HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - - -  - - - -

BÀI THI GIỮA KỲ HỌC PHẦN

SH03051 – CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG
ĐỀ TÀI:
“KHẢO SÁT TÍNH TỰ BẤT HỢP VÀ CHỌN GIỐNG KHÁNG
BỆNH SƯƠNG MAI Ở CÂY KHOAI TÂY
BẰNG CHỈ THỊ PHẨN TỬ DNA”

Họ và tên : VŨ HƯƠNG GIANG

MSV : 637217
Lớp : K63 - CNSHC
Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 06/2021

1
 MỤC LỤC
1. Giới thiệu chung về cây khoai tây..................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung.....................................................................................................3
1.2. Đặc điểm.................................................................................................................4
1.3. Lịch sử....................................................................................................................4
1.4. Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh ở khoai tây..............................................................5
1.5. Giá trị dinh dưỡng..................................................................................................5
1.6. Di truyền học..........................................................................................................6
1.7. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới..............................................................7
1.8. Tình hình sản xuất khoai tây trong nước................................................................8
2. Sự tự bất hơp SI ở khoai tây......................................................................................9
2.1. Sự tự bất hợp SI......................................................................................................9
2.2. Phát hiện sự đa dạng alen S-RNase ở loài khoai tây lưỡng bội..............................9
2.2.1. Giới thiệu chung..................................................................................................9
2.2.2. Nguyên liệu và phương pháp...............................................................................9
2.2.3. Kết quả...............................................................................................................12
3. Phát hiện bệnh mốc sương mai ở khoai tây.............................................................17
3.1. Bệnh mốc sương mai............................................................................................17
3.2. Lịch sử phát hiện..................................................................................................18
3.3. Phạm vi phân bố...................................................................................................18
3.4. Triệu chứng...........................................................................................................18
3.5. Phát hiện bệnh mốc sương mai ở khoai tây bằng chỉ thị phân tử DNA...............19
3.5.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.................................................................19
3.5.2. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a................20
3.5.3. Phân lập mẫu bệnh sương mai khoai tây...........................................................20
3.5.4. Đánh giá bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo............................................................21
3.5.5. Kết quả PCR phát hiện gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a........................21
4. Tài liệu tham khảo...................................................................................................24
4.1. Tài liệu tham khảo tiếng Anh...............................................................................24
4.2. Tài liệu tham khảo tiếng Việt...............................................................................24

1. Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1. Giới thiệu chung
Khoai tây là loài cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột, là loài
cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế giới và là loại cây trồng phổ biến thứ tư về
mặt sản lượng tươi xếp sau lúa, lúa mì và ngô. Lưu trữ khoai tây dài ngày đòi
hỏi bảo quản trong điều kiện lạnh.

2
 Hình 1. Khoai tây.
 Phân loại khoa học
Bảng 1. Phân loại khoa học
Giới Plantae
Angiospermae
Eudicots
Asterids
Bộ Solanales
Họ solanaceae
Phân họ Solanoideae
Tông Solaneae
Chi Solanum
Loài S.tuberrosum
Theo Hawkerkks (1991), khoai tây được phân thành 18 nhóm, trong đó có
68 loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào
số lượng nhiễm sắc thể.
 Nhóm 1: Diploids: 2n=2x=24
S.x arjanhuiri juz.et Buk
S. gomiocalyx juz.et Buck
S. stenotomum juz.et Buk
S. phueja juz.et Buk
Trong các loài trên, loài S. phueja juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất trong trồng trọt.
 Nhóm 2: Triploids: 2n=3x=36
S.x chaucha jux.et Buk là dạng lai tự nhiên giữa S.tuberosum subp.Andigena và
S.stenotomum.
S.xjuzepczukii Buk là dạng lai tự nhiên giữa S.acuale và S.snenotomum, phân bố ở
trung Peru đến Nam Bolivia, có khả năng kháng bệnh sương mai.
 Nhóm 3: Tetraploisd: 2n=4x=48
Loài S.tuberosum L. và 2 loài phụ là: Phân loài tuberosum và Phân loài
Andigena (juz.et Buk) Hawkes
 Nhóm 4: Pentaploids: 2n=5x=60
Loài S.x curtilobum juz.et Buk.

3
 1.2. Đặc điểm
Cây khoai tây là cây lưu niên thân thảo có chiều cao khoảng 60cm, cây chết
sau khi ra hoa. Hoa khoai tây có màu trắng, hồng, đỏ, xanh hoặc màu tím, nhụy
hoa màu vàng. Khoai tây được thụ phấn chủ yếu bởi côn trùng, ong vò vẽ
mang phấn hoa từ cây này đến cây khác, tuy nhiên cũng xảy ra hiện tượng tự
thụ phấn.Sau khi khoai tây ra hoa, một số giống cho quả màu xanh lá cây giống
màu xanh cà chua anh đào, có thể chứa 300 hạt. Quả khoai tây chứa một lượng
lớn alkaloid, solanine nên không dùng để ăn được.
Rễ khoai tây trồng từ củ giống chỉ phát triển rễ chùm, có rễ cọc khi trồng bằng
hạt, từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác. Ở các thân ngầm dưới mặt đất cũng có khả
năng ra rễ, nhưng rễ ngắn và ít phân nhánh. Bộ rễ phân bố chủ yếu trên đất canh tác
0-40cm, nhưng rễ có thể ăn sâu tới 1,5-2m. Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu
tạo zick zac, có 3-4 cạnh, cao trung bình từ 40-70cm đến 1-1,2m. Phụ thuộc vào
giống, thời kỳ chăm sóc mà chiều cao cây có thể khác nhau. Thân thường có màu
xanh hoặc xanh nhạt hay đậm, đối khi có màu phớt hồng hoặc tìm tùy thuộc vào
giống. Là hình thành và hoàn thiện theo sự tăng trưởng của cây, bản lá to, lá kép xẻ
lông chim, có 3-7 đôi mọc đối xứng qua trục và một lá lẻ trên cùng thường lớn hơn
gọi là lá chét đỉnh, màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà
có thể màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt... Hoa khoai tây thường mọc tập trung
trên một chùm hoa. Nó thuộc loại hoa lưỡng tính và có cấu tạo 5:5:5, cuống ngắn.
Màu sắc hoa thường trắng, cũng có thể là phớt hồng, tím, hồng, vàng và đỏ... phụ
thuộc vào từng loại và giống. Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, quả có dạng hình
cầu, hình trứng hoặc hình nón. Vỏ quả có màu xanh đôi khi có xọc vằn hoặc đóm,
trong quả có hai ngăn chứa hạt và thịt quả. Hạt khoai tây thuộc loại rất nhỏ, trọng
lượng 1000 hạt chỉ đạt khoảng 0,7-1g. Hạt có dạng ovan dẹt, bên ngoài là vỏ, bên
trong có nội nhũ và phôi. Phôi khoai tây có hình chữ U, bên trong chứ hai lá mầm
phôi và rễ mầm. Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ được
hình thành là do thân phát triển trong điều kiện bóng tối. Hình dạng củ khoai tây có
thể là tròn, elip, tròn dài, đôi khi là hình vuông. Màu sắc củ tùy thuộc vào từng giống,
có thể màu trắng, màu trắng nhạt, vàng hay vàng nhạt... Mầm khoai tây phát triển từ
điểm sinh trưởng của mắt củ là cơ quan sinh sản vô tính của khoai tây. Màu sắc của
mầm khác nhau phụ thuộc vào từng giống có thể màu trắng hoặc màu tím, khi gặp
ánh sáng mầm có màu xanh.
1.3. Lịch sử
Khoai tây có nguồn gốc từ Peru, trong nghiên cứu được David Spooner xuất bản
năm 2005 thì khoai tây có nguồn gốc từ một khu vực phía nam Peru. Hiện tại,
người ta cho rằng khoai tây đã được du nhập vào châu Âu vào khoảng thập
niên 1570 và sau đó nó đã được những người đi biển châu Âu đưa đến các lãnh
thổ và các cảng trên khắp thế giới khi chế độ thực dân châu Âu mở rộng vào
thế kỷ XVII và XVIII. Có hàng ngàn bậc phân dưới loài khoai tây được tìm
thấy ở Andes, nơi người ta có thể tìm thấy hơn một trăm thứ khoai tây ở một
thung lũng, mỗi hộ nông dân có thể tích trữ tới mười mấy loại khoai tây khác
nhau. Năm 1845, một loại bệnh do nấm Phytophthora infestans đã lan ra nhanh
chóng khắp khu vực tây Ireland, dẫn đến nạn đói lớn ở Ireland.

