Методи цитологічних досліджень

З історії виникнення наукової

думки

859р. – аль-Карауі (Фес,

Марокко) – старійший
унівеститет з нині існуючих.
 Виникнення університетської освіти
738р. – Академія Хань-Линь у Китаї
813-833р. – засновано Байт-аль-Хікма (Будинок мудрості),
Багдад
848р. – Пандідактеріон (Магнаврська школа або
Константинопольський університет) утворений на базі
античного атеніума, що функціонував з 425р.
859р. – аль-Карауі (Фес, Марокко) – старійший унівеститет з
нині існуючих.
ІХ ст. – заснування вищих світських навчальних закладів у
мусульманській частині Піренейського півострова (Кордова,
Толедо, Севілья).
 Перші університети у Західній Європі

1088р. – почалося викладання у Болонському університеті

1096р. – початок викладання у Оксфорді
1209р. – заснування Кембріджу.
1215р. – заснування Сорбонни (Паризький університет)
1218-1254р. – засновано університет у Саламанці (Іспанія)
Також у ХІІІст. засновано університети у Монпельє, Падує,
Тулузі, Неаполі.
ХІVст. – університети у Празі, Кракові, Відні, Гейдельберзі.
 Перші вищі навчальні заклади у Східній Європі

1544р. – універсиет Альбертіна у Кьонігсберзі

1579р. – університет у Вільнюсі
1632р. – Дерптський університет (Тарту).
1608-1661р. – заснування Львівського університету Яна
Казимира (зараз імені І.Франка)
1574-1586 – заснування Львівської братської школи
1576-1640рр. – існування Слов’яно-греко-латинської школи у
Острозі.
1615р. – Заснування Києво-Братської колегії (з 1701р. –
Києво-Могилянська академія).
1685р. – Слов’яно-греко-латинська академія (Москва)
1724-1766р. – академічний університет у Санкт-Петербурзі
1755р. – Московський університет
1804р. – Казанський університет
1804р. – Харківський університет
1816р. – Варшавський університет
1819р. – Санкт-Петербурзький університет
1834р. – Київський універсиетет Св.Володимира (зараз імені
Тараса Шевченка)
Наука - вироблення і систематизація нових знань про
навколишній світ

Консерватизм, страх
новизни, тяжіння до
Традиційне звиклих форм
суспільство хозяйнування, циклічне
сприйняття часу

Лібералізм, активне
сприйняття нового, пошук
Нове буржуазне
і засвоєння модернових
суспільство
форм господарювання,
лінійне сприйняття часу
Бездоказові припущення, що сприяють розвитку науки

1) Існування матеріального світу

2) Позитивне світосприйняття (світ – благо, а не зло)

3) Відокремленість світу від надприродних сил (богів, духів
тощо)

4) Автономність матеріального світу від надприродних сил

(богів, духів тощо)

5) Пізнаваність (потенційна) світу людиною

6) Світ існує за певними законами, до яких може бути
зведено всю різноманітність явищ світу
7) Принцип універсалізму (тотожність законів існування
всесвіту в різних його частинах)
Свобода та дисципліна розуму, як передумови появи науки
ХІІІст. – розквіт схоластики, Альберт Великий (1200-
1280), Тома Аквінський (1225-1274). Введення системи
посилань.
Роджер Бекон (1214-1292), звернення до зовнішнього світу,
тлумачення явищ зовнішього світу.
Вільгельм Оккам (1285-1349), формулювання принципу
«Бритви Оккама» (парсимонії): «Не вигадуй сутностей
понад необхідне».
ХІІІ-ХVIІІст. – Інквізиція (розслідування).

ХІІІ-ХІVст. – Бурхливий ріст кількості міст. Формування

людини моделі «Y» (свободна та самодисциплінована).
Свобода, як противага хаосу та диктату (середовище
існування людини моделі «Х»: інстинктивна, традиційна).
Передумови появи мікроскопічних
досліджень

1284р. – винайдення окулярів

(Сальвіно д’Армате?)

Бл.1509рр. – Леонардо даВінчі малює

перші багатолінзові телескопи

1540-1559рр. – Леонард Діггес конструює теодоліт та

перший телескоп, а його син Томас використовує його
для астрономічних спостережень
Шолом (Horned Helmet) Генріха VIII, 1511-1514
 З історії
цитології,
гістології та
ембртіології
1590р. - майстри з виготовлення окулярів Г.Янсен та його
сини З. та Я. Янсени створюють перший мікроскоп.

З.Янсен Р.Гук

1665р. - Р.Гук вперше побачив та

описав клітини у корку та у бузині.
Мікроскоп Гука та перше, зроблене
їм зображення клітини
 1674 р.-А.ван Левенгук
(Тонізсон) вперше повідомив
про відкриття ним
одноклітинних організмів.
1678 р. - А. ван Левенгук,
одночасно з іншим
дослідником Н.
Хартсекером відкриває
сперматозоїд.
1680 р. - А.ван Левенгук
відкриває еритроцити
1683р. - А.ван Левенгук він
відкриває бактерії.

Сперматозоїди з малюнків А.ван Левенгука

(ліворуч)та Н.Хартсекера (праворуч).
Н.Грю М.Мальпігі
1671р. - Н.Грю та М.Мальпігі
використовують поняття
«тканина»
Мікроскопи XVII - ХVIII століття

Стереомікроскоп Н.Грю
(1685) та його малюнок
зрізу стебла
чортополоха
Мікроскопи Маршалла
(вгорі) та Колпейцера
(праворуч вгорі), та
Адамса (праворуч знизу)
 Опис ядра та ядерця
1781 р. – Ф.Фонтана бачить и
замальовує ядра та ядерця у клітинах
шкіри вугря.

Я.Е. Пуркін’є
“Зародковий пухирець” Пуркін’є.
1825р.
1825-1833 рр. - Я.Пуркін’є, Ф.Мірбель
та Р.Броун описують ядро.
Г. Валентін вводить поняття “ядро”
та “ядерце”.

Р.Броун
 Створення клітинної теорії
1812 р. – Д. Мольденгауер за допомогою мацерації відділяє
окремі клітини.
1830-1838р. - Я. Пуркін’є вводить термін протоплазма

1837р. - Я.Пуркін’є вперше формулює гіпотезу про єдність

клітинної будови тварин та рослин

1838р. - М.Шлейден робить висновок про едність

клітинної будови рослинних тканин

1839р. - Т.Шванн розповсюджує узагальнення Шлейдена

на тваринні клітини та показує, що в основі усіх
структур тваринних та рослинних організмів лежить
клітина («Мікроскопичні дослідження щодо
відповідності в структурі та рості тварин і рослин»).
 М.Шлейден та Т.Шванн
•Всі тваринні та рослинні організми, усі їх
частини мають клітинну будову.
•Клітини різних організмів подібні: мають
ядро, протоплазму та оболонку.
•Клітини утворюються шляхом
Малюнок з книги
структуралізації позаклітинної рідини
(цитобластеми) навколо ядра (цитобласта). Т.Шванна
 Відкриття протесу поділу клітин
1832-1835рр. – Б. Дюмортьє та Г. Моль описують поділ
клітин нитчастих водоростей.
1840р. – Ф.Унгер описує поділ клітин камбіальних клітин
під час росту деревини.
1848-1861рр. В.Гофмейстер бачить окремі стадії
мітотичного поділу.

Телофаза та анафаза у
клітинах тичинкової нитки
традесканції. Праворуч –
малюнок В. Гофмейстера
(1849р.).
1855р. - Р.Вірхов у статті «Целюлярна патологія»
формулює тезу «Omnis cellula e cellula» (кожна клітина
від клітини).
У 1858р. виходить книга «Целюлярна патологія», яка
одразу була перекладена на декілька мов та незабаром
перевидана
 Сучасна клітинна теорія.

1.Клітина - елементарна одиниця живого.

2.Клітини різних організмів гомологічні за своєю будовою.

3.Розмноження клітин відбувається шляхом поділу.

