HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - - -  - - - -

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRONG CHỌN TẠO GIỐNG VÀ CÂY TRỒNG

ĐỀ TÀI:

Họ và tên : VŨ HƯƠNG GIANG

MSV : 637217
Lớp : K63 - CNSHC
Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 05/2021

1
 Mục Lục
1. Lão hóa là gì?...........................................................................................3
2. Lão hóa tế bào và lão hóa cơ quan.......................................................... 3
3. Dấu hiệu của sự lão hóa...........................................................................5
4. Ứng dụng RT-PCR nghiên cứu lão hóa.................................................. 9
5. Tài liệu tham khảo................................................................................. 16

2
1. Lão hóa là gì?
Lão hóa đặc trưng bởi sự mất dần tính toàn vẹn sinh lý, dẫn đến suy
giảm chức năng và tăng khả năng tử vong. Tình trạng suy giảm này là
yếu tố nguy cơ chính đối với các bệnh lý chính của con người bao gồm
ung thư, tiểu đường, rối loạn tim mạch và các bệnh thoái hóa thần kinh.
Nghiên cứu về lão hóa đã trải qua một bước tiến chưa từng có trong
những năm gần đây, đặc biệt với việc phát hiện ra rằng tốc độ lão hóa
được kiểm soát, ít nhất là ở một mức độ nào đó, bằng các con đường di
truyền và các quá trình sinh hóa được bảo tồn trong quá trình tiến hóa.
Lão hóa là sự suy giảm chức năng sinh lý phụ thuộc vào thời gian ảnh
hưởng đến hầu hết các cơ thể sống, được củng cố bởi những thay đổi
trong các con đường phân tử, và cũng là yếu tố nguy cơ sâu sắc nhất của
nhiều bệnh không lây nhiễm.
Một mặt, để xác định các dấu hiệu sinh học về lão hóa sẽ tạo điều kiện
phân biệt những người ở cùng độ tuổi thời gian nhưng có tỷ lệ lão hóa
khác nhau. Các chỉ thị sinh học định lượng về sự lão hóa cũng có thể xác
định một bảng đo lường cho 'sự lão hóa khỏe mạnh' và thậm chí xa hơn,
dự đoán tuổi thọ. Mặt khác, các dấu ấn sinh học về lão hóa cũng có thể hỗ
trợ các nhà nghiên cứu thu hẹp phạm vi nghiên cứu của họ vào một khía
cạnh sinh học cụ thể trong nỗ lực giải thích quá trình sinh học đằng sau
quá trình lão hóa hoặc các bệnh liên quan đến lão hóa. Các chỉ thị sinh
học kiểu hình có thể không xâm lấn, toàn cảnh và dễ lấy, trong khi các
chỉ thị sinh học phân tử có thể phản ánh một số cơ chế phân tử cơ bản
tình trạng tuổi tác.
Sự lão hóa tế bào được Hayflick và Moorfield mô tả lần đầu tiên vào
năm 1961, người ta đã quan sát thấy rằng các nguyên bào sợi bình thường
của người có tiềm năng sao chép hạn chế và cuối cùng không thể phục
hồi. Phần lớn các tế bào già có hình dẹt và to đặc trưng, và qua nhiều năm,
một số lượng lớn các kiểu hình phân tử đã được mô tả, chẳng hạn như
những thay đổi trong biểu hiện gen, xử lý protein và tổ chức nhiễm
sắc. Sự ngừng tăng trưởng chủ yếu xảy ra ở pha G1. Tế bào hình lưỡi
liềm duy trì hoạt động trao đổi chất và về cơ bản có thể tồn tại vô thời
hạn.
2. Lão hóa tế bào và lão hóa cơ quan
Có hai loại ảnh hưởng tới sự già đi của tế bào. Đầu tiên là do các
telomere bị rối loạn chức năng hoặc thông qua con đường ức chế khối u
gây tổn thương DNA. Trường hợp thứ hai, có thể không liên quan đến
telomere, được đặc trưng bởi sự điều hòa của gen CDKN2A (chất ức chế
kinase phụ thuộc cyclin p16 INK4a ).
Tuy nhiên, những sự khác biệt cơ bản này rất phức tạp bởi thực tế là
p16 có thể được điều chỉnh bởi nhiều loại phản ứng khác nhau, bao gồm
một số dạng tổn thương gen. Mối quan hệ giữa các lần phân chia tế bào