4
 1.4. Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh ở khoai tây
 Nhiệt độ
Nhiệt độ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả
năng phân bố, thời vụ gieo trồng, quá trình sinh trưởng, phát triển và nắng suất
của cây. Tổng nhu cầu nhiệt cho khoai tây sinh trưởng và phát triển dao động
từ 16oC-18oC. Nhiệt độ trong vụ trồng bình quân dao động 16 oC-18oC là thích
hợp và cho năng suất cao nhất. Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển khác nhau
sẽ yêu cầu điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Hạt nảy mầm ở nhiệt độ tối thiểu 12 oC-15oC và nhiệt độ thích hợp nhất là
18oC-22oC. Nhiệt độ lớn hơn 25oC làm mầm phát triển chậm và dễ thối.
- Thời kỳ sinh trưởng thân lá nhiệt độ thích hợp là 20oC-22oC.
- Thời kỳ phát triển củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn để thúc đẩy hình
thành thân và củ.
 Ánh sáng
Khoai tây là cây ưa sáng, cường độ ánh sáng thích hợp cho khoai tây sinh
trưởng và cho năng suất cao là từ 40.000-60.000 lux. Thời kỳ cây non đến giai
đoạn hình thành củ khoai tây đòi hỏi ánh sáng ngày dài để quang hợp và tích
lũy chất dinh dưỡng, đồng thời ra hoa, đậu quả. Thời kỳ sinh trưởng sinh thực
và khi củ bắt đầu hình thành, cây khoai tây cần có thời gian chiếu sáng ngắn.
 Độ ẩm
Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, chính vì vậy trong thâm canh để nâng cao
năng suất cần phải cung cấp nước thường xuyên cho cây để cây sinh trưởng
phát triển tốt. Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu về nước cũng khác
nhau. Thời kỳ trồng đến xuất hiện tia củ cần đảm bảo độ ẩm tối thiểu 60-80%.
Thời kỳ phát triển củ cần giữ độ ẩm 80%. Thiếu nước hoặc thừa nước ảnh
hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây.
 Đất trồng và pH đất
Đất trồng khoai tây thích hợp nhất là đất phù sa nhẹ, đất cát pha, đất nhẹ tơi xốp
có lượng mùn cao, lớp đất canh tác dày, giữ ẩm tốt, tưới tiêu tốt. Khoai tây có
thể phát triển trên đất có pH từ 4,8-7,1; pH lý tưởng đối với cây khoai tây là
5,2-6,4. Nếu pH trên 7 cây khoai tây dễ bị nhiễm bệnh ghẻ củ.
1.5. Giá trị dinh dưỡng
Khoai tây vừa là cây lương thực, vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao, hàm lượng dinh dưỡng của khoai tây chỉ kém trứng. Sử dụng 100g khoai
tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% năng lượng, 10% sắt, 10%
vitamin B1, 20-50% nhu cầu vitamin C cho một người trong ngày đêm. Khi
xem xét các cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới, cây khoai tây sinh lợi hơn bất
cứ cây trồng nào khác vì đem lại năng lượng protein cao nhất. Trong khoai tây
có nhiều chất chống oxy hóa, có khả năng ngăn ngừa lão hóa, hạn chế sự phát
triển của ung thư và một số bệnh khác. Đã phát hiện ra rằng tác dụng giảm ung
thứ tuyến tiền liệt khi hấp thụ khoai tây thường xuyên. Nước ép củ khoai tây có
tác dụng trung hòa độ axit cao trong dạ dày, kích thích tiêu hóa, chữa viêm
tuyến dịch vị.
1.6. Di truyền học
 Đặc tính sinh sản
5
 Giao tử 2n
Sự đa dạng của khoai tây liên quan đến địa lý sự phân bố và sự biến đổi của loài.
Khoai tây được trồng phổ biến gồm các thể lưỡng bội (2n=24), thể tứ bội
(2n=48), thể ngũ bội (2n=60). Giao tử 2n là các nhiễm sắc thể xôma (somatic
chromosome number), thường bị nhầm lẫn với các giao tử không giảm phân.
Giao tử không giảm phân là giao tử không có sự tái tổ hợp di truyền trong quá
trình hình thành giao tử, không có quá trình giảm phân. Giao tử 2n đã được sử
dụng để tạo ra thể lưỡng bội trong nhân giống ở nhiều đơn vị phân loại của
thực vật bậc cao, góp phần tạo ra sự đa bội hóa và có khả năng di truyền từ đơn
bội sang đa bội.
 Đơn bội
Đơn bội từ thể tứ bội là thể lưỡng bội xảy ra trong tự nhiên. Các đơn bội từ các
tứ bội thường không ra hoa, bất dục đực do giao phối cận huyết trog quá trình
đơn bội hóa. Chọn lọc các thể đơn bội, các dòng nhân lưỡng bội thu được có
thể có các biến dị di truyền lưỡng bội hoang dã, con lai F1 giữa cá thể đơn bội
và loài hoang dã có thể được sử dụng làm cấu nối chuyển các tính trạng có lợi
từ thể lưỡng bội sang thể tứ bội. Ngoài ra, kiểu đơn bội này được sử dụng để
nghiên cứu sự phân li của các tính trạng ở mức độ tứ bội nếu tạo ra nhiều kiểu
gen đơn bội từ một kiểu gen ở thể tứ bội.
 Sự tự bất hợp
Sự tự bất hợp xảy ra ở các loài Solanum mang củ, đặc biệt là ở mức lưỡng bội.
S-locus điều khiển sự tự bất hợp SI ( Self- Incompatibility) gồm hai gen liên kết
chặt: S-RNase (S-locus-RNase) và multiple SLFs (S-locus F-box protein).
Trong locus S với nhiều alen kiểm soát gametophytic self-incompatibility. Cấu
trúc gen của locus S bao gồm alen S2 với exon và intron có tổng kích thước là
786bp. Vị trí locus S được xác định nằm trên nhiễm sắc thể I.
 Bộ gen
Bản đồ gen khoai tây đầu tiên được báo cáo vào năm 1988 sử dụng chỉ thị
RELP đánh dấu.

