Fehérje termeltetés rovar sejtkultúrákkal

Bakulovírus – rovarsejt rendszer

Heterológ fehérje termelés rovarsejt kultúrákkal, rovar lárvákkal

- Sokoldalú, erős rekombináns fehérje termelő rendszer
- kísérleti célú fehérje előállítás (pl. enzimek, transzport fehérjék, receptorok, fehérje komplexek)
- humán- és állatgyógyászati fehérjék (pl. bioaktív peptidek, fehérjék, vakcinák, antitestek)
- Bakulovírusok: biológiai rovarvédőszereként való alkalmazás:
- inszekticid hatóanyagok kifejeztetése a kártevő rovarokban

- Fehérje termelő képesség hasonló mint az élesztő rendszereké: magas expressziós szint: ~mg - ~g/L
- erős virális promóterek
- Élesztőkhöz képest költségesebb és lassabb technológia, de olcsóbb, gyorsabb az emlőssejt rendszereknél.
- Poszt-transzlációs módosítások előnyösebbek a gomba rendszerekhez képest.
(De: korlátozottak, gyakran nem teljes mértékben, nem megfelelően mennek végbe.)
Bakulovírus expressziós rendszer:
 Gazdasejt: rovarsejtek
 Expressziós vektor: rekombináns bakulovírus genom
- Sejtvonalak, expressziós vektorok, genetikai eszközök beszerezhetők, kereskedelmi forgalomban vannak.
- Biztonságos rendszer.
- Rovarsejtek:
• egysejtréteg kultúrák
• szuszpenziós kultúrák  növeszthetők nagy térfogatú fermentorban
- Könnyen léptéknövelhető technológia.
- A rekombináns fehérje általában szolubilis a rovarsejtben és könnyen kinyerhető.
Fehérjetermelésre használt rovarok és rovar eredetű sejtkultúrák
rovar sejtvonalak:
 Spodoptera frugiperda army worm Sf9 Sf21

 Trichoplusia ni cabbage looper Tn-368 High-Five Tn5B1-4

 Drosophila melanogaster S2
Rovarsejt kultúra tápoldat

Emlős sejtek Rovar sejtek

Glükóz 4 g/l 2,5 g/l

Aminosavak 0,01 – 0,15 g/l 0,1 – 1,5 g/l
Glutamin 1 g/l 1 g/l
HCO3- 3,5 g/l 0,35 g/l
H2PO4 0,1 g/l 1 g/l
Sók 4.5 g/l NaCl 1 g/l MgSO4, KCl
Vitaminok, növekedési faktorok sok kevesebb
(fetal bovine serum) (szérum mentes tápoldat is használható)

pH 7,2 6,4
Rovarsejt kultúra fermentáció
Bakulovírusok
- kizárólagosan ízeltlábúakat, főleg rovarokat fertőző vírusok
Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera, Trichoptera
- szűk gazdaspecifitás
- nem patogének növényekre, emlősökre
- a környezetben stabilan fennmaradó vírusok
- nagy méretű, pálcika alakú vírusok
- genom: cirkuláris, dsDNS, 80 – 180 kbp
- ~ 120 – 160 ORF

Baculoviridae: 2 rend:
 Granulovírusok (GV)
 Nukleopolihedrovírusok (NPV)
- virionban lévő nukleokapszidok száma alapján:
• Single-nucleopolyhedroviruses (SNPV)
• Multiple-nucleopolyhedroviruses (MNPV)
Bakulovírusok
A fertőzési ciklusok során a vírusoknak két formája létezik:
 Occlusion drived virus (ODV) (Occluded virus – OV)
- nukleokapszidok (virionok) polihedrin fehérje mátrixban
 polihedron (occlusion body)
- a virális fertőzés nagyon késői szakaszában alakulnak ki
a megtámadott sejtekben
Előtte: intenzív polihedrin fehérje szintézis.
- a fertőzött sejtek halála és lízise után kijutnak a környezetbe
- az elsődleges vírusfertőzésért felelősek
- polihedron: védelem a környezeti hatásokkal szemben
 vírus hónapokon át fertőzőképes, életképes
 Budded virus (BV)
- egyedüli nukleokapszid
- fertőzött, de még nem lizálódott sejtekből szabadul fel
- nem fertőz újabb rovart
- a rovar még nem fertőzött sejtjeit támadja
- rovarsejt kultúrák sejtjeit is meg tudja fertőzni
- a nukleokapszidot a rovarsejtből való kijutás során
felvett sejtmembrán borítja
gp64 fehérje
F protein