3
và sự khởi đầu sự lão hóa đã được nghiên cứu trong ống nghiệm, và dẫn
đến các đề xuất rằng sự lão hóa có thể góp phần vào các kiểu hình lão hóa
của sinh vật trong điều kiện in vivo. Quan điểm này được củng cố bởi
những phát hiện rằng các tế bào được thu thập từ người lớn tuổi hiến tặng
có khả năng nhân đôi trong điều kiện in vitro thấp hơn so với những tế
bào từ các cá thể trẻ . Sự tiêu hao dần dần của các telomere sau đó đã
cung cấp cơ chế phân tử cho sự phân chia tế bào.
Điều quan trọng cần lưu ý là sự phân chia tế bào có thể bị ảnh hưởng
đáng kể bởi các tác động bên ngoài, chẳng hạn như các loại phản ứng oxy
hóa, rút ngắn telomere. Mặc dù các tế bào lão hóa hiển thị một số kiểu
hình, người ta cũng cho rằng lão hóa có thể được coi là một dạng biệt hóa
giai đoạn cuối.
Các nghiên cứu gần đây đã thực sự cho thấy sự lão hóa tế bào là
một cơ chế ức chế khối u trong điều kiện in vivo quan trọng ở nhiều loại
mô người và chuột. Vai trò có thể có của lão hóa đối với rối loạn chức
năng liên quan đến tuổi thường được chứng minh bằng cách viện dẫn
khái niệm về viêm màng phổi đối kháng, cụ thể là các đặc điểm có lợi
(chẳng hạn như ức chế ung thư) dưới sự chọn lọc ở những cá thể hoạt
động sinh sản có thể có những tác động không được chọn lọc và không
mong muốn khi tuổi cao hơn.
Các telomere ngắn lại theo mỗi vòng nhân đôi bộ gen, cơ chế nhân
đôi ADN bằng mồi ARN. Tốc độ rút ngắn telomere tối thiểu trong tế bào
người, và có thể bắt nguồn từ quá trình xử lý ngoại phân tử ở các đầu
nhiễm sắc thể. Quá trình tiêu hao telomere có thể được đẩy nhanh bởi
một số yếu tố, chẳng hạn như tổn thương oxy hóa. Các telomere bị suy
giảm chức năng đủ để kích hoạt phản ứng lão hóa đầy đủ, và trong nhiều
trường hợp, nó là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng ngừng tăng
trưởng được quan sát thấy. Ngay cả một telomere bị rối loạn chức năng
đơn lẻ cũng có thể đủ để tạo ra sự lão hóa ở tế bào bị ảnh hưởng.
Các phương pháp chính xác để đo độ dài telomere đơn lẻ trong từng
tế bào, cũng như độ dài telomere trung bình trong quần thể tế bào đã được
phát triển và các nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ nghịch giữa chiều dài telomere và
tuổi tác trong một số mô. Một số lượng đáng kể các bệnh lý quan trọng
liên quan đến tuổi tác, chẳng hạn như bệnh tim mạch, tiểu đường và bệnh
Alzheimer có liên quan đến việc rút ngắn telomere, cũng như béo phì,
căng thẳng tâm lý và tình trạng kinh tế xã hội. Quan điểm dịch tễ học về
mối tương quan giữa chiều dài telomere bị ảnh hưởng bởi sự khác biệt
lớn giữa các cá thể về chiều dài telomere khi sinh, và tỷ lệ tiêu hao
telomere sau khi sinh.
Các telomere bị rối loạn chức năng kích hoạt phản ứng tổn thương
DNA tương tự như phản ứng gây ra bởi sự đứt gãy sợi kép, có thể được
hình dung trong các tế bào riêng lẻ bằng các ổ hạt nhân chứa dạng
phosphoryl hóa của biến thể histone. Sự xuất hiện của các ổ tổn thương

4
DNA tăng lên theo độ tuổi sao chép của sự lão hóa của sinh vật ở cả
chuột và động vật linh trưởng. Một số trạng thái bệnh tật của con người
có liên quan đến việc rút ngắn quá mức hoặc tăng chiều dài
telomere. Mặc dù các kiểu hình có thể khá đa dạng, tất cả đều bao gồm
một số dạng bệnh lý liên quan đến tuổi tác, lão hóa sớm và chết sớm. Ba
hội chứng được biết là do đột biến gen mã hóa telomerase
holoenzyme: rối loạn sừng hóa bẩm sinh, và một số trường hợp xơ phổi
vô căn. Bệnh nhân mắc chứng rối loạn tăng sừng bẩm sinh có vóc dáng
thấp bé, thiểu năng sinh dục và vô sinh, dị tật ở da và hệ tạo máu, điển
hình là tử vong do suy tủy xương. Nhiều bệnh lý tương tự cũng phát triển
ở những con chuột loại bỏ telomerase. Hội chứng được phát hiện gần đây
nhất, xơ phổi vô căn, là một bệnh gây chết người khởi phát ở người lớn
với xơ phổi hóa tiến triển sau đó suy hô hấp.
3. Dấu hiệu của sự lão hóa
 DNA và nhiễm sắc thể
Telomere là phức hợp ribonulceoprotein ở cuối nhiễm sắc thể và trở
nên ngắn hơn sau mỗi lần sao chép, vì telomerase, enzyme chịu trách
nhiệm sao chép của nó, không được biểu hiện thường xuyên trong tế bào
sinh dưỡng. Chiều dài của telomere trong bạch cầu có liên quan đến quá
trình lão hóa và tuổi thọ cũng như các bệnh liên quan đến tuổi tác.
Trong sửa chữa DNA, mối liên hệ giữa sửa chữa DNA có liên quan đến
quá trình lão hóa do sự tích tụ của các tế bào già hoặc sự sắp xếp lại bộ
gen. Gần đây hơn, liên kết này đã được chứng minh trực tiếp, và sự cảm
ứng có kiểm soát của đứt gãy chuỗi kép DNA trong gan chuột gây ra các
bệnh lý lão hóa và biểu hiện gen đã được chỉ ra. Hóa mô miễn dịch của γ-
H2AX (biến thể của histon) là một chỉ thị sinh học định lượng được thiết
lập về sự lão hóa vì H2AX là một biến thể của họ protein H2A và H2AX
được phosphoryl hóa, γ-H2AX, là thành phần ban đầu và thiết yếu của
các ổ tổn thương DNA và do đó, đây là một dấu hiệu đáng tin cậy về mức
độ tổn thương DNA. Các dấu hiệu huyết thanh về tổn thương DNA, bao
gồm CRAMP, EF-1a, stathmin, N-acetyl-glucosaminidase và chitinase.
Các nguyên bào sợi dưới da của những người hiến tặng trăm tuổi được
chứng minh là ít nhạy cảm hơn với tổn thương DNA do H2O2 gây ra so
với nguyên bào sợi từ những người hiến tặng trẻ và già. Các thí
nghiệm ex vivo như vậy cũng có thể là một dấu hiệu sinh học tiềm năng
của quá trình lão hóa.
Các sửa đổi biểu sinh (Epigenetic). Những thay đổi liên quan đến tuổi
trong mẫu ADN methylation, đáng chú ý được đo bằng đồng hồ biểu sinh,
là một trong những chỉ thị sinh học lão hóa tốt nhất được nghiên
cứu. Phân tích cấu hình methyl hóa trong máu cho thấy chỉ có ba vị trí
CpG có thể dự đoán tuổi với độ lệch tuyệt đối trung bình so với tuổi dưới
5 tuổi. Mối liên hệ giữa tuổi và sự methyl hóa DNA có thể được mở rộng
đến các bệnh liên quan đến tuổi tác, chẳng hạn như bệnh tiểu đường.