4.Багатоклітинні організми є складними ансамблями клітин,

об’єднані у цілісні, інтегровані системи тканин та органів,
підпорядкованих та пов’язаних між собою міжклітинними,
гуморальними та нервовими формами регуляції.
 Вивчення процесу поділу клітин

1872р. – Е.Руссов описує

хромосоми у метафазі та
анафазі мітотичного поділу у
хвощів.

1873р. – А.Шнейдер описує фази поділу зиготи турбелярії

Mesostomum :
1874р. – І.Д. Чистяков
описує поділ клітин
плауна та хвоща і
заперечує прямий поділ
ядерця та ядра.
1875р. – Детальний опис процесів
мітозу Е.Страсбургером (спірогіра,
пилок цибулі, плаун), О.Бючлі (круглі
черви, моллюски, комахи),
В.Майзелем (жаба, ссавці).

Поділ клітини за
Е. Страсбургером
 Поділ клітин за П.І.Перемежко
(ліворуч) та за В.Флеммінгом
(праворуч).

1878р. – роботи В.Шлейхера (опис

хромосом, введення терміну
“каріокінез”), П.І.Перемєжко (поділ
клітин епідермісу хвоста тритона),
В.Флеммінга (клітини личинки
саламандри, введення терміну “мітоз”).
1883-1884рр. – Е.ван Бенеден та
Е.Гейзер описують розщеплення
хромосом.
Кін. XIX-поч. ХХ ст. - опис органел клітини

1857р. – А.фон Келлікер (ліворуч) вперше

побачив зернистість у м’язовій клітині.
1886р. Р.Альтман описує “біобласт”
який вважає елементарною одиницекю
клітинної активності.
1898р. К.Бенда вводить термін
“мітохондрія”.

1876р. – В.Флеммінг описує клітинний центр.

1880р. – О.В. Баранецький описує спиральну
будову хромосом.

1889р. – Р. Альтман вводить термін “нуклеїнова

кислота”
1894р. – Ф. Нісль описує
“тигроїд” (ЕПС). Лише у 1945 р. 1898р. – К.Гольджі
завдяки дослідженням описує комплекс
К.Портера, А.Клауде та Гольджі.
Е.Ф.Фуллама з’ясовується, що
тигроїд – форма ЕПС.
 З історії вивчення ембріології

1651р. – «Дослідження про

зародження тварин».
Формулювання теорії
епігенеза.
У.Гарвей: Все з яйця!

Уільям Гарвей
 З історії вивчення ембріології
1668 – Де Грааф описує сім’яні
канальці.
1672 – Де Грааф описує
структуру, яку незабаром було
названо на його честь “Граафів
пухирець”. Сам де Грааф
Р. де Грааф вважав, що відкрив яйце ссавця.
(1641-1673)

Малюнки з книги
Р.деГраафа «De
Mulierum Organis
Generationi
Inservientibus»
1672р.
 Концепції розвитку зародка

епігенезіс
преформізм або 1651р. – У.Гарвей: “все з
еволюція яйця”

1759р. К.Ф.Вольф у книзі

«Theoria generationis»
обгрунтовує теорію
епігенезу
анімалькулізм овізм
Ш.Бонне (партеногенез у
А.ван Левенгук, попелиць),
Н.Хартсекер, А.Галлер (спостереження за
М.Мальпиги, вольвоксом),
Г.В. Лейбниц Я. Сваммердам (метаморфоз у
метеликів)
К.Ф. Вольф
Малюнок К.Вольфа
з книги «Теорія
генерацій»
 1817-1818рр. Х.Г. Пандер вивчає
стадії розвитку пташиного
зародка, описує зародкові листки.

1827р. – К.Бер описує

яйцеклітину (точніше Ембріон птаха за
ооцит) у зародковому Х.Г. Пандером
Х.Г. Пандер горбику.
1828 – К.Бер описує Зріз через ембріон
нейруляцію. хребетного за К.Бером

У книзі “Історія розвитку

тварин” (1828-1837)
К.Бер розповсюджує
теорію зародкових
листків на усіх хребетних
та формулює закон
К.Е. фон Бер зародкової подібності.
 1777-1780рр. Л.Спалланцані проводить штучне
запліднення ікри жаби та ропухи, показав, що
сперма, позбавлена сперматозоїдів, не запліднює
ікру, однак вирішив, що запліднюючий вплив
створює певна фракція сперми.
1824р. – Ж.Прево та Ж.Дюма встановлюють
відсутність сперміїв у старих та
нестатевозрілих тварин.
Ладзаро 1841р. – К.Лаллеман та М.Пєльт’є вивчають
Спалланцані походження сперматозоїдів у різних тварин.
1842-1847рр. – теорія спонтанной овуляції Ф.А.Пуше
1840рр. – Контактно-каталітична теорія запліднення
(А.Келлікер та Т.Бішоф).
1843-1852рр. – М.Беррі та Дж.Ньюпорт описують
проникнення сперматозоїда у яйцеклітину кроля та аскариди.
1854-1855рр. – Ф.Кебер, Р.Вагнер та Г.Мейснер обгрунтовують
теорію проникнення спермія до яйця.
 Відкриття мейозу
1876р. - О.Гертвіг
описав мейоз та разом
з Р.Гертвігом описує
запліднення у
морського їжака
1881р. - О.Гертвіг
та Р.Гертвіг
створюють
целомічну теорію
Оскар Гертвіг 1883р. - Е. ван Бенеден
Ріхард Гертвіг
описує зміни хромосом
під час мейозу у аскариди.
1905р. - Й.Б.Фармер і
Й.Б.Мур запропонували
термін «мейоз»
 Становлення
порівняльної та
еволюційної ембріології

О.О.Ковалевський Початкові етапи І.І.Мечніков

розвитку ланцетніка (за
Ковалевским)
1865-1876рр. – О.О.Ковалевський досліджує розвиток ланцет-
ника та асцидій.

1871рр. – О.О.Ковалевський обггрунтовує твердження про

гомологію зародкових листків безхребетних та хребетних
(«Ембріологічні дослідження червів та членистоногих»).
 1874р. – Е.Геккель використовує
дані О.О.Ковалевського для
створення теорії гастреї.

1876р. – І.І.Мечніков обгрунтовує

теорію паренхімелли
(фагоцителли)

1882р. – І.І.Мечніков відкриває

явище фагоцитозу.

Етапи розвитку асцидії

(за Ковалевским)
 Мікроанатомічні, цитологічні та гістологічні
дослідження у Київському університеті

1868 р. – у медичному факультеті Київського

університету Св.Володимира організовано
кафедру гістології, ембріології та порівняльної
анатомії, першим завідувачем якої було
призначено П.І.Перемежко.
П.І.Перемежко
П.І.Перемежко автор досліджень з мікроанатомії м’язової тканини
(1863р., описано міосателіти), дослідження мітотичного поділу
епітеліальних клітин (1878р.), також працював над вивченням
гемопоеза, будови кровотворних органів та залоз внутрішньої секреції.
Брав участь у написанні першого вітчизняного підручника з гістології
(1888р.). П.І.Перемежко – засновник київської школи гістологів
(В.І.Судакевич, С.Колачевський и В.Баковецкий тощо). Серед учнів
П.І.Перемежко і його наступники Я.М. Якимович и Ф.І. Ломінський.
 В.О.Бец – завідувач кафедри анатомії, автор
численних робіт з гістології центральної
нервової системи, основоположник вчення
про цитоархітектоніку кори великих півкуль
головного мозку, 1873р. вперше описав
гігантські пірамідні нейрони (клітини Беца).