- ODV és BV vírusformával fertőzött rovarsejt pázsit:

eltérő plakk morfológia
Bakulovírus formák
Rovar lárvák bakulovírus fertőzése
Rovar lárvák bakulovírus fertőzése
Rovar lárvák bakulovírus fertőzése

Nukleopolihedrivírus fertőzések:

Occluded virus: fertőzés állatról – állatra (vírus a rovar környezetében)

Budded virus: fertőzés sejtről – sejtre (vírus a rovaron belül)
Bakulovírusok életciklusa Polihedrin szintézis:
- a sejt megfertőződését
követő 36 – 48 óra után
kezdődik
- 4-5 napig tart

Viral replication
and assembly

Nucleocapsid
transport
(cytosceleton)
Bakulovírusok életciklusa

Budded virus felszíni fehérjéinek (gp64 és F protein) szintézise

Bakulovírus génexpresszió szakaszai
• Korai génexpresszió
- korai gének: DNS replikációhoz, késői génexpresszióhoz
(DNS polimeráz, helikáz, virális RNS polimeráz (4), késői faktorok)

• Késleltetett korai génexpresszió

• Késői génexpresszió
- vírus összeszerelődéshez, becsomagoláshoz kellő fehérjék
(nukleokapszid és vírusburok fehérjék (pl. gp64))

• Nagyon késői génexpresszió

- polihedrin  occlusion body mátrix
- p10  az occlusion body sejtmagból való felszabadulását segíti
Bakulovírus fehérje expressziós rendszerekben felhasznált vírusok

 Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)

- Lucernaaraszoló lepképől izolált vírus
- több mint 30 rovarfajt képes fertőzni
- legtöbb rovar sejtvonalat tudja fertőzi, ezekben a sejtekben jól szaporítható
- nagy genom: 130 kbp
- 154 ORF
- polihedrin promóter: nagyon erős
- polihedrin gén nem esszenciális a BV virion képződéséhez  Budded virus forma szaporítható

 Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV)

- selyemlepkéből izolált bakulovírus
- rovar sejtvonalakat is fertőzi

 Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus (BmNPV)

Baculovírus expressziós vektorok
- Bakulovírus alapú vektorok.
- Rekombináns vírus juttatja be a heterológ fehérje génjét a termelő rovar gazdasejtbe, és biztosítja a
kifejeződését.
- Általában a polihedrin gén kódoló régiójának helyére építik be a célfehérjét kódoló DNS-t.
- nagyon magas szintű expresszió
- polihedrin nem szükséges a fertőzőképes budded virus kialakulásához

- Legelterjedtebben használt bakulovírus: AcMNPV

- Heterológ fehérje génjének beépítése a vírus genomba  rekombináns AcMNPV
- Nagyméretű DNS építhető be az AcMNPV genomba: max. 38 kbp
Transzfer vektor:
- E. coli vektor
- expressziós kazetta:
• upstream AcMNPV DNS
• poliherdin (vagy más) promóter
• MCS
• polihedrin terminációs és poliadenilációs szignál régió
• downstream AcMNPV DNS
Baculovírus expressziós vektorok
Promóterek:

 polh gén promóter

- nagyon erős promóter
- a fertőzés nagyon késői szakaszában aktív, hosszú ideig
- szekretált fehérje expresszióra nem alkalmas (a fehérjék a sejt lízisével jutnak ki a sejtekből)

 p10 gén promóter

- korábbi fertőzési szakaszokban is aktíválódik  a fertőzés alatt végig aktív
- polihedrin promóternél kisebb aktivitású

 pg64 promóter
- fertőzés korai fázisában aktív  hatékony szekretált fehérje termelést biztosít

 ie-1 gén promóter (Orgyia pseudotsugata NPV)