5
 RNA và transcriptome
Với sự tiến bộ nhanh chóng trong công nghệ giải trình tự RNA đơn
bào (RNA-seq), bắt đầu được ứng dụng vào nghiên cứu các chỉ thị sinh
học của quá trình lão hóa. Sự biến đổi biểu hiện giữa các tế bào, được đo
bằng RNA-seq đơn bào của các tế bào T được phân loại theo phương
pháp đo tế bào, có liên quan đến sự lão hóa và tính nhạy cảm với bệnh tật.
Các RNA không mã hóa. MicroRNA (miRNA) là một loại RNA
không mã hóa (có 21 đến 23 nucleotide) nhỏ, thông qua cơ chế bắt cặp
base, điều chỉnh một loạt các quá trình sinh học, bao gồm cả quá trình
trao đổi chất và quá trình lão hóa. Trong số đó, các miRNA tuần hoàn có
thể ổn định trong huyết tương bằng cách liên kết với các yếu tố protein
hoặc lipoprotein, do đó làm cho chúng dễ dàng tiếp cận các chỉ thị sinh
học. miR-34a là miRNA tuần hoàn đầu tiên được quan sát có mô hình
biểu hiện bị thay đổi trong quá trình lão hóa của chuột. Biểu hiện của nó
được phát hiện có tương quan với tình trạng mất thính lực do tuổi tác ở
chuột và người. miR-21 được định nghĩa là một chỉ thị sinh học gây viêm
trong một nghiên cứu về 365 miRNA trong huyết tương của người già và
khỏe mạnh. miR-151a-3p, miR-181a-5p và miR-1248 được báo cáo là
giảm đáng kể theo tuổi ở người, trong đó cả ba miRNA cũng cho thấy
dấu hiệu liên quan đến chứng viêm. miR-126-3p đã được phát hiện có
tương quan thuận với tuổi ở 136 đối tượng khỏe mạnh từ 20 đến 90
tuổi. Thông qua sự biểu hiện của GFP được điều khiển bởi các chất xúc
tiến miRNA. Nhận thấy rằng mức độ mir-71 , mir-246 và mir-239 ở tuổi
trưởng thành khác nhau giữa các cá nhân và dự đoán tuổi thọ.
RNA dài không mã hóa (lncRNA) là một lớp không đồng nhất của
RNA không mã hóa được định nghĩa là những bản phiên mã dài hơn 200
nucleotide và không có khung đọc mở rõ ràng. Hai đánh giá gần đây tóm
tắt vai trò của lncRNA trong quá trình lão hóa. LncRNA MIR31HG được
xác định là có khả năng điều hòa trong quá trình lão hóa do gen sinh ung
và cần thiết cho sự ức chế qua trung gian nhóm polycomb của locus
INK4A. Điều chỉnh giảm của lncRNA xảy ra trong quá trình lão hóa sao
chép và sự đánh gục của nó trong các nguyên bào sợi của phôi chuột gây
ra sự lão hóa thông qua sự rối loạn điều hòa chu kỳ tế bào. Meg3 được
điều hòa trong quá trình lão hóa tim mạch cũng như trong các tế bào nội
mô tĩnh mạch rốn ở người đang tuổi trưởng thành 40. Vì hầu hết các
nghiên cứu về lncRNA đều là những nghiên cứu mang tính lý thuyết,
lncRNA thông lượng cao, chẳng hạn như CRISPR-Cas9 của lncRNA
chức năng, sẽ là một bước hữu ích trong tương lai để hiểu các chức năng
của lncRNA trong quá trình lão hóa.
 Sự trao đổi chất
Hạn chế chế độ ăn uống là phương tiện bảo tồn nhất để kéo dài tuổi
thọ. Con đường truyền tín hiệu insulin / yếu tố tăng trưởng giống insulin
1 (IGF-1) (IIS), tham gia vào quá trình cảm nhận glucose, được phát hiện

