SH3060-Chẩn đoán phân tử và liệu pháp gen

CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
& LIỆU PHÁP GEN

MỤC LỤC
Chương 1: Một số khái niệm cơ bản trong chẩn đoán.......................................5
1.1. Chẩn đoán.......................................................................................................5
1.2. Sàng lọc...........................................................................................................6
1.3. Đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u...................................................................................6
1.4. Các vấn đề cơ bản trong chẩn đoán................................................................8
1.4.1. Nhận diện mẫu.........................................................................................8
1.4.2 Lập luận xác suất.......................................................................................9
1.4.3. Ý kiến nguyên nhân.................................................................................9
Chương 2: Một số kỹ thuật chẩn đoán bệnh.....................................................10
2.1. Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm..............................................................................10
2.2. Kỹ thuật tế bào học.......................................................................................11
2.2.1. Nhuộm in vitro.......................................................................................11
2.2.2. Nhuộm in vivo........................................................................................19
2.3. Phương pháp miễn dịch học..........................................................................20
2.3.1. Western blot...........................................................................................20
2.3.2. Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry).........................................24
2.3.3. Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA)....................................26
2.3.4. Xét nghiệm ngưng kết (Agglutination test)............................................31
2.3.5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)....................................34

2.4. Phương pháp FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)...............................39
2.4.1. Các kiểu mẫu dò trong FISH.................................................................42
2.4.2. Hai kiểu tế bào sử dụng FISH................................................................43
2.5. Phương pháp FLOW CYTOMETRY...........................................................47
2.5.1. Khái niệm...............................................................................................47
2.5.2. Lịch sử....................................................................................................47
2.5.3. Nguyên tắc hoạt động............................................................................48
2.5.4. Phân tích kết quả....................................................................................55
2.6. Phương pháp khuếch đại nucleic acid...........................................................60
2.6.1. Chuẩn bị mẫu.........................................................................................61
2.6.2. Khuếch đại.............................................................................................64
2.6.3. Phát hiện và phân tích............................................................................72
2.6.4. Giải trình tự nucleic acid........................................................................85
2.6.5. Sử dụng chip trong phân tích.................................................................89
Chương 3: Ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán..................................................90
3.1. Chẩn đoán bệnh nhiễm..................................................................................90
3.1.1. Quan sát thông qua kính hiển vi............................................................90
3.1.2. Nuôi cấy và xác định..............................................................................91
3.1.3. Tìm kiếm bằng chứng qua sự đáp ứng của cơ thể.................................92
3.1.4. Phương pháp miễn dịch.........................................................................93
3.1.5. Phương pháp sử dụng nucleic acid........................................................94

3.2. Chẩn đoán ung thư........................................................................................95
3.2.1. Sàng lọc và phát hiện sớm.....................................................................95
3.2.2. Chẩn đoán thông thường........................................................................98
3.2.3. Chẩn đoán phân tử...............................................................................101
3.3. Chẩn đoán bệnh di truyền...........................................................................105
3.3.1. Chẩn đoán trước làm tổ (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD)105
3.3.2. Chẩn đoán tiền sinh (Prenatal diagnosis).............................................109
Chương 4: Một số khái niệm cơ bản trong liệu pháp gen..............................118
4.1. Giới thiếu....................................................................................................118
4.2. Tế bào mục tiêu...........................................................................................120
4.2.1. Tế bào sinh dưỡng................................................................................120
4.2.2. Tế bào sinh dục....................................................................................121
Chương 5: Liệu pháp gen.................................................................................123
5.1. Lịch sử nghiên cứu liệu pháp gen...............................................................123
5.2. Chiến lược liệu pháp gen............................................................................127
5.2.1. Liệu pháp in vivo..................................................................................127
5.2.2. Liệu pháp ex vivo.................................................................................128
5.3. Vector có bản chất virus dùng trong liệu pháp gen.....................................130
5.3.1. Vector có bản chất virus.......................................................................131
5.3.2. Vector retrovirus (Rv).........................................................................132
5.3.3. Vector adenovirus (Ad)........................................................................147

5.3.4. Hệ thống vector virus kết hợp với Adeno............................................158
5.3.5. Hệ thống vector virus simplex herpes..................................................163
5.3.6. Những vector virus khác......................................................................168
5.4. Vector không phải virus dùng trong liệu pháp gen.....................................168
5.4.1. DNA và RNA được khuếch đại trong vi khuẩn và tế bào eukaryote...168
5.4.2. Oligonucleotide....................................................................................174
5.4.3. Ribozyme.............................................................................................198
5.4.4 Triplex DNA.........................................................................................214
5.4.5. SMaRT.................................................................................................216
Chương 6: Sự tồn tạo gen liệu pháp trong tế bào và nhóm gen mục tiêu.....218
6.1. Sự tồn tại gen liệu pháp trong tế bào..........................................................218
6.2. Nhắm gen mục tiêu.....................................................................................219
6.3. Ứng dụng.....................................................................................................220
6.3.1. Chữa bệnh di truyền.............................................................................220
6.3.2. Chữa bệnh ung thư...............................................................................243
6.3.3. Chữa bệnh nhiễm, bệnh mắc phải........................................................248
6.3.4. Liệu pháp gen ứng dụng trong cấy ghép..............................................250
6.3.5. Liệu pháp gen và việc “thiết kế con người”.........................................251

Chương 1: Một số khái niệm cơ bản trong chẩn đoán
1.1. Chẩn đoán
Trong y học, chẩn đoán (diagnosis) là quá trình xác định điều kiện y học
hay bệnh từ các dấu hiệu (sign) hay triệu chứng (symptom) và từ các kết quả
cộng gộp của nhiều quá trình chẩn đoán khác, kể cả hoàn cảnh. Các kết luận của
thể được tổng hợp từ quá trình này được gọi là chẩn đoán. Thuật ngữ
“diagnosis” có nguồn gốc từ chữ “dia” nghĩa là “bởi” (by) và từ chữ “gnosis” có
nghĩa là biết (knowledge).
Cách đây hơn 2000 năm, Hippocrate đã ghi nhận sự liên hệ giữa bệnh và di
truyền. Tương tự, Pythagorat đã ghi chú sự liên hệ giữa chuyển hóa và di truyền.
Tuy nhiên, chỉ gần đây cộng đồng y học mới thừa nhận vai trò quan trọng của di
truyền học và nó đã trở thành một bộ phận tất yếu của y học ngày nay.
Những năm đầu thập niên 1990. Willian Osler đã đưa ra những sáng kiến về
thực hành y học. Theo Osler, chức năng của bác sĩ là xác định bệnh và các biểu
hiện của nó, hiểu được các cơ chế của nó, làm thế nào để ngăn chặn và chữa trị.
Ý tưởng của Osler vẫn được tiếp tục đến ngày nay, vấn đề cơ bản của chiến lược
này là “bệnh mà bệnh nhân mắc là gì và cách tốt nhất chữa trị cho bênh đó là
như thế nào?”.
Người nối nghiệp William Osler là Archibald Garrod. Trong khi Osler đề ra
các nguyên lý nền tảng mà y học nên tiến hành, thì Garrod đặt những nguyên lý
này trong ngữ cảnh lớn hơn. Chẳng hạn bệnh lí gắn chặt với các tính chất đặc
trưng của từng cá nhân về hóa học được di truyền và tùy thuộc vào các cơ thể
của sự chọn lọc tiến hóa. Ý tưởng của Osler về thực hành y khoa đã thống trị
sinh lý y học ngày nay. Bệnh nhân là tập hợp các triệu chứng, được xác định và
5
phân tích thuật toán để đưa ra một chẩn đoán, đồng thời đưa ra một chiến lược
chữa trị hiệu nghiệm nhất.
Khái niệm của Garrod về tính chất sinh lý của cá thể được khẳng định khi
bộ gen người được giải mã thành công. Những mối quan hệ tinh vi giữa di
truyền, tính chất sinh học cá thể và môi trường trở nên rõ ràng, thông qua các
biến đổi được phát hiện trong DNA. DNA của mỗi bệnh nhân cho biết cơ chế họ
sẽ có những thay đổi, hay lâm bệnh như thế nào. Người ta hi vọng rằng từ các
hiểu biết về gen, sự ốm đau, bệnh tật có thể được phát hiện, các quá trình bệnh
có thể được dự đoán, trước khi chúng có cơ hội biểu hiện. Mặc dù kiến thức
trong lĩnh vực này còn lâu nữa mới hoàn thiện, nhưng cũng đã có nhiều can thiệp
y học được phát triển dựa vào vấn đề này.
1.2. Sàng lọc
Ngoài khái niệm chẩn đoán người ta còn sử dụng khái niệm “sàng lọc” để
chỉ các quá trình tìm kiếm bệnh. Sàng lọc (screen) bệnh là một thuật ngữ khác có
thể cùng mục đích, cùng phương pháp như chẩn đoán, nhưng phase tiến hành
khác biệt. Thông thường, chẩn đoán bệnh được đề cập khi cá thể có những biểu
hiện bệnh hay triệu chứng bộc phát, trong khi đó sàng lọc bệnh dùng để phát
hiện bệnh chưa có những biểu hiện lâm sàng.
1.3. Đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiêụ
Thuâ ̣t ngữ “có thể” và “chắc chắn” đã cơ bản phản ánh đô ̣ nhạy (sensitivity)
và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u (specificity) của các xét nghiê ̣m. Đô ̣ nhạy được định nghĩa là phần
trăm các cá thể có bê ̣nh mà xét nghiê ̣m có thể xác định đúng, trong khi đó đô ̣ đă ̣c
hiê ̣u được định nghĩa như là phần trăm cá thể không bê ̣nh, được xác định chắc
chắn. Người ta sử dụng các phương pháp đô ̣c lâ ̣p đưa ra quyết định cuối cùng về
6
người nào bê ̣nh và người nào không bê ̣nh để tính toán các giá trị này.
Mô ̣t xét nghiê ̣m lí tưởng phải có đô ̣ nhạy 100% và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u 100%,
nhưng trên thực tế, đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u thường có mối quan hê ̣ ngược. Mô ̣t
xét nghiê ̣m có đô ̣ nhạy cao sẽ xác định hầu hết các cá thể bị bê ̣nh, nên thường có
phần trăm cao hơn các trường hợp dương tính giả, do đó có đô ̣ đă ̣c hiê ̣u thấp.
Mô ̣t nhân tố quan trọng khác có ảnh hưởng đến kết quả xét nghiê ̣m là tỉ lê ̣ bê ̣nh
trong quần thể sàng lọc. Nếu bê ̣nh hiếm, ngay khi xét nghiê ̣m có đô ̣ nhạy và đô ̣
dă ̣c hiê ̣u cao cũng sẽ có mô ̣t tỉ lê ̣ dương tính giả cao, bởi vì nhiều cá thể không bị
bê ̣nh cùng được xét nghiê ̣m.
Bảng 1.1. Mô ̣t số thuâ ̣t ngữ
Thuật ngữ Định nghĩa Tính toán
Độ nhạy Tỷ lệ cá thể bệnh được xác định

100xTP/(TP+FN)
(sensitivity) đúng bởi xét nghiệm.
Độ đặc hiệu Tỷ lệ cá thể không bệnh được

100xTN/(TN+FP)
(specificity) xác định đúng bởi xét nghiệm.
Phần trăm cá thể có bệnh mà

Phần trăm âm tính giả
không được phát hiện bởi xét 100xFN/(TP+FN)
(Percentfalse negative)
nghiệm.
Phần trăm dương tính Phần trăm cá thể không bệnh, mà

giả (Percent false được kiểm tra là có bệnh bởi xét 100xFP/(TN+FP)
positive) nghiệm.
7
Giá trị dự đoán dương Khả năng có thể đúng của các cá
tính (Positive predictive thể được kiểm tra là dương tính TP/(TP+FP)
value) thì có bệnh.
Giá trị dự đoán âm tính Khả năng có thể đúng của các cá
(Negative predictive thể được kiểm tra là âm tính thì TN/(TN+FN)
value) không có bệnh
Chú thích: Dương tính đúng (true positive – TP), dương tính giả (false
negative – FN), âm tính giả (false positive – FP), âm tính đúng (true negative –
TN)
1.4. Các vấn đề cơ bản trong chẩn đoán
Ba vấn đề chính không tách biệt nhau khi thực hiện một chẩn đoán đơn là:
sự nhận diện mẫu (pattern regconition), lập luận xác suất (probility reasoning)
và suy nghĩ nguyên nhân (causal thinking).
1.4.1. Nhận diện mẫu
Sự nhận diện mẫu là việc xác định và so sánh các biểu hiện của cá thể bệnh
với các biểu hiện của cá thể bệnh với cái biểu hiện của một bệnh đã biết. Những
dấu hiệu, triệu chứng được so sánh với những mẫu bệnh đã được xếp loại và
đánh dấu trước đây.
Các phương pháp CNSH sử dụng để phát hiện sớm, nhanh và chính xác các
biểu hiện của bệnh (chẩn đoán), hoặc tìm kiếm các tác nhân gây bệnh (sàng lọc)
ở mức độ phân tử (protein, nucleic acid), hay tế bào và mô. Vì tính hữu dụng của
8
các phương pháp này trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh, cho nên chúng nhanh
chóng giữ vai trò quan trọng trong y học
1.4.2 Lập luận xác suất
Lập luận xác suất phản ánh khả năng tương đối một bê ̣nh đặc biệt mà cá thể
có thể mắc phải, khi có các biểu hiện đã được xác định. Khả năng cá thể mắc
bệnh đó cao khi mô ̣t số chỉ tiêu chẩn đoán đã được gặp, các xét nghiệm hiếm cho
kết quả dương tính giả. Ngoài ra,sự nhận diện mẫu chính xác góp phần gia tăng
độ chính xác của việc lập luận xác suất.
1.4.3. Ý kiến nguyên nhân
Sau chẩn đoán, cần tìm kiếm các nhân tố hay các quá trình đáp ứng có thể
gây nên bệnh. Bằng sự hiểu biết và lọai bỏ các nguyên nhân, bệnh có thể được
ngăn chặn.
9
Chương 2: Một số kỹ thuật chẩn đoán bệnh
2.1. Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm
Kỹ thuật nuôi cấy được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh. Với kỹ
thuật này, vi sinh vật quan tâm hiện diện trong mẫu bệnh phẩm đươc nuôi tăng
sinh, sau đó, sự hiện diện của chúng được phát triển thông qua nhiều biện pháp
khác nhau.
Mẫu sinh phẩm được đặt trong môi trường lỏng hay đặt trên bề mặt rắn.
Dung dịch lỏng dùng trong nuôi cấy được xem như là môi trường nuôi cấy lỏng
hay “canh”. Bề mặt sử dụng để phát triển vi sinh vật là môi trường nuôi cấy
ngắn. Hầu hết môi trường nuôi cấy rắn được chuẩn bị bằng cách them cơ chất
(thường là agar).
Trong một số trường hợp nuôi cấy virus hay vi khuẩn đặc biệt, sinh phẩm
phải được đặt trong những mẫu tế bào động vật sống (nuôi cấy mô), bởi hầu hết
virus gây bệnh ở người và động vật chỉ sống trong các tế bào động vật. Để nuôi
được mầm bệnh, trước hết, người ta phải nuôi các tế bào động vật (tế bào chủ).
Sau khi những tế bào chủ sống, phát triển bám lên bề mặt (thường là thủy tinh
hay nhựa), lúc đó đặt các mẫu sinh phẩm vào nuôi, các virus bệnh sẽ kí sinh vào
tế bào động vật.
Ngoài việc phải cung cấp các chất dinh dưỡng thích hợp, nuôi cấy vi sinh
vật còn đòi hỏi môi trường có nhiệt độ thích hợp. Đối với hầu hết các vi sinh vật
quan tâm trong vi sinh lâm sang, nhiệt độ từ 35 - 37°C là thích hợp cho sự phát
triển tối ưu.
Với nhiều vi sinh vật, sự phát triển của chúng còn đòi hỏi điều kiện không
khí thích hợp, chẳng hạn nhiều vi khuẩn chỉ sống trong môi trường yếm khi, một
10
số chỉ sống được trong môi trường hiếu khí, một số khác không phụ thuộc nhiều
ở không khí.
2.2. Kỹ thuật tế bào học

