomicin,
spektinomicin, fusidinsku
kiselinu, tetraciklin,
hloramfenikol, sulfonamide i
soli žive
 Konjugativni plazmid
enterobakterija
Ti plazmid iz Agrobacteruim tumefaciens
 Nosi T-DNK koja se unosi u
biljnu ćeliju, odlazi u nukleus i
stabilno se ugrađuje u
hromozome
 T-DNK nosi funkcionalne
biljne promotore odgovorne za
pojačanu sintezu biljnih
hormona, uzrokuje tumore
stabla
 Transformisano tkivo sintetiše
opine, derivate arginina koji
bakteriji služe u ishrani
 Na Ti plazmidu su geni za
katabolizam opina
Transpozoni
Genetički elementi koji se
premeštaju sa jednog
mesta na hromozomu na
drugo procesom
transpozicije - mesto
specifičnom
rekombinacijom (site-
specific recombination)
IS sekvence
 Najjednostavnije građeni transpozoni, dužine 700-
2500 bp, kodiraju samo enzime transpozaze koji
katalizuju transpoziciju, na krajevima su invertovani
ponovci
Pravi transpozoni
 Prosti: slične građe kao IS sekvence, ali pored gena
za transpozazu nose i gene za faktore virulencije ili
rezistenciju na antibiotike (Tn3, Tn7, itd)
 Složeni: ograničeni IS sekvencama, a u centralnom
delu su geni za faktore virulencije ili rezistenciju na
antibiotike (Tn5, Tn10)
 Najsloženiji transpozon je Mu (mju) bakteriofag.
Mehanizmi transpozicije

 Konzervativna transpozicija

Isecanje transpozona sa
prvobitne pozicije i ugradnja
na novom mestu
(transpozon uklonjen sa
prvobitne pozicije)
Mehanizmi transpozicije

 Replikativna transpozicija
Pojava nove kopije
transpozona na drugom
mestu
(transpozon postoji i na
prvobitnoj poziciji)
Privremenu strukturu –
kointegrat razdvaja enzim
resolvaza
Efekti transpozicije
 Insercione mutacije

 Veliki genetički rearanžmani (delecije, inverzije)

 Promene u ekspresiji gena
Invertibilni genetički elementi; fenomen fazne varijacije
kod S. typhimurium

Invertovani ponovci oko hin gena (kodira Hn protein – enzim invertazu)

Fazna varijacija – reverzibilne promene u strukturi flagela
Biološki smisao – zaštita od odbrambenih mehanizama domaćina (S.
typhimurium je patogena)