6
sớm nhất và là con đường nổi tiếng nhất để chống lại tuổi thọ. Nghịch lý
thay, IGF-1 giảm ở chuột hoang dã hoặc chuột lão hóa sớm trong khi hoạt
động IIS suy giảm kéo dài tuổi thọ. Những quan sát như vậy dẫn đến khả
năng bao gồm các thành viên của con đường IIS, chẳng hạn như hormone
tăng trưởng và IGF-1, làm chỉ thị sinh học của sự lão hóa.
Mục tiêu cơ học của protein rapamycin (mTOR) cảm nhận được nồng
độ axit amin cao. Ức chế mTOR có thể kéo dài tuổi thọ. Không giống
như con đường IIS, hoạt động của mTOR tăng lên theo tuổi trong biểu
mô bề mặt buồng trứng của buồng trứng chuột và người già, góp phần
vào những thay đổi bệnh lý. Protein ribosome S6 được phosphoryl hóa
(p-S6RP, hoặc pS6) là mục tiêu và cũng là một dấu hiệu đã biết của tín
hiệu mTOR hoạt động , là chỉ thị sinh học tiềm năng của sự lão hóa như
được chỉ ra trong nghiên cứu về buồng trứng tuổi.
Trái ngược với chức năng IIS và mTOR, protein kinase kích hoạt 5'-
adenosine (AMP) và sirtuins cảm biến sự khan hiếm chất dinh
dưỡng. AMPK phát hiện mức AMP cao trong khi sirtuins là cảm biến có
mức NAD + cao và cả hai đều đánh dấu trạng thái năng lượng thấp. Việc
điều chỉnh hoạt động AMPK của metformin, một loại thuốc điều trị bệnh
tiểu đường loại II, có thể bắt chước một số lợi ích của việc hạn chế calo
và metformin kéo dài tuổi thọ ở chuột đực. AMPK được điều chỉnh theo
độ tuổi trong cơ xương.
Sirtuins có khả năng liên kết trực tiếp tín hiệu trao đổi chất của tế bào
(được phản ánh bởi NAD + ) với các biến đổi sau dịch mã của protein
thông qua một phản ứng hóa học (khử lysine). Trong quá trình lão hóa,
NAD + giảm và sirtuins giảm. Một phân tích về các nguyên của người cho
thấy rằng SIRT1 và SIRT6 được điều chỉnh giảm. SIRT1, SIRT3 và
SIRT6 được phát hiện bằng phương pháp Western blot cho thấy buồng
trứng của chuột ở độ tuổi giảm đáng kể. Trong tế bào đơn nhân máu
ngoại vi của con người, SIRT2 cũng giảm theo tuổi.
Trong chuyển hóa protein, carbamyl hóa protein là một trong những
biến đổi sau dịch mã không phải enzym xảy ra trong suốt vòng đời của
sinh vật, dẫn đến sự tích tụ trong mô của các protein carbamyl hóa. Nó
được coi là một dấu hiệu của lão hóa phân tử và có liên quan đến các
bệnh liên quan đến lão hóa, chẳng hạn như bệnh tim mạch.
Sản phẩm cuối glycation nâng cao (AGEs) là một nhóm không đồng
nhất của các phân tử hoạt tính sinh học được hình thành bằng cách
glycation không phải enzym của protein, lipid và axit nucleic. Sự tích tụ
AGEs trong các mô lão hóa dẫn đến chứng viêm, quá trình apoptosis, béo
phì và các rối loạn liên quan đến tuổi tác khác. AGE có thể được phát
hiện thông qua sắc ký lỏng hiệu năng cao, các kỹ thuật miễn dịch. N-
glycans là một loại glycoprotein có chuỗi đường liên kết với nitơ amide
của asparagin. Phổ của glycans liên kết N (N-glycome) hiện có thể được
nghiên cứu nhờ vào sự phát triển của các phương pháp thông lượng cao.

7
 Trong chuyển hóa lipid, chất béo trung tính được phát hiện là tăng
đơn điệu theo tuổi tác và do đó có thể là một dấu hiệu sinh học của sự lão
hóa. Các nghiên cứu về các mẫu huyết thanh bằng máy bắn súng
lipidomics đã phát hiện ra rằng phospho/sphingolipid là các chất đánh
dấu giả định và các chất điều biến sinh học đối với sự lão hóa khỏe
mạnh. Tuy nhiên, thiết kế của các nghiên cứu này có vấn đề ở chỗ họ có
một nhóm người cao tuổi là đối tượng kiểm soát lão hóa không khỏe
mạnh và so sánh họ với nhóm người già, nhưng hai nhóm rõ ràng là rất
khác nhau. lứa tuổi. Do đó, không rõ liệu sự khác biệt về tuổi tác hay sự
thành công của quá trình lão hóa khỏe mạnh đã góp phần tạo ra sự khác
biệt trong lipidomics.
 Stress oxy hóa và ty thể
Chỉ thị sinh học của stress oxy hóa từ lâu đã được coi là một loại dấu
ấn sinh học lão hóa. Các sản phẩm của quá trình oxy hóa gây hại cho
protein bao gồm o-tyrosine, 3-chlorotyrosine và 3-nitrotyrosine. 8-iso
prostaglandin F 2α là một chỉ thị sinh học đối với tổn thương
phospholipid. 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine và 8-hydroxyguanosine
được tạo ra do quá trình oxy hóa của axit nucleic. Nồng độ của các chỉ thị
sinh học này trong dịch cơ thể có thể được phát hiện thông qua sắc ký
lỏng hiệu năng cao và khối phổ. Shen và cộng sự đã thiết kế một protein
huỳnh quang màu vàng hoán vị vòng tròn (cpYFP) được biểu hiện
trong Caenorhabditis eleganschất nền ty thể như một cảm biến về stress
oxy hóa và những thay đổi về trao đổi chất.
Mặc dù các gốc tự do, nguồn gốc của stress oxy hóa, chủ yếu được
tạo ra trong ty thể, nhưng các ty thể bị rối loạn chức năng có thể góp phần
gây lão hóa độc lập với các loại oxy phản ứng. Để đo chức năng của ty
thể, các chiến lược lập hồ sơ đo hô hấp dựa trên máu và cơ có sẵn, và mối
liên hệ của báo cáo tiềm năng này với năng lực sinh học của các mô hoặc
kiểu hình khác.
 Sự già đi của tế bào
Trong các mô phân bào, sự tích tụ dần dần của các tế bào già được
cho là một trong những nguyên nhân gây ra lão hóa. Các chỉ thị sinh học
của sự già đi của tế bào cũng có thể được sử dụng làm chất đánh
dấu. Chất đánh dấu được sử dụng rộng rãi nhất là β-galactosidase (SAβ-
gal) và p16 INK4A liên quan đến sự lão hóa . SAβ-gal phản ánh khối
lượng lysosome tăng lên nhưng có thể mang lại kết quả dương tính giả vì
độ đặc hiệu thấp. SAβ-gal là chất đánh dấu tổn thương tế bào.
Các dấu hiệu tế bào tuổi già khác bao gồm phản ứng tổn thương DNA
được kích hoạt và dai dẳng, ngắn và rối loạn chức năng telomere, và kiểu
hình bài tiết liên quan đến tuổi già.
 Viêm và giao tiếp giữa các tế bào
SASP là hậu quả của sự lão hóa tế bào và có thể xảy ra ở những tế
bào, mặc dù trải qua chu kỳ tế bào, vẫn hoạt động về mặt trao đổi chất và