Nhuộm là một kỹ thuật sinh hóa, bổ sung thuốc nhuộm chuyên biệt cho một
loại phân tử nào đó vào một cơ chất để định tính hay định lượng sự hiện diện của
cơ chất đó. Các phân tử cơ chất có thể là DNA, protein, lipid hay carbohydrate.
Kết hợp với các quy trình cố định và chuẩn bị mẫu, các nhà khoa học và bác sĩ
đã sử dụng kỹ thuật nhuộm như là công cụ chẩn đoán ban đầu, nhưng rất cần
thiết.
Nhuộm và thuốc nhuộm thường được sử dụng trong nghiên cứu y sinh để
làm hiện rõ các cấu trúc quan tâm trong các mô và tế bào. Phương pháp nhuộm
thường được tiến hành cùng với sự hỗ trợ của kính hiển vi. Nhuộm còn được sử
dụng để xác định và kiểm tra mô, quần thể tế bào hay các bào quan, đánh dấu
các tế bào mục tiêu trong kỹ thuật flow cytometry, cũng như protein hay các
nucleic acid trong điện di.
Các phương pháp nhuộm xếp thành hai nhóm: nhuộm in vitro và nhuộm in
vivo.
2.2.1. Nhuộm in vitro
Nhuộm in vitro là việc làm sao cho các cấu trúc hay các tế bào hiện màu khi
chúng không còn sống. Nhuộm in vitro có nghĩa là nhuộm trong phòng thí
nghiệm, khác với nhuộm in vivo trực tiếp trên cơ thể sống.
Nhuộm tương phản (counterstain) là việc nhuộm bổ sung nhằm làm tế bào
hay cấu trúc sống không hiện màu khi đã nhuộm cơ bản. Chẳng hạn, crystal
violet chỉ nhuộm các vi khuẩn Gram dương trong nhuộm Gram. Nhuộm tương
11
phản Safranin được sử dụng nhuộm tất cả các tế bào, cho phép xác định những vi
khuẩn Gram âm.
Các bước chuẩn bị phụ thuộc vào kiểu phân tích được tiến hành, một số hay
tất cả các quy trình có thể cần thiết, gồm:
(1) Làm tế bào thấm (Permeabilization) (xử lí tế bào với chất hoạt tính bề
mặt nhẹ, làm phân hủy màng tế bào để thuốc nhuộm đi vào bên trong).
(2) Cố định tế bào (Fixation) duy trình hình dạng tế bào hay mô liên quan
bằng cách dung các hóa chất (formaldehyde, ethanol, methanol hay picric
acid…) tạo ra các liên kết hóa học giữa phân tử protein và cơ chất khác trong
mẫu, làm tăng khả năng “cứng rắn”, hay cố định trong paraffin để tăng tính chịu
cơ học và tính ổn định mô, nhằm dễ dàng cắt chúng thành nhiều lát mỏng (slice).
(3) Gắn (Mounting) đính các mẫu vào lame để quan sát và phân tích dưới
kính hiển vi. Một số trường hợp tế bào có thể phát triển trực tiếp trên lame như
máu, tinh dịch… các mẫu có thể kéo thành vệt (smear) trên lame, sau đó cố định.
Với mẫu mô lớn, những lát mỏng được cắt bằng microtome (máy cắt lắt), và
được gắn lên lame.
Cách nhuộm đơn giản nhất là ngâm mẫu (sau khi hay trước khi cố định và
gắn) vào dung dịch thuốc nhuộm, sau đó rửa và quan sát. Nhiều thuốc nhuộm đòi
hỏi sử dụng chất cẩn màu (mordant) – một hợp chất phản ứng với thuốc nhuộm
để hình thành dạng không hòa tan, tủa hiện màu. Thuốc nhuộm được rửa bằng
cách nào đi nữa, màu vẫn còn.
Các kết quả nhuộm thường được nhận diện, đánh giá với sự hỗ trợ của kính
hiển vi. Có phương pháp nhuộm không cần kính, ví dụ nhuộm protein trong điện
di…
12
Kính hiển vi quang học được sử dụng để quan sát mẫu nhuộm với các thuốc
nhuộm hiện màu (staining dye). Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để quan
sát các mẫu nhuộm với các thuốc nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye).
Kính hiển vi điện tử sử dụng để hiện rõ các cấu trúc nội bào, trường hợp này cần
sử dụng các hợp chất đậm đặc electron của kim loại nặng. Chẳng hạn,
phosphotungstic acid là thuốc nhuộm âm tính thường được sử dụng cho các
virus, các dây thần kinh, polysaccharide và các nguyên liệu mô sinh học khác.
Một số phương pháp nhuộm thông thường:
2.2.1.1. Nhuộm Gram
Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram, một nhà khoa học người Đan
Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn mới được lấy tên ông.
Nguồn: http://miendich.com.vn/
Hình 2.1. Các bước nhuộm Gram và hình ảnh minh học
13
Nhuộm Gram là kỹ thuật phân loại Gram các vi khuẩn dựa vào các hợp chất
vách tế bào. Hóa chất sử dụng là Crystal violet, iodine như là chất cẩn màu và
fuchsin (hay Safranin), được dùng để nhuộm tương phản, nhằm xác định tất cả vi
khuẩn. Vi khuẩn Gram quan trọng trong y học, sự hiện diện hay vắng mặt chúng
sẽ làm thay đổi tính nhạy cảm với một số kháng sinh. Các vi khuẩn dương tính
sẽ có màu xanh đen hay màu tím (violet).
Vi khuẩn Gram dương vách tế bào giàu Peptidoglycan và thiếu màu thứ
cấp. Trong khi đó, Gram âm vách tế bào có sự hiện diện của Lipopolysaccharide,
chúng có màu đỏ hay hồng, bởi sự tương phản màu trong quá trình nhuộm.
Nguồn: https://www.pinterest.com/pin/393572454908490948
Hình 2.2. Sơ đồ minh học thành tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm
14
Nguồn: http://benhxahoi.vn/Benh-lau/co-the-tu-chan-doan-duoc-benh-lau-
khong.html
Hình 2.3. Hình ảnh sau khi nhuộm Gram
2.2.1.2. Nhuộm HE (Haematoxylin và Eosin)
Nhuộm HE được sử dụng nhiều trong kỹ thuật mô học để kiểm tra các lát
mỏng. Haematoxylin làm nhân tế bào có màu xanh. Trong khi đó, eosin sẽ
nhuộm nguyên sinh chất và các mô liên kết, làm cho chúng có màu hồng hay đỏ.
Eosin được hấp thụ mạnh bởi các tế bào hồng cầu và làm chúng có màu đỏ sáng.
Sau khi loại bỏ các thành phần tế bào, khuôn nền lúc này chỉ còn là màng
lưới protein, không còn nhân và các thành phần bào quan khác. Màng sợi này
gồm các sợi li ti đan xen vào nhau, các sợi bắt màu hồng nhạt. Sự đan xen của
các sợi đã để lại các khoảng trống nhỏ trên màng, là điều kiện tốt để kích thích tế
bào bám và tăng sinh trên khuôn nền
15
Nguồn: http://www.hoanmy.com/cuulong/hoi-chung-sweet
Hình 2.4. Kết quả nhuộm HE
2.2.1.3. Nhuộm Papanicolaou (hay nhuộm Pap)
Nhuộm Papanicolaou là một kỹ thuật nhuộm mô multichromatic phát triển

bởi George Papanikolaou, cha đẻ của ngành mô bệnh học.
Phương pháp nhuộm này thường dùng được để kiểm tra mẫu tế bào từ các
dịch tiết khác nhau. Loại mẫu sinh thiết dịch thể này thường được nhuộm với các
Pap smear và sử dụng kết hợp với haematoxylin, Orange G, hay Lifght Green SF
yellowish và thỉnh thoảng là Bismarck Brown Y.
Nhuộm Pap được sử dụng để phân biệt các tế bào trong các chế phẩm của
dịch tiết cơ thể (các mẫu vật có thể được làm Pap smears: dịch phụ khoa, đờm,
nước tiểu, dịch não tủy, dịch ổ bụng, chất dịch màng phổi, chất dịch synovial,
mẫu dịch liên quan khối u).
16
Khi thực hiện đúng cách, các mẫu vật nhuộm màu nên hiển thị màu sắc từ
toàn bộ quang phổ: đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh, và tím. Với phương pháp này,
các mẫu nhiễm sắc thể cũng có thể nhìn thấy, các tế bào tổn thương ngoại biên
được khảo sát dễ dàng, các hình ảnh vi thể được tốt hơn, và các tế bào được
nhuộm màu khá đẹp. Các kết quả được nhuộm rất rõ ràng, thậm chí với các mẫu
dày, chồng chéo tế bào vẫn có thể được khảo sát rõ.
Nguồn:http://beta.hongthienmy.vn/sanpham.aspx?itemid=305
Hình 2.5. Nhuộm Pap để kiểm tra bệnh ung thư cổ tử cung ở phụ khoa
2.2.1.4. Nhuộm PAS (Periodic acid- Schiff- PAS)
Phương pháp nhuộm này thường được sử dụng để mô tả các carbohydate

(glycogen, glycoprotein, proteoglycan). Phương pháp này được dùng để phân
biệt những kiểu tế bào khác nhau của các bệnh liên quan đến dự trữ glycogen.
Bộ nhuộm PAS gồm 03 thành phần:
- Hóa chất Schiffs (500ml).
- Periodic Acid 0.5% (500ml).
17
- Hematoxylin-I (500ml).
Ví dụ: ECM của nguyên bào sợi chủ yếu là collagen. Sau khi nhuộm, khuôn
nền bắt màu hồng nhạt của thuốc nhuộm, có thể khẳng định khuôn nền thu nhận
được có thành phần chủ yếu là collagen.
2.2.1.5. Nhuộm Masson Trichrome
Là phương pháp nhuộm kết hợp ba màu, được đưa ra bởi Masson, nhằm
phân biệt tế bào từ các mô liên kết xung quanh. Kết quả là các sợi cơ và keratin
có màu đỏ, xương và collagen có màu xanh da trời (blue), hay màu xanh lá cây
(green), nguyên sinh chất có màu hồng hay đỏ sang, và nhân tế bào có màu đen.
2.2.1.6. Nhuộm Romanowsky
Phương pháp nhuộm này dựa vào sự kết hợp của eosinnate (eosin được làm
giảm) và methylene blue (đôi khi với các sản phẩm oxy hóa azure A và azure B).
Các biến thể bao gồm: nhuộm Wright, nhuộm Jenner, nhuộm Leishman và
nhuộm Giemsa.
Sau khi nhuộm, nhân tế bào có màu tím tạo ra tổ hợp DNA- AB- EY. Các
phương pháp này sử dụng để nhuộm mẫu máu và dịch tủy xương, phát hiện kí
sinh vật trong máu hay trong dịch tủy như bệnh sốt rét. Sẽ thích hợp hơn khi
nhuộm HE cho mẫu tế bào máu, bởi có thể phân biệt được các loại tế bào bạch
cầu ngoại vi. Ngoài ra, phương pháp còn giúp phát hiện kí sinh vật trong máu
hay trong dịch tủy như bệnh sốt rét.
2.2.1.7. Nhuộm bạc
Phương pháp sử dụng dung dịch bạc để nhuộm các mẫu mô. Đây là phương
pháp đặc biệt quan trọng để biểu hiện các protein (chẳng hạn collagen III) và
18
DNA. Chúng còn được sử dụng để biểu hiện cả các cơ chất bên trong và bên
ngoài tế bào. Nhuộm bạc còn được sử dụng trong điện di gradien gel.
Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để cho phép phát hiện một lượng
protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid (pg),
nhạy gấp 1.000 - 10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr.
Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là:
(1) Dùng các dung dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm
vào gel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde.
(2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và
dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều
kiện kiềm.
2.2.1.8. Nhuộm Sudan
Là phương pháp sử dụng thuốc có ái tính với Sudan, thường là lipid.

Nhuộm Sudan nhằm xác định các mức độ mỡ phân hay phát hiện tế bào mỡ. Các
thuốc nhuộm Sudan III, Sudan IV, Oid Red O và Sudan Black B thường được sử
dụng.
2.2.2. Nhuộm in vivo
Nhuộm in vivo là quá trình nhuộm các mô sống bằng cách làm các tế bào
hay các cấu trúc mô được biểu hiện nhờ màu tương phản. Qua đó hình dạng, hay
sự định vị nội bào (hay mô) có thể được quan sát rõ ràng
Mục đích thông thường của phương pháp này là phát hiện các chi tiết trong
tế bào. Tuy nhiên, cũng có thể phát hiện hóa chất hay các phản ứng sinh hóa đặc
hiệu xảy ra trong các loại tế bào hoặc mô sống.
19
Thông thường phương pháp này còn gọi là nhuộm sống (vital stain), bởi
chúng được tiến hành trong cơ thể khi các tế bào còn sống. Tuy nhiên, cách này
thường gây độc cho cơ thể. Để đạt được các tác động mong muốn, thuốc nhuộm
phải được sử dụng ở nồng độ rất loãng với mức từ 1/5000 – 1/500000.
2.3. Phương pháp miễn dịch học

2.3.1. Western blot
Western blot (hay immunoblot) là phương pháp kết hợp kiểu dây chuyền
giữa sinh học phân tử với sinh hóa và miễn dịch di truyền, nhằm phát hiện
protein trong một mẫu mô được chiết xuất. Điện di gel được sử dụng để phân
tách các protein đã bị biến tính. Sau đó, các protein này sẽ được chuyển thẩm từ
hệ gel lên bộ màng (thường là màng nitrocellulose). Các protein trên màng tiếp
tục được lai với các kháng thể chuyên biệt.
Lai Western blot được thực hiện giữa các protein với nhau, dựa trên nguyên
tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể.
2.3.1.1. Quy trình
 Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Mẫu được thu nhận từ mô hay các tế bào nuôi được đun sôi từ 1 - 5 phút
trong dung dich đệm (chẳng hạn Laemmli) có chứa thuốc nhuộm, một hợp chất
sulfur (thường là β-mercaptoethanol) và một chất tẩy (sodium dodecyl sulfate –
SDS). Nhiệt độ làm biến tính protein, tháo hoàn toàn các cuộn gấp. SDS sẽ làm
phân tử protein tích điện âm và β-mercaptoethanol ngăn cản sự tái hình thành
các cầu nối disulfide.
 Bước 2: Chạy điện di
20
Protein trong mẫu được phân tách theo khối lượng phân tử bằng điện di trên
gel. Gel được pha chế theo công thức khác nhau, tùy từng phòng thí nghiệm,
khối lượng phân tử của protein quan tâm và dung dịch đệm sử dụng (gel
polyacrylamide thường được sử dụng nhất)
Trong điện di một chiều, các mẫu được nạp vào các giếng cạnh nhau trên
gel. Protein được phân tách dựa vào khối lượng tạo thành các vạch (band) trong
mỗi đường (lane) hình thành dưới giếng. Một thang hỗn hợp protein sẵn có sẽ
giúp xác định khối lượng phân tử được sử dụng, đồng thời quá trình chạy điện di
sẽ xác định khối lượng phân tử protein quan tâm.
Điện di gel hai chiều cũng có thể được sử dụng trong phân tích này. Các
protein được tách theo điểm đẳng điện (độ pH mà tại đó chúng tích điện trung
hòa) trong lần điện di đầu và theo khối lượng phân tử của chúng trong lần điện di
thứ hai.
 Bước 3: Chuyển protein từ gel lên màng
Để các protein có thể được phát hiện bởi kháng thể, chúng chuyển thẩm
tách từ gel lên màng (được làm bởi nitrocellulose hay PVDF). Các protein tích
điện di chuyển từ trong gel vào màng, nhưng vẫn duy trì tổ chức của chúng có
trong gel. Kết quả của quá trình là sự hiện diện protein trên bề mặt màng. Sự gắn
các protein dựa vào sự tương tác kị nước, cũng như các tương tác điện tích giữa
màng và protein.
 Bước 4: Khóa màng
Khi màng được chọn cho khả năng gắn protein, các bước phải tiến hành sao
cho ngăn cản sự tương tác của protein không đặc hiệu gắn vào kháng thể (chỉ
dành cho protein mục tiêu). Khóa sự gắn không đặc hiệu được tiến hành bằng
21
cách đặt màng trong một dung dịch loãng của protein, thường là BSA (Bovine
serum albumin), hay sữa khô không chất béo, với 1% chất tẩy tween 20 hay
carbon chất dẻo.
 Bước 5: Lai với kháng thể chuyên biệt và phát hiện kết quả
Màng được lai với kháng thể chuyên biệt trước đó để phát hiện protein quan
tâm. Các kháng thể quan tâm được liên kết với một enzyme báo cáo, nhằm tạo ra
tín hiệu màu hay phát quang. Nhìn chung, có nhiều phương pháp phát hiện kết
quả gắn:
 Phương pháp phát hiện hai bước
- Sau khi khóa, dung dịch loãng của kháng thể sơ cấp (0,5 và 5 μg/ml)
được ủ với màng trong điều kiện lắc nhẹ. Dung dịch kháng thể sơ cấp và màng
có thể được cố định và ủ từ 30phút - 12 giờ.
- Rửa màng để tách kháng thể sơ cấp thừa (không gắn vào màng)
- Cho màng tiếp xúc với kháng thể khác nhằm bắt cặp với các vị trí
chuyên biệt trên kháng thể sơ cấp và gọi là kháng thể thứ cấp.
- Các kháng thể thứ cấp được liên kết với biotin hay một enzyme báo cáo
(alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase).
 Phương pháp phát hiện một bước
- Kỹ thuật này cần một kháng thể mẫu dò có cả hai khả năng là nhận diện
các protein quan tâm và chứa yếu tố đánh dấu để phát hiện, các mẫu dò thường
sẵn có cho các thể protein đã biết (protein tag). Mẫu dò sơ cấp được ủ với màng
giống cách ủ kháng thể sơ cấp trong quá trình hai bước. Sau đó rửa và phát hiện
trực tiếp.
22
 Phát hiện bằng thước đo màu (Colorimetric detection)
- Phương pháp này phụ thuộc vào công đoạn ủ western blot cùng cơ chất
có phản ứng với một enzyme báo cáo (như peroxidase). Cơ chất gắn vào kháng
thể thứ cấp, làm dung dịch thuốc nhuộm chuyển thành dạng hòa tan để cho một
màu khác và do đó chúng dễ dàng nhuộm màu màng nitrocellulose. Mức độ thu
nhận protein sẽ được đánh giá thông qua việc đo nồng độ (densitimetry), hay đo
quang phổ (spectrophotometry).
 Sự phát quang bằng phản ứng hóa học (Chemiluminescence)
- Phụ thuộc vào sự ủ của western blot với cơ chất sẽ phát quang khi tiếp
xúc với chất báo cáo trên kháng thể thứ cấp.
- Sau đó ánh sáng được phát hiện bằng chụp ảnh. Gần đây, các máy chụp
hình CCD có thể ghi nhận các hình ảnh của western blot.
 Phát hiện phát huỳnh quang
- Những mẫu dò đánh dấu huỳnh quang được kích thích bởi ánh sáng
- Sự phát ra của luồng ánh sáng kích thích có thể được ghi nhận bằng một
photosensor (CCD camera). Đây là phương pháp nhạy cảm nhất trong phân tích
blot.
 Phát hiện phóng xạ
- Đánh dấu phóng xạ không đòi hỏi cơ chất