В.О.Бец
Клітини
Беца

Київ, Видубецький монастир. Нагробок

В.О.Беца: «Основоположнику изучения
центральной нервной системы, профессору
анатомии Киевского университета Владимиру
Алексеевичу Бецу 1834-1894 гг. Признательные
украинские морфологи»
 Н.А.Хржонщевський (1836-1906) – перший професор та
завідувач кафедрою загальної патології. Автор низки праць з
анатомії та гістології легеневих альвеол, нирок, печінки,
кровоносних та лімфатичних судин, нервів. Автор методу
ін’єкції барвників.
В.В.Підвисоцький – учень
Н.А.Хржонщевського та П.І.Перемежко.
Автор гістологічних досліджень
підшлункової залози, печінки
В.В.Підвисоцький

С.Г.Навашин – цитолог і ембріолог рослин,

професор Київського університету. У 1898р.
відкрив подвійне запліднення у рослин.
Засновник вчення про морфологію хромосом та
каріосистематику.
С.Г.Навашин
 І.І.Шмальгаузен – біолог-еволюціоніст,
завідувач кафедри експериментальної
зоології (експериментальна ембріологія та
порівняльна анатомія). Вивчав проблеми
росту, процеси формотворення у
еволюційному розвитку, розробник вчення
про кореляції та їх еволюційну роль.
І.І.Шмальгаузен
1934р. на біологічному факультеті Київського
університету відновлено кафедру анатомії ,
гістології та ембріології . Завідувачем кафедри (з
1934р. по 1941р.) став професор О.А.Івакін. Він
автор численних робіт з експериментальної
морфології, анатомії, гістології,
трансплантації. Автор ряду підручників, в тому
числі і перший підручник з анатомії людини з
елементами гістології та ембріології
О.А.Івакін українською мовою.
 Завідувачі кафедрою цитології, гістології та біології
розвитку у новітній період

Б.Г.Новіков В.М.Гордієнко М.Е.Дзержинський

(зав. кафедрою з (зав. кафедрою з (зав. кафедрою з
1944р. по 1981р.) 1981р. по 1997р.) 1997р.)

З 1955р. на кафедрі читається курс теорії еволюції; з 1963р –

цитології.
Мікроскопічні
методи
дослідження
 Мікроскопічні методи цитологічних досліджень

Світлова Електронна
мікроскопія мікроскопія

Метод світлого поля Трансмісійна

(просвічуюча)
Конфокальна мікроскопія
Метод темного поля мікроскопія
Фазово-контрастна Растрова
мікроскопія (скануюча)
мікроскопія
Інтерференційна
мікроскопія Скануюча силова
Поляризаційна мікроскопія
мікроскопія Близько-
Тунельна Атомна силова польна
Флуоресцентна мікроскопія мікроскопія оптична
мікроскопія мікроскопія
 Будова світлового мікроскопа
ОПТИЧНА СИСТЕМА МЕХАНІЧНА
СИСТЕМА
окуляр
бінокулярна
лінзи бінокулярної насадка, тубуси
насадки та тубусів штатив
предметний
об’єктив столик з
препаратоводієм
макрогвинт
конденсор,
ірисова гвинт
діафрагма, конденсора
фільтри мікрогвинт
джерело світла основа
 основа та дзеркальце

тубус без окуляра

 предметний
столик з
препаратоводієм

предметний
столик
револьверна голівка
з об’єктивами

макро та мікрогвинти
 макрогвинт
макрогвинт та
мікрогвинт
 конденсор і
діафрагма

предметний столік
(знизу), конденсор,
ніжки станіни
дзеркальце, конденсор
 Аберації оптичної системи
Монохроматичні Хроматичні

Монохроматичні аберації – притаманні монохромним

пучкам променів

Сферична аберація – крапка

передається у вигляді плями
розсіювання. Як результат,
знижується контрасність
зображення.

Астигматизм – крапка передається у

вигляді плями розсіювання
еліпсовидної форми
Кома (коматична аберація) – чіткість
зображення знижується від центру
до границі поля зору внаслідок
порушення симетрії світлового
пучка. У зображенні крапки
спостерігається однобічна
деформація

Кривизна поля зображення – не дозволяє

одночасно бачити чітко центр та
краї поля зору.
 «подушка» ідеальне «бочка»
зображення

Дисторсія – виникає, якщо порушується подібність між

об’єктом та його зображенням з-за того, що лінійне
збільшення у центрі та на краях поля зору різне.
 Хроматичні аберації – виникають, коли зображення,
створене промінням однієї довжини хвилі не співпадає з
зображенням, створеним хвилямі з іншою довжиною.

До хроматичних
аберацій належать
хроматизм положення,
хроматизм збільшення
та хроматичні різниці
геометричних аберацій

Хроматизм положення – зображення різних кольорів

розташовується на неоднаковій відстані від оптичної системи
(виникають кольорові облямівки).
Хроматизм збільшення – зображення різних кольорів хоча й
знаходяться в одній площині, але мають різні розміри.
Приклад складних
фігур розсіювання
при хроматичних
абераціях
Приклади зображень з хроматичними абераціями
Хроматизм
положення (1) та
його корекція за
допомогою
ахроматичної лінзи
(2)
 Типи оптики:

•Анастигматична оптика – без астигматизму

•Апланатична оптика – без коми та сферичної аберації

•Ортоскопічна оптика – без дисторсії

Звичайна двовипукла лінза

Об’єктив типу апланат

Об’єктив типу анастигмат

 Класифікація об’єктивів за
типом оптичної корекції:

•Ахромати– виправлена сферична аберація, кома та

хроматизм положення для двох довжин хвиль.

•Апохромати (АПО, APO)– виправлена сферична аберація,

кома, астигматизм, хроматизм положення для 3-х довжин

хвиль.
•Планахромати та планапохромати (ПЛАН, Plan, PL)– пласке

поле зору (тобто подолано кривизну поля зору), що важливо

під час фотозйомки. Решта – як у ахроматов чи апохроматов.

 Апохромат

Планапохромат Стігмахромат
Стігмахромати (СХ) – тип планооб’єктивів. Оскільки стандартні
планапохромати є дорогими, у робочих мікроскопах використовують
так звані «економічні об’єктиви». Це об’єктиви з поліпшеною якістю
зображення по полю: стігмахромати (ЛОМО), ахростігмати (LEICA),
СР-ахромати и ахроплани (CARL ZEISS).
Семіпланати (Semi-Plan, SP) – об’єктиви, подібні до ахроматів в яких
зменшена, але не повністю виправлена кривизна поля зору.
Планахромати
різних збільшень
(маркування:
«PL», «Plan»)
 Ахромат (немає додаткових позначень)

орієнтовне
збільшення Числова
(60-80х) апертура
(А)
Збільшення,
крат
Штатна
Штатна товщина
довжина покривного
тубуса (мм) скла (мм)

Позначення на об’єктиві (стандарт ISO)

Визначення орієнтовного
збільшення за
кольоровими смужками

чорний – 1х-1,25х
сірий – 1,6х-2,0х
коричневий – 2,5х-3,2х
червоний – 4х-5х
жовтогарячий – 6,3х-8,0х
жовтий – 10х-12,5х
світло-зелений – 16х-20х
темно-зелений – 25х-32х
блакитний – 40х-50х
синій – 60х-80х
білий – 100х-160х
 Імерсійні об’єктиви

1678р. – Р.Гук висуває ідею імерсійної мікроскопії

1840р. – Д.Б.Амічі виготовив перші імерсійні об’єктиви

1867р. – Е.Гундлах конструює перший об’єктив для

гліцеринової імерсії

1872р. – К.Цейс запроваджує у виробницьтво водноімерсійні

об’єктиви Е.Аббе.

1872р. – К.Цейс запроваджує у виробницьтво масляноімерсійні

об’єктиви Е.Аббе.
Кольорова смужка, що
вказує на орієнтовне
збільшення.
Кольорова смужка, що
вказує на тип імерсії

без кольору – суха система

чорний – масляна імерсія (МИ,
Oil)
білий – водна імерсія (ВИ, W)
жовтогарячий – гліцеринова
імерсія (ГИ/Glys)
червоний – інший тип імерсії
Кольорова маркування всього напису
на об’єктиві.