8
tiết ra protein. Các thành phần chính của các yếu tố SASP là các yếu tố
tín hiệu hòa tan, bao gồm interleukin, chemokine và các yếu tố tăng
trưởng. Các protein có liên quan đến SASP, chẳng hạn như interleukin-6,
yếu tố hoại tử khối u-alpha, protein hóa trị monocyte-1, metalloproteinase
nền và protein liên kết IGF, gia tăng trong nhiều mô với sự lão hóa theo
trình tự thời gian và xảy ra cùng với tình trạng viêm vô trùng.
Các DAMP, chẳng hạn như protein sốc nhiệt, histon, nhóm có tính di
động cao và S100, tạo thành một lớp phân tử được giải phóng sau khi bị
thương hoặc tế bào chết và làm trung gian cho phản ứng miễn dịch.
 Chỉ thị sinh học kiểu hình lão hóa
Chức năng thể chất và nhân trắc học là những phép đo thực tế nhất
trong số các dấu hiệu sinh học kiểu hình của sự lão hóa. Về vấn đề này,
tốc độ đi bộ, đứng trên ghế, thăng bằng khi đứng, lực cầm nắm, chỉ số
khối cơ thể, vòng eo và khối lượng cơ bắp đều được biết đến. Các phép
đo chức năng vật lý này, mặc dù đơn giản, thực sự có thể thực hiện tốt
hơn quá trình methyl hóa DNA về mối quan hệ với tình trạng sức khỏe
trong nghiên cứu nhân khẩu học.
Các kiểu hình số lượng của các đặc điểm bên ngoài của con người
cũng cho thấy mối quan hệ đáng kể với sự lão hóa. Các đặc điểm trên
khuôn mặt được định lượng dựa trên hình ảnh ba chiều (3D) trên khuôn
mặt, chẳng hạn như chiều rộng miệng, chiều rộng mũi và sụp mí ở góc
mắt, có liên quan nhiều đến tuổi tác. Trên thực tế, hình ảnh khuôn mặt 3D
có thể được sử dụng để định lượng tuổi sinh học của một cá nhân.
 Tích hợp các chỉ thị sinh học lão hóa
Các chỉ thị sinh học về lão hóa có thể được sử dụng để dự đoán tuổi
sinh lý, phản ánh tình trạng sức khỏe của họ, thông qua số liệu thống kê
và thuật toán học máy. Có thể sử dụng một lớp chỉ thị sinh học duy nhất,
về bản chất là một ma trận các đặc điểm, có thể được sử dụng trong dự
đoán. Quá trình methyl hóa DNA được sử dụng để dự đoán tuổi với sai số
khoảng 3,6 năm bằng cách sử dụng 8.000 mẫu. Hình ảnh khuôn mặt 3D
cũng được sử dụng để dự đoán tuổi với độ lệch trung bình là 6 tuổi.
4. Ứng dụng RT-PCR nghiên cứu lão hóa
 Nguyên liệu và phương pháp
HDFs và nguyên bào sợi BJ được nuôi cấy trong môi trường
Modified Eagle's Medium của Dulbecco (Biowest, Riverside, MO, USA)
và bổ sung 10% huyết thanh bò thai, 1% GlutaMAX và 1% penicillin-
streptomycin. HMECs được lấy từ mô giảm tạo hình tuyến vú của 5
người hiến tặng: 48R (16 tuổi), 240L (19 tuổi), 112R (61 tuổi), 122L (66
tuổi) và 429ER (72 tuổi); hoặc không phải khối u ngoại vi chứa mô cắt bỏ
vú của 1 người hiến tặng: 353P (72 tuổi). HMECs được nuôi cấy bằng
cách sử dụng môi trường M87A bổ sung độc tố và oxytocin, với việc bổ
sung 100 U / mL penicilin và 100 µg / mL của streptomycin. Tất cả các
thí nghiệm với tế bào HMEC đều được thực hiện với số lần nhân đôi dân

9
số <20, được tính từ bước 2. Điều kiện ủ cho tất cả các loại tế bào là 37°C
và 5% CO 2 trong môi trường.
 Cảm ứng và phát hiện huỳnh qunag
BJ hTERT ER đang phát triển theo cấp số nhân: Nguyên bào
sợi Ras được xử lý với 200nM 4-OHT trong 8 ngày để tạo ra sự lão
hóa. Sau khi xử lý 4-OHT, các tế bào được cố định bằng 2%
formaldehyde-0,2% glutaraldehyde trong 1x PBS trong 10 phút ở nhiệt
độ phòng, rửa bằng 1x PBS và xử lý trong 12 giờ với H2O chứa 40 mM
đệm citrate-phosphate (pH 6), 2mM MgCl2, 150mM NaCl, 1mg/ml X-
Gal, và 5mM kali ferricyanide và kali ferrocyanide. Điều trị này dẫn đến
sự hiện diện của chất kết tủa nhuộm xanh trong các tế bào già. Các tế bào
sau đó được rửa bằng 1xPBS, metanol và nước cất. Tổng số 100 tế bào đã
được chụp và định lượng cho mỗi điều kiện.
 Tách chiết RNA và tổng hơp cDNA
Các tế bào hợp lưu được rửa một lần bằng PBS đá lạnh. Sau đó, PBS
được hút và thuốc thử TRIzol (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,
MA, USA) được thêm vào. Sau khi trộn kỹ, dịch chiết được giữ ở -80°C
cho đến khi thu thập được toàn bộ RNA từ tất cả các mẫu. Sau khi làm
tan băng chiết xuất TRIzol, chloroform được thêm vào với tỷ lệ 1:5 (v/v),
và RNA được tách khỏi DNA và protein bằng cách ly tâm. 200 μL pha
nước sau đó được trộn với cùng một lượng dung dịch ly giải của bộ
Maxwell RSC đơn giản RNA kết hợp với hệ thống Maxwell (Promega,
Madison, WI, USA). Nồng độ và độ tinh khiết của RNA được đánh giá
bằng máy quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA, USA). Các mẫu RNA có tỷ lệ độ hấp thụ OD 260/280
trong khoảng 1,8–2,1 và OD 260/230 giữa 2–2,2 được sử dụng để phân
tích thêm. Chất lượng của các mẫu RNA được kiểm tra bằng điện di trên
chip trên Máy phân tích sinh học Agilent 2100 theo quy trình của nhà sản
xuất (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Số toàn vẹn RNA
(RIN) cho tất cả các mẫu RNA là 10, là giá trị toàn vẹn RNA tối đa.
cDNA sợi đơn được tổng hợp từ 1µg RNA tổng số với thể tích cuối
cùng là 20µL. Với mục đích này, bộ tổng hợp iScript cDNA (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA) đã được sử dụng và tuân theo hướng dẫn của nhà
sản xuất. cDNA được bảo quản ở -20°C để sử dụng trong tương lai. Các
sản phẩm cDNA được kiểm tra về sự nhiễm bẩn DNA bộ gen bằng cách
sử dụng điện di trên gel agarose.
 Lựa chọn gen và thiết kế đoạn mồi
Tám gen đã được chọn để kiểm tra tính ổn định của chúng giữa các
quá trình lão hóa khác nhau. Từ tám gen, các cặp
mồi ACTB , OAZ1 và TMEM199. Phần còn lại của bộ mồi được thiết kế
bằng phần mềm trực tuyến Primer3, và sau khi xác nhận bằng silico với
UCSC Genome Browser, được mua từ Condalab (Metabion, Munich,
Đức).