- Để ghi nhận ảnh, người ta đặt một tấm phim X-ray trực tiếp lên western
blot khi nó được tiếp xúc với yếu tố đánh đấu, và tạo ra các vùng tối tương ứng
với các band protein quan tâm.
- Phát hiện bằng phóng xạ ít phổ biến, bởi rất tốn kém và có nhiều rủi ro.
23
Nguồn: http://biology.vn/phuong-phap-western-blot/
2.3.1.2. Ứng dụng
 Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt protein trong mô.
Độ lớn của protein.
 Mức độ hoạt động của gen.
 Phân tích cây trồng chuyển gen.
 Phân tích bệnh do vi khuẩn, virus gây ra.
 Ứng dụng trong y tế.
2.3.2. Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry)
2.3.2.1. Khái niệm
Hóa mô miễn dịch là quá trình các protein định vị trong tế bào của lát mô
gắn với kháng thể tương ứng của chúng theo nguyên tắc kháng nguyên – kháng
thể.
2.3.2.2. Cơ chế
Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Để quan sát được chúng, các
24
kháng thể này phải gắn với các chất báo cáo, có thể là các enzyme như
horseradish perosidase, alkaline phosphatase hay chất phát huỳnh quang như
FITC.
Kháng thể sử dụng có thể đa dòng (polyclone) hay đơn dòng (monoclone).
2.3.2.3. Các kiểu hóa mô miễn dịch
 Phương pháp gián tiếp
Sử dụng một kháng thể chống lại kháng nguyên làm mẫu dò như là một
kháng thể thứ hai có đánh dấu sẵn, chống lại kháng thể thứ nhất.
Nói cách khác, dùng một kháng thể sơ cấp không đánh dấu tương ứng với
kháng nguyên và một kháng thể thứ hai có đánh dấu, chống lai kháng thể thứ
nhất.
Đây là phương pháp nhạy vì sự khuếch tán tín hiệu thông qua các phản ứng
kháng thể thứ cấp với nhiều vị trí kháng nguyên khác nhau trên kháng thể thứ
nhất. Kháng thể thứ cấp thường được đánh dấu với thuốc nhuộm phát quang như
FITC, Rhodamine hay Texas red, vì vậy gọi là phương pháp miễn dịch gián tiếp.
Khi kháng thể thứ cấp được đánh dấu với một enzyme như peroxidase, alkaline
phosphatase hay glucose oxidase, thì gọi là phương pháp miễn dịch enzyme gián
tiếp.
 Phương pháp trực tiếp
Sử dụng các kháng thể đánh dấu gắn trực tiếp với kháng nguyên đã nhuộm.
Phương pháp này nhuộm một bước với kháng thể đã được đánh dấu.
Nếu kháng thể được đánh dấu với các chất phát quang thì được gọi là
phương pháp miễn dich huỳnh quang trực tiếp và nếu được đánh dấu bằng
25
enzyme thì gọi là phương pháp miễn dịch enzyme trực tiếp.
Do chỉ sử dụng một kháng thể nên quy trình ngắn và nhanh, tuy nhiên độ
nhạy thấp bởi sự khuếch đại tín hiệu yếu.
 Xác định nguồn gốc của những u không biệt hóa.
 Xác định carcinom vú xâm nhập và thâm nhiễm giả.
 Xác định tế bào nhiễm khuẩn.
 Xác định sự phân bố và định vị của các biomarker trong một mô.
 Chẩn đoán ung thư với các marker chuyên biệt được xác định cho
nhiều bệnh ung thư khác nhau.
 Trong nghiên cứu cơ bản để hiểu được sự phân bố và sự định vị của

các biomarker trong các phần khác nhau của một mô.
2.3.3. Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA)
2.3.3.1. Định nghĩa
Radioimmunoassay (RIA), phương pháp miễn dịch dùng đánh dấu phóng
xạ, được phát triển bởi Rosalyn Yalow và Solomon Aaron Berson phát triển vào
những năm 1950, là một trong những phương pháp dùng để đo nồng độ kháng
nguyên trong mẫu nghiên cứu mà không cần phải tiến hành thí nghiệm in vivo.
Phương pháp này được Rosalin và Solomon Yalow ứng dụng và phát triển
để đo nồng độ insulin. Thành công của việc ứng dụng RIA để đo được nồng độ
hormone trong máu được coi là bước đột phá của y học nói chung và của nội tiết
học nói riêng. Đây cũng là công trình nghiên cứu đưa Rosalyn Sussman Yalow
26
đến với giải Nobel trong lĩnh vực Y học - Sinh lý học năm 1977.
2.3.3.2. Lịch sử nghiên cứu
Rosalin Yalow và Solomon Aaron Berson là những người đầu tiên phát
triển các kỹ thuật phóng xạ nghiên cứu thể tích máu và sự trao đổi chất i-ốt. Sau
đó họ chuyển sang phương pháp nghiên cứu cách cơ thể sử dụng hormones, đăc
biệt là insulin, điều hòa mức đường trong máu. Các nhà nghiên cứu đã chứng
minh rằng bệnh tiểu đường là do việc sử dụng không hiệu quả của insulin. Trước
đó, người ta nghĩ rằng bênh tiểu đường gây ra chỉ do thiếu insulin.
Năm 1959, Rosalin Yalow và Solomon Aaron Berson hoàn thiện kỹ thuật
đo lường của họ và đặt tên là miễn dịch phóng xạ (RIA). Nhờ kỹ thuật này họ đã
nhận được giải Nobel năm 1977. RIA cực kỳ nhạy cảm, nó có thể đo một nghìn
tỷ của một gram vật liệu mỗi ml máu. Việc đo chính xác lượng nhỏ của hocmone
là chìa khóa cho nội tiết học sau này.
Solomon Berson (1919-1972) Rosalind Yalow (1921-2011)
2.3.3.3. Nguyên tắc của RIA
27
Trộn lượng kháng nguyên đã đánh dấu phóng xạ biết trước (thường đánh
dấu với các đồng vị phóng xạ gamma của iodine vào tyrosine) với kháng thể gắn
vào kháng nguyên đó. Sau đó, thêm vào kháng nguyên “lạnh”, hay không đánh
dấu và đo lượng kháng nguyên thay thế.
Sử dụng một phản ứng miễn dịch (phản ứng kháng nguyên-kháng thể) để
đánh giá một phối tử.
Ag + Ag* + Ab  AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab*
+ Ag*: Kháng nguyên được đánh dấu phóng xạ.
+ Ag: Kháng nguyên không đánh dấu phóng xạ.
+ Ab: Kháng thể đặc hiệu.
+ Hai phối tử bị đảo ngược AgAb và Ag*Ab liên quan đến hoạt
động phóng xạ.
Phương pháp ban đầu được dùng để tách là sử dụng kháng thể thứ cấp, trực
tiếp chống lại kháng thể thứ nhất, nhằm để tủa và li tâm thu nhận.
Nguồn: http://www.slideshare.net/boreddysunilkumarreddy/ria-26810530
28
2.3.3.4. Các bước cơ bản
 Các bước cơ bản của RIA bao gồm:
(1) Đánh dấu phóng xạ cho mẫu chuẩn (kháng nguyên chuẩn). Thành phần
phóng xạ thường được sử dụng là đồng vị gamma của iod được gắn với tyrosine.
(2) Thêm kháng thể với hàm lượng đã biết trước và đặc hiệu cho kháng
nguyên chuẩn đã được đánh dấu phòng xạ nói trên. Phản ứng kết hợp kháng
nguyên (KN) - kháng thể (KT) sẽ xảy ra.
(3) Thêm mẫu huyết thanh cần xác định nồng độ KN. KN trong huyết thanh
(chưa được đánh dấu phóng xạ và được gọi là KN “lạnh” (unlabled antigen hay
"cold antigen") sẽ cạnh tranh với KN đã được gắn chất phóng xạ để kết hợp với
KT.
(4) KN có nồng độ càng cao, lượng KN kết hợp với KT sẽ càng lớn và có
khả năng cạnh tranh để kết hợp với KT càng cao dẫn đến làm giảm tỷ lệ KN
chuẩn (đã được đánh dấu) kết hợp với KT. Như vậy, một lượng KN chuẩn được
giải phóng.
(5) KN ở trạng thái kết hợp KN - KT sẽ được tách khỏi KN tự do. Đây là
bước quan trọng có tính quyết định mức độ chính xác của phép đo. Để thực hiện,
một kháng kháng thể (anti-antibody) được thêm vào để tạo kết tủa với KN chuẩn
thứ nhất. Phần "cặn" sẽ được tách bằng phương pháp ly tâm.
(6) Đo nồng độ của KN chuẩn được giải phóng ở bước (4) thông qua tín
hiệu phóng xạ đã được gắn với KN chuẩn ở bước (1).
(7) Dựng đường biểu diễn nồng độ kết hợp KN-KT qua đó xác định nồng
độ KN trong mẫu cần chẩn đoán.
29
Hình 2.6. Các bước của phương pháp RIA
Nguồn: http://www.benhvien103.vn/vietnamese/bai-giang-chuyen-nganh/y-
hoc-hat-nhan/chan-doan-in-vitro-bang-ky-thuat-mien-dich-phong-xa/1273.prt
30
2.3.3.5. Ứng dụng của RIA
 Phát hiện ma túy (thuốc).
 Sàng lọc ngân hàng máu đối với viêm gan (một điều kiện rất dễ lây)
virus.
 Phát hiện ung thư sớm.
 Đo nồng độ hormone tăng trưởng.
 Chẩn đoán và điều trị viêm loét dạ dày tá tràng.
 Nghiên cứu với các hóa chất trong não gọi là dẫn truyền thần kinh.
2.3.3.6. Ưu và nhược điểm
Bảng 2.1. Ưu, nhược điểm của phương pháp RIA
Ưu điểm Nhược điểm
- Nhạy cảm và chuyên biệt, nó có thể - Đòi hỏi thiết bị hiện đại, tinh vi.
phát hiện một vài picogram (10 -12 g) - Chi phí lớn.
của kháng nguyên trong ống.
- Yêu cầu nghiêm ngặt về an toàn
trong quá trình thí nghiệm, thận
trọng vì các cơ chất phóng xạ sử
dụng
2.3.4. Xét nghiệm ngưng kết (Agglutination test)
2.3.4.1. Nguyên tắc
31
Nguyên tắc cơ bản của xét nghiệm ngưng kết là
sự hình thành các khối lớn (ngưng kết) từ nhiều mẫu
nhỏ có bao phủ bởi kháng nguyên, khi có sự hiện
diện của kháng thể chuyên biệt. Trong quá trình này,
kháng thể chuyên biệt có chức phận như “keo dán”,
gắn các hạt nhỏ với nhau thành khối lớn.
Các xét nghiệm ngưng kết có thể thực hiện trên

lame kính, trên thẻ với lượng kháng nguyên và kháng thể them vào phải ít hơn
hay trong các ống tube.
Tuy vậy, các xét nghiệm ngưng kết thường được thực hiện trên các đĩa với
những giếng đáy hình nón để có thể chuẩn độ huyết thanh. Trong các đáy giếng
hình nón đó, các hạt nhỏ sẽ tập trung ở giữa. Nhưng khi kháng thể gây ra ngưng
kết, các hạt nhỏ sẽ kết hợp tạo thành các khối lớn nằm ở nhiều vị trí khác nhau
trong giếng. Các khối lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường
Bản chất của phương pháp này là định tính và định lượng bằng cách pha
loãng tuần tự.
2.3.4.2. Các bước thực hiện
- Bước 1: Tra mẫu
Một giọt mẫu vật được đặt trên thẻ. Chất phân tích được thả nổi tự do trong
dung dịch.
32
- Bước 2: Thêm dung dịch ngưng kết
Một dung dịch chứa các phân tử phát hiện chất phân tích cụ thể, gắn liền
với hạt được thêm vào các mẫu trên thẻ. Chất phân tích và phân tử phát hiện ban
đầu trôi nổi tự do gây ra các màu sắc và kết cấu của sự sụt giảm trên thẻ để được
một thể thống nhất.
- Bước 3: Khuấy động mẫu, lắng cặn, quan sát sự ngưng kết
Khuấy động từ từ hỗn hợp trên trong vài phút để chất phân tích và phân tử
dò tương tác với nhau. Chất phân tích và phân tử dò hình thành liên kết. Nếu
chất phân tích không có mặt trong các mẫu vật thì liên kết không hình thành,
màu sắc và kết cấu của hỗn hợp sẽ vẫn đồng nhất.
33
Xét nghiệm này được sử dụng trong chẩn đoán bệnh, thông qua việc phát
hiện sự hiện diện của kháng thể (đặc hiệu với kháng nguyên gây bệnh) mà cơ thể
tạo được.
2.3.4.4. Ưu và nhược điểm
Bảng 2.2. Ưu - nhược điểm của xét nghiệm ngưng kết
Ưu điểm Nhược điểm
- Hạn chế trong một số thử nghiệm