чорний – базовий світлопольний

об’єктив

зелений – фазові об’єктиви

червоний – поляризаційні об’єктиви

Позначення на об’єктиві: маркування типу оптичної корекції
«Achr» (Achromat) – ахроматичний об’єктив

«Аpo» (Аpochromat) АПО (АРО) - апохроматичний об’єктив

Microfluar, Neofluar, NPL, Fluotar СФ , М-ФЛЮАР -

напівапохромати (мікрофлюари) об’єктиви з проміжними
характеристиками.

"Plan-Neofluar" система лінз виправляє викривлення площини та

хроматичні аберації.

ПЛАН-АПО, Plan-Apo, ПЛАН, PL, Plan, Plan-Achr, Achroplan –

планоб’єктиви (відповідно планапохромати та планахромати)

СХ – стігмахромат

CP-achromat , «Achrostigmat» - поліпшений ахромат, полуплан

Позначення на об’єктиві: додаткові літерні маркування, що
вказують на спеціальні методи дослідження

Ф (Рh2) – фазовий (цифра відповідає маркуванню на спеціальному

конденсорі чи вкладишу

П (Pol) – поляризаційна мікроскопія

Л (L) – люмінісцентна мікроскопія

ФЛ (PhL) – фазово-люмінісцентна мікроскопія

ЭПИ (Epi, HD) – епіоб’єктив для роботи у відбитому світлі за методом

темного поля

ДИК (DIC) – диференціально-інтерференціонний контраст

Окуляри Гюйгенса застосовуються з ахроматами малих та
середніх збільшень, планахроматами малих збільшень.
Належать до двох підтипів: окуляр Гюйгенса та окуляр
Рамсдена.

Окуляр Гюйгенса. Дійсне збільшене

зображення у окулярі Гюйгенса
розміщується між його лінзами у
площині діафрагми окуляра і
розглядається як у лупу за допомогою
верхнього скла.

Окуляр Рамсдена. Весь цілком діє як лупа, і у

ньому зображення препарату, яке дає
об’єктив знаходиться під окуляром.
Різновидами окулярів Гюйгенса є ортоскопічні та
компланатичні окуляри різних фірм.
Компенсаційні окуляри
застосовуються з різними
апохроматичними
об’єктивами, з
ахроматичними
об’єктивами великих
збільшень та з
планахроматичними
об’єктивами середніх та
сильних збільшень.
Гомалі – спеціалізовані об’єктиви для
фотонасадок. Виправляють кривизну
поля зору (не використовуються разом з
планахроматами).
 Основні характеристики мікроскопа
Загальне збільшення (V) мікроскопа знаходять як результат
множення збільшення об’єктива на збільшення окуляра та,
(якщо мікроскоп бінокулярний) на збільшення бінокулярної
насадки.

V= Vоб× Vок× Vбн

Числова (або нумерична) апертура (А) мікроскопа визначає
здатність оптичної системи сприймати більшу чи меншу
кількість світла.
Числова
апертура
A= n × sina (А)
N - показник заломлення середовища між фронтальною лінзою
об’єктива та покрівним склом.
Nповітря = 1 (Апертура якісного сухого об’єктива – 0,95)
Nводи= 1,33
N74%гліцерину= 1,43
Nкедрової олії= 1,515 (Апертура масляно-імерсійного об’єктива – 1,4)
Nвазелинової олії = 1,5 (для УФ-мікроскопії)
Nмонобромнафтоліну = 1,66 (для мікроскопії у відбитому світлі)
 Синус половинного кута вхідного отвору об’єктиву: sina

Якщо n=1 (повітря);

a=90, то
sin90=1; A=1.
Якщо n=1 (повітря);
a=40, то
sin40=0,64; A=0,64.
A якісного сухого об’єктива = 0,95
Принцип Кьолера. Конденсор також має апертуру. При
налаштуванні мікроскопічної системи бажано, щоб
апертрура конденсора дорівнювала апертурі об’єктива:

Aоб.= Аконд.
Якщо виконується умова:

Aоб.= Аконд. 1
То рекомендовано використовувати
повну імерсію.

Освітлювальний пристрій Е.Аббе 1872р.

 Обмежені розміри
оптичної системи
мікроскопа та те, що
світло зазнає дифракції у
неоднорідному середовищі
– одна з причин поганого
зображення об’єкту.
Зображення крапки –
світле коло, оточене
світлими та темними
смугами
 Роздільна
здатність
мікроскопа.

Роздільна здатність мікроскопа – це найменша відстань між

двома точками, при якій ці дві точки у мікроскопі будуть
виглядати як два окремих об’єкти.
Роздільна здатність самосвітніх точок обраховується за
формулою:
d = 0,61 l = 0,61 l
n sin a А
l
або, наближено: d≈ 2
 Деякі спеціальні випадки розрахунку
роздільної здатності мікроскопа.
Роздільна здатність для несамосвітніх точок:

d= l = l
n sin a А

Роздільна здатність для конфокального мікроскопа:

l l
d = 0,44 = 0,44
n sina А
Довжина (l) та амплітуда
(А) світлової хвилі
Для електронної мікроскопії:
h
l= або
mV
де h – стала М.Планка, m - маса електрона, V – швидкість,
 - різниця потенціалів.
 Вплинути на довжину світлової хвилі можна
завдяки використанню світлофільтрів.

Нейтральні світлофільтри – знижують інтенсивність світла

Матові світлофільтри – усувають нерівномірність освітлення поля

зору.
Селективні (кольорові) світлофільтри – додають контрастності
Додаткові кольори:
чистий червоний+синьо-зелений = білий
чистий синій + жовтий = білий
чистий зелений + пурпурний = білий
Додаткові функції селективних світлофільтрів:
зелений: при фотографуванні (посилення контрасту), фазово-
контрастній мікроскопії
світло-синій – електричне світло схоже на денне (- жовті та червоні
промені)
 Корисне збільшення мікроскопічної системи.

Vкорисне = 1000 × А
при більшому збільшенні знижується рівень освітленості
препарата

Якщо об’єктив 90×, апертура А=1,35

Vкорисне = 1000 × 1,35 = 1350×

Vок = 1350/90 = 15×

 Глибина різкозті (глибина чітко зображуваного простору).

Боке (від яп. ボケ (写真) боке — «нечіткість») – художній

прийом створення нечіткості фонових деталей зображення
Глибина різкозті (глибина чітко зображуваного простору).

1000 l
T = +
7AV 2A2

Де:
Т - глибина чітко зображуваного простору (мкм)
V – збільшення (крат)
А – нумерична апертура
l - довжина світлової хвилі (мкм)

Якщо V=1350, А=1,3 , то Т= ?

Т= 0,24 мкм
 Деякі характеристики світлової хвилі
Довжина та амплітуда

Кольорові, амплітудні прозорі

та непрозорі об’єкти

Фаза
коливань Фазові об’єкти

Площина поляризації

Ізотропні та анізотропні об’єкти

 Деякі методи мікроскопії

Поляризаційна
Метод темного мікроскопія
поля

Метод фазового
контрасту

Інтерференційна
мікроскопія

Мікроскопія
забарвлених об’єктів
 Мікроскопія у темному полі або ультрамікроскопія
виклористовує явище, відому як ефект Тиндаля

Мінімальні розміри часток, видимих у при темнопольній

мікроскопії залежать від освітлення і можуть досягати 2нм
(зазвичай 100-200нм).

За дифракційними плямами неможливо визначити істинні

розміри, форму, структуру часток, проте можна визначити
наявність, концентрацію та рух часток.