10
 PCR định lượng và tính toán hiệu quả mồi
Các phản ứng PCR định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng
SYBR Green Supermix phổ quát (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) trên
máy tuần hoàn nhiệt CFX96 với phần mềm Bio-Rad CFX Manager (Bio-
Rad, Hercules, CA, USA). 50ng cDNA được sử dụng cho mỗi phản
ứng. Chương trình khuếch đại được bắt đầu ở 95 ° C trong 3 phút, sau đó
là 40 chu kỳ 10 giây ở 95 ° C và 30 giây ở 60 ° C. Sau khi khuếch đại,
một chu kỳ biến tính nhiệt bổ sung (nhiệt độ dao động từ 65°C đến 95°C
với gia số 0,5°C) được thực hiện để thu được các sản phẩm RT-qPCR và
xác minh tính đặc hiệu của bộ khuếch đại. Các phản ứng cho mỗi mẫu
được chạy trong ba lần, trừ khi có quy định khác. Hiệu quả của mồi RT-
qPCR được thử nghiệm cho từng cặp mồi bằng cách sử dụng độ pha
loãng nối tiếp 10 lần cDNA được chọn trong số các mẫu. Giá trị chu kỳ
ngưỡng trung bình (Ct) cho mỗi độ pha loãng nối tiếp được vẽ biểu đồ
dựa trên logarit của hệ số pha loãng cDNA. Hiệu quả của mồi RT-qPCR
được tính theo công thức sau:

Hiệu suất của tất cả các cặp mồi được thiết kế nằm trong khoảng từ
80% đến 110%, được coi là giá trị hiệu quả tối ưu.
 Phân tích dữ liệu
Để đánh giá tính ổn định của các gen, hai thuật toán bổ trợ trong
Microsoft Excel đã được áp dụng, NormFinder và geNorm . NormFinder
cung cấp bảng xếp hạng các gen được thử nghiệm dựa trên giá trị ổn định
được tính toán từ các biến thể biểu hiện gen trong và giữa các nhóm.
GeNorm tính toán giá trị M , một thước đo độ ổn định cho mỗi gen
tham chiếu. Giá trị M thấp cho thấy độ ổn định biểu thức cao hơn. Gien
có chữ M giá trị trên 1,5 được coi là không phù hợp để chuẩn hóa. Thuật
toán xác định hai gen tham chiếu ổn định nhất bằng cách loại trừ từng
bước gen kém ổn định nhất. GeNorm cũng tính toán số lượng gen cần
thiết để bình thường hóa tối ưu. Ngoài ra, nó so sánh sự biến đổi theo cặp
(V) của hai gen ổn định nhất với các gen còn lại; do đó, nó tính giá trị V
của Vn/Vn+1 giữa hai hệ số chuẩn hóa tuần tự. Một biến thể của
Vn/Vn+1 dưới 0,15 cho thấy rằng không cần gen để bình thường hóa.
 Các kết quả
Để xác định tác động của lão hóa đối với sự ổn định của các gen, sử
dụng ba mô hình lão hóa. Mô hình đầu tiên được kiểm tra là mô hình OIS,
được thiết lập trong các nguyên bào sợi bao quy đầu BJ sơ cấp của con
người bất tử (BJ fibroblasts) được chuyển nạp với gen sinh ung thư H-
RAS được hợp nhất với liên kết phối tử 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)
phản ứng với Estrogen Receptor (ER) . Sau tám ngày điều trị 4-OHT, các

11
tế bào được nhuộm màu cho hoạt động của beta-galactosidase (SA-βgal)
liên quan đến lão hóa. Tỷ lệ nguyên bào sợi BJ hiển thị hoạt tính SA-βgal
sau điều trị 4-OHT cao hơn đáng kể (60,25%) so với điều kiện đối chứng
(2,85%). Mô hình thứ hai được sử dụng làm mô hình lão hóa trong ống
nghiệm , bao gồm nuôi cấy nối tiếp các nguyên bào sợi da sơ cấp của con
người (HDFs), cho phép phân tích sự biểu hiện của gen trong một môi
trường không đổi theo thời gian. Các HDF sơ cấp có tiềm năng tăng
trưởng hạn chế và đạt đến giới hạn sao chép của chúng sau 30 lần nuôi
cấy. Do đó, chúng tôi đã thiết lập sự phân biệt giữa các tế bào trẻ (chuyển
đoạn sớm, EP), đó là các tế bào có ít hơn 10 đoạn trong nuôi cấy và các tế
bào già (chuyển đoạn muộn, LP), là các tế bào có hơn 20 đoạn trong nuôi
cấy. Cuối cùng, chúng tôi sử dụng tế bào biểu mô tuyến vú của người
(HMEC) lấy từ mô khỏe mạnh của những người hiến tặng trẻ (≤19 tuổi)
và già (≥61 tuổi) làm mô hình cho quá trình lão hóa trong điều kiện in
vivo .Để đánh giá hiệu suất xét nghiệm RT-qPCR, trước tiên chúng tôi
tính toán hiệu quả khuếch đại cho tất cả các cặp mồi được phân tích trong
nghiên cứu này.
Hiệu quả của mồi RT-qPCR thu được, hiệu suất mồi nằm trong
khoảng 85,61% đến 104,61%, và các đường cong tiêu chuẩn cho thấy độ
tuyến tính cao với hệ số tương quan (R2) giữa 0,971 và 0,999. Đánh giá
các đường cong nóng chảy cho thấy các đỉnh đơn cho mỗi cặp mồi, điều
này xác nhận tính đặc hiệu của các bộ khuếch đại.