6
 Bảng 2. Các loại chỉ thị và bản đồ gen

1.7. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới
Sản xuất khoai tây trên thế giới đã trải qua những thay đổi lớn. Tính đền đầu
những năm 1990, hầu hết khoai tây đã được trồng và tiêu thụ ở châu Âu, Bắc
MỸ, và các nước thuộc Liên Xô cũ. Kể từ đó, đã có một sự gia tăng đáng kể
trong sản xuất và nhu cầu ở châu Á, châu Phi, Mỹ Latinh, sản lượng khoai tây
tăng từ dưới 30 triệu tấn vào đầu năm 1960 và hơn 165 triệu tấn vào năm 2007.

7
 Hình 2. Bản đồ phân bố địa lý trông khoai tây trên toàn thế giới.
(Nguồn: RTB Maps)
Châu Á và châu Âu là hai khu vực sản xuất khoai tây lớn, chiếm hơn 80%
sản lượng thế giới trong năm 2007. Trong khi châu Phi và châu Mỹ Latinh diện
tích trồng chiếm khoảng hơn 20% của toàn thế giới. Bắc Mỹ là nơi sản xuất
khoai tây đứng đầu thế giới với hơn 40 tấn/ha. Châu Á chiếm gần một nửa
nguồn tiêu thụ khoai tây của thế giới, nhưng dân số lớn nên sức tiêu thụ bình
quân trên đầu người ở mức khiêm tốn 24kg vào năm 2005.
1.8. Tình hình sản xuất khoai tây trong nước
Sản xuất khoai tây tại Việt Nam đã đạt đỉnh điểm vào những năm 1979 và 1980
sau đó giảm dần. Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng suất
thấp và diện tích trồng giảm dần do thiếu nguồn củ giống tốt.

Hình 3. Diễn biến diện tích, sản lượng khoai tây ở Việt Nam giai đoạn 2009-2013.
(Nguồn: FAOSTAT.2014)
Diện tích trồng và sản lượng khoai tây tăng dần qua các năm từ năm 2009 tới năm
2012 nhưng không đáng kể tới năm 2013 diện tích trồng khoai tâu giảm tới 42%
nhưng năng suất lại tăng gần 20% so với năm 2012. Diện tích trồng giảm nhưng năng
suất không giảm theo, đây là một tín hiệu đáng mừng cho ngành sản xuất khoai tây ở
8
nước ta. Tuy nhiên, sản xuất khoai tây còn gặp nhiều khó khăn trong quá trình sản
xuất cũng như chọn tạo giống. Giống khoai tây thường bị thoái hóa do điều kiện
ngoại cảnh và đặc biệt là thoái hóa do virus.
2. Sự tự bất hơp SI ở khoai tây
2.1. Sự tự bất hợp SI
Sự tự bất hợp hay Self-incompatibility (SI) là tên gọi chung cho một số cơ chế di
truyền ở thực vật hạt kín, ngăn cản quá trình tự thụ tinh và do đó khuyến khích
lai xa và dị hợp. Không nên nhầm lẫn nó với các cơ chế vật lý kiểm soát di
truyền ngăn cản quá trình tự thụ phấn như là heterostyly, sequantial
hermaphroditism (dichnogamy).
Đối với thực vật sự tự bất hợp, xảy ra khi hạt phấn của cùng một cây hay trên
một cây khác có cùng kiểu gen hay alen. Các cơ chế được nghiên cứu chỉ ra sự
tự bất hợp SI ức chế sự nảy mầm của hạt phấn trên vòi nhụy, ảnh hưởng đến sự
kéo dài của ống phấn. Locus S chứa hai vùng mã hóa protein cơ bản- một vùng
biểu hiện trong nhụy hoa và vùng kia trong bao phấn ( được gọi là các yếu tố
quyết định đực và cái).
Trong gametophytic self-incompatibility (GSI), kiểu hình tự bất hợp của hạt
phấn được quyết định bởi kiểu gen đơn bội của giao tử đó. Đây là loại SI phổ
biến nhất. Cơ chế RNase được tìm thấy ở Solanaceae được tìm thấy vào năm
1989. Trong cơ chế này, ống phấn phát triển không bình thường, S-RNase có
thể gây ra sự thoái hóa RNA ribosome bên trong ống phấn, ngăn chặn sự kéo
dài của ống phấn và hạt phấn có thể bị chết đi.
2.2. Phát hiện sự đa dạng alen S-RNase ở loài khoai tây lưỡng bội
2.2.1. Giới thiệu chung
Phần lớn các loài thực vật có hoa là lưỡng tính, và các cơ quan sinh sản của
chúng nằm gần nhau dẫn tới xảy ra các quá trình tự thụ phấn. Tuy nhiên do tác
động có hại của quá trình tự thụ tinh và giao phối cận huyết, các loài thực vật
đã phát triển một số cơ chế, trong đó phổ biến nhất là sự tự bất hợp. Sự tự bất
hợp là một hiện tượng ngăn cản sự tự thụ tinh giúp cho nhụy hoa có thể phân
biệt được tự thụ phấn và giao phấn, dẫn đến việc chọn lọc khi bắt giữ các hạt
phấn. Tùy thuộc vào cơ chế kiểm soát di truyền sự tương đồng trong phấn hoa,
thực vật được phân loại là có cơ chế phát sinh thể bào tử hoặc giao tử. Sự tiến
hóa của các cơ chế ngăn chặn giao phối cận huyết ở thực vật có hoa là nguyên
nhân quan trọng dẫn đến thành công của quá trình tiến hóa của chúng, do đó
khiến chúng trở thành một trong những nhóm thực vật trên cạn thành công
nhất.
Tính bất hợp ở giao tử hay Gametophytic system (GSI) được tìm thấy ở trên 60 họ
thực vật có hoa. Họ Solananceae, Rosaceae, Plantaginaceae, Leguminoceae,
Onagraceae, Papaveraceae, Poaceae. Các nghiên cứu GSI ở cấp độ phân tử cho thấy
GSI hoạt động theo hai cơ chế khác nhau để có khả năng nhận ra và loại bỏ hạt phấn
tránh hiện tượng tự thụ phấn. Một trong số đó là cơ chế Stylar ribonuclease (S-Nase)
đã được xác định và đặc trưng cho các thành viên của họ Solanaceae, họ Rosaceae,
họ Plantaginaceae và họ Rubiaceae. Hầu hết, sự tự bất hợp ở giao tử của các loài
Solanum lưỡng bội mang củ được kiểm soát bởi S-Locus đa alen duy nhất.
2.2.2. Nguyên liệu và phương pháp
9
 Nguyên liệu thực vật
Nghiên cứu này bao gồm nhóm Phueja, nhóm Stenotomum, và nhóm Solanum
okadae. Các cây được trồng trong điều kiện nhà kính có kiểm soát ở quang chu
kỳ thời gian 16 giờ, độ dài ngày tự nhiên trong mùa hè với ánh sáng bổ sung
khi cần thiết.
Bảng 3. Nguyên liệu thực vật.