Для темнопольного методу рекомендовано застосовувати

ахромати 8, 20, 40 крат та спеціальну імерсію для темного
поля
 Ефект Тиндаля

Дрібний об’єкт у
світлі, що проходить є
невидимим

Дрібний об’єкт у
відбитому світлі, стає
видимим
Темнопольний мікроскоп запропонували Р.Зігмонді та
діафрагма Р.Зідентопф у 1903р.
Зігмонді

параболоїд-конденсор Зідентопфа
або кардіоїд-конденсор
 Темнопольна мікроскопія

звичайна світлова мікроскопія

конденсор
забезпечує
бічне
освітлення
препарату

діафрагма темнопольна мікроскопія

Зігмонді (вид
згори)
 Поляризаційна мікроскопія

Анізотропія – неоднаковість фізико-

хімічних властивостей середовища
у різних напрямах в середині цього
середовища. Причиною
анізотропності є те, що при
впорядкованому розтащуванні
атомів, молекул чи йонів сили
взаимодії між ними и міжатомні
відстані виявляються неоднаковими
у разних напрямках.
Ізотропія – однаковість
Зміна світлового потоку властивостей середовища у всіх
в залежності від напрямках.
взаємного розташування
двох поляризаторів
Частина світла у оточуючому світі поляризована. Так частково
поляризовано світло, що йде від хмар та неба. Застосовуючи
поляризатор при фотографуванні можна добитися зміни яскравості
та контрасту різних частин зображення. Так результатом зйомки
пейзажу у сонячний день є темне, насичено синє небо. Максимальний
ефект досягається при зйомці у напрямку перпендикулярному напрямку
на сонце.
джерело ізотропний
світла об’єкт
світло не
проходить
крізь
аналізатор
неполяри-
зоване поляризатор

об’єктив
аналізатор з
світло з дозволеною
дозволеною
площиною площиною
поляризації поляризації
звичайний
промінь не
проходить
крізь
аналізатор,
надзвичайний -
неполяри- анізотропний проходить
зоване світло об’єкт
 Поляризаційна мікроскопія

аналізатор
звичайна світлова
мікроскопія

поляризатор

поляризаційна
мікроскопія
 Дослідження фазових об’єктів
Інтерференційний мікроскоп

1
перший промінь проходить
повз об’єкт, другий - через
об’єкт, що досліджується
Якщо об’єкт
не є фазовим,
Варіант 1. при
2 інтерференції
Дослідження
променів
НЕфазового
амплітуда
об’єкта
збільшується
 Дослідження фазових об’єктів
Інтерференційний мікроскоп

1
перший промінь проходить
повз об’єкт, другий - через
об’єкт, що досліджується
Якщо об’єкт
є фазовим,
Варіант 2. при
2 інтерференції
Дослідження
променів
фазового
амплітуда
об’єкта
зменшується
 Інтерференційний мікроскоп

rS Формула О.О.Лєбєдєва
Р = (1932р.) дозволяє
100 a визначити масу речовини

Р – маса речовини (г); r – величина

фазового ссуву (см), S – площа об’єкта
(см2), a - константа (для білків – 0,0018).

В інтерференційному мікроскопі
навколо коацерватних крапель
видно інтерференційні кільця
(за Т. Н. Євреіновою).
 Дослідження фазових об’єктів
Фазово-контрастна мікроскопія

1 – конденсорне кільце
2 – площина об’єкта
3 – фазова платівка
4 – первинне зображення

фазова платівка у вигляді кільця

поглинає частину світла та ссуває фазу
на π/2 (назад) відносно незбурених
променів. Об’єкт виглядає світлим на
темному тлі (негативний фазовий
контраст). При позитивному фазовому
контрасті – випередження по фазі.
 Клітина епітелію курчати у фазово-
контрастному мікроскопі

Ф.Зерніке,
сконструював
фазово-
контрастний
мікроскоп, 1953р.
отримав
Нобелівську
премію
 Дослідження фазових об’єктів
Фазово-контрастна мікроскопія

фазова
пластинка

звичайна світлова мікроскопія

кільцева
діафрагма

Зсуви по фазі світлових

хвиль перетворюються фазово-контрастна мікроскопія
у зміни амплітуди
 Дослідження фазових об’єктів
Диференційна інтерференційно-контрастна мікроскопія
(мікроскопія Номарського, DIC)
 Дослідження фазових об’єктів

Дифференциальная интерференционно-контрастная
микроскопия (мікроскопія Номарського, DIC)

Шлях променів у мікроскопі Номарського (DIC)

Фазово-контрастне зображення діатомових водоростей
(ліворуч) та DIC-зображення (праворуч). Відсутнє
дифракційне гало.
Харова водорость Micrasterias furcata у DIC мікроскопі
Світле поле

Метод фазового контрасту

Інтерференційна
мікроскопія

Темне поле
 Світле поле Темне поле

Поляризаційна мікроскопія Метод фазового контрасту

Мікроскопи
порівняння
Схема бінокулярної насадки
Бінокулярні
лабораторні
мікроскопи
Інвертований
мікроскоп
Методи фарбування клітин
 Деякі природні барвники жовтого кольору

Жовтий барвник
Резеда (лютеолин)
виготовляють з
листя, стебла та
Reseda luteola
насіння резеди
Quercus tinctiria
Кверцитрон (кверцитин) міститься у
корі дуба. Обидва жовті
барвникисхожі за будовою та
належать до групи флавоноїдів
Виявлення Helicobacter pylori (синій колір) та ГАГ у
тканинах шлунку (толуідиновий синій та альциановий
жовтий).
 Фарба Сафлор
Пелюстки
(картамін)
висушують

Carthamus tinctorius
(Сафлор фарбуючий)

…отримують 25г Шафрану

(кроцетину)
З 4000 приймочок
шафрану (Crocus sativus)...
Не тільки рослиини можуть бути джерелом отримання
барвників

Кермесовий червець (Coccus ilicis), …є джерелом барвнику

що вражає кермесовий дуб... Кермесу (шкарлат)

1 кг кошенілі ...200 000 особин карміноносного червеця

отримують з ... (Coccus cacti)
 Глікоген (1) у
гепатоцитах
аксолотля.
Фарбування карміном
та гематоксиліном.

Виявлення ГАГ (від рожево-червоні)

при фарбуванні муцикарміном
Корені Rubia tinctoria, були
джерелом алізаріна (марени) -
барвника популярного серед
військових 17-19ст.

Д.Кіріко
“Автопорт-
рет”
Молюск Murex brandaris - природнє
джерело Тирського пурпуру

М.М.Ге “Що є
істина?”

З листя Indigofera tinctoria

виготовляли барвник Індіго або
Вайда
Ендоскпія шлунка. Забарвлення індігокарміном дозволяє
виявити ділянки дисплазії.
В.Г.Перкін, у 1856р.
Вперше знайшов
спосіб отримання
синтетичного
барвника (мовеїна).
Видимий спектр - лише невелика частка
електромагнітного випромінювання, з
довжиною хвилі близько 400-700нм

Біле світло - суміш усіх хвиль видимої

довжини. Поглинання деяких хвиль
об’єктом надає йому кольору
Хромоген - сполука, що містить ненасичені зв’язки. Проте
сам він не здатний забарвлювати.

Орто- і парахіноїдні кільця, нітрогрупи, послідовні подвійні

зв’язки можуть виступати як хромогени

–C=C– –C=N– –C=O– –N=N–

Ще декілька варіантів хромогенів
 Хромофори - солеутворюючі сполуки, при введенні яких до
складу барвника, він набуває забарвлюючих властивостей.

-NH2 -N(CH3)2 -NO2 -COOH -HSO3

Декілька прикладів хромофорів та барвників

Суміш цих
двох сполук - Бісмарк коричневий
фуксин

Фуксія
Ауксохроми - (від ауксо- посилювати та хромос - колір)
сполуки, які посилюють властивості хромогенів до
поглинання світла певної довжини.
–NH3 –COOH –HSO3 –OH

Нафталин - незабарвлена сполука

Додавання хромофорів (двох нитрогруп)

призводить до утворення сполуки, яка
забарвлена у блідожовтий колір

При додавання ауксохрому -ОН колір стає

більш глибоким, насиченим, хоча сам по собі
нафтол - також незабарвлений
Гомологи. Додавання різних ауксохромний груп до барвника
призводить до утворення гомологів, колір яких може значно
відрізнятися.