- Đơn giản
- Độ nhạy của cơ chất phát hiện khá thấp
2.3.5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
ELISA là một phương pháp hữu ích và mạnh, trong việc xác định sự hiện
diện và định lượng ở mức ng/ml – pg/ml các chất có trong dung dịch như huyết
thanh, nước tiểu, tinh dịch và dịch huyền phù nuôi cấy. ELISA được sử dụng
rộng rãi trong các nghiên cứu khoa học sự sống và bệnh học nói chung.
Nguyên lý của ELISA là sử dụng 1 enzyme để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu
giữa kháng nguyên (Antigen-Ag) và khág thể (Antibody-Ab). Enzyme sẽ chuyển
34
cơ chất không màu thành sản phẩm có màu, qua đó cho thấy có hiện diện mối
gắn kết Ag-Ab. ELISA có thể được sử dụng để phát hiện, hoặc sự hiện diện của
Ag, hoặc Ab trong một mẫu, tuy nhiên chúng phụ thuộc vào xét nghiệm được
thiết kế như thế nào.
Có 3 phương pháp chính, gồm: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA
sandwich. Tất cả các kiểu này đều có thể được sử dụng trong các xét nghiệm
được gọi là ELISA cạnh tranh hay ELISA kìm hãm.
 ELISA trực tiếp
- Kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch đệm (thường là
carbonate/ bicarbonate ở pH cao 9,6 hay dung dịch PBS trung tính), sau đó bổ
sung dung dịch này vào phase rắn (đĩa nhựa). Dung dịch đệm không chứa những
protein có thể cạnh tranh với kháng nguyên mục tiêu để gắn vào pha rắn.
- Kháng nguyên sẽ bám thụ động vào đĩa nhựa trong quá trình ủ. Tuy nhiệt
độ ủ và thời gian ủ không quan trọng, nhưng việc chuẩn hóa các điều kiện là cần
thiết.
- Sau khi ủ, tiến hành rửa để loại bỏ các kháng nguyên không hấp thụ được
vào bề mặt. Việc rửa đơn giản chỉ là đổ đầy dung dịch đệm trung tính (PBS
chẳng hạn) vào giếng, và hút ra bỏ cho hết.
- Kháng thể có gắn enzyme được bổ sung trực tiếp vào các vị trí kháng
nguyên trên bề mặt rắn đã hấp thụ kháng nguyên. Các kháng thể này được pha
loãng trong dung dịch đệm chứa một số cơ chất ức chế sự hấp phụ thụ động của
protein, nhưng cũng cho phép sự gắn kết miễn dịch. Những cơ chất này, hoặc là
những protein khác sẽ được thêm vào ở nồng độ cao để “cạnh tranh” các vị trí
gắn trên pha rắn với các protein kháng thể, hoặc là chất tẩy ở nồng độ thấp.
35
Chúng được gọi là những tác nhân “khóa”, dung dịch chứa tác nhân “khóa” gọi
là “dung dịch đệm khóa”.
- Sau khi ủ kháng thể sẽ gắn kháng nguyên của chính nó.
- Tiến hành rửa nhằm loại bỏ các kháng thể không bám, chỉ còn lại phức
hợp kháng thể - kháng nguyên đã gắn với enzyme.
- Bổ sung các cơ chất thích hợp cho enzyme đã gắn vào kháng thể. Điều
này tạo ra phản ứng xúc tác bởi enzyme tạo màu. Màu sắc dung dịch được xác
định bằng cách sử dụng máy quang phổ trắc quang, đọc tại bước sóng thích hợp
 ELISA gián tiếp
- ELISA gián tiếp có các bước đầu tiên cũng giống như ELISA trực tiếp.
- Sau khi kháng nguyên được hấp phụ trên bề mặt rắn và rửa bỏ những
phần không hấp phụ, một kháng thể không đánh dấu được bổ sung vào trước.
Kháng thể này cũng được pha loãng trong dung dịch đệm khóa.
- Sau khi ủ, tiến hành rửa để loại bỏ các kháng thể không bám vào kháng
nguyên
- Sau đó bổ sung kháng thể thứ hai có gắn enzyme để kháng lại kháng thể
thứ nhất. Kháng thể này cũng được pha loãng trong dung dịch đệm khóa
- Một lần nữa tiến hành ủ và rửa bỏ những kháng thể không bám
- Bổ sung cơ chất cho enzyme vào để tiến hành phản ứng tạo màu và phát
hiện mục tiêu.
=> Ưu điểm: Kháng thể có gắn enzyme là các kháng thể khác loài như anti-
IgM, anti – IgG… nên có thể sử dụng để phát hiện cho bất kì mẫu kháng huyết
36
thanh nào, với một kháng nguyên nào đó nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng
thương mại hóa.
=> Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau.
Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử
nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được.
 ELISA sandwich
Thuật ngữ sandwich xuất phát từ việc các kháng nguyên được kẹp giữa các
kháng thể vừa phát hiện ở pha rắn và hoạt động như một kháng thể gắn enzyme.
Kháng thể gắn vào pha rắn gọi là kháng thể “bắt giữ” và kháng thể còn lại gọi là
kháng thể phát hiện. Việc sử dụng hai kháng thể để phát hiện một kháng nguyên
làm tăng tính chính xác của xét nghiệm.
Các hệ thống sandwich khác nhau phụ thuộc vào nguồn kháng thể sử dụng.
Có hai cách: sandwich trực tiếp và sandwich gián tiếp.
- ELISA sandwich trực tiếp: liên quan đến việc gắn thụ động các kháng thể
vào pha rắn. Những kháng thể này sau đó gắn vào kháng nguyên. Kháng nguyên
được pha loãng trong dung dịch đệm khóa để tránh gắn không chuyên biệt vào
pha rắn. Kháng thể thứ hai được bổ sung vào, chúng gắn với enzyme. Enzyme
này sẽ cắt cơ chất được thêm vào thành sản phẩm có màu, chúng được đo bằng
quang phổ trắc quang.
- ELISA sandwich gián tiếp: tương tự như phương pháp trực tiếp nói trên.
Tuy nhiên, điểm khác biệt là kháng thể thứ hai them vào không gắn enzyme, nên
để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể khác kháng lại
kháng thể thứ hai có gắn enzyme được thêm vào sau đó. Việc tiến hành ELISA
37
gián tiếp có nhiều ưu điểm hơn, vừa có ưu điểm của ELISA sandwich vừa mang
ưu điểm của xét nghiệm ELISA gián tiếp.
 ELISA cạnh tranh - ức chế
Thuật ngữ “cạnh tranh” hay “ức chế” dùng mô tả các xét nghiệm, nhằm xác
định số lượng của một cơ chất, bởi khả năng của chính nó xen vào một hệ thống
đã chuẩn độ được thiết lập trước. Tất cả các hệ thống ELISA (trực tiếp, gián tiếp,
sandwich) đều có thể sử dụng để tiến hành ELISA cạnh tranh, nhằm đo kháng
thể, hoặc kháng nguyên.
Sự hiện diện của kháng nguyên (hay kháng thể), có thể được phát hiện và
định lượng trong mẫu chưa biết, bằng cách xác định khả năng cạnh tranh của
kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu và kháng nguyên (hay kháng thể)
có đánh dấu để gắn vào kháng thể (hay kháng nguyên) đã gắn vào giếng trước đó
Đầu tiên, một đường chuẩn được thiết lập để xác định lượng kháng nguyên
(hay kháng thể) trong các mẫu chưa biết, bằng cách so sánh với đường chuẩn
được thiết lập sẵn trong hệ thống. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa khả
năng cạnh tranh gắn của kháng nguyên (hay kháng thể) được đánh dấu với kháng
nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu vào kháng thể (hay kháng nguyên) đã
cố định trên giếng khi bổ sung một lượng kháng nguyên (hay kháng thê) có đánh
dấu với các lượng khác nhau đã biết trước nồng độ của kháng nguyên (hay
kháng thể) không đánh dấu.
Nếu nồng độ kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu càng thấp thì
hầu hết các vị trí kháng thể (hay kháng nguyên) trên giếng sẽ bị kháng thể đánh
dấu gắn (sự gắn này được phát hiện thống qua đo tín hiệu) và ngược lại. Dựa vào
mối quan hệ này, người ta thiết lập được đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa
38
tín hiệu, hay phần trăm gắn của kháng nguyên (hay kháng thể) đánh dấu (trục
tung) với nồng độ kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu (chất cạnh
tranh) (trục hoành).
Một mẫu chưa biết nồng độ được định lượng xem như là chất cạnh tranh.
Tiến hành đo tín hiệu phát ra khi bổ sung chất này và dựa vào đường chuẩn sẽ
xác định được nồng độ của kháng thể (hay kháng nguyên) có trong mẫu.
Có ba kiểu hệ thống phát hiện trong kỹ thuật ELISA gồm: màu, huỳnh
quang và phát quang.
Xét nghiệm màu là kết quả của phản ứng tạo màu hấp phụ ánh sang trong
khoảng nhìn thấy được. Mật độ quang của sản phẩm phản ứng có tỉ lệ cân xứng
với lượng đươc đo. Các enzyme thường được xử dụng cho xét nghiệm kiểu này
gồm: horseradish peroxidase, alkaline phosphatase ruột bò và β-D-galactosidase
E.coli.
Xét nghiệm huỳnh quang miễn dịch là một biến tấu của ELISA hiện màu.
Một enzyme chuyển một cơ chất thành sản phẩm phản ứng sẽ phát hiện huỳnh
quang khi được kích thích bởi bước sóng đặc biệt. Các đơn vị phát quang tương
đối được phát hiện tỉ lệ thuận với lượng chất phân tích được đo. So với ELISA
phát màu, xét nghiệm ELISA phát hiện huỳnh quang khá nhạy.
Xét nghiệm phát quang, giống như xét nghiệm phát huỳnh quang, là biến
tấu của ELISA chuẩn. Một enzyme chuyển cơ chất thành một sản phẩm phát ra
các photon ánh sáng, thay vì phát thành màu. Người ta tin rằng ELISA phát
quang là phương pháp nhạy nhất hiện nay được sử dụng, vì chúng có khả năng
khuếch đại tín hiệu rất tốt.
39
2.4. Phương pháp FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ - FISH (Fluorescence In Situ

Hydridization) ra đời từ năm 1989 là một trong nhiều kỹ thuật chẩn đoán hiện
nay. Trên thế giới đã ứng dụng FISH trong nhiều lĩnh vực, trong tương lai FISH
sẽ sử dụng để tăng cường hiệu quả biểu hiện của nhiều công cụ nghiên cứu khác.
Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng
trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật
này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu
và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển.
Nguồn: http://www.ajnr.org/content/28/3/406/F2.expansion.html
Hình 2.7. Sơ đồ biểu diễn kỹ thuật FISH
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) là một kỹ thuật tế bào học (kỹ

thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử), sử dụng một đoạn
mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh quang hay còn được gọi là mẫu dò phát
40
quang gắn chuyên biệt vào các phần NST có trình tự tương đồng cao, để phát
hiện và định vị sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc
thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu và chính xác.
Kính hiển vi huỳnh quang có thể được sử dụng để xác định các nơi có mẫu
dò gắn vào NST.
Để tiến hành FISH, trước hết một mẫu dò được thiết kế đủ dài để lai chuyên
biệt với mục tiêu của nó (và không có các trình tự tương tự trên bộ gen) nhưng
không quá lớn để cản trở quá trình lai. Mẫu dò được gắn trực tiếp với chất phát
huỳnh quang và với các mục tiêu cho các kháng thể hay với biotin. Các NST
được cố định vào một cơ chất, thường là thủy tinh.
 Các bước tiến hành:
1. Chuẩn bị mẫu và đầu dò (cần phải được xử lý với hóa chất thích hợp để
tăng tính thấm của màng tế bào, thường sử dụng là formadehyde,
paraformadehyde hay ethanol. Đối với vi khuẩn Gram dương cần có biện pháp
xử lý lớp vỏ chứa peptidoglycan).
2. Cố định mẫu.
3. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào (thực hiện
trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ từ 37 đến 50°C. Sau quá trình lai tiến hành rửa
bỏ các đầu dò không liên kết và các chất bẩn khác).
4. Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai.
5. Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) có thể thực hiện trên các đầu tận
cùng hoặc vùng cận đầu tận cùng của NST (subtelomeric FISH) hoặc trên các
41
mục tiêu đã được xác định trước trên NST (targeted FISH) thông qua các đoạn
dò ADN đặc hiệu cho các locut hoặc một trình tự nucleotit nhất định trên NST.
Những đoạn dò ADN này được thiết kế và đánh dấu bằng các loại thuốc nhuộm
huỳnh quang, trên tiêu bản đánh giá đoạn dò sẽ lai với đoạn ADN tương ứng
trong genome theo nguyên tắc bổ sung và phát tín hiệu màu huỳnh quang, các tín
hiệu này sẽ được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang để đánh giá các bất
thường đặc hiệu của NST.
Kỹ thuật FISH cho phép phát hiện các bất thường NST có kích thước bé
hơn 1Mb, tùy thuộc vào kích thước của các đoạn dò được sử dụng. Các đoạn dò
này chủ yếu là ADN lấy từ các nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo (BAC: bacterial
artificial chromosome) có kích thước khoảng từ 150-350 Kb (1Kb = 1000 bazơ).
2.4.1. Các kiểu mẫu dò trong FISH
Tùy từng chức năng mà người ta chia thành 3 kiểu mẫu dò khác nhau, mỗi
kiểu có các ứng dụng khác nhau:
- Các mẫu dò chuyên biệt gắn với một vùng chuyên biệt của NST. Kiểu
này rất hữu ích khi cần tách một vùng gen, hay muốn xác định 1 NST nào mà
gen định vị.
- Mẫu dò cả NST là tập hợp gồm các mẫu dò nhỏ hơn, mỗi cái gắn vào
một trình tự khác nhau dọc chiều dài NST. Sử dụng nhiều mẫu dò được đánh dấu
với một hỗn hợp các thuốc nhuộm phát huỳnh quang, người ta có thể đánh dấu
mỗi NST một màu sắc duy nhất. Loại mẫu dò cả NST chuyên biệt hữu ích cho
các kiểm tra sự bất thường NST, chẳng hạn, khi mảnh của một NST gắn vào
phần cuối một NST khác.
42
- Các mẫu dò lặp lại trung thể hay alphoid được tạo ra từ các trình tự lặp đi
lặp lại có trên vùng giữa của mỗi NST. Mẫu dò này dùng để xác định cá thể nào
mang vật liệu di truyền từ một NST chuyên biệt nào đó.
Nguồn: http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-cac-loai-mau-do-va-phuong-phap-
danh-dau-11225/
2.4.2. Hai kiểu tế bào sử dụng FISH
- FISH kì giữa (metaphase FISH) sử dụng các tế bào đang ở giai đoạn kì
giữa của phân bào để phát hiện các mất đoạn nhỏ (microdeletion), hay phát hiện
một số sự tái sắp xếp của NST trong các bệnh ung thư.
43
- FISH kì trung gian (interphase FISH) sử dụng các tế bào giai đoạn
trung gian để xác định số NST, cũng như phát hiện sự tái sắp xếp của các NST
chuyên biệt gây ung thư. Thuận lợi chính của FISH kì trung gian là có thể tiến
hành nhanh trong 24 giờ, vì sự tăng trưởng của tế bào không cần thiết.
 Ứng dụng
 FISH kì giữa:
44
Kỹ thuật FISH phát hiện mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể ở một số hội chứng di
truyền. FISH giúp khẳng định các chẩn đoán lâm sàng, và chẩn đoán trước sinh
cho các gia đình có tiền sử sinh con mắc các hội chứng này.
Bảng 2.3. Ứng dụng kỹ thuật FISH để chẩn đoán một số hội chứng
Hội chứng Vị trí Dấu hiệu lâm sàng Tỉ lệ phát hiện
- Nhược cơ
- Chậm phát triển tinh thần

Hội chứng Prader Willi 15q11.2 - Béo phì 70%
- Giảm năng tuyến sinh

dục
- Mất điều hòa
Hội chứng Angelman 15q11.2 - Chậm phát triển tinh thần 80%
- Cười không thích hợp
- Bộ mặt bất thường

Hội chứng DiGeorge 22q11.2 - Thiếu sản tuyến giáp, cận >90%
giáp
45
- Tiếng khóc như mèo kêu
Hội chứng Cri-du-Chat 5p15.2 - Não bé 90%
- Bộ mặt bất thường
Hội chứng William 7q11.23 - Dị tật tim >95%
Nguồn: http://ditruyen.com/ditruyen-175/ky-thuat-lai-huynh-quang-tai-cho-
fish.html
 FISH kì trung gian:
Chẩn đoán trước sinh: Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử

dụng để sàng lọc một số hội chứng di truyền thường gặp: hội chứng
Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy 13), hội chứng Edward (trisomy
18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng Kleinerfelter (XXY… với ưu
46
điểm:
- Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối.
Hoàn thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày.
(Chú ý: Các quyết định đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào một
mình kết quả FISH).
- Độ chính xác cao.
- Yêu cầu chỉ 10 - 20ml dịch ối.
- Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai rau.
fish.html
Kỹ thuật FISH phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung
thư.
Bạch cầu cấp thể tủy hoặc thể lympho: đánh giá các thay đổi về nhiễm sắc
thể, đặc biệt sự có mặt của một số chuyển đọan đặc hiệu như chuyển đoạn nhiễm
sắc thể số 9 và 22 (Ph1), số 4 và 11, số 8 và 21...có giá trị phân loại và tiên lượng
47
điều trị.
U nguyên bào thần kinh: đánh giá các thay đổi về nhiễm sắc thể, đặc biệt là
sự lặp đoạn của gen NMYC, mất đoạn nhánh ngắn nhiễm sắc thế số 1, và thêm
đoạn nhánh dài nhiễm sắc thể số 7... có giá trị phân loại và tiên lượng điều trị.
fish.html
2.5. Phương pháp FLOW CYTOMETRY
2.5.1. Khái niệm
Flow cytometry là kỹ thuật đo và xử lí đồng thời nhiều tính chất sinh lí của
các phần tử đơn, thường là tế bào, khi chúng di chuyển theo dòng chất lỏng
xuyên qua một chùm tia sáng. Khi các tế bào hay các phân tử trên bị va đập bởi
ánh sáng tập trung, chúng phát ra tín hiệu. Tín hiệu này sẽ được cảm nhận bởi
máy dò (detector) và được chuyển đến máy tính. Trên máy tính, các số liệu được
xử lí và cung cấp thông tin về thuộc tính tế bào. Thuộc tính của phần tử có thể
được đo đạc bao gồm: kích thước của phần tử, độ phức tạp bên trong cấu trúc,
tính chất hạt của phân tử và mật độ huỳnh quang.
2.5.2. Lịch sử
48
- Năm 1969, Lou Herzenberg phát minh ra kỹ thuật phân loại tế bào dựa
vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang (đèn argon) và phát triển thiết bị phân
loại tế bào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS - Fluorescent Activated Cell
Sorter).
- Đến năm 1990, Becton Dickinson (BD) tung ra thị trường máy
FACSCount chuyên dụng cho đếm T-CD4, tại thời điểm đó, máy chưa được cấp
giấy chứng nhận bởi FDA nhưng hiện nay đã được FDA công nhận.
- Năm 1996, BD tiếp tục đưa ra hệ thống FACSCalibur, và sau đó là các

dòng máy FACS Canto, FACS Aria hiện đại và đa nhiệm.
- Năm 1996, Công ty Guava cũng bắt đầu giới thiệu dòng máy đếm tế bào
đầu tiên của hãng.
- Năm 1999, Beckman Coulter công bố về dòng máy EPICS XL và năm