 Thụ phấn
Tự thụ phấn có kiểm soát và tự thụ phấn chéo được thực hiện để xác nhận sự tự
bất hợp ở khoai tây. Bao phấn của khoai tây là những ống rỗng có các lỗ nhỏ ở
đỉnh. Để thu phấn hoa từ các bao phấn hình ống này, người ta sử dụng một bộ
rung để rung hình nón bao phấn và phấn hoa được thu vào một ống ly tâm siêu
nhỏ. Sau đó, phấn hoa được đưa vào đầu nhụy bàng chổi sơn sau khi nhụy đã
trưởng thành. Các phép lai được kiểm tra sau khoảng 4 tuần: tự bất hợp nếu
không có phôi (no berry or no seed set) hoặc tính tương hợp khi quả mọng
(berry or seed set) được hình thành.
 Tách chiết DNA
DNA bộ gen được chiết tách để định kiểu gen PCR cụ thể cho alen từ các
con lai S.okadae thu được đã phân ly mang các alen S khác nhau. Hai đĩa lá có
trọng lượng khoảng 10-100mg lá non được xử lý để tách chiết DNA bằng bộ
kit DNeasy Plant Mini.
 Tiến hành phản ứng PCR cụ thể cho alen
Các đoạn mồi định được thiết kế để cho phép khuếch đại alen cụ thể từ các con
lai đã phân ly với các cơ sở S-Rnase đã biết. Các loại mồi được sử dụng như
sau:
+) So1-RNase (So1-F(5’ GGATAAGGAGGGATCACAGC 3’)
và So1-R (5’ TGTTGGCTTTGTATTTTGTAGCA 3’).
+) So2-RNase ( So2-F(5’ TGCGAGTCCGAAGACAAGTA 3’)
10
 và So2-R(5’ AAGGGAAAGAAAACGGAAGC 3’).
+) So4-RNase ( So4-F(5’ TCGATTGGAGTTCTGCACTG 3’)
và So4-R(5’ TTTCATCGCATGTGTTACCC 3’).
+) So5-RNase (So5-F(5’TGGTCGAAAGGAACAACCTT 3’)
và So5-R(5’ TTCCAACCTGGTCATTCAAAG 3’).
Các đoạn mồi được thiết kế có nhiệt độ nóng chảy tối ưu là 60oC. Phản ứng PCR
bao gồm đệm PCR 1X, 3mM MgCl2, 0,2mM dNTPs, 0,4mM mồi xuôi, muồi ngược,
2U Taq DNA polymerase. Phản ứng PCR được thực hiện trong PTC-200 Thermal
Cycler trong các điều kiện chu kỳ sau: biến tính 3 phút ban đầu ở 94oC, tiếp theo là
35 chu kỳ trong 30 giây ở 94oC, quá trình ủ ở nhiệt độ tùy thuộc vào Tm (nhiệt độ
nóng chảy) của mồi, 1 phút ở 72oC và theo gian kéo dài cuối cùng là 7 phút ở 72oC.
 Chiết xuất RNA
RNA được chiết từ mô nhụy hoa bằng cách sử dụng bộ RNase Plant Mini. Khoảng 10-
100mg mô, được làm lạnh trong nitơ lỏng, được nghiền thành bột mịn và được xử lý
để tách chiết RNA.
 Phản ứng phiên mã ngược (RT)-PCR: 3’RACE
Phản ứng phiên mã ngược (RT) được thực hiện bằng cách sử dụng mồi oligo-dT
(5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA (T)18-3’) với 27bp và 18
nucleotide thymidine ở đầu 3’. Tổng hợp cDNA sợi đầu tiên được thực hiện
bằng cách sử dụng Omniscrip® Reverse Transcriptase. Phản ứng bao gồm 1X
RT Buffer, 0,5mM dNTPs, 1mM NotI d(T), 10U chất ức chế RNase, 4U
Omniscript Reverse Transcrptase, 1-2mg RNA tổng số biến tính ở 65oC trong 5
phút trong nước không có RNase. Hỗn hợp phản ứng RT được ủ ở 37oC trong
một giờ để tổng hơp cDNA.
Một đoạn mồi thoái hóa, So1C2-F1.3(5’-
TTTACNRTNCATGGNCTNTGGCC-3’) được thiết kế dựa trên các domain
của Solanaceae S-RNase. Điều này được sử dụng để khuếch đại một phần trình
tự S-RNase từ RNA nhụy hoa bằng cách sử dụng kỹ thuật 3’RACE dựa trên
RT-PCR. Mồi thoái hóa (So1C2-F1.3) được sử dụng cùng với một mồi khác
(5’-AACTGGAAGAATTCGCGG-3’) có cùng trình tự nhận biết như mồi
oligo-dT được xử dụng trong quá trình tổng hợp cDNA sợi thứ nhất. Khuếch
đại RT-PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng bao gồm 2,5ml phần phản
ứng RT(trong phản ứng cDNA), 30mM Tris-HCl(pH8,3), 50mM KCl, 1,5mM
MgCl2, 0,2mM dNTPs, 0,4mM So1C2-F1.3 (mồi xuôi), 0,2mM mồi ngược, 2U
Taq DNA polymerase. Quá trình khuếch đại được mô tả như trên với nhiệt độ
ủ 55oC và thời gian kéo dài cuối cùng là 5 phút.
 Phản ứng phiên mã ngược RT-PCR: 5’RACE
Các đoạn mồi đặc hiệu cho gen được thiết kế từ các trình tự từng phần được
phân lập từ nhân bản 3’RACE cho các S-RNase đã được xác định và được sử
dụng để nhân bản cDNA có chiều dài đầy đủ bằng kỹ thuật 5’RACE-PCR. Ba
mồi đặc hiệu cho So2-RNase:
+)So2-GSP1 (5’-ATTATACCATGATTTCGGAGAGC-3’)
+)So2-GSP2 (5’-AGATCGATACTACACGTTCCATG-3’)
+)So2-GSP3 (5’-CAGTGATACTCCAGTTGTTTGC-3’)
Đối với Ss2-RNase:

11
 +) Ss2-GSP1 (5’-AGAAGTAATACCATTCTTTCCGAG-3’)
+) Ss2-GSP2 (5’-AACACGTTCCATGCTTAATG-3’)
+) Ss2-GSP3 (5’-CCAGATGTATTCCAGAGCTTC-3’)
Tổng hợp cDNA sợi đầu tiên và kỹ thuật 5’RACE-PCR được thực hiện bằng
cách sử dụng Hệ thống 5’RACE để khuếch đại, phiên bản 2.0 (Invitrgen) theo
khuyến nghị của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR thu được bằng cách sử dụng mồi
AAP hoặc AUAP và các mồi đặc hiệu.
 Nhân dòng vector pCR® 2.1
Các sản phẩm RACE-PCR được nhân bản bằng bộ kit nhân dòng TA
(Invitrogen). Nồng độ của sản phẩm PCR cần thiết để liên kết với 50ng vector
pCR®2.1 đã được xác định, phản ứng được thiết lập (với 1ml of 10xligation
buffer, 2ml of 25ng pCR®2.1 vector, 1ml of 4.0 Weiss units T4 DNA ligase).
Hỗn hợp được ủ ở 14oC qua đêm, biến đổi thành các tế bào One Shot
competent cell (TOP10F’Invitrogen), sau đó đưa vào các đĩa LB có chứa
40mg/ml X-Gal, 100mM IPTG và 50mg/ml kanamycin hoặc 100mg/ml
ampicillin.
 Giải trình tự các đoạn chèn plasmid
Các khuẩn lạc được sàng lọc bằng cách sử dụng mồi M13 universal primer, và
DNA plasmid được chiết xuất từ các dòng dương tính giả bằng cách sử dụng
QIAprep Spin Miniprep kit. Trình tự của DNA được chèn vào được xác định
bằng cặp mồi M13 universal primer.
2.2.3. Kết quả
 Xác định trạng thái tự bất hợp và các mối quan hệ của mầm khoai tây
Các kết quả từ các dòng vô tính trong S.okadae trong bảng dưới đây cho thấy tất
cả các quá trình tự thụ phấn đều tự bất hợp. Từ các phép lai, người ta quan sát
thấy rằng trong số các dòng OKA7129 có khả năng mang các cặp alen S giống
nhau dựa trên giao phấn không tương đồng. Các phép lai giữa OKA1 và OKA3
không tạo ra bất kỳ quả nào theo cả hai hướng cho thấy các dòng vô tính này
cùng có chung một cặp alen S.
Bảng 4. Kết quả thụ phấn S.okadae thu được.