Порарозанілін Метиленовий
(червоний) зелений

Метилвіолет
(червоно-
пурпурний) Кристалвіолет
(пурпурно-синій)
Бактерії - збудники сибірської виразки. Фарбування за
Грамом (у цьому методі препарат фарбується
розчином метилового фіолетового).
Desulfovibrio desulfuricans. Форбування кристалвіолетом
Клітини наднирника миші. Форбування метиленовим
зеленим та тіоніном
 Фізико-хімічна класифікація барвників

Неполярні або Ліпофільні

Полярні індеферентні (гідрофобні,
Судан Б, Судан Ж неполярні)
структури

Кислотні Основні Нейтральні Нейтральні

Конго Барвник Май- фарбуючі суміші
Бісмарк
червоний, коричневий, Грюнвальда Триацидна суміш
еозин, метиленовий (еозиновокислий (метиленовий зелений,
пікринова синій, фуксин, метиленовий кислий фуксин, оранж)
кислота, метиленовий синій)
кислий
зелений
фуксин

ацидофільні Базофільні
(оксифільні) структури
структури
 Гематоксилін Гематеин

Гематоксилін виробляється з
витяжки з серцевини
кампешевого дерева Комплекси гематеїну з
(Haemotoxilon campechiancum) хромом та алюмінієм
Поперечнопосмуговані м’язи. Фарбування
гематоксиліном.
 Ще декілька груп барвників

Ксантенові:

Еозин В Еозин Y (власне еозин)

Флуоресцеїн Бенгальський рожевий

 Еос з тілом
Мемнона.
V ст. до н. е
Перехідний епітелій сечового міхура.
Форбування гематоксиліном та еозином.
Сафраніни: Фенотіазини:

Наприклад, Наприклад,
мовеїн: метиленовий синій:
Клітини
печінки,
забарвлені
сафраніном та
осмієвою
кислотою

Сафранін О
Мазок крові
собаки з
паразитарним
гельмінтом
Dirofylaria.
Фарбування
метиленовим
синім.
Азобарвники:

Наприклад: Конго червоний

Похідні
фенолу:

Наприклад: Пікринова
кислота
Медулярний рак щитовидної залози. Забарвлення конго
червоним
Кістка, забарвлена тіоніном та пікриновою кислотою
 Неполярні або індеферентні барвники

Судан чорний B Судан IV

Різні типи хлорофілів

також можуть бути
використані в якості
барвників
Перинеальна залоза
крота. Забарвлення
суданом чорним.
Краплі жиру у
адипоцитах.
Забарвлення суданом ІV.
 Види забарвлення:

Субстантивне Аджективне
(пряме) (непряме,
протравне)

Типи забарвлення:

Прогресивне Регресивне
Cф Прогесивне фарбування
Cmax

Copt

Cmin
t opt t opt t

Cф Регесивне фарбування
Cmax

Copt

Cmin
t opt t opt t
 Метахромазія

Ортохрооматичне
забарвлення Метахрооматичне
забарвлення

Зміна спектрів
поглинання
барвників при
метахромазії
 Отро- та метахромазія при зфарбуванні крові
барвником Май-Грюнвальда

Базофіл забарвлено Нейтрофіл та еозинофіл

метахроматично забарвлено ортохроматично
 Прижиттєве дослідження структур. Вітальні барвники

Виявлення
Виявлення тучних мітохондрій
клітин (нейтральний (янус зелений)
червоний)
Мазок крові
кота з анемією
Хейнца.
Вітальне
забарвлення
метиленовим
синім.
Прижиттєве дослідження структур. Цейтраферна зйомка

Дроблення зиготи морського їжака

(фазово-контрасна мікроскопія)
Мітоз
 Виготовлення постійних препаратів
для світлової мікроскопії

1) Взяття матеріалу.
2) Фіксація (фізична: нагрівання, висушування, тощо; хімічна: формалін,
метиловий спирт, глютаральдегід та деякі інші речовини) .
3) Зневоднення (спиртами: 70º→80º→90º →96º→100º→ксилол) і
заливка в парафін.
4) Виготовлення зрізів за допомогою мікротома.
5) Депарафінування (бензолом або ксилолом) та гідратація
(спиртами: 96º→90º→80º→70º) зрізів.
6) Фарбування зрізів.
7) Зневоднення зрізів (спиртами: 70º→80º→90º→96º→ксилол) та
заключення їх у бальзам.
 Виготовлення постійних препаратів для світлової мікроскопії
←Гідрофільне середовище Гідрофобне середовище→
Фіксація→H2O→70º→80º→90º→96º→ксилол→ К/П → парафін

Заморожені
зрізи, вібротомні
зрізи

Фарбування→H2O→70º→80º→90º→96º→ксилол→ бальзам (DPX)

Гідрофільне середовище
 Методи фарбування зрізів

Оглядові Спеціальні
(дозволяють виявляти різні
(дозволяють побачити
загальну будову препарата) специфічні структури у препараті,
наприклад, органели клітини)
 Методи фарбування зрізів

Оглядові
(дозволяють побачити
загальну будову препарата)
Спеціальні
(дозволяють виявляти різні
специфічні структури у препараті,
наприклад, органели клітини)

Цитохімічні (гістохімічні)
(дозволяють виявляти різні
хімічні речовини у клітинах)

Імуноцитохімічні (імуногістохімічні)
(дозволяють специфічно виявляти
окремі речовини у клітинах)
 ИЧ-промені розсіюються менше, ніж
Інфрачервона мікроскопія видимі, Непрозорі об’єкти, яякі
важко чи неможливо розглядати у
видимому світлі, можна зробити
видимими у ІЧ діапазоні (більше
700нм) за допомогою електронно-
оптичного перетворювача (ІЧ-
насадка).
Метод застосовується
у с/г для виявлення
пошкоджень насіння
(виявляється хітинові
покриви, гіфи грибів,
ИЧ-мікроскоп спори тощо).
Digilab UMA-400
ИЧ-мікроскоп
МИК15.
 Ультрафіолетова мікроскопія
Сучасний
Ультрафіолето-
вий мікроскоп
UVM-1 →

←Royal
Raymond Rife та
його УФ-
мікроскоп, 1912-
1920р.

Зображення в УФ-мікроскопі може бути візуалізоване за

допомогою фотографування або проектування на
люмінісцентний екран.
 Флюоресцентна (люмінісцентна) мікроскопія
Люмінесценція — нетеплове
світіння речовини, що
відбувається після поглинання
нею енергії збудження
(холодне світло).
Фотолюмінесценція —
світіння під дією світла
(видимого та УФ). Воно
поділяється на
флюоресценцію
Флюоресценція різних (короткотривале світіння)
мінералов та фосфоресценцію
(довготривале).
Правило Стокса-Ломмеля: Спектр люмінесценції зміщений
відносно спектра поглинання у бік довгих хвиль.
Флюоресцентна мікроскопія

Флюорес-
центні
барвники
Рентгенівска
мікроскопія
Електронна
мікроскопія
 Електронна трансмісійна
(просвічуюча) мікроскопія

Хід променів Електронограма

клітини
Якщо U=100В, то l=12,3нм; якщо U=50000В, то l=0,5нм
 Виготовлення препаратів
для електронної мікроскопії

1) Взяття матеріалу.
2) Фіксація (глютаральдегідом та деякими іншими речовинами).
3) Контрастування (осмієвою кислотою, фосфорно-вольфрамовою
кислотою, уранілацетатом та деякими іншими речовинами).
3) Зневоднення (спиртами: 70º→80º→90º →96º→100º) і заливка в
епоксидні смоли (епон, аралдит).
4) Виготовлення зрізів за допомогою ультрамікротома.
мідна сіточка, вкрита вугільною
й ( або) пластиковою плівкою

зразок у вигляді
тонких серійних зрізів

3 мм
Зображення, отримані за допомогою NeoScope
 3D Томографія (опція)
JEM-1400 Recorder

Visualizer

High Tilt Retainer

Slicer

Composer Movie
Принцип електронної томографії (1)

Electron beam
Thin sample

TEM image

We think the simulated dimension is dropped

from three dimensions to two dimensions.
Принцип електронної томографії (2)

Thin sample Projection Backprojection

(Radon transform) (Inverse radon transform)

TEM System
 Бактерія

100 nm
3D-Реконструкція
 TEM зображення вірусу ВІЛ

3D reconstructed area

200 nm

magnification：x12K

Specimen preparation : Slice section (OsO4 staining)

 TEM зображення вірусу ВІЛ

(x, y, z) = (432 x 360 x 64 nm)

Tilt angle : -65deg. to +65 deg. (1deg.