2003 cho ra đời dòng máy Cytomics FC500 và sau đó là các dòng máy Navious,
Galious và Mo-Flow với các chức năng ngày càng hiện đại và tính đa nhiệm
ngày càng cao.
- Năm 1998, hãng Partec sản xuất ra máy đếm CyFlow.
- Và năm 2000, cho ra dòng máy CyFlow SL, và sau này có dòng máy đa
nhiệm CyFlow Space.
- Năm 2002, Guava đưa ra dòng máy PCA.
- Năm 2004, Guava cho ra đời dòng máy Guava EasyCD4 chuyên dùng
cho đếm tế bào T-CD4.
2.5.3. Nguyên tắc hoạt động
Kỹ thuật Flow cytometry được thực hiện trên máy Flow cytometer với ba
49
bộ phận chính:
- Hệ thống dòng lỏng (Fluidics)
- Hệ thống quang học (optics)
- Hệ thống điện tử (Electronics)
Trong máy Flow cytomerter, các hạt chặn laser trong một dòng chất lỏng
bất kỳ.
Trong dòng chảy cytometer, các hạt được tiến hành để đánh chặn laser
trong một dòng chất lỏng. Hạt đình chỉ hoặc di động có kích thước 0,2-150
micromet phù hợp để phân tích.
Các tế bào từ mô rắn phải được tách trước khi phân tích. Các phần của chất
lỏng dòng mà các hạt nằm được gọi là lõi mẫu. Khi các hạt đi qua tia laser,
chúng ngăn cản tia laser. Ánh sáng được thu nhận tại một ống kính, phân tích các
đặc tính của chùm sáng và đưa ra dữ liệu.
Hình 2.9. Các tín hiệu ánh sáng tán xạ được chuyển đổi thành các xung
điện tử có thể xử lý bằng máy tính.
50
a. Hệ thống dòng lỏng (Fluidics)
Hệ thống dòng lỏng vận chuyển các phần tử theo một dòng qua tia laser để
phân tích.
Để đạt được mức độ chiếu sáng tối ưu, hệ thống cần phải thỏa mãn hai điều
kiện:
- Dòng lỏng vận chuyển các phần tử đặt tại trung tâm chùm tia laser.
- Chỉ một phần tử được di chuyển qua chùm tia laser tại một thời điểm nhất
định.
Hình 2.10. Thủy động lực tập trung của một mẫu
Nguồn: http://www.labome.com/method/Flow-Cytometry-A-Survey-and-
the-Basics.html)
b. Hệ thống quang học (Optics/Optical System)
Hệ thống quang học bao gồm các nguồn tia laser và các bộ lọc quang học.
Tia laser chiếu sáng các phần tử trong dòng chất lỏng, sau đó, bộ phận lọc
51
quang học điều khiển các tín hiệu sáng phát ra đến bộ phận cảm nhận.
Tán xạ ánh sáng xảy ra khi một phần tử làm lệch hướng ánh sáng laser tới.
Mức độ tán xạ tùy thuộc vào tính chất sinh lí của quần thể đó, bao gồm kích
thước và độ phức tạp bên trong của nó. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự tán xạ gồm
màng, nhân, các vật chất hạt bên trong, độ lồi lõm bề mặt, hình dáng tế bào.
Có hai dạng tia tán xạ:
Ánh sáng tán xạ theo phương tới FSC (Forward scattered light): tỉ lệ với
diện tích bề mặt tế bào. Đo FSC tức đo ánh sáng bị nhiễu xạ hầu như hoàn toàn.
FSC giúp nhận biết những phần tử lớn hơn một kích thước nhất định mà không
cần phải khảo sát tính chất huỳnh quang của chúng. Nói cách khác, FSC giúp
phân biệt những tế bào, dựa vào sự khác nhau giữa kích thước của chúng.
Ánh sáng tán xạ theo phương bên SSC (Side-scattered light): tỉ lệ với tính
chất hạt hay độ phức tạp bên trong tế bào. Đo SSC là đo ánh sáng bị phản xạ,
hay khúc xạ hầu như hoàn toàn, hiện tượng này xảy ra ở bất kì mặt phân cắt bên
trong trong nào của tế bào, nơi có sự thay đổi số lượng khúc xạ.
Hình 2.11. Tính chất tán xạ ánh sáng của một tế bào
52
Nguồn: http://www.d.umn.edu/~biomed/flowcytometry/introflowcytometry.pdf)
Hình 2.12. Tín hiệu SSC và FSC trong phân tích flow cytometry
Nguồn: http://www.d.umn.edu/~biomed/flowcytometry/introflowcytometry.pdf
(Sự khác nhau về kích thước và độ hạt tế bào, làm cho các tế bào khác
nhau hình thành các quần thể khác nhau trên cửa sổ phân tích. Các quần thể có
FSC và SSC tương ứng với các lymphocyte giúp nhận biết quần thể lymphocyte
trong mẫu, phân biệt với quần thể neutrophil và monocyte).
Dựa trên thông số thu được khi đo đồng thời FSC và SSC, người ta có thể
phân biệt, nhận diện được các dạng tế bào trong một quần thể tế bào hỗn độn.
Một hợp chất phát huỳnh quang có khả năng hấp thu những ánh sáng có
bước sóng nằm trong một giới hạn đặc trưng của hợp chất đó. Sauk hi hấp thụ
một photon ánh sáng thích hợp, một electron trong hợp chất được chuyển lên
mức năng lượng cao hơn. Hiện tượng này của electron được gọi là trạng thái
kích thích. Electron kích thích nhanh chóng trở về trạng thái ổn định và phóng
thích năng lượng kích thích, dưới dạng một photon ánh sáng có bước sóng dài
53
hơn bước sóng của photon kích thích ban đầu. Sự chuyển tiếp năng lượng này
được gọi là phát huỳnh quang. Dãy bước sóng ánh sách có thể kích thích một
hợp chất phát huỳnh quang gọi là phổ hấp thu. Dãy sóng ánh sáng hợp chất phát
huỳnh quang được phát khi kích thích gọi là phổ phát xạ.
Tia laser argon thường được dùng trong flow cytometry vì phát ra ánh sáng
bước sóng 488nm có khả năng kích thích nhiều phân tử phát huỳnh quang. Nói
cách khác, ánh sáng có bước sóng 480nm nằm trong phổ hấp thu của nhiều chất
phát huỳnh quang. Một trong những phân tử phát huỳnh quang thường được sử
dụng là fluorescein isothiocyanate (FITC). 480nm là bước sóng hấp thu gần mức
tối đa của FITC. Với ánh sáng có bước song khác nhưng vẫn nằm trong phổ hấp
thu, FITC vẫn hấp thu, nhưng độ phát huỳnh quang không đạt được như khi bị
kích thích ở bước song 480nm. Có thể sử dụng đồng thời nhiều loại phân tử phát
huỳnh quang, nếu chúng cùng bị kích thích ở bước song 480nm và đỉnh phát xạ
của chúng không gần nhau. Ví dụ, có thể sử dụng đồng thời FITC (đỉnh hấp thụ
530nm) và phycoerythrin (PE) (đỉnh hấp thụ 570nm).
Hệ thống quang học bao gồm: hệ thống quang kích thích (gồm hệ laser và
các thấu kính được sử dụng để định hình và tập trung tia laser) và hệ thống thu
quang (gồm một thấu kính thu nhận ánh sáng phát ra từ sự tương tác giữa tia
laser và phân tử; hệ thống các gương và bộ phận lọc quang học để lọc, dẫn các
ánh sáng có bước song chuyên biệt đến các máy dò quang – optical detector).
Khi một tế bào hay phân tử đi xuyên qua chùm tia laser, các tín hiệu huỳnh
quang và SSC phát ra được chuyển hướng đến các ống nhân quang
(photomultiplier tubes - PMT), các tín hiệu FSC được chuyển đến photoiode. Tất
cả các tín hiệu trước khi được dẫn đến các máy detector phải qua một hệ thống
gương và bộ phận lọc quang học. PMT nhận biết các tín hiệu huỳnh quang,
54
thường là yếu. Tính chuyên biệt của một máy detector đối với một loại thuốc
nhuộm huỳnh quang được tối ưu hóa bằng cách đặt một thiết bị lọc trước PMT,
chỉ cho phép một dãy các bước song có thể đến được máy detector. Dãy phổ này
gần với đỉnh phát xạ của thuốc nhuộm
Những thiết bị lọc như vật được gọi là Bandpass (BP) filter. Các thiết bị lọc
khác sử dụng trong flow cytomertry gồm shortpass (SP) filters và longpass (LP)
filters. SP filter chỉ cho ánh sáng có bước sóng nhỏ hơn hoặc một bước sóng
định sẵn đi qua. LP filter chỉ cho ánh sáng có bước song lớn hơn, hoặc bằng
bước sóng định sẵn đi qua.
Các tín hiệu sáng được sinh ra khi các phân tử đi xuyên qua chum tia laser,
chúng được chuyển thành tín hiệu điện bằng bộ tách sóng quang (photodetector)
và sau đó gắn cho một trị số trên biểu đồ dữ liệu. Có hai dạng photodetector ở
máy BD flow cytometer: photodiode và PMT. Photodiode kém nhạy sáng hơn
PMT và được sử dụng để nhận biêt các tín hiệu FSC mạnh. PMT được sử dụng
để nhận biết các tín hiệu yếu hơn như huỳnh quang và SSC
Khi thuốc nhuộm huỳnh quang được gắn vào kháng thể đơn dòng, chúng có
thể được sử dụng để nhận biết một dạng tế bào chuyên biệt dựa trên các marker
bề mặt mang tính kháng nguyên của tế bào. Các kháng thể đơn dòng tương ứng
với các quần thể tế bào khác nhau được nhuộm với các loại thuốc nhuộm huỳnh
quang khác nhau, sẽ giúp nhận diện các quần thể tế bào.
c. Hệ thống điện tử
Hệ thống điện tử chuyển các tín hiệu ánh sáng đã được nhận bởi bộ phận
cảm nhận thành các tín hiệu điện tử và xử lí bằng máy tính. Một vài công cụ có
trang bị bộ phận phân loại (tách) có khả năng đưa ra các thông số phân loại, làm
55
tích điện gây chệch hướng di chuyển của các phân tử để tách chúng ra khỏi hỗn
hợp.
Với máy flow cytometer, các phân tử sẽ chảy qua một tia laser chắn ngang
dòng chảy. Bất kì phần tử hay tế bào nào ở dạng huyền phù có kích thước từ 0,2
- 150µm đều có thể được phân tích.
Hình 2.13. Hệ thống máy Flow cytometer
Nguồn: http://www.selectscience.net/flow_cytometry_buying_guide.aspx
2.5.4. Phân tích kết quả
56
a. Thu nhận và biểu diễn dữ liệu
Sau khi các tín hiệu sáng đã chuyển thành tín hiệu số, chúng được lưu trữ
trong máy tính theo một cấu trúc chuẩn.
Cấu trúc chuẩn nói trên (được thiết lập bởi tổ chức Committee of the Societi
for Analytical Cytology), bao gồm: một bảng mô tả ngắn gọn về mẫu, công cụ sử
dụng để thu nhận dữ liệu; kiểu dữ liệu và cuối cùng là kết quả phân tích dữ liệu.
Một tế bào đơn được phân tích dựa trên 4 thông số (FSC, SSC, huỳnh
quang FITC và PE) với 8b dữ liệu. Khi phân tích 10.000 tế bào cho một mẫu thì
hồ sơ dữ liệu FCS (flow cytometry standard) chứa 80 kb.
Khi hồ sơ dữ liệu đã được lưu, các quần thể tế bào có thể được biểu diễn
dưới nhiều dạng. Nếu chỉ khảo sát một thông số (chẳng hạn chỉ khảo sát FSC
hay FITC), máy tính có thể biểu diễn dưới dạng biểu đồ một tham số, trục hoành
đại diện cho giá trị tín hiệu của tham số dưới dạng các giá trị số, trục tung đại
diện cho số sự kiện ứng với 1 giá trị số trên biểu đồ (tức là ứng với một giá trị tín
hiệu của tham số). Các tín hiệu có mật độ (giá trị) giống nhau được gán cho cùng
một số. Các tín hiệu sáng hơn (mật độ cao hơn) được biểu diễn bên phải các tín
hiệu mờ hơn.
Khi khảo sát, so sánh đồng thời hai tham số, có thể sử dụng biểu đồ Dot
plot. Trục hoành đại diện cho giá trị của một thông số và trục tung đại diện cho
giá trị của thông số còn lại. Ngoài ra, có thể sử dụng biểu đồ 3D, trong đó trục
hoành và trục tung tương ứng như biểu đồ Dot plot, trục Z biểu diễn số sự kiện
tương ứng.
b. Chặn cổng (gating)
57
- Dùng để giới hạn số lượng dữ liệu lại trong một tập hợp nhỏ đang quan
tâm.
- Một tập hợp con dữ liệu có thể xác định thông qua một cổng. Cổng là một
đường ranh giới dưới dạng số hay hệ giao tiếp đồ họa để xác định tính chất của
phân tử phù hợp cho những phân tích sâu hơn.
c. Phân tử dữ liệu để xác định các quần thể con
Hình 2.14. Thu nhận lymphocyte trong mẫu máu chứa nhiều loại tế bào
(Dựa trên số liệu FSC và SSC, có thể thiết lập một cổng trên đồ thị biểu
diễn đồng thời hai thông số FSC và SSC, cho phép phân tích chỉ những tế bào có
kích thước của lymphocyte. Các tế bào có cùng FSC và SSC sẽ được phân tích
và nhận diện bằng tính chất phát quang của chúng, khi chúng được nhuộm với
thuốc nhuộm phát quang).
Phân tích dữ liệu bao gồm biểu diễn dữ liệu từ dạng một hồ sơ kiểu liệt kê
sang dạng biểu đồ, sao đó, do sự phân phối các sự kiện trong biểu đồ. Dữ liệu
58
cũng có thể được chia nhỏ bằng cách tạo cổng dựa trên đặc tính quần thể chuyên
biệt.
Có nhiều cách để phân tích dữ liệu huỳnh quang của các sự kiện được giới
hạn trong cổng:
(1) Tạo một biểu đồ một tham biến với các marker biểu đồ
(2) Tạo biểu đồ Dot plot hai tham biến với các marker góc phần tư
(3) Biểu đồ ba chiều
(4) Thống kê khoanh vùng quần thể, có thể tạo ra vùng có hình dạng khác
nhau trong cùng một biểu đồ dữ liệu, sau đó sử dụng số liệu thống kê trong vùng
để tìm ra tỉ lệ phần trăm của quần thể chuyên biệt
(5) Phân tích theo cụm. Chương trình này cho phép các vùng tự chuyển đổi
vị trí để khoanh vùng các cụm kết quả từ một tập hợp dữ liệu này đến một tập
hợp dữ liệu khác.
d. Phân loại và thu nhận tế bào
Trong hầu hết các máy áp dụng Flow cytometry, sau khi phân tử rời khỏi
chùm tia laser đều bị loại bỏ. Một số máy có dụng cụ phân loại cho phép bắt giữ
và thu nhận tế bào quan tâm để phân tích xa hơn. Sau khi thu nhận, tế bào có thể
được phân tích vi mô, phân tích sinh hóa, sinh lí hay phân tích chức năng.
Để phân loại các phần tử hay các tế bào, trước tiên, máy cần phải được cài
đặt sẵn chương trình cần thiết giúp nhận dạng được các tế bào quan tâm. Dựa
trên những đặc điểm này, máy sẽ tách chúng ra khỏi những tế bào khác. Khi đã
xuất hiện quần thể quan tâm trên biểu đồ dữ liệu, tiến hành khoanh vùng lại và
thiết lập các cổng. Cổng này sau đó được đưa vào phần mềm của máy như là
59
cổng phân loại, giúp nhận dạng tế bào quan tâm và tách chúng ra khỏi dòng vốn
có nhiều loại tế bào.
Tùy theo loại máy flow cytometer, bộ phận bắt các tế bào được thiết kế
khác nhau. Máy FACSCalibur (kiểu bechtop) sử dụng thiết bị cơ học gọi là ống
bắt (catcher tube) để phân loại tế bào, ống bắt di chuyển ra vào qua dòng mẫu để
thu nhận tế bào quan tâm với tốc độ 300 tế bào/giây.
Khi một tế bào đi qua chùm laser, máy FACSCalibur sử dụng tính chất của
cổng phân loại, nhanh chóng xác định và bắt giữ tế bào đích tùy vào kiểu phân
loại đã chọn trước. Do sự bố trí tia laser trên máy và vận tốc dòng mẫu cố định
nên thời gian phần tử di chuyển từ tia chắn laser đến catcher tube là hằng định.
Khi đã mặc định tiêu chuẩn (phần tử thỏa mãn kiểu phân loại), máy đưa catcher
tube vào dòng mẫu để bắt tế bào.
Đối với Máy FACSVantange SE (kiểu stream in air cytometer), sự phân li