 Nhân bản RT-PCR của nhụy hoa S-RNase

Khuếch đại RT-PCR nhụy hoa giả định S-RNase từ S.tuberosum Group
Stenotomum, S.tuberosum Group Phureja và S.okadae có kích thước dự kiến là
khoảng 850bp cho cả 3 vật liệu trên.

12
 Hình 4. Kết quả RT-PCR S.okadae bằng cách sử dụng mồi S-RNase C2.
 Kết quả RT-PCR 3’RACE
Bảng 5. Kết quả phản ứng RT-PCR 3’RACE.

Từ kết quả xác định trình tự được tóm tắt trong bảng 5, một số alen xuất hiện
nhiều lần. Ví dụ, So1-RNase được tìm thấy có mặt ở bốn trong số các kiểu gen
S.okadae bao gồm OKA1, OKA3,OKA5,OKA9. So2-RNase được tìm thấy
trong OKA1, và OKA3. Ss9 và Sp1 lần lượt có mặt trong cả bản sao
Stenotomum STN 4679 và Phueja clone DB226 (Ss9 ban đầu được nhân bản từ
Stenotomum, sau đó được nhân bản từ Phureja được đặt tên là Sp1). Tuy nhiên
khi so sánh trình tự thấy rằng, hai S-RNase được mã hóa bởi cùng một trình tự
axit amin, do đó tạm thời được đổi tên thành Ss9/Sp1 đại diện cho cả hai alen,
mặc dù về mặt lý thuyết chúng có thể đại diện cho hai alen khác biệt về mặt

13
chức năng. Quan sát này không nằm ngoài dự đoán vì Stenotomum và Phureja
có liên quan chặt chẽ về mặt tiến hóa và được coi là thành viên nhóm loài
Solanum teberosum. Tổng số trình tự S-RNase được xác định trong nghiên cứu
này là 16, gồm 5 trình tự từ S.okadae và 11 trình tự từ S.tuberosum. Sự liên kết
của trình tự axit amin từng phần của Solanum S-RNase được thể hiện ở hình 3.
Ba trong số các miền bảo tồn (conserved domain) (C3-C5), và hai miền siêu
biến (hypervariable domain) (HVa và HVb) được đánh dấu và là một phần của
các đặc điểm cấu trúc chính của solanaceous S-RNase. Một trong hai gốc
histidine xúc tác được biết có liên quan đến hoạt tính ribonuclease của S-
RNase được chỉ ra trong sự liên kết của vùng C3. Sáu trong số tám gốc
Cysteine cũng được tìm thấy trong các solanaceous S-RNase. Các gốc cysteine
này rất quan trọng để xác định cấu trúc bậc ba của S-RNase. Hai gốc còn lại
nằm ngoài vùng liên kết giữa C1 và C2. Tất cả các S-RNase chứa sáu gốc
cysteine, ngoài trừ cysteine nằm ngay sau vùng C5.

Hình 5. Sự liên kết axit amin từng phần của Solanum S-RNase.
Tỷ lệ phần trăm tương đồng giữa các axit amin của 16 S-RNase nằm trong
khoảng 32,9 đến 94,5% (Bảng 6). Mức độ tương đồng về trình tự này thấp phù
14
 hợp hợp với mức đa hình cao được biết là tồn tại giữa các alen S-RNase trong
họ Solanaceae. Có thể quan sát thấy mức độ tương đồng axit amin trong một
loài có thể thấp 32,9% đối với S.okadae S-RNase, 33,1% đối với Stenotomum
S-RNase và 44,2% cho Phureja S-RNase.
Bảng 6. Tỷ lệ phần trăm tương đồng giữa các axit amin.

 Kết quả RT-PCR 5’RACE

Ba đoạn mồi đặc hiệu cho gen antisense (GPS) được thiết kế thông qua nhân
bản 3’RACE và được sử dụng trong 5’ RACE để xác định trình tự gen S-
RNase. Các sản phẩm RT-PCR chỉ ra các amplicon dự kiến trong hai trường
hợp như được chỉ ra cho So2-RNase trong hình 4. Sau khi biến đổi, ba khuẩn
lạc có đoạn chèn được xác định bằng PCR khuẩn lạc đã được chọn để tách
chiết DNA plasmid và xác định trình tự đoạn chèn.

15
 Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR 5’RACE So2-RNase của OKA1.
 Kết quả RT-PCR 5’RACE
RT-PCR 5’RACE bổ sung C1 và C2 vào vùng 5’ của hai S-RNase. Sự sắp
xếp các trình tự axit amin của hai S-RNase được nhân dòng So2 từ S.okadae và
Ss2 từ Group Stenotomum với ba trong số các trình tự S-RNase S.chacoense.
Hai vùng siêu biến (HVa và HVb) và 5 vùng conserved domain (C1, C2, C3,
C4, C5) được tìm thấy ở các solanaceus S-RNase. Hai gốc histidine nằm trên
vùng C2, C3 được biết có liên quan đến hoạt động ribonuclease của S-RNase.
Tám conserved cysteine được tìm thấy trên S-RNase hòa tan. Ngoài ra, vị trí
N-glycosyl hóa được tìm thấy trong C2 trong hầu hết các solanaceus S-RNase.

Hình 7. Trình tự axit amin sau khi RT-PCR 5’RACE.