 TEM зображення актину та
актиніну

Specimen preparation : negative staining by uranium acetate

 TEM зображення актину та
актиніну

(x, y, z) = (212 x 212 x 25 nm)

Tilting angle : -65deg. to +65 deg. (1deg.

 Високовольтна електронна мікроскопія

Р.Г.Паладе у
середині 1950-х
за допомогою Тривимірна реконструкція мітохондрії
електронного
мікроскопа
відкрив
рибосоми.
 Скануюча електронна мікроскопія

1935-1938рр. Створення
скануючого електронного
мікроскопа (Кнолль, фон
Ардене).
 дві поверхні сколу зовнішньої
мембрани ядерної оболонки

ніж

ядро

цитоплазма

крига

Заморожування-
сколювання
 внутрішньомембранна
витравлена частка
крига зовнішні поверхні плазматичної
мембрани й мембранної органели,
виявлені травленням

витравлена
цитоплазма

крига

Заморожуваня-
травлення
 зразок

підгрунтя

тяжкий метал, випаровуючись з нитки,

відтіняє зразок

зверху напилюється зміцнююча плівка вуклецю

репліку наносять на поверхню сильного розчинника,

який розчиняє зразок

репліку промивають і для дослідження розміщують

на мідній сіточці

5
0,2 мкм
2 мкм
Конфокальна скануюча мікроскопія

1955р. - М.Мінскі
створює першу
робочу модель
конфокального
мікроскопа
 Двофотонна лазерна мікроскопія
Два фотона з низькою
енергією (інфрачервоне
світло 700-1000нм)
збуджують одну
молекулу флюорофору,
яка, у своб чергу
випромінює один квант
світла видимої
частини спектра (400-
500нм).

Для створення достатньої інтенсивності інфрачервоного

світла застосовується високочастотний сапфіровий лазер.
Для посилення інтенсивності світла, що випромінюється
флюорофором, використовується фотоелектронний
помножувач. Зображення створюється шляхом скканування
зразка крапка за крапкою.
 Конфокальна скануюча мікроскопія

«Гітара»

«Уютное гнёздышко»
Ломакін А.Ю. «Метелик»
«Фейерверк» (білок CLIP-
170, лінія HeLa)
«На передньому краї»
(цитоскелет)
 «Острівець
безтурботності»
«Клітинина в шоці»
Цейтраферна зйомка поділу клітини
Тунельна скануюча мікроскопія

1981р. - створення першого скануючого

тунельного мікроскопа (Г.Бінніг,
Г.Рохрер).
Атомна силова мікроскопія
1986р. – Г. Бинниг
 Атомна силова мікроскопія.

ДНК

Еритроцити

Нейтрофіли

Фібробласт миші E.coli

 Близькопольна оптична мікроскопія 1982р. – Дітер Поль

БОМ-зонд на основі оптичного волокна

Електромагнітне (ЕМ) поле у ділянці субхвильової діафрагми має складну

структуру .Безпосередньо за отвором (Z < 100 а) розташовується ближня
зона, у якій ЕМ поле існує у вигляді еванесцентних (таких, що не
розповсюджуються) мод, локалізованих поблизу поверхні діафрагми. На
відстанях Z > 100 а (дальня зона) спостерігаються лише випромінювані
моди. Їх потужність при λ = 500 нм та отвором ~ 5 нм складає лише 10-10
від потужності випромінювання, що падає.
Однак, у ближній, зоні внаслідок взаємодії еванесцентних мод зі
зразком, частина енергії ЕМ поля переходить у випромінувані
моди, інтенсивність яких може бути зареєстрована оптичним
фотоприймачем.
Методи микроскопії ближнього поля
Апертурний Безапертурний

dБОМ=50-100нм, до 13нм dБОМ=до 1нм

Апертурна близькопольна Близькопольне зображення
оптична мікроскопія формується при скануванні
досліджувканого зразка
діафрагмой з субхвильовим
отвором і реєструєтсья у
вигляді розподілу
інтенсивності оптичного
випромінювання в залежності
від положення діафрагми.
Контраст на БОМ
зображеннях визначається
процесами відбиття,
заломлення, поглинання та
розсіювання світла, які
залежать від локальних
оптичних властивостей
зразка.
 Апертурна близькопольна
оптична мікроскопія
Оптичне волокно

Виготовлення БОМ-зонду на основі оптичного волокна

Схема “shear-force”
датчика відстані зонд-
поверхня
на основі кварцевого
резонатора
камертонного типу

Дисипативні сили, що
діють на зонд, та зміна
коливань зонда поблизу
від поверхні зразка.
Близькопольна оптична
мікроскопія

можливі конфігурації
БОМ
 Одна
молекула в
БОМ

Поодинокі молекули білків

на поверхні клітинної
мембрани

молекули білка zFP538

(представник
флюоресцентних білків
1. Топография

3. Спектри флюоресценції
2. Пропускання 420 нм
1,0

Флюоресценция, отн. ед.

Точки:
0,9
1
0,7 2
3
0,6 4
5
0,4 6

0,3

0,1

0,0
500 550 600 650 700 750
Длина волны, нм

Ліпофусцинова гранула з
клітини епітелію ока людини
Методи микроскопії ближнього поля
Апертурний Безапертурний

dБОМ=50-100нм, до 13нм dБОМ=до 1нм

У безапертурному мікроскопі для локалізації випромінення
використовується голка зонду, піднесена до освітленої поверхні
на відстань меншу ніж довжина хвилі. У такому режимі вістря
розсіює ближнє поле, локалізоване у поверхні зразка.
 конфокальна БОМ
мікроскопія

зображення нанотрубки у конфокальному мікроскопі

та БОМ
 Поодинокі молекули GFP у фібробласті. БОМ-
мікроскопія. Використано двофотонне збудження.
 Немікроскопічні методи
дослідження клітин

Гістохімія
Реакції
Авторадіографія
Фельгена (на ДНК),
Використання речовин,
ШІК (на вуглеводи), мічених радіоактичними
Берлинська блакить атомами
(на залізо) і т. ін.

Імуногістохімія

Використання антитіл для

виявлення визначених білків
 Нінгідрінова реакція

Ф.-В. Распайль

+ HNO3  Ксантопротеїнова
реакція
 Кацусіка
Хокусай
“Велика
хвиля”

4Fe3+ + 3[Fe(CN)6 ] 4+ Fe4[Fe(CN)6]3

берлинська блакить
Відкладення заліза у гепатоцитах у хворого на
гемохроматоз (берлинська блакить)
Схема проведення
реакції Фьольгена

Ураження
токсоплазмою.
Виявлення ДНК
Нирка. PAS-реакція (ШІК)
 Нейтрофіли.
Виявлення ліпідів
Кістковий мозок. Реакція на
неспецифічну естеразу
2 мкм
 Авторадіографія

Використання
речовин, мічених
радіоактичними
атомами;
дозволяє прослід-
1 3 кувати шляхи
руху та місця
метаболічних
перетворень
речовин у
23 4 клітині.