tế bào tiến hành bằng cách làm chuyển động cả dòng mẫu dọc theo trục của nó
để tách thành từng giọt. Khoảng cách giữa các giọt cố định. Máy có thể tính
được khoảng cách giữa các giọt một cách chính xác, cho phép bắt đầu phân tách
tế bào. FACSVantage SE tích điện cho các giọt chứa tế bào phù hợp với tiêu
60
chuẩn phân loại. Khi các giọt mang điện dương và mang điện âm đi qua tấm tích
điện, chúng chuyển hướng đến các ống nhận khác nhau, tùy điện tích của giọt.
Nguồn: http://2011.igem.org/Team:NCTU_Formosa/protocol_F
2.6. Phương pháp khuếch đại nucleic acid
Hầu hết phương pháp chẩn đoán dựa vào sự khuếch đại nucleic acid được
sử dụng trong phân tích bệnh nhiễm. Một số trong các phương pháp đó được
dùng để phát hiện các biến đổi di truyền ở người, phục vụ các chẩn đoán ung
thư, chẩn đoán tiền làm tổ, tiền thai, chẩn đoán các bệnh di truyền, hoặc phân
tích sự biểu hiện gen. Ngoài ra sự khuếch đại DNA còn giúp xác định sự nhạy
cảm của một cá thể với các tác nhân nhiễm nào đó và các tác nhân môi trường
độc hại.
Trong các kỹ thuật khuếch đại khác nhau, thông tin trình tự được sử dụng
để thiết kế các mẫu dò, nhằm phát hiện các trình tự nucleic acid đặc biệt bằng sự
kiện lai của mẫu dò và một số kiểu sự kiện khuếch đại khác. Quá trình khuếch
đại chỉ là một phần của sự phân tích hoàn chỉnh. Bước chuẩn bị mẫu là cần thiết,
sao cho thích hợp với từng phương pháp khuếch đại được lựa chọn. Kiểu phương
pháp khuếch đại được lựa chọn thường tùy thuộc vào trình tự nuclein acid cần
phân tích.
61
Hình 2.15. Phân tích dựa vào khuếch đại nucleic acid
Dựa vào cơ chế hoạt động, kỹ thuật khuếch đại có thể được chia thành ba
nhóm:
(1) Các phương pháp khuếch đại mục tiêu (Target amplification).
(2) Các phương pháp khuếch đại tín hiệu (Signal amplification).
(3) Các phương pháp khuếch đại mẫu dò (Probe amplification).
2.6.1. Chuẩn bị mẫu
Phân tích kiểu gen nhiều thuận lợi hơn so với phân tích kiểu hình, như
nhanh, nhạy, đặc hiệu cao và tạo ra các dữ liệu được chuẩn hóa, lượng hóa. Tuy
nhiên, nhiều câu hỏi cũng được đặt ra như khả năng phát hiện các vi khuẩn
không còn sống… Khi sử dụng các cặp mồi bảo tồn cao, sự quá nhạy của PCR
có thể phát hiện sự nhiễm của môi trường vào mẫu. Do đó, khi chọn vùng
nucleic acid mục tiêu để khuếch đại, một vài vấn đề cần được xem xét. Chẳng
hạn, nên chọn DNA hay RNA, chọn khung đọc mở (open reading frame - ORF)
62
hay một vùng không mã hóa, một trình tự bảo tồn hay một vùng khác, các liên
quan đến sự lựa chọn một gen đơn hay nhiều bản sao…
Bảng 2.4. Một số kỹ thuật khuếch đại
Phương pháp Tham khảo Mẫu dò Enzyme sử dụng
Mục tiêu
Saiki, 1985 DNA polymerase

PCR Hai mồi
Mullis, 1987 chịu nhiệt
Các mồi (một với

Phiên mã ngược,
TAS Kwoh, 1989 promoter T7 RNA
RNA polymerase
polymerase)
Các mồi (một với Phiên mã ngược,

Guatelli, 1990
3SR/NASBA promoter T7 RNA RNase H, RNA
Compton, 1991
polymerase) polymerase
Các mồi với trình tự Endonuclease giới

SDA Walker, 1992 nhận biết của hạn, DNA
endonuclease polymerase
Mẫu dò
Các mẫu dò lai từ đầu

LAR Wu, 1989 DNA ligase
đến đuôi
Các mẫu dò lai từ đầu DNA ligase chịu

LCR Barany, 1991
đến đuôi nhiệt
Khuếch đại Kramer, 1989 Cuộn gấp mẫu dò cơ chất

QB replicase
dựa vào QB Lomeli, 1989 với vùng chuyên biệt
63
mục tiêu và vị trí nhạy
replicase
cảm RNase III
Fire, 1995 Mẫu dò móc khóa và 2 DNA ligase,

RCA
Lizardi, 1998 mẫu dò thêm khác DNA polymerase
Tín hiệu
Hỗn hợp mẫu Klausner, 1988 Các mẫu dò sơ cấp và

Không
dò Yang, 1991 thứ cấp đánh dấu
Mẫu dò giữ, mẫu dò kéo

Urdea, 1991
Các mẫu dò dài, mẫu dò được đánh
Sanchez- Không
bDNA dấu và các multimer
Pescador, 1988
khuếch đại dạng nhánh
Liamichev, 1999 Hai oligo chồng lấp và Flap

Invader
Ryan, 1999 mẫu dò tín hiệu thứ cấp endonuclease
Một yêu cầu thiết yếu cho sự thành công khi phân tích dựa vào sự khuếch
đại nucleic acid là phải có một mạch khuôn chất lượng cao và ngăn cản được
ngoại nhiễm.
Mục tiêu chính của việc chuẩn bị mẫu là giải phóng và ổn định các nucleic
acid, điều chỉnh nồng độ mẫu, tách chất ức chế và đặt các nucleic acid trong
dung dịch bảo quản tương thích. Việc chọn phương pháp, hay chuẩn bị mẫu
cũng phụ thuộc vào đặc tính của sinh vật và các đặc tính vật lý của sinh phẩm.
Phương pháp tách chiết tối ưu phải sao cho tiện lợi, dễ dàng, an toàn và có thể
được tự động hóa.
64
Một lượng lớn các kiểu mẫu sinh phẩm có thể thu nhận như máu, huyết
tương, huyết thanh, các phân đoạn tế bào, dịch ối, nước tiểu, dịch não tủy, nước
bọt, phân, dịch mũi, miếng gạc, các mô đã cố định bằng formaline, thực phầm,
các mẫu môi trưởng… đều là các nguồn nucleic acid có thể dễ dàng được khuếch
đại, sau khi chúng được xử lý thích hợp (Greensfield, 1993).
Các nucleic acid có thể được tách và giải phóng khỏi mẫu bằng nhiều cách
khác nhau: đun nóng, đông lạnh-giải đông, sóng âm hay bởi cách xử lí với
sodium hydroxide, các chất tẩy như SDS (sodium dodecyl sulphate) hay Triton
X-100, các chất làm biến tính như guanidinium isothyosulphate và protease
(Greensfield, 1993). Nucleic acid sau đó được thu nhận, tủa hay giữ trên chất
nền (matrix). Nếu số lượng vi khuẩn nhiễm ít thì cần tách các tác nhân ức chế sự
khuếch đại (bởi việc thêm phenol chloroform trong các bước tinh sạch) và cô đặc
mẫu bằng cách tủa với alcohol.
Hiện nay, thị trường có nhiều bộ kit cho việc chuẩn bị mẫu từ nhiều kiểu
sinh phẩm khác nhau. Chúng thường dựa vào sự li giải tế bào bằng enzyme, gắn
các nucleic acid vào chất nền chứa các cột quay sử dụng kỹ thuật quay (li tâm),
hay chân không để rửa và thay đổi dung dịch đệm. Một cách khác, sử dụng hạt
từ tính kết hợp với mẫu dò để bắt giữ nucleic acid, sau đó tạo từ trường để thu
gom các hạt khi đệm được thay đổi (O’Meara, 1998).
Một phương pháp trực tiếp chuẩn bị mẫu là bắt giữ các vi sinh vật mục tiêu
bằng phương pháp tách miễn dịch từ tính (immunomagenetic) (Olsvik, 1994)
hay tiến hành lọc (Bẹ,1991), rửa các tế bào tách chiết và bổ sung trực tiếp vào
ống PCR, trong ống này chúng bị li giải trước khi khuếch đại.
2.6.2. Khuếch đại
65
Khả năng khuếch đại chuyên biệt một lượng rất nhỏ nucleic acid đã làm cho
kỹ thuật này trở thành một công cụ vô giá trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, phân
tích di truyền, pháp y và các kiểm nghiệm môi trường. Các kỹ thuật khuếch đại
chỉ là một phần của quá trình phân tích phức tạp. Chuẩn bị mẫu là bước quan
trọng cần thực hiện trước khi khuếch đại và sau đó là bước phát hiện mục tiêu.
Sự khuếch đại phân tử được sử dụng để làm tăng nồng độ của mẫu chuyên
biệt hay mẫu dò, hoặc được sử dụng làm gia tăng lượng tín hiệu giúp cho dễ
pháp hiện.
2.6.2.1. Khuếch đại mục tiêu

Hầu hết các kỹ thuật phân tử nhạy đều sử dụng một bước enzyme để
khuếch đại các nucleic acid mục tiêu, trước khi phân tích trình tự chuyên biệt.
Kỹ thuật PCR do Kary Mullis phát triển năm 1983 được sử dụng rộng rãi nhất.
PCR dựa trên khả năng của một DNA polymerase nhân bản một mạch DNA bởi
việc kéo dài mạch bổ sung, bắt đầu từ một cặp mồi (oligonucletide primer)
(Mullis và Faloona, 1987).
Trong suốt quá trình PCR, sự khuếch đại mạch khuôn sẽ tăng theo số mũ 2n,
cho phép khuếch đại một mẫu ban đầu thành hàng triệu mẫu.
Hai điều kiện xác định quan trọng khi tiến hành PCR là thiết kế mồi và
nhiệt độ lai. Hiện nay, có nhiều phần mềm vi tính được lập trình cho việc chọn
primer tối ưu. Những hướng dẫn cho việc phát triển những quy trình PCR mới và
thông tin về những software thiết kế primer đã được tóm lược (Johnson, 2000).
Sự nhạy cảm của PCR cũng gây nhiều rủi ro về những tín hiệu dương tính
giả bởi sự tạp nhiễm. Nhiều đề nghị đưa ra để làm giảm thiểu những rủi ro nảy
sinh (Kwok và Higuchi, 1989; Fredricks và Relman, 1999), và những kiểm soát
66
giúp xác định bất kì kết quả dương tính giả nào. Nếu PCR được sử dụng cho mục
đích chẩn đoán thì cần phải kiểm soát được quá trình để có thể chắc chắn rằng,
kết quả âm tính là do sự vắng mặt thực sự của mục tiêu.
Nhiều hệ thống thương mại phục vụ cho PCR dựa trên sự phát hiện những
vi khuẩn (ví dụ, Chylamidia tracomatis và Mycobacterium tuberculosis) và mục
tiêu virus (ví dụ, Hepatidis C virus [HCV] và HIV) cũng đã được sản xuất bởi
Roche Molecular systems. Một quy trình khuếch đại DNA mục tiêu khác có hiệu
quả cũng đã được thương mại hóa là SDA (Stran displacement assay) (Walker và
cs, 1992).
Một quy trình PCR điển hình gồm 25 – 35 chu kỳ, tốn 2 - 3 giờ và đây
thường là bước làm giảm tốc độ trong nucleic acid. Sự ra đời của miniaturisation
đã giúp giảm thể tích mẫu, giảm chi phí, thời gian chu kỳ ngắn, lượng sản phầm
cao với khả năng tự động phân tích “hands free”. Nhờ vậy, thời gian phản ứng
giảm xuống 90 giây bởi adapting PCR để hệ thống chạy liên tục trên một chip
(Kopp và cs, 1998), trong khi realtime PCR được tiến hành trong một máy luân
nhiệt, chu kì khí nhanh trong 10 - 20 phút (Wittwer và cs, 1997a). Affymetrix
cũng phát triển một thiết bị rút ngắn (miniature device) việc tách chiết mẫu,
nested PCR cũng như phát hiện đột biến HIV-1 bằng cách lai array (Anderson và
cs, 2000). Hệ thống như SSR (selt sustained replication) (Guatelli và cs, 1990)
và kỹ thuật phân tích dựa trên trình tự nucleic acid (NASBA) (Conton, 1991) là
những chiến lược khuếch đại mục tiên RNA thay đổi, có sử dụng RNA
polymerase reverse trancriptase (RT) và RNase H. Đây là những kỹ thuật đẳng
nhiệt (isothermal) ít robust hơn PCR, nhưng hữu dụng khi giúp chọn lọc được
các RNA khuếch đại mong muốn. Các bộ kit phát hiện HIV-1 và
67
cytomegalogirus (CMV) dựa trên NASBA đã được thương mại hóa (Organon
Teknika).
Bảng 2.5. Biến thể của PCR
Biến thể Tham khảo
Hot – start Chou và cs, 1992
Nested – PCR Haqqi và cs, 1998 ; Mullis và Faloona, 1987
Touchdown PCR Don và cs, 1991
RT – PCR Erlich và cs, 1991
Multiplex PCR Chamberlain và cs, 1988
Asymmetric PCR Innis và cs, 1988; Shyamala và Amess, 1989
Real – time PCR Tiagi và Kramer, 1996; Nazarenko và cs, 1997;

wittwer và cs, 1999
Miniaturisation Whitcombe và cs, 1999; Kopp và cs, 1998

Wittwer và cs, 1997; kopp và cs, 1998
LAMP (Lop-mediated isothermal amplification): là một phương pháp dùng

để khuếch đại DNA mục tiêu (target DNA), mà không cần phải dùng tới máy
luân nhiệt (thermalcycler). Những ưu điểm của LAMP là nhạy và nhanh, hiệu
quả khuếch đại không bị ảnh hưởng bên các DNA lạ nhiễm vào. Điểm khác biệt
giữa LAMP và PCR (cũng chính là ưu điểm của LAMP) là LAMP có thể thực
hiện được trong điều kiện đẳng nhiệt (isothermal). Chỉ cần một giai đoạn biến
tính ở 95oC và giai đoạn đầu, còn cả quá trình sau chỉ cần thực hiện ở 65 oC. Sự
khác biệt đó nằm ở loại mồi và DNA polymerase được sử dụng. PCR chỉ cần
một cặp mồi, có LAMP phải dùng đến hai cặp.
68
Hình 2.16. Nguyên lý của kỹ thuật PCR
PCR sử dụng Taq polymerase có khả năng hoạt động tốt ở nhiệt độ cao,
trong khi đó LAMP sử dụng Bst polymerase có khả năng thay thế mạch (strain
displacement activity). Khả năng khuếch đại không cần luân nhiệt của LAMP
nằm ở những cái loop. Khi cặp mồi đặc hiệu FIP và BIP bắt vào loop, dưới hoạt
tính của Bst polymerase, mạch DNA mới sẽ được kéo dài đồng thời với sự tách
mạch của hai mạch cũ.
Chính điều này giúp LAMP không cần luân nhiệt trong suốt chu trình
khuếch đại.
Các DNA mục tiêu sẽ được khuếch đại thành những cấu trúc hình quả tạ có
chiều dài khác nhau. Kết quả của LAMP có thể được phát hiện nhờ điện di hay
đèn huỳnh quang sau khi thêm vào một nhân tốt đặc biệt. Kết quả dương tính của
LAMP là tạo một smear trên gel điện di, do sự hình thành các cấu trúc quả tạ.
Ưu điểm của LAMP so với PCR là đơn giản, nhạy hơn. LAMP có thể
khuếch đại cả một lượng rất nhỏ DNA. Nhờ vậy, những người không có nhiều
69
kiến thức về CNSH cũng có thể thực hiện và quan sát được mà không cần điện
di. Có những bộ kit chỉ cần cho mẫu vào là cũng biết được kết quả, điều này rất
có ích để chẩn đoán nhanh bệnh của gia súc.
Hạn chế của LAMP là chỉ có thể được thực hiện khi lai giữa sáu trình tự
đặc trưng nằm ở hai đầu DNA mục tiêu. Điều này đòi hỏi phải có những cặp mồi
FIP, BIP thật đặc hiệu. LAMP cũng dễ cho hiện tượng dương tính giả nên thực
hiện trong những khu vực riêng biệt. Ngoài ra, LAMP không thể phát hiện được
từ hai nhân tố gây bệnh trở lên như multiplex và nested PCR.
2.6.2.2. Khuếch đại mẫu dò