 Phân tích con lai với cặp mồi đặc trưng cho alen
16
 Để kiểm tra chức năng của alen S, người ta đã thực hiện các phép lai semi-
compatible cross ở Solanum okadae. Các cây con lai của 4 phép lai giữa các
kiểu gen OKA1, OKA3, OKA5, OKA9 được phân tích sự có mặt của các alen
S-RNase. Các đoạn mồi đặc hiệu được thiết kế cho từng alen trong số bốn alen
đại diện cho các kiểu gen này (So1, So2, So4, So5), được sử dụng trong quá
tình khuyếch đại PCR từ 28-30 cây thế hệ con cho mỗi phép lai. Trong mỗi
trường hợp, các kiểu gen riêng lẻ của cây trồng đều phù hợp với phản ứng
semi-compatible cross, các hạt phấn chứa alen có điểm chung với cây bố mẹ là
không thụ phấn cho cây cái. Tất cả các cây con đều chứa alen S “non common”
từ cây bố mẹ cho phấn ở trạng thái dị hợp tử.
Ví dụ, trong phép lai đầu tiên ở bảng 7 (OKA1 x OKA5), alen S5 của bố mẹ
hạt phấn được di truyền bởi tất cả các thế hệ con lai. Ngược lại, alen S1 của bố
mẹ hạt phấn bị loại bỏ vì không có thế hệ con lai nào của S1S1 hoặc S1S2 kiểu
gen đã được xác định. Tất cả 116 kiểu gen thế hệ con lai đều di truyền theo
alen S-RNase. Điều này cung cấp bằng chứng các trình tự nhân bản tương
đồng với các functional S-allele cho thấy sự kiểm soát giao tử của kiểu hình hạt
phấn sao cho các alen bị loại bỏ một cách hiệu quả trong quá trình thụ phấn và
không xuất hiện trong các hợp tử được hình thành.
Bảng 7. Kết quả 4 phép lai giữa các OKA1, OKA3, OKA5, và OKA9.

3. Phát hiện bệnh mốc sương mai ở khoai tây

3.1. Bệnh mốc sương mai
Phytophthora infestans là một loài vi sinh vật gây ra bệnh nghiêm trọng cho cây
khoai tây, được gọi là bệnh mốc sương mai hay bệnh tàn rụi khoai tây.

17
 Hình 8. Triệu chứng bệnh mốc sương mai trên cây khoai tây.
Bệnh mốc sương mai là thủ phạm gây ra nạn đói châu Âu thập niên 1840,
Ireland năm 1845. Phytophthora infestans cũng gây ảnh hưởng trên cây cà
chua và một số loài khác trong họ Solanaceae. Bệnh thường xuất hiện đầu tiên
ở mép chóp lá tạo vết xám xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá. Phần giữa
vết bệnh chuyển màu nâu đen và xung quanh vết bệnh thường có lớp bao tử
màu trắng xốp bao phủ như một lớp mốc trắng như sương muối làm cho là lụi
tàn nhanh chóng. Bệnh hại ở cuống lá, cành, thân cây khoai tây, lúc đầu là vết
nâu hoặc thâm đen, sau lan rộng bao quanh và kéo dài thành các đoạn. Bệnh
làm cho thân, cành khoai tây thối mềm và dễ bị gãy gục.
3.2. Lịch sử phát hiện
Bệnh mốc sương mai khoai tây lần đầu tiên ghi nhận tại Mêxico đây cũng được
coi là trung tâm đa dạng sinh học của nấm mốc sương. Triệu chứng bệnh được
mô tả chi tiết năm 1845 trên cây khoai tây. Bệnh được xác định nguyên nhân là
do nấm. Ban đầu Montagne đặt tên nấm là Botrytis infestans (1845), tới năm
1854 được đổi tên thành Peronospora infestans, năm 1876 nấm được
Montagne và Anton de Bary đặt lại là Phytophthora infestans và tên này được
gọi tới ngày nay. Sự phát tán của nấm được chia làm hai giai đoạn giữa thế kỷ
19 và giai đoạn thế kỷ 20 cho đến nay. Giai đoạn giữa thế kỉ 19 lúc đầu khoai
tây bắt đầu xuất hiện và được phổ biến rộng rãi trên khắp các nước Bắc Mỹ và
châu Âu. Cùng với sự phổ biến của khoai tây, nấm mốc sương cũng phát tán ra
các vùng trồng đầu tiên là Mỹ theo nguồn bệnh trên khoai tây dại sau đó từ Mỹ
lan sang châu Âu theo đường củ giống. Giai đoạn thứ hai vào thế kỷ 20 lúc này
do toàn cầu hóa về thương mại cũng như vận chuyển hàng hóa mốc sương mai
theo củ khoai tây phát tán ra hầu như tất cả các vùng có xuất hiện cây khoai
tây. Bệnh hại nặng có thể mất mùa và dẫn tới nạn đói như Ireland năm 1845-
1846 và ở Đức năm 1919.
3.3. Phạm vi phân bố
Bệnh phân bố ở hầu hết các nước trên thế giới nơi có điều kiện lạnh đủ để trồng
khoai tây. Theo thống kê của CABI 1982, nấm P.infestans đã xuất hiện trên
hầu hết các châu lục. Tại châu Á, bệnh xuất hiện tại 26 nước trong đó có những
18
 nước lân cận và láng giềng nước ta như Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Nhật Bản,
Hàn Quốc, Ấn Độ... và bao gồm cả Việt Nam. Do tính chất phức tạp của giai
đoạn phát tán thứ hai của nấm P.infestans không chỉ chủng cũ mang chủng
nấm A1 phát tán mà cả chủng mới A2 cũng được phát đi toàn thế giới. CABI
năm 1996 cũng đưa ra thống kê các nước đã xuất hiện chủng mới này. Theo
kết quả trên chủng nấm A2 đã xuất hiện ở 26 nước và vùng lãnh thổ trong đó
châu Á có 5 nước là Ấn Độ, Indonesia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Israel. Quần thể
ở Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ đã xuất hiện cả hai loại chủng nấm. Theo những
công bố mới đây có thể chủng nấm A2 đã xuất hiện ở một số tỉnh phía nam
Trung Quốc giáp với biên giới nước ta. Ở nước ta bệnh phân bố trên hầu hết
khắp các vùng trồng khoai tây và cà chua. Bệnh gây hại mạnh và quanh năm ở
các vùng có khí hậu mát mẻ như Lâm Đồng, Lào Cai, gây hại vào vụ đông và
đông xuân ở tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ nơi có một mùa đông
lạnh.
3.4. Triệu chứng
Bệnh hại trên thân, lá củ. Triệu chứng của bệnh rất đa dạng tùy thuộc vào điều
kiện thời tiết. Triệu chứng bệnh trên lá: Vết bệnh ban đầu là những điểm nhỏ
màu xanh thẫm sau đó lan rộng ra có màu nâu thẫm, ranh giới giữa mô bệnh và
mô khỏe không rõ ràng. Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá sau đó
lan rộng vào phiến lá. Phần giữa vết bệnh hóa nâu đen do các đám mô bị chết
hóa nấu, xung quanh vết bệnh thường có đám cành bảo tử và bảo tử phân sinh
màu trắng. Khi thời tiết ẩm ướt hoặc buổi sáng có sương các đám bào tử phân
sinh này dày và xốp tạo ra một lớp trắng như sương muối ở mặt dưới lá bệnh.
Triệu chứng trên cuống lá, cành, và thân cây. Các vết bệnh lúc đầu nâu hoặc
thâm đen sau đó lan rộng ra xung quanh kết hợp với nhau tạo thành đoạn dài.
Trên thân vết bệnh kéo dài thành từng đoạn vỏ và thân cây thâm đen thối ướt.
Khi điều kiện độ ẩm xuống thấp vết bệnh chết tóp lại. Khi độ ẩm trên vết bệnh
có lớp cành bào tử và bào tử phân sinh trắng như sương muối bao phủ. Bệnh
làm cho thân cành bị thối mềm có mùi mốc. Triệu chứng trên củ khoai tây có
thể nhầm lẫn với một số bệnh thối củ do vi khuẩn có chung các đặc điểm như
có vết màu nâu lõm xuống. Tuy vậy, khi cắt ngang củ sẽ thấy các mô bệnh có
màu nâu xám lan rộng vào phía trong đôi khi còn ăn sâu vào trong lõi củ. Các
củ bị bệnh hoặc các lát củ này khi đạt nhiệt độ <20 oC và ẩm độ bão hòa có thể
quan sát thấy một lớp nấm trắng và cành bào tử phân sinh cũng như bào tử
phân sinh trên bề mặt củ.
3.5. Phát hiện bệnh mốc sương mai ở khoai tây bằng chỉ thị phân tử DNA
3.5.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là 76 mẫu giống khoai tây nhập nội từ ngân hang gen
khoai tây của trường đại học UC DAVIS, Hoa Kỳ được trình bày tại bảng sau.
Bảng 8. Các mẫu giống nghiên cứu.
ST Tên ST Tên mẫu STT Tên STT Tên
T mẫu T giống mẫu mẫu
giốn giôn giốn
g g g
19
 1 PI442690 20 PI243506 39 PI230468 58 PI458397
2 PI498094 21 PI218215 40 PI498110 59 PI230557
3 PI20881 22 PI338620 41 PI234013 60 PI292121
4 PI458395 23 PI283109 42 PI281112 61 PI338614
5 PI320315 24 PI595517 43 PI292075 62 PI338621
6 PI472772 25 PI558139 44 PI232841 63 PI320293
7 PI472934 26 PI225673 45 PI283096 64 PI320311
8 PI498104 27 PI338617 46 PI584496 65 PI281093
9 PI275161 28 PI245317 47 PI473073 66 PI310961
10 PI161172 29 PI175419 48 PI133619 67 PI458331
11 PI472735 30 PI320284 49 PI275163 68 PI473230
12 PI275189 31 PI310978 50 PI281066 69 PI473538
13 PI160215 32 PI473228 51 PI320342 70 PI161152
14 PI472759 33 PI472823 52 PI133636 71 PI217451
15 PI186553 34 PI279291 53 PI320292 72 PI133713
16 PI442688 35 PI472869 54 PI161350 73 PI175443
17 PI279276 36 PI243457 55 PI310986 74 PI279278
18 PI275235 37 PI225628 56 PI280977 75 PI473245
19 PI473402 38 PI473234 57 PI275240 76 PI472737