Đánh giá hiệu quả của mồi RT-qPCR. Hiệu suất khuếch đại cho mỗi
chu kỳ ngưỡng mồi (Ct) và logarit của nồng độ cDNA ban đầu được vẽ
để tính toán độ dốc (S) của mỗi cặp mồi. Các đường cong chuẩn được tạo
ra từ ít nhất bốn điểm pha loãng cho mỗi cặp mồi. Phản ứng RT-qPCR
cho mỗi mẫu được chạy lặp lại, với độ lệch chuẩn <0,85.

12
 Thống kê các gen tham gia RT-qPCR
Để nghiên cứu hồ sơ biểu hiện của các gen trong các mô hình lão hóa
khác nhau, các thí nghiệm RT-qPCR đã được thực hiện và giá trị ngưỡng
chu kỳ trung bình (Ct) cho mỗi gen được tính toán và sự biến đổi trong
biểu hiện giữa các mẫu khác nhau, được xác định là hệ số của biến thể
(CV), thu được cho mỗi gen. CV phải nhỏ cho một gen; do đó, chúng tôi
cho rằng một gen tham chiếu ổn định và đáng tin cậy phải có CV thấp
hơn 2.
Trong mô hình OIS, hầu hết các gen cho thấy rất ít biến thể biểu hiện
trong nhóm, với PUM1 , HPRT1 và TBP là các gen biểu hiện mức độ
biểu hiện ổn định nhất (CV <2 đối với nguyên bào sợi BJ kiểm soát và
già), vì giá trị Ct không đổi trong các tế bào kiểm soát và già
đi. OAZ1 và TMEM199 hiển thị các biến thể mạnh mẽ trong nhóm, hiển
thị giá trị CV cao nhất. Trong nguyên bào sợi BJ tuổi
già, GAPDH và ACTB cho thấy mức độ biểu hiện của chúng giảm đáng
kể mạnh nhất so với đối chứng nguyên bào sợi. Để so sánh các biến thể
trong biểu hiện gen với sự lão hóa, một chiều giữa các đối tượng
ANOVA sử dụng giá trị Ct của mỗi gen đã được tiến hành, cho thấy tác
động đáng kể của OIS đối với biểu hiện gen [F (15, 76) = 2.045, p  =
0,0224]. Mức độ biểu hiện GAPDH thay đổi giữa kiểm soát (giá trị Ct
trung bình: 19,48; độ lệch chuẩn (SD: 0,40) và nguyên bào sợi BJ tuổi già
(giá trị Ct trung bình: 17,11; SD: 0,21). Tương tự, các mức biểu hiện
của ACTB hiển thị các biến thể trong nhóm thấp, nhưng chúng khác biệt
đáng kể giữa đối chứng (giá trị Ct trung bình: 19,66; SD: 0,42) và nguyên
bào sợi BJ tuổi già (giá trị Ct trung bình: 17,90; SD: 0,44) (Kiểm tra hậu
kỳ Bonferroni; p  <0,001). Những kết quả này cho thấy
PUM1 , HPRT1 và TBP là các gen ổn định nhất cho các nghiên cứu biểu
hiện trong OIS.

13
 Giá trị Ct của tám gen trong các mô hình lão hóa khác nhau và số
lượng gen tối ưu cần thiết để chuẩn hóa chính xác được tính bằng
geNorm. ( a ) lão hóa do gen gây ung thư ở nguyên bào sợi BJ, ( b ) lão
hóa trong điều kiện in vitro ở HDFs và ( c ) lão hóa trong điều kiện in
vivo ở HMECs từ những người hiến tặng trẻ và già. ( d ) Biến thiên theo
cặp (Vn/n+1) của các gen được geNorm thu được để xác định số lượng
gen cần thiết để chuẩn hóa chính xác trong mỗi mô hình lão hóa. Một
đường không liên tục biểu thị sự biến thiên theo cặp (V) là 0,15, giá trị
giới hạn được xác định bởi geNorm. Viết tắt: 4-OHT: 4-
Hydroxytamoxifen; Ct: ngưỡng chu kỳ; HDFs: Nguyên bào sợi da ở
người; HMECs: Tế bào biểu mô tuyến vú ở người; EP: đoạn đầu
(<10); LP: đoạn muộn (> 20); YDs: các nhà tài trợ trẻ tuổi; ADs: các nhà
tài trợ lớn tuổi.
Lưu ý: các hộp bao gồm các giá trị từ phân vị thứ 25 đến 75, đường
kẻ ngang hộp biểu thị giá trị trung bình và râu hiển thị giá trị tối thiểu và
tối đa cho mỗi gen tham chiếu. Thử nghiệm ANOVA một chiều đã được
tiến hành. .
Về sự biểu hiện của các gen trong HDFs ở điều kiện in vitro tuổi già,
chúng tôi nhận thấy GUSB và PUM1 có các biến thể biểu hiện trong
nhóm thấp nhất, được phản ánh bởi giá trị CV nhỏ nhất trong EP và LP
HDFs. Ngược lại, mức độ biểu hiện trong nhóm thay đổi cao nhất được
phát hiện đối với OAZ1 và TBP (CV> 2). Chúng tôi cũng phát hiện ảnh
hưởng đáng kể của tuổi trong điều kiện in vitro của HDFs lên biểu hiện
gen sau khi tiến hành thử nghiệm ANOVA một chiều [F (15, 73) =
2,337, p  = 0,0086]. Bài kiểm tra Bonferroni cho thấy mức độ biểu hiện
của GAPDH thay đổi đáng kể giữa sớm (giá trị Ct trung bình: 22,74; SD:
0,33) và muộn (giá trị Ct trung bình: 20,46; SD: 0,23) HDFs đoạn ( p  =