5
1 – введення міченої радіоактивним атомом речовини;
2 – включення цієї речовини у метаболічні процеси в клітині;
3 – нанесення фотоемульсії;
4 – проявка фотоемульсії;
5 – результат реакції.
Зріз мозку ембріону щура. Авторадіографія
ГАМК-виробляючого ферменту GAD67 у
субвентрикулярній зоні
Імуногістохімічні методи
(використання мічених антитіл для специфічного виявлення
індивідуальних речовин у клітинах) барвник

антитіло барвник
PARP-негативний нейрон

вторинні
антитіла

первинні
антитіла

PARP-позитивний нейрон

антиген
клітинний антиген А

антитіла кроля
проти антигена А

мічені антитіла
кози проти
антитіл кроля
 Види маркерів, якими мітять антитіла

Флюорес- Мічені Колоїдне Фермент

центні атоми золото
зонди

Флюорес- Авторадіо- Електронна Світова

центна графія мікроскопія мікроскопія
мікроскопія
HER2/neu на мембранах
клітин раку молочної залози
 потік
розчинника
папір

розділені
компоненти
зразок
на старті
 зверху на колонку додається
зразок розчинник із великого резервуара

фракціоновані молекули збирають

 потік розчинника

кульки
заряджені
позитивно

зв’язані молекули,
заряджені негативно

вільні
молекули,
заряджені
позитивно

Іонообмінна хроматографія
 потік розчинника

пористі кульки

малі молекули
затримуються

великі молекули
не затримуються

Гель-фільтрація
 потік
потік розчинника
розчинника

кульки з ковалентно
зв’язаним субстратом

зв’язані молекули
фермента

інші білки проходять

не затримуючись

Афінна хроматографія
 Методи кількісної оцінки

Цитофотометрія

Інтерференційна
мікроскопія
Авторадіографія
 Цитофотометрія
За ступенем поглинання світлових променів певної довжини
хвилі визначається кількість певних речовин у клітині.

світлові хвилі частка хвиль, що

відповідної дов- пройшли крізь зразок
жини і відомої (частина хвиль була
інтенсивності поглинута зразком)

джерело дослідний детектор

випромі- зразок (вимірює
нювання інтенсивність
випромінювання,
яке пройшло
через зразок)
 Метод мікрохірургії

Клонування

Мікроманіпулятор

Штучне запліднення
Отримання каріопластів та цитопластів
 броньована седиментаційний
камера матеріал

ротор

мотор
охолодження вакуум
 Диференційне центрифугування

Без градієнту
щільності З градієнтом
щільності
 зразок
стабілізуючий
градієнт
концентрації
сахарози

ЦЕНТРИФУГУВАННЯ

компонент,
що повільно
седиментує
компонент,
що швидко
седиментує
ФРАКЦІОНУВАННЯ
Культивування клітин і тканин
Культивування клітин і тканин
Генрієтта Лакс та клітини HeLa
 клони гібридних клітин,
суспензію двох кожен з яких зберігає
типів клітин невелику кількість різних
центрифугують хромосом людини і повний
і додають агент, набір хромосом миші
що сприяє їхньому
злиттю

у селективному середовищі
проліферують тільки
гетерокаріони, що дають
початок гібридним
клітинам, які потім
злиття клітин
клонують
і утворення
гетерокаріонів

фібробласт клітина гетерокаріон гібридна клітина

людини пухлини миші
 миша,
мутантна клітинна
імунізована
лінія, отримана
антигеном Х
з пухлини
В-лімфоцитів

клітина продукує
анти-Х-антитіла

(в нормальному середовищі можуть

В-лімфоцити (загинуть
ростиневизначено довго, але гинуть
після декількох днів
у селективному середовищі)
росту в культурі)
ЗЛИТТЯ
продукти реакції, розміщіні
секретовані
у пластині з багатьма лунками
анти-Х-антитіла

на селективному середовищі ростуть тільки гібридоми

перевірка надосадової фракції на

наявність анти-Х-антитіл і клонування
клітин у лунках (1 клітина на лунку)

розмноження клітин і перевірка

надосадової фракції на наявність
анти-Х-антитіл; клони, що дають
позитивну реакцію, є постійними
джерелами анти-Х-антитіл
 Принципова схема
роботи проточної
ячейки
Детектор
Лазер
 ®
Оптична схема EPICS XL
FL3 (ECD)
FL2 (RD1) FL4 (PC5)
FL1 (FITC)
Аргоновий лазер з
повітряним охолодженням

Детектор 90о
світлорозсіювання

Лінзи для
фокусування променя

Високочутлива
Детектор
кварцева проточна ячейка
маловуглового
світлорозсіюваня
Загальні флуорохроми для
збудження 488 нм

Ізотіоцианат Флуорисцеїну (FITC)

Фікоеритрин (PE, RD1)
Перидинін-Хлорофіл Протеїн (PerCP)
 сопло ультразвукового
вібратора

суспензія клітин

захисне середовище

сигнал заряду
краплин

лазер
детектори

маленькі групи краплин,

маленькі групи краплин, заряджених позитивно,
заряджених негативно, для виявлення окремих
для виявлення окремих нефлюоресцентних клітин
флюоресцентних клітин

- 2000 В + 2000 В

накопичувач клітин накопичувач клітин

колба для клітин, що не відхилилися

 Морфометрична установка
2

3
1

1 - мікроскоп; 2 – цифрова фото-відео-камера; 3 – комп’ютер.

 Вимірювання довжини
поперечного зрізу шкіри

Вимірювання площі
перерізу мієлінового
нервового волокна
Окуляри з
морфометричною
шкалою
 характер відбиття
випромінювання
світло залежить від
від джерела структури об’єкта
випромінювання
 екран

яскрава
пляма
на екрані

промені, відбиті в цьому напрямку,

взаємно підсилюються

промені світла

промені, відбиті в цьому напрямку,

взаємно послаблюються

Б
яскрава
пляма
на екрані
відсутня
Дякую за увагу!
 Деякі характеристики мікроскопа

Загальне збільшення мікроскопа знаходять як результат

множення збільшення об’єктива на збільшення окуляра та
(якщо мікроскоп бінокулярний) на збільшення бінокулярної
насадки.
Роздільною здатністю мікроскопа
називають найменшу відстань між
двома точками, при якій ці дві точки у
мікроскопі будуть виглядати як два
окремих об’єкти. Роздільна здатність
обраховується за формулою

d=(0,61λ)/(n sinα)
Схема методу авторадіографії
 Основні характеристики мікроскопа

Загальне збільшення мікроскопа знаходять як результат

множення збільшення об’єктива на збільшення окуляра.

Роздільна здатність мікроскопа – це

найменша відстань між двома
точками, при якій ці дві точки у
мікроскопі будуть виглядати як два
окремих об’єкти.
Роздільна здатність обраховується за
формулою: l
d = 0,61
n sin a

l
або, наближено: d≈ 2
 Мікроскоп 1876р.
Захарія Янсен

Дякую за увагу!
 Виготовлення постійних препаратів
для світлової мікроскопії

1) Взяття матеріалу.
2) Фіксація (фізична: нагрівання, висушування, тощо; хімічна: формалін,
метиловий спирт, глютаральдегід та деякі інші речовини) .
3) Зневоднення (спиртами: 70º→80º→90º →96º→100º→ксилол) і
заливка в парафін.
4) Виготовлення зрізів за допомогою мікротома.
5) Депарафінування (бензолом або ксилолом) та гідратація
(спиртами: 96º→90º→80º→70º) зрізів.
6) Фарбування зрізів.
7) Зневоднення зрізів (спиртами: 70º→80º→90º→96º→ксилол) та
заключення їх у бальзам.
 Виготовлення постійних препаратів
для світлової мікроскопії

1) Взяття матеріалу.
2) Фіксація (фізична:
Заморожування нагрівання, висушування, тощо; хімічна: формалін,
зразків.
метиловий спирт, глютаральдегід та деякі інші речовини) .
Виготовлення
3) Зневодненнязрізів на кріомікротомі.
(спиртами: 70º→80º→90º →96º→100º→ксилол) і
заливка в парафін.
4) Виготовлення зрізів за допомогою мікротома.
5) Депарафінування (бензолом або ксилолом) та гідратація
(спиртами: 96º→90º→80º→70º) зрізів.
6) Фарбування зрізів.
7) Зневоднення зрізів (спиртами: 70º→80º→90º→96º→ксилол) та
заключення їх у бальзам.