 Phương pháp nghiên cứu

 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm khảo sát tập đoàn được bố trí tuần tự không nhắc lại. Mỗi mẫu
giống 6-8 khóm, hàng cách hàng 30cm, khóm cách khóm 20cm. Trồng thành
từng ô thí nghiệm tách riêng.
 Quy trình kỹ thuật
- Làm đất: đất được cày lên, phơi ải.
-Thời vụ: Trồng vào cuối tháng 9/2013.
- Phân bón: phân chuồng 20 tấn/ha, phân lân 400kg/ha, phân ure 200kg/ha,
Kaliclorua 250kg/ha, bón lót toàn bộ phân hữu cơ khoai mục, phân lân và ⅟3
phân đạm. Bón thúc lần 1 với ⅟3 phân đạm, ⅟2 phân kali, khi cây có chiều cao
từ 10-15cm. Bón thúc lần 2 với 1/3 phân đạm, 1/2 phân kali sau khi bón thúc lần
một 15-20. Lưu ý: Không để phân bón tiếp xúc trực tiếp với củ giống và gốc
cây.
3.5.2. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a
 Tách chiết DNA
DNA được chiết xuất theo phương pháp CTAB.
 Hóa chất và đệm
- DEB (DNA Extraction Buffer): 4% CTAB, 1,5M NaCl, 100mM Tris-HCl,
20mM EDTA, 2%β-Mercaptoethanol. Hoà tan CTAB và các hóa chất khác
trong nước cất 2 lần bằng cách ủ trong waterbath ở 65oC. Thêm 2%β-
Mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng.
- TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTZ, pH 8.0.

20
 - Hóa chất khác: Phenol: Chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1),
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1), 100% ethanol, 76% ethanol.
 Quy trình chiết xuất DNA
- Thu các lá non vào buổi sáng.
- Cắt khoảng 100mg mô lá vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 350ml DEB, tiếp
tục thêm 350ml DEB và trộn đều trước khi chuyển sang nghiền mẫu khác.
- Ủ mẫu ở 65oC trong một giờ hoặc hơn. Ủ lâu hơn kết quả năng suất DNA pellet
cao hơn, sạch hơn.
- Chiết xuất với cùng thể tích 25:24:1 và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo ngược các
ống trong 5 phút, sau đó ly tâm mẫu trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm
để phân tách các pha, chuyển pha lỏng phía trên sang một tube 1,5ml mới. Từ
bước này tránh vortex, hút đi hút lại đặc biệt qua các đầu pipet thể tích nhổ, và
bất cứ thao tác nào gây ra lực cơ học để tránh đứt gãy DNA.
- Chiết với cùng thể tich 24:1, trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp rồi lật ngửa ống
trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm, chuyển pha lỏng
phía trên sang một tube mới.
- Tủa DNA với 2-2,5 lần thể tích ethanol lạnh 100% sao cho nồng độ khoảng
70%, nếu không thấy xuất hiện kết tủa trắng thì đặt mẫu ở -2oC trong khoảng
20 phút đến 2 tiếng hoặc qua đêm nếu thấy cần thiết.
- Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, tốc độ 13000 rpm.
- Đổ bỏ cồn, rửa pellet hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB.
CTAB đã được hòa tan trong ethanol, số còn lại được loại bỏ trong bước này.
Làm khô pellet khoảng 1 giờ và hòa tan trong 50ml TE.
- Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở hiệu
điện thế 100V trong khoảng 15 phút. Độ gọn và sáng của băng DNA cho biết
mức độ đứt gãy và nồng độ DNA tổng số.
3.5.3. Phân lập mẫu bệnh sương mai khoai tây
Phân lập nấm bệnh sương mai theo phương pháp của Dr.Fry’s laboratory in
Cornell, U.S.A and Dr.Shaw’s laboratory in Bangor. Thu thập mẫu bệnh và rửa
mẫu dưới vòi nước, lựa chọn các mô bệnh điển hình. Cắt mô bệnh thành những
miếng có kích thước 1cm x 1cm. Miếng cắt phải có cả mô bệnh và mô khỏe.
Khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 30 giây, sau đó rửa sạch bằng nước cất
vô trùng. Thấm khô miếng cắt bằng giấy thấm vô trùng, dùng kéo đã khử trùng
cắt vết bênh thành các miếng nhỏ 5x5mm. Đặt các mảnh mô cây vào môi
trường nghèo dinh duỡng WA, ở nhiệt độ 15oC, 16 giờ sáng/tối. Khi nấm đã
phát triển một lớp trắng xốp, lấy phần đầu sợi nấm cấy chuyển sang môi trường
V8 và đặt ở trong tủ định ổn 18oC trong điều kiện tối hoàn toàn.
 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Chuẩn bị 1 lít môi trường Water agar (WA) gồm: 15g agar, 1 lít nước cất, chuẩn
độ pH 6,5.Chuẩn bị 1 lít môi trường V8 bao gồm 200ml V8 juice, 3g CaCO 3,
15g Agar, 800ml nước cất, chuẩn độ pH 7,2. Hấp khử trùng hai môi trường ở
121oC, 1,5atm trong 30 phút. Sau đó để nguội đến 60-70 oC rồi đổ ra các đĩa
peptri đã được khử trùng và sử dụng để cấy nấm.
 Phương pháp thu bảo tử trên môi trường nhân tạo