Phản ứng chuỗi nối ligase (ligase chain reaction - LCR) ( Barany, 1991)
dựa vào thử nghiệm nối oligonucleotide (oligonucleotid ligation assay - OLA)
(Landegren và cs, 1998) là kỹ thuật khuếch đại mẫu dò, sử dụng DNA Ligase để
nối hai đầu tận cùng mẫu dò nằm cạnh nhau trên DNA mục tiêu.
Hình 2.17. Nguyên lý kỹ thuật LCR
70
Sự lặp lại quá trình này tạo ra những sản phẩm nối. Sản phẩm này có thể
được phát hiện bằng cách sử dụng những nhóm chức năng gắn mẫu dò. Một kỹ
thuật biến đổi gọi là Gapped LCR sử dụng DNA polymerase và ligase làm giảm
rủi ro kết quả dương tính giả từ sự nối đầu bằng (blunt end ligation) (Ayyadevara
và cs, 2000). Vì chỉ khuếch đại, mẫu dò bị giới hạn khi áp dụng để xác định trình
tự nucleotide trong mẫu, không hiệu quả cho việc xác định mục tiêu. Tuy nhiên,
phương pháp này khá nhạy đối với các mismatch và được dùng để phát hiện
điểm đột biến điểm tại vị trí nối (Landergen và cs, 1988).
Mẫu dò hình móc khóa (padlock) là một biến thể của nguyên lý gắn có sự
tương đồng hoàn toàn với mục tiêu. Các đầu cuối bên ngoài của mẫu dò dạng
thẳng được gắn với DNA mục tiêu, để thành dạng mẫu dò xoay tròn (Nilsson và
cs, 1994).
Kỹ thuật này tương thích với hệ thống khuếch đại theo kiểu vòng tròn xoay
(rolling-circle amplification - RCR), cho phép phát hiện chọn lọc các vòng được
gắn (Baner và cs, 1998). Chiến lược khuếch đại mới giúp khuếch đại đa thành
phần các mẫu dò dạng vòng tròn, dễ dàng lập kiểu di truyền (genotype) thông
qua sự gắn chuyên biệt allele của các mẫu dò dạng vòng tròn mở (Farugi và cs,
2001). Các mẫu dò chuyên biệt allele dạng thẳng được giữ cố định có thể sử
dụng làm mồi RCR, cho phép xác định trạng thái tương đồng của mục tiêu
(Lizardi và cs, 1998). Ngoài ra, một số kỹ thuật khuếch đại mẫu dò khác hiện
hành, như QB replicase (Kramer và Lizardi, 1989), hay mẫu dò cycling CPT
(Duck và cs, 1990).
2.6.2.3. Sự khuếch đại tín hiệu

Một cách khác tiếp cận mục tiêu (và khuếch đại mẫu dò) là khuếch đại các
tín hiệu được tạo ra nhờ phát hiện được trình tự của mục tiêu.
71
Hình 2.18. Sự tạo vòng mẫu dò bằng cách gắn và khuếch đại bằng RCA
Mẫu dò hình móc khóa được lai với DNA mục tiêu, nếu sự bắt cặp là hoàn
hảo thì chúng được nối lại bằng DNA ligase. Một primer được bổ trợ với mẫu
dò hình móc khóa, sau đó bắt đầu khuếch đại mẫu dò thông qua cơ chế hình tròn
xoay (rolling circle), sử dụng DNA polymerase thay thế một mạch. Điều này sẽ
tạo ra một sản phẩm mạch đơn chứa nhiều bản sao trong vùng đuôi của trình tự
bổ trợ với mẫu dò hình tròn. Để đạt sự khuếch đại xa hơn, RCA nhánh
(branched RCA-bRCA) có thể tiến hành bằng cách thêm một mồi thứ cấp mà bắt
đầu sao chép sản phẩm RCR.
Sự khuếch đại tín hiệu DNA nhánh (bDNA) được phát triển bởi tập đoàn
Chiron. Phương pháp này sử dụng các mẫu dò DNA phức tạp, trước hết cho việc
bắt giữ và sau đó là cho sự gia tăng số vị trí gắn tiềm tàng từ tín hiệu báo cáo
(reporter signal) cuối cùng được tạo ra (Urdea và cs, 1991). Tín hiệu được tạo ra
tương quan với lượng DNA mục tiêu và do đó, lượng DNA có thể được xác định
từ đường cong có chia tỉ lệ (calibration curve).
Cách tiếp cận này ít nhạy hơn sự khuếch đại mục tiêu nhưng có một số
thuận lợi: rủi ro do nhiễm là tối thiểu và thử nghiệm bDNA có thể phát hiện một
dãy rộng hơn các kiểu gen (genotype) của virus hơn là các thử nghiệm dựa vào
PCR – luôn bị giới hạn sự đặc hiệu vì số lượng trình tự của mục tiêu bị hạn chế.
72
Điều này giúp phát hiện chính xác các genome RNA virus vốn có tính hỗn tạp
cao (heterogeneity) trong trình tự (Hankins và cs, 1997).
Hình 2.19. Phát hiện dựa vào bDNA
Một kỹ thuật khuếch đại tín hiệu khác là Invader assay, liên quan đến nhiều
chu kì phân tách phức tạp của một phức hợp mẫu dò chồng lên nhau (overlap).
Sự phân tách này dẫn đến việc giải phóng các mẫu dò tín hiệu, hoặc có thể được
phát hiện trực tiếp (Liamichev và cs, 1999), hoặc gây ra sự phân tách của mồi
được đánh dấu giải phóng tín hiệu huỳnh quang của mỗi phân tử mục tiêu (Hall
và cs, 2000). Endonuclease tạo ra các vết cắt nhạy cảm, với sự có mặt của
mismatch (bắt cặp sai) tại vị trí chồng lấp (overlap), chúng được dùng cho sự đa
hình nucleotide đơn (SNP) và phát hiện đột biến (Hessner và cs, 2000).
2.6.3. Phát hiện và phân tích
2.6.3.1. Phân tích định tính
Phân tích định tính các sản phẩm PCR có thể hiểu nôm na là xác định được
“tính chất” của đối tượng, nhằm trả lời câu hỏi: có gen đó hiện diện trong mẫu
không? Có sinh vật A nào đó hiện diện trong mẫu không? Gen A nào đó bị biến
73
đổi không?
Tùy thuộc vào mục đích tiến hành, người ta có thể tiến hành các kiểu phân
tích khác nhau. Để chọn phương pháp phân tích kết quả sau khi khuếch đại
nucleic acid, một vài khía cạnh cần được xem xét, kể cả mức độ đặc hiệu của
phương pháp khuếch đại. Một phương pháp khuếch đại PCR đặc hiệu cao không
cần phải khẳng định lại kết quả bằng phương pháp phát hiện lai với các mẫu dò.
Trái lại, cần phải kiểm tra khi sản phẩm khuếch đại bị nghi ngờ dị hợp, hay
những biến đổi trình tự hiếm cần được phát hiện (thường xảy ra ở phân tích HIV
hay trong các nghiên cứu tác nhân gây bệnh mới). Phương pháp phát hiện các
sản phẩm PCR được chia thành 2 nhóm: các phương pháp dị hợp và các phương
pháp đồng hợp.
Các phương pháp không đồng nhất đòi hỏi tất cả các thao tác sau khi chạy
PCR như ước tính sản phẩm, nạp mẫu vào gel hay cột, chuyển sản phẩm lên trên
màng, chip hay những phase rắn khác, bổ sung các mẫu dò nucleic acid hay
protein và các cơ chất, hay nối bằng enzyme hoặc các phản ứng kéo dài
nucleotide. Nhiều nghiên cứu nhằm tự động hóa các quá trình này. Các phương
pháp phân tích dị hợp xếp vào năm nhóm, chúng khác nhau về nguyên tắc phát
hiện.
- Nhóm thứ nhất có phương pháp phân tích dựa vào điện di
(electrophoresis), bao gồm điện di trên gel agarose, giải trình tự theo ranger,
SSCP, DGGE, HA. Nguyên tắc phân biệt để phát hiện trong các phương pháp
này là dựa vào kích thước, cấu hình và trình tự. Sự khác nhau nói trên làm các
phân tử nucleic acid dịch chuyển với tốc độ khác nhau trên bảng gel và nhờ đó
mà chúng được tách biệt.
74
Hình 2.20. Phân tích bằng DNA-chip
- Nhóm thứ hai bao gồm các phương pháp: Southern blot, Reverse dot blot,
ASO, DNA-chip… Nguyên tắc phân biệt để phát hiện trong các phương pháp
này là dựa vào sự lai chuyên biệt của các đoạn nucleic acid mạch đơn (gọi là
mẫu dò) với trình tự thích hợp trên mạch sản phẩm khuếch đại. Kết quả của các
phân tích trả lời cho câu hỏi: “có” hoặc “không có” trình tự DNA mục tiêu trong
hỗn hợp sản phẩm khuếch đại.
Hình 2.21. Phân tích Mini-DNA sequencing
75
- Nhóm thứ ba bao gồm một loạt phương pháp: RFLP, CFLP,
Pyrosequencing, Mini-sequencing. Nguyên tắc chung cho các phương pháp này
là tận dụng sự cắt chuyên biệt của enzyme ở các vị trí khác nhau trên trình tự
nucleic acid khuếch đại.
- Nhóm thứ tư có phương pháp sắc kí như HPLC, với nguyên tắc dựa vào
tốc độ di chuyển khác biệt của các trình tự nucleotide khác nhau.
- Nhóm thứ năm là phương pháp đo khối phổ như MALDI-TOF với nguyên
tắc dựa vào trình tự nucleotide để phân tích sự khác biệt giữa các trình tự này.
Phương pháp đồng hợp phát hiện các sản phẩm bên trong ống tube PCR kín
và thường là thực thời (real time), không cần thêm bất kì thành phần chất nào,
giảm nguy cơ nhiễm. Phương pháp đồng hợp có thể chia thành các phương pháp
không đặc hiệu, phát hiện các amplicon đúng, cũng như primer dimer và các sản
phẩm không chuyên biệt khác. Thứ hai là các phương pháp đặc hiệu, chỉ phát
hiện các sản phẩm khuếch đại chứa trình tự chuyên biệt của mục tiêu.
Một thuận lợi lớn khi các phân tích đa được tiến hành trên cùng một mẫu
PCR. Tuy nhiên, ngày nay các thuốc nhuộm đa (FRET-pair) đã cho phép phát
hiện nhiều mục tiêu hay nhiều sự biến đổi trình tự trong cùng một mẫu.
Hình 2.22. Phát hiện bằng đo khối phổ
76
Mặc dù, nhiều phương pháp phát hiện đã có sẵn, một vài nguyên lý cần
được kết hợp với nhau để có thể tối ưu hóa các phân tích. Chẳng hạn tận dụng sự
đa hình vị trí ở kiểu gen trong phân tích biểu hiện gen và trong các ứng dụng
định lượng khác. Các phản ứng Minisequencing cũng có thể tiến hành trên một
oligonucleotide array. Các sản phẩm kéo dài (hay sự kéo dài base đơn của
oligonucleotide, được tạo ra khi có sự pha trộn các deoxyribonucleotide
triphosphate) có thể được phân tích bằng MALDI.
Tất nhiên, các phương pháp sử dụng để phát hiện và phân tích sản phẩm
khuếch đại bằng PCR cũng có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp
khuếch đại khác. Chẳng hạn, kỹ thuật Invander (Invander technology) có thể sử
dụng các mẫu dò phát huỳnh quang dập tắt (quenched flourescent probes) và các
sản phẩm khuếch đại thông qua sự phiên mã (TMA), có thể được kết hợp với các
xét nghiệm bảo vệ lai (hybridization protection assay – HPA) để phát hiện các
RNA virus.
Gần đây, một số phương pháp phát hiện nhạy hơn mà không dựa vào sự
khuếch đại các nucleic acid được giới thiệu. Những phương pháp này sử dụng
các hiện tượng vật lý như có chế quét Raman cộng hưởng kích thích bề mặt tế
bào (surface enhanced resonance Raman scattering), hay FCS (flourescent
corelation spectroscopy), hoặc EV (alectrophoretic velociti). Có phương pháp
tận dụng sự thay đổi màu sắc của mẫu khi gắn chúng với các tiểu phần vàng
nano kết hợp với các mẫu dò lai.
Có ba dạng chính trong định tính và một số ứng dụng phổ biến.
- Dựa vào sản phẩm PCR, đồng thời kết hợp với những kỹ thuật khuếch đại
khác cho phép định kiểu các vi sinh vật ở các mức chuyên biệt khác nhau trong
một loài. PCR có thể được sử dụng để khuếch đại một trình tự đã biết, sau đó sản
77
phẩm được cắt thành các mảnh khác nhau bằng endonuclease. Kết quả này sẽ
được biểu lộ khi chạy điện di hỗn hợp đó trên gel. Một thuận lợi đầu tiên khi sử
dụng các phương pháp này là không cần phải tiến hành Southern blot và lai mẫu
dò.
Một chiến lược khác là sử dụng RAPD (random amplification of