- folyamatos, alacsony aktivitás

 Minimális CMV (humán citomegalovírus) promóter

Szekréciós szignál peptid:

• AcMNPV gp64
• bakulovírus kitináz
• házi méh melittin
Baculovírus expressziós vektorok
Az expressziós kazetta beépítése az AcMNPV genomba:
- rovarsejtek kotranszfekciója AcMNPV genomi DNS-el és a transzfer vektorral
- kettős rekombináció a kotranszformáns sejtekben
- polihedrint nem termelő vírusok okozta fertőzés
 eltérő megkülönböztethető sejt lízis okozta plakkok
(occlusion negatív)
- ellenőrzés: fals pozitívok kiszűrése
- DNS hibridizáció
- PCR
- rekombináns bakulovírusok izolálása a plakkokból

- fehérje termelő rovarsejt kultúra lefertőzése
a rekombináns vírusokkal

Rekombináns plakk azonosítás:

 Polihedrin negatív morfológia
 E. coli LacZ kointegrálása
- korai vagy késői fertőzési fázisban aktív
bakulovírus promóterrel kifejeztetve
 GFP

- nagyon alacsony rekombinációs gyakoriság (~ 0,1 %)

Baculovírus expressziós vektorok
Rekombináns bakulovírus gyakoriság növelése:
- AcMNPV genom linearizálás
- transzfekció rovarsejtekbe
- alacsony fertőzőképesség
 kevés nemrekombináns plakk

- Rekombináns plakkok gyakorisága: ~ 30 %

Továbbfejlesztés:
- két Bsu36I hasítóhely beépítése az AcMNPV
genomba: ORF603 és ORF1629 génekbe

- ORF1629 esszenciális a vírus fertőzéshez

(sejtmagi aktin filamentum rendszer kialakításában
vesz részt)
 Bsu36I-vel linearizált vírus genom
nem replikálódik

- kettős rekombináció a transzfer vektorral


helyreállítódik az ORF1629 gén

- Plakkok több mint 90%-a rekombináns.

Baculovírus expressziós vektorok
E. coli – rovarsejt bakulovírus shuttle vektor (Bacmid):
- Rekombináns expressziós vektor elkészítése
E. coli-ban, vagy in vitro.
- Expressziós kazetta vírus genomba építése
helyspecifikus rekombinációval.

Bacmid: mesterséges E. coli kromoszóma

- AcMNPV genomi DNS fenntartása E. coli-ban
- integrációs hely (att) lacZ’-ben
Transzfer vektor: donor plazmid
- célfehérje expressziós kazettája
- gentamicin, ampicillin rezisztencia
Helper plazmid:
- transzpozíciós fehérjék

- kotranszformáció E. coli-ba  rekombináció

- rekombináns bacmid  fehér telep (IPTG, X-Gal)
- rekombináns vírusgenom tisztítása E. coli-ból
- rovarsejt transzfekció (pl. kémiai, elektroporáció,…)

In vitro helyspecifikus rekombnáció:  integrációs rendszer

- módosított AcMNPV genom: attR1 – tk – attR2 (tk: timidin kináz gén  ganciklovir letalitás rovarsejtben)
- donor plazmid: attL1 – expressziós kazetta – attL2
- In vitro reakcióelegy: + integrase, excisionase, integration host factor
Rekombináns fehérje expresszió a bakulovírus – rovarsejt rendszerrel:

Transformation
Rekombináns fehérje expresszió a bakulovírus – rovarsejt rendszerrel:
Rekombináns fehérje termelés BmNPV alapú bacmid vektorral selyemlepke hernyóban
Glikoziláció ízeltlábúakban
- rovarsejtek N-glikozilációja eltér az emlősökétől  glikozilált emlős fehérjék nem autentikusak.
- mannóz csoportok lehasítása végbemegy
- paucimannóz képződés
- -1,6-fukóz oldallánc kialakul
- esetenként -1,3-fukóz is kapcsolódik: allergén
- galaktóz és a terminális sziálsav csoportok nem épülnek be a glükán láncba
Glikoziláció ízeltlábúakban: humanizáció
Emlős glikozilációs enzimek bevitele rovar sejtvonalakba
• szarvasmarha -1,4-galaktotranszferáz
• patkány -2,6- szialiltranszferáz
- Korai fázisban aktív promóterek expresszálják
a heterológ glükozilációs enzimeket
- CMP-szialilsav szintézis enzimeit kifejező sejtvonal
- sejtek növesztése N-acetilmannózamin
tartalmú tápoldatban
Glikoziláció ízeltlábúakban: humanizáció
Baculovírus expressziós rendszer hatékonyságának fejlesztése
 Rovarsejtek proteolítikus aktivitásának csökkentése
- kitináz és v-katepszin proteáz gének eltávolítása a AcMNPV genomból

 Chaperon koexpresszió
- BiP, PDI, kalnexin, kalretikulin

 Fehérje komplexek termelése

- komplex fehérjék alegységeinek párhuzamos termeltetése
- rovarsejtek kotranszfektálása többféle, egy-egy fehérjét expresszáló bakulovírussal
- többféle fehérjét kódoló vírus
Baculovirus surface display
- Emlős vakcina előállítás: BV vírussal immunizálás
- Ligand – receptor screen
- Immunoglobulin screen
Baculovirus surface display
Baculovírus – rovarsejt expressziós rendszer jellemzői

- Nem készíthetők rekombináns sejtvonalak

- Fehérjetermelő rovarsejtek rekombináns bakulovírus fertőzéssel hozhatók létre:
- rovarsejt kultúrát kell felnöveszteni
- fertőzés rovarsejtekből kitisztított budded virussal
- a fertőzés terjed a sejtkultúrában
- könnyű előállítás
- A folyamat végére a sejtkultúra elpusztul.
- A fehérje termelő sejteket minden alkalommal elő kell állítani.
- A vírusok tárolhatók.

- Valódi szekretált fehérjetermelés csak a fertőzés

korai időszakában lehetséges.
- a szekréciós rendszer könnyen telítődik
- Késői, nagyon késői fázisban sok fehérje termelődik
folding, poszt-transzlációs módosítások nem megfelelőek
- Egy sejtkultúra sejtjei különböző fertőzési állapotban, szakaszban vannak!
- A gazdasejt transzkripciójának leállása miatt kevesebb saját fehérje.

- Splicing

- Sejtek lízise: proteázok.

- Nagy molekulatömegű fehérjék expressziója.

Baculovírus – rovarsejt expressziós rendszerrel termeltetett fehérjék
Bakulovírus mint növényvédőszer
- A rovarok fertőzése elhúzódó folyamat: A kártevő lárvák a bakulovírus fertőzést követően még 10 – 14
napig életképesek és táplálkoznak.

- Modosított bakulovírusok előállítása:

Cél: - gyorsabb patogenitás
- táplálkozás megakadályozása

- Bakukovírussal toxin, hormon géneket juttatnak be a rovarok sejtjeibe

 Diuretikus hormon hemolimfa térfogatcsökkenése
 Juvenilis hormon észteráz (Heliothis virescens) táplálkozás megszűnik
 Bacillus thuringiensis toxin táplálkozás megszűnik
 Skorpiótoxin paralízis
 darázstoxin lassú növekedés