21
 Cho vào đĩa peptri có nấm đã mọc lan kín đĩa từ 1-3ml nước cất vô trùng, dùng
bàn trang thủy tinh di nhẹ trên bề mặt của môi trường nhân tạo cho bào tử rời
ra khỏi sợi nấm sau đó chắt nước bào tử ra cốc hoặc bình định mức, Soi bào tử
trên kính hiển vi.
3.5.4. Đánh giá bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo
Lây nhiễm và đánh giá khả năng kháng nhiễm nhân tạo theo Umaeru and
Lihnell (1976), cụ thể như sau: Thu lá thứ tư từ ngọn xuống, mỗi giống thu 5
lá. Sau đó đặt trên đĩa peptri hoặc khay nhựa có dải lớp giấy thấm ở dưới sau
đó được nhỏ lên lá 1 giọt dung dịch bào tử với nồng độ 4.10 4 bào tử/ml. Lây
nhiễm xong khay nhựa chứa các lá lây nhiễm được ủ ở 18 oC trong 6 ngày sau
đó đánh giá về bệnh.
Diện tích vết bệnh <1,0cm2 thì kháng cao (HR).
Diện tích vết bệnh 1,1-2,5cm2 thì kháng (R).
Diện tích vết bênh 2,51-3,0cm2 thì nhiễm vừa (M).
Diện tích vết bệnh >6,0cm2 thì nhiễm nặng (S).
3.5.5. Kết quả PCR phát hiện gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a
Gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a là hai gen được các nhà khoa học chứng
minh là kháng tốt đối với các chủng Phytophthora infestans ở châu Á trong đó
có Việt Nam. Để0 chọn được giống khoai tây kháng được các chủng bệnh nấm
sương mai trước hết phải có nguồn gen kháng, sau đó phải phân lập chủng
bệnh nấm sương mai từ đó đánh giá để chọn được các gen không hữu hiệu
phục vụ đắc lực vào chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh này.
DNA của 76 mẫu giống khoai tây được chiết tách sau đó sử dụng chỉ thị R1F/R
(76-2sf2/76-2SR) để phát hiện gen kháng R1 và R3-1380 để phát hiện gen
kháng R3a. Khi nhân đoạn chỉ thị liên kết với gen R1 kích thước đoạn được
nhân lên là 1400bp nghĩa là có gen còn không đoạn nào được nhân lên nghĩa là
không có gen. Trong 76 mẫu, chúng tôi đã phát hiện được 5 mẫu chứa gen R1
đó là các mẫu giống: PI133713, PI320311, PI230557, PI133619, PI558139.

Hình 9. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng R1.
Giếng 3, 5 ,7 , 9 và 10 là đoạn chỉ thị được nhân lên liên kết với gen kháng R1, ở
các giếng còn lại các đoạn chỉ thị không được nhân lên. Đối với gen kháng
R3a, khi nhân đoạn chỉ thị liên kết với gen này kích thước đoạn nhân lên là
1380 đồng nghĩa là chứa gen. Còn giống không chứa gen thì DNA không được
nhân lên.

22
 Hình 10. Điện di sản phẩm chứa gen R3a.
Trong tổng số 76 mẫu giống, phát hiện được 7 mẫu chứa gen R3a là các
mẫu giống: PI175419, PI473234, PI234013, PI47307, PI338621, PI279278.
Chỉ thị phân tử đã phát hiện được 5 mẫu giống chứa gen kháng R1 và 7 mẫu
giống chứa gen kháng R3a. Những mẫu giống chứa gen R1 và R3a cần được
đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo xem có kháng được các chủng bệnh sương
mai của Việt Nam hay không. Nêu các giống chứa gen này kháng tốt thì đây là
nguồn vật liệu khởi đầu vô cùng quý giá để tạo ra các giống khoai tây mới
kháng bệnh.
Bảng 9. Mức độ nhiễm bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo
ST Tên mẫu giống Gen R1 Gen R3a Chủng Chủng
T SM1 SM2
1 PI442690 - - R S
2 PI498094 - - S S
3 PI20881 - - R M
4 PI458395 - - R R
5 PI320315 - - R R
6 PI472772 - - S S
7 PI472934 - - M M
8 PI498104 - - S R
9 PI275161 - - S R
10 PI161172 - - R R
11 PI472735 - - M R
12 PI275189 - - M R
13 PI160215 - - R R
14 PI472759 - - R R
15 PI186553 - - HR R
16 PI442688 - - S R
17 PI279276 - - R R
18 PI275235 - - R R
19 PI473402 - - S S
20 PI243506 - - S S
21 PI218215 - - R S
22 PI338620 - - R S
23 PI283109 - - M R
24 PI595517 - - S R

23
25 PI558139 + - HR HR
26 PI225673 - - R R
27 PI338617 - - M R
28 PI245317 - - S R
29 PI175419 - + HR HR
30 PI320284 - - S M
31 PI310978 - - S M
32 PI473228 - - R R
33 PI472823 - - HR R
34 PI279291 - - R M
35 PI472869 - - R M
36 PI243457 - - S M
37 PI225628 - - S S
38 PI473234 - + HR HR
39 PI230468 - - S R
40 PI498110 - - R R
41 PI234013 - + HR HR
42 PI281112 - - R R
43 PI292075 - - S R
44 PI232841 - - M R
45 PI283096 - - M M
46 PI584496 - + R M
47 PI473073 - - HR HR
48 PI133619 + - HR HR
49 PI275163 - - M S
50 PI281066 - - S M
51 PI320342 - + HR HR
52 PI133636 - - S M
53 PI320292 - - S M
54 PI161350 - - S M
55 PI310986 - - S M
56 PI280977 - - S M
57 PI275240 - - S M
58 PI458397 - - S R
59 PI230557 + - HR HR
60 PI292121 - - R R
61 PI338614 - - R R
62 PI338621 - + HR HR
63 PI320293 - - R S
64 PI320311 + - HR HR
65 PI281093 - - M S
66 PI310961 - - M S
67 PI458331 - - M S

24
 68 PI473230 - - M S
69 PI473538 - - S R
70 PI161152 - - R S
71 PI217451 - - R S
72 PI133713 + - HR HR
73 PI175443 - - R S
74 PI279278 - + HR HR
75 PI473245 - - R S
76 PI472737 - - R R

4. Tài liệu tham khảo

4.1. Tài liệu tham khảo tiếng Anh
 Daniel K.Dzidzienyo, Glenn J.Bryan, Gail Wilde, Timothy P.Robbins (2016).
Allelic diversity of S-RNase alleles in diploid potato species. Retrieved from:
https://doi.org/10.1007/s00122-016-2754-7
 Kazuo Watanabe (2015). Potato genetics, genomics, and applications. Retrieved
from: https://www.jstage.jst.go.jp/article/jsbbs/65/1/65_53/_html/-char/en

4.2. Tài liệu tham khảo tiếng Việt

 Lâm Mai Tùng (2015). Khảo sát chọn giống khoai tây kháng bệnh sương mai
bằng chỉ thị phân tử DNA. Truy cập ngày 24 tháng 6 năm 2021.

25