polymorphic DNA) còn gọi là arbitrary PCR (PCR tùy ý), sự khuếch đại chuyên
biệt thấp với các mồi ngắn và tùy ý để tạo ra dấu vân tay (fingerfrint) DNA bộ
gen đơn giản.
Bảng 2.5. Một số phương pháp phân tích và phát hiện các sản phẩm
78
PCR (định tính)
Đây là phương pháp phân tích hiệu quả, loại bỏ được bước giới hạn và
không cần thiết bất kì thông tin trình tự nào trước đó. Broad range PCR có thể
được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật ở các mức đặc biệt khác nhau, tùy
thuộc vào sự lựa chọn vùng bộ gen để khuếch đại. Vùng được chọn thường chứa
cả những vùng tương đối bảo tồn, cho phép thiết kế các mồi phổ quát (universal
primer) và cả những vùng biến đổi cao để xác định. Khi những trình tự thích hợp
của sinh vật được biết, sự lai các sản phẩm PCR với các mẫu dò chuyên biệt trên
một chip có thể được sử dụng để đạt được các mục đích chẩn đoán. Xác định các
chủng ở mức phân tử cũng hữu ích trong dịch tễ học nhằm so sánh sự cách li môi
trường và lâm sàng, xác định những cơn bùng nổ bệnh dịch, phân biệt sự tái phát
và tái nhiễm, cuối cùng để nghiên cứu cấu trúc và dòng chảy gen trong quần thể
tác nhân gây bệnh.
Phát hiện chuyên biệt: Sự chẩn đoán theo kiểu “có hay không” luôn dựa
vào các phương pháp khuếch đại với các mồi chuyên biệt cho từng mục tiêu.
Hầu như bất kì phương pháp phát hiện sản phẩm PCR nào cũng có thể được ứng
dụng, bởi chỉ cần xác nhận sự hiện diện của sản phẩm quan tâm. Các xét nghiệm
PCR đặc hiệu, nhanh, rất hữu dụng trong việc xác định chẩn đoán các sinh vật đã
biết, nhất là khi chúng thuộc loại không nuôi cấy được, khó tính, phát triển chậm
hay nguy hiểm.
Nhu cầu phát hiện virus trong các mẫu huyết tương để sử dụng sản phẩm từ
máu bằng kỹ thuật khuếch đại ngày càng tăng. Bằng cách khuếch đại vùng gen
mã hóa nhân tố độc gây bệnh, những tác nhân nhiễm sản xuất chất độc trong mô
hay tế bào có thể được xác định một cách nhanh chóng và chính xác.
79
Một khó khăn so với phương pháp tách chiết truyền thống, dựa vào nuôi
cấy và phân tích là việc đánh giá sự kháng với kháng sinh. Cần tiến hành tách
biệt các phương pháp truyền thống với khuếch đại nucleic acid, nếu như tính
nhậy của sinh vật chưa được biết.
Hình 2.23. Một số ví dụ phương pháp đồng hợp phát hiện sản phẩm PCR
Phát hiện các trình tự đa hình và các đột biến: Một ví dụ khác của phân
tích dựa vào sự khuếch đại về định tính là phát hiện các đột biến, hay các cấu
trúc đa hình trong trình tự mục tiêu. PCR có thể được kết hợp với một vài
phương pháp khác để phát hiện sự thay đổi từng base trong trình tự. Khuếch đại
PCR đặc hiệu trình tự là một phương pháp nhạy cảm, rất thích hợp để phân tách
từng base. Trong các phương pháp phát hiện dựa vào kỹ thuật lai, những khác
biệt trong đặc điểm lai giữa một kết hợp hoàn chỉnh với một kết hợp sai
(mismatch) thường được sử dụng để phát hiện đột biến.
80
Nhiều phương pháp khác thường dựa vào sự kết nối chuyên biệt trình tự của
các oligonucleotide, hay sự kéo dài của các mồi kết hợp hoàn toàn. Trong nghiên
cứu, một lượng lớn các vị trí đa hình thường được quan tâm ở vài mẫu tương
đối, trong khi đó để ứng dụng lâm sàng, một lượng lớn mẫu phải được kiểm tra
nhằm cho những biến đổi ít hơn. Các ứng dụng trong vi sinh vật học bao gồm
việc tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng liên quan, nghiên cứu sự biến đổi
allele người khi bị ảnh hưởng của tác nhân nhiễm, qua đó tìm hiểu cơ chế kháng
các tác nhân nhiễm. Ngoài ra, có thể phát hiện các kháng với kháng sinh trong vi
khuẩn và sự kháng lại thuốc chống virus. Một định lượng lớn virus sẽ là một
trong các cách tiếp cận để xác định gián tiếp sự kháng thuốc. Cơ chế di truyền
liên quan đến sự kháng nói chung rất phức tạp, chưa được biết rõ.
Phân tích chất lượng được định nghĩa là sự phát hiện một hay nhiều sản
phẩm đặc hiệu nào đó (ví dụ, phát hiện tác nhân gây bệnh), hay xác định các
kiểu trình tự khác nhau. Tùy vào điều kiện và mục đích, nhiều phương pháp
được dùng (Bảng 1.4) để phát hiện sản phẩm hay các kiểu trình tự.
Phát hiện sản phẩm chuyên biệt qua điện di gel cho phép tiến hành các phân
tích thuận lợi. Phân tích này sẽ cho câu trả lời có hay không, với ước tính số
lượng, chất lượng và kích thước của mục tiêu. Sản phẩm PCR khuếch đại cũng
có thể được phát hiện thông qua phương pháp lai với mẫu dò chuyên biệt (Saiki
và cs, 1989).
Sự phát hiện mục tiêu được tiến hành hoặc trực tiếp với các tín hiệu đánh
dấu gắn với amplicon như chất phát quang, hay gián tiếp theo kiểu sandwich
thông qua phương pháp miễn dịch enzyme hay enzyme gắn streptavidin. Phương
pháp thường dùng là sản phẩm khuếch đại sẽ được đánh dấu với
biotin/digoxigenin, sau đó cố định chúng thông qua kháng thể biotin/digoxigenin
81
gắn vào cơ chất rắn. Quy trình này cho phép phát hiện một cách trực tiếp, hay
gián tiếp các phân tử mục tiêu với một mẫu dò oligonucleotide. Sản phẩm đã
khuếch đại được cố định bằng cách tiến hành PCR với primer PCR gắn đồng hóa
trị với cơ chất rắn (Oroskar và cs, 1996).
Xác định sự biến đổi trình tự (Sequence variation) trong kiểu phân tử của vi
khuẩn hay nucleic acid của virus sẽ có ý nghĩa lớn, nhằm phát hiện nguồn bệnh
trong dịch tễ học, đồng thời kiểm tra các quá trình tiến triển bệnh. Trình tự DNA
được nhìn nhận như là một “tiêu chuẩn vàng” (gollden standard), làm khuôn mẫu
cho việc thiết lập các kết luận về sự biến đổi trình tự đã biết và chưa biết.
Tuy nhiên, đã có sự không ổn định kết quả khi sử dụng các kỹ thuật đột
biến dựa vào điện di. Có nhiều phương pháp như dựa trên sự đa dạng cấu hình
mạch đơn (single- strand conformation polymophism – SSCP), phương pháp
điện di gel gradient biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis – DGGE)
và phép phân tích heteroduplex (heteroduplex analysis – HA) đã được sử dụng
để rà soát trình tự biến đổi, trên cơ sở nhận biết những khác biệt của các trình tự
đó. Sắc kí lỏng cao áp biến tính (denaturing high performance liqiud
chromatogrph – DHPLC) có thể được sử dụng một cách hiệu quả hơn, thay cho
phương pháp điện di để xác định các biến đổi, dễ dàng tự động hóa.
Biểu hiện đa hình chiều dài của những đoạn cắt giới hạn (restriction
fragment polymorphism – CFLP) được dựa vào những biến đổi của kích thước
và số lượng các mảnh được tạo ra, sau khi cấu trúc được phân hủy bởi enzyme
cắt giới hạn hay do phân tách (endonuclease hay ribonuclease). Các mảnh có thể
được sử dụng cho mục đích so sánh trong nghiên cứu y sinh, pháp y và dịch tễ
học, cũng như để xác định đặc điểm của các subtide virus, vi khuẩn hay các phân
tử kháng nguyên khác.
82
Những phản ứng enzyme như OLA, pyrosequencing và SBE cũng có thể
được tiến hành để sàng lọc các đột biến điểm và SNP, hiện tại, các phản ứng này
đang được tiến hành theo kiểu array (Pastinen và cs, 1997; Hirschhorn và cs,
2000).
Lai với oligonucleotide chuyên biệt allele (ASO) là phương pháp đã được
ứng dụng rộng rãi cho việc phát hiện đột biến điểm và SNP. Nguyên tắc của
phương pháp dựa vào việc xác định những khác biệt xảy ra trong cơ chế lai, giữa
sự bắt cặp sai (mismatch) và bắt cặp hoàn toàn (perfectmatch). Kỹ thuật này đã
được thương mại hóa, sử dụng rất hiệu quả cho tiping HCV (Le Pogam và cs,
1998) và phát hiện đột biến kháng thuốc ở HIV (Stuyver và cs, 1997). Với thuận
lợi của việc lai dựa vào kỹ thuật DNA chip, quy trình lai ASO được tiến hành
với phương thức công nghệ cao, sản phẩm có số lượng và chất lượng tốt. Những
công cụ array oligonucleotide này được sử dụng để sàng lọc các đột biến ở
BRCA1 (Vahey và cs, 1991), hoặc dùng cho việc xác định SNP và tiping (Wang
và cs, 1998). Một phương pháp mới là sử dụng máy đo khối phổ để phân tích các
phân tử DNA nhỏ. Thuận lợi của phương pháp này là nhanh, chính xác trình tự
và không cho đánh dấu để phát hiện (Graber và cs, 1999).
Có ít nhất bốn thiết bị kết hợp máy luân nhiệt, tia laser và một hệ thống
phần mềm để tự động hóa sự phát hiện, định tính nucleic acide như ABI Prism
7700 (PE Biosystems), Light Cycler (Rocher), SmartCycler (Cepheid) và I-
Cycler(Biorad).
2.6.3.2. Phân tích định lượng
Với sự phát triển của kỹ thuật dựa vào khuếch đại và các phương pháp phát
hiện sản phẩm khuếch đại, một số cách tiếp cận định lượng nucleic acid đã được
báo cáo trong vài thập niên qua. Các phương pháp định lượng dựa vào khuếch
83
đại này được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực định lượng vi khuẩn, virus và kí
sinh trùng. Phương pháp RT-PCR cũng có khả năng phân tích sự biểu hiện gen,
đặc biệt trong trường hợp lượng mRNA thấp, hay RNA từ một vài tế bào đơn.
Những ứng dụng khác như định lượng sự phiên mã để kiểm soát trong liệu pháp
gen, hay định lượng các sản phẩm gen kháng thuốc, định lượng sự nhiễm DNA.
Việc lựa chọn xét nghiệm định lượng phụ thuộc vào độ nhạy cảm và độ
chính xác của phạm vi định lượng cần thiết. Trong ứng dụng lâm sàng, nhiều
phương pháp khuếch đại có thể được sử dụng như PCR, NASBA, bDNA…
Trong nghiên cứu, các phương pháp định lượng dựa vào PCR được sử dụng
nhiều hơn cả.
Ba cách tiếp cận định lượng nucleic acid được sử dụng rộng rãi:
Phân tích pha loãng tới hạn: PCR được sử dụng rất thành công khi kết hợp
với phương pháp pha loãng tới hạn và nguyên lý thống kê Poission để xác định
lượng mục tiêu nucleic acid trong mẫu chưa biết. Nguyên tắc của phương pháp
này là định lượng số mục tiêu nucleic acid ban đầu hiện diện trong mẫu, không
định lượng lượng sản phẩm DNA PCR tạo thành. Mẫu được pha loãng đến điểm
cuối “tất cả hay không có gì”. Để chắc chắn rằng lượng mục tiêu ít nhưng chỉ có
một mục tiêu để tiến hành đến điểm cuối dương tính (possive end point), người
ta tiến hành khuếch đại nested.
Để định lượng được, nhiều khuếch đại được tiến hành tại nhiều seri pha
loãng và lượng mục tiêu được tính toán bằng thống kê Poisson dựa trên tỉ lệ mẫu
dương tính/ âm tính tại giới hạn pha loãng, ở đó vài phản ứng PCR được tiến
hành song song. Sản phẩm PCR có thể được phát hiện bằng bất kỳ phương pháp
nào khi chỉ cần định tính.
84
PCR cạnh tranh: Đây là chiến lược được sử dụng rộng rãi nhất, liên quan
đến việc đồng thời định lượng mục tiêu và lượng DNA tiêu chuẩn bên trong đã
biết. Định lượng thực hiện bằng cách so sánh lượng của hai sản phẩm PCR. Khi
phân tử mục tiêu và DNA tiêu chuẩn cạnh tranh với mồi, với DNA polymerase
và những thành phần khác của hỗn hợp, thì DNA tiêu chuẩn được gọi là chất
cạnh tranh, vì thế quy trình được gọi là PCR cạnh tranh.
Một số vấn đề liên quan khi thực hiện với PCR cạnh tranh bao gồm: (1)
thiết kế mồi, (2) định lượng gen quan tâm, (3) sự nhạy cảm, phạm vi động lực và
độ chính xác cần thiết, (4) định lượng dựa vào phase tăng trưởng (exponential
phase) và phase ổn định (plateau phase), (5) chọn lựa phương pháp phát hiện và
(6) kiểm soát chất lượng.
Về cơ bản, mẫu (chưa biết lượng) sẽ được cố định và được khuếch đại cùng
với các seri pha loãng chất cạnh tranh. Chất cạnh tranh phải khác (chẳng hạn sự
khác biệt về chiều dài) với trình tự mục tiêu để những amplicon có thể nhận ra vị
trí enzyme cắt giới hạn duy nhất, những trình tự duy nhất cho việc gắn của
protein báo cáo (protein gắn DNA – DNA binding reporter protein), hay việc lai
với mẫu dò DNA chuyên biệt. Kết quả được trình bày bằng đường cong liên
quan đến log (tỉ lệ của tín hiệu chất cạnh tranh so với tín hiệu mục tiêu), cũng
như hàm lượng ban đầu của chất cạnh tranh.
PCR động lực (kinetic PCR): Một chiến lược khác để định lượng sản phẩm
PCR là dựa vào sự phát hiện sản phẩm khuếch đại. Khả năng sử dụng động lực
học của phản ứng khuếch đại để đo lượng sản phẩm tích lũy sau khi khuếch đại
đã được đề nghị rất sớm. Tuy nhiên, phải có các cải thiện dựa vào tính chất hóa
học, cũng như nhiều thiết bị cần thiết khác để kỹ thuật có thể đưa vào ứng dụng
rộng hơn.
85
Hiện nay, có ba hệ thống thương mại đã được phát hiện để định lượng mục
tiêu nucleic acid bằng cách sử dụng nguyên lý động lực học phản ứng là ABI
PRISM 7700, hệ thống 5700 Sequence Detection System (PE Applied
Biosystem), the Light Cycler (Idaho Technologies) và The iCycler iQ (Bio-rad).
2.6.4. Giải trình tự nucleic acid
Hai thập niên qua, giải trình tự nucleic acid (DNA và RNA) đã tiến hành ở
nhiều phòng thí nghiệm. Các kỹ thuật này ngày càng hoàn thiện và được tự động
hóa, chúng được sử dụng để giải trình tự cả bộ gen của nhiều cá thể như nấm
men (Saccaromyces cerevisiae) (15Mb) (Goffean và cs, 1996); giun tròn
(Caenorhab ditis elegans) (97Mb) (The C. elegans sequencing Consortium,
1998); ruồi giấm Drosophila melanogaster (120Mb) (Adam và cs, 2000) và đặc
biệt, bộ gen người (3000Mb). Giải được trình tự cả bộ gen làm cho việc tìm hiểu
sự biểu hiện gen dễ dàng, giúp hiểu cơ chế tiến hóa và nguyên nhân bệnh.
Việc giải trình tự còn được sử dụng để phát hiện và đánh dấu các đột biến
(Berg và cs, 1995) và sự đa hình (như SNP, đoạn chèn và mất đoạn) trong bộ gen
(Mullikin và cs, 2000). Tìm hiểu sub typing các vi khuẩn (Spratt, 1999) và virus
(Aren, 2001) bằng cách giải trình các vùng khác nhau trên bộ gen của chúng,
cũng là một ứng dụng quan trọng. Giải trình tự gen còn phục vụ cho các nghiên
cứu phân tử, dịch tễ học, sự đột biến kháng thuốc…
2.6.4.1. Kỹ thuật giải trình tự chuỗi
Kỹ thuật giải trình tự chuỗi cơ bản được phát triển hơn 20 năm và vẫn được
tiếp tục hoàn thiện cho đến nay. Phương pháp Sanger sequencing được xây dựng
bởi Sanger năm 1977, trên cơ sở giải trình tự DNA bằng polymerase, thông qua
sự kết thúc chuỗi dideoxy (Sanger và cs, 1977), Một chiến lược giải trình tự thứ
86
hai (Maxam-Gillbert sequencing) cũng được đề nghị trên cơ sở phân hủy hóa
học, nhưng nó ít được sử dụng vì các chất độc hại (Maxam Gillbert, 1977).
Những phương pháp nói trên, về đại thể giống với việc người ta tập hợp các
mảnh có đầu 5’ bình thường và đầu 3’ với base đặc biệt, tiếp đến phân tách
chúng bằng điện di, qua đó xác định trình tự của nucleic acid mục tiêu.
Điện di (trên tấm gel) có thể tiến hành một lane 4 thuốc nhuộm (Smith và
cs, 1986) hay bốn lane với một thuốc nhuộm (Ansorge và cs, 1986). Đã có
những thiết bị chuyên dụng được thương mại hóa cho cả hai kiểu kỹ thuật nói
trên.
Đánh dấu huỳnh quang được kết hợp chặt chẽ với những mảnh giải trình tự
thông qua các dideoxynucleotide (giải trình tự kết thúc là thuốc nhuộm (Prober
và cs, 1987), hay primer giải trình tự (giải trình tự mồi gắn thuốc nhuộm) (Smith
và cs, 1986). Phương pháp giải trình tự kết thúc bằng thuốc nhuộm toàn diện hơn
và ít chi phí.
Một cải tiến quan trọng là tạo ra các DNA polymerase sử dụng trong quy
tình giải trình tự của Sanger. Với sự phát hiện DNA polymerase chịu nhiệt, phản
ứng giải trình tự kiểu PCR trở thành một phương pháp mạnh
2.6.4.2. Phân tách và phát hiện
- Giải trình tự dựa vào tấm tự động: là kiểu phổ biến nhất được sử dụng.
Với giải trình tự DNA phát huỳnh quang kết hợp với điện di tren gel thẳng đứng,
giúp phát hiện trực tiếp các mảnh đánh dấu huỳnh quang sau khi kích thích bằng
một tia laser.
- Điện di ống mao quản: các tấm gel được thay thế bằng ống mao quản. Kỹ
thuật này có những thuận lợi như tự động, sản lượng cao, giảm chi phí và hóa
87
chất.
- Điện di gel siêu mỏng: có thể chịu đựng được điện thế cao hơn các tấm gel
bình thường, cho phép tách các mảnh DNA nhanh hơn.
- Giải trình tự DNA siêu cấp: Một kiểu tiến hành điện di ống mao quản, sử
dụng các microchip hay các thiết bị siêu cấp. Chẳng hạn hệ thống bốn màu trong
kỹ thuật giải trình tự mảnh với các kênh điện di ống mao quản siêu chế tạo, có
thể tiến hành giải trình tự với 600 base trong 20 phút. Về nguyên tắc, kỹ thuật
này cho sản lượng cao hơn và toàn bộ quy trình như nạp mẫu, luân nhiệt, tinh
sạch… đã được tự động hóa.
2.6.4.3. Các chiến lược giải trình tự khác
Giải trình tự dựa vào lai: hai chiến lược khác nhau sử dụng các
oligonucleotide array để tiến hành giải trình tự bởi lai được đưa vào cuối những
năm 1980. Trong kiểu thứ nhất, các oligonucleotide được lai với một trình tự
mục tiêu cố định và hình thành các mạch kép giữa sự kết hợp hoàn hảo mẫu dò
với DNA mục tiêu. Điều này cho phép trình tự mục tiêu được cấu trúc lại từ kiểu
lai. Kiểu thứ hai dựa vào sự lai của DNA mục tiêu với một vài array lớn của các
mẫu dò chồng lấp ngắn có trình tự biết trước. Kiểu này có tiềm năng, cho nên
được sử dụng vào phân tích đột biến, và các biến đổi trình tự trong tương lai.
Mini-sequencing (MS):
- Kéo dài base đơn: các phản ứng mini-sequencing được giới thiệu Syvaen
vào năm 