14
0,0177). Mức độ biểu hiện của HPRT1 cũng được tìm thấy thay đổi đáng
kể giữa EP (giá trị Ct trung bình: 25,65; SD: 0,41) và LP (giá trị Ct trung
bình: 28,48; SD: 0,42) HDFs (thử nghiệm Bonferroni post-hoc; p  =
0,0048). Do đó, GUSB và PUM1 dường như là các gen phù hợp nhất để
phân tích biểu hiện trong các mô hình lão hóa trong ống nghiệm.
 Sự ổn định biểu hiện của gen
Để chọn các gen thích hợp cho từng mô hình lão hóa khác nhau, các
gen được xếp hạng dựa trên độ ổn định biểu hiện của chúng, được đánh
giá bằng hai thuật toán thống kê, NormFinder và geNorm. Tuy nhiên, khi
đối mặt với sự khác biệt giữa các phương pháp này, các gen được đề xuất
luôn là gen gần với gen ổn định nhất, phản ánh khả năng của chúng là gen
phù hợp.
Trong OIS, cả NormFinder và geNorm đều tiết lộ rằng gen kém ổn
định nhất là OAZ1 , tiếp theo là TMEM199. Các gen này thể hiện mức độ
biến đổi cao trong hồ sơ biểu hiện của chúng. Ngược lại, NormFinder và
geNorm chỉ ra rằng các gen phù hợp nhất để sử dụng làm gen là PUM1 ,
tiếp theo là TBP và HPRT1.
 Xác định gen được chọn
Để xác nhận các gen được các thuật toán thống kê chọn để tham gia
quá trình chuẩn hóa. Chọn các gen có mức độ biểu hiện được chứng minh
là thay đổi theo sự lão hóa hoặc già đi. Đối với mỗi quá trình lão hóa, dữ
liệu được chuẩn hóa thành ba nhóm gen riêng biệt. Phù hợp với kết quả
của thuật toán NormFinder và geNorm, chúng tôi đã chọn một gen ổn
định nhất, sự kết hợp được khuyến nghị của hai gen và gen ứng viên có
độ ổn định thấp nhất.
Trong số các đặc điểm khác nhau của sự lão hóa, sự gia tăng biểu
hiện của CDKN1A đã được sử dụng rộng rãi như một chỉ thị sinh học để
xác định các tế bào tuổi già. Do đó, chúng tôi quyết định kiểm tra hồ sơ
biểu hiện CDKN1A trong kiểm soát và nguyên bào sợi BJ già đi. Sự biểu
hiện của CDKN1A cũng được điều chỉnh đáng kể trong các nguyên bào
sợi BJ cao tuổi sau khi điều chỉnh gen PUM1 và TBP. Những phát hiện
này xác nhận rằng sự kết hợp của PUM1 và TBP cũng đáng tin cậy để
phân tích những thay đổi biểu hiện của các gen mục tiêu trong quá trình
OIS. Tuy nhiên, khi gen kém ổn định nhất OAZ1 , được sử dụng để
chuẩn hóa dữ liệu, không có sự khác biệt thống kê nào về biểu
hiện CDKN1A được phát hiện giữa tế bào bình thường và tế bào
già. Trên thực tế, kiểu biểu hiện CDKN1A thể hiện một xu hướng ngược
lại, giảm ở độ tuổi lão hóa thay vì tăng lên khi OAZ1 được sử dụng làm
gen tham chiếu.
Phản ứng chuỗi polymerase định lượng phiên mã ngược (RT-qPCR)
đã trở thành một cách tiếp cận hiệu quả để phân tích biểu hiện gen nhạy
cảm. Các xét nghiệm RT-qPCR đáng tin cậy dựa trên việc chuẩn hóa kết
quả cho các gen ổn định. Tổng hợp những dữ liệu này lại với nhau đánh

15
giá tính ổn định biểu hiện của tám gen thường được sử dụng trong ba mô
hình lão hóa: lão hóa do ung thư gây ra (OIS), in vitro và in vivo sự lão
hóa. Sử dụng thuật toán NormFinder và geNorm, chúng tôi xác định rằng
các cặp gen ổn định nhất là PUM1 và TBP trong
OIS, GUSB và PUM1 cho quá trình lão hóa trong điều kiện in
vitro và GUSB và OAZ1 cho quá trình lão hóa trong điều kiện in vivo. Để
xác thực các ứng cử viên này, chúng tôi đã sử dụng chúng để chuẩn hóa
dữ liệu biểu hiện của các gen CDKN1A , APOD và TFRC , mà biểu hiện
được biết là bị ảnh hưởng trong OIS, in vitro và in vivo sự lão
hóa. Nghiên cứu này chứng minh rằng việc chuẩn hóa chính xác dữ liệu
RT-qPCR là rất quan trọng trong nghiên cứu lão hóa và cung cấp một tập
hợp con cụ thể của các gen ổn định cho các nghiên cứu lão hóa trong
tương lai.
5. Tài liệu tham khảo
 Lourdes Gonzalez-Bermudez (2019). Identification of reference genes
for RT-qPCR data normalisation in aging studies. Retrieved from:
https://www.nature.com/articles/s41598-019-50035-0
 Carlos López-Otín (2013). The Hallmarks of Aging. Retrieved from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3836174/
 Jessie C.Jeyapalan (2008). Cellular senescence and organismal aging.
Retrieved from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3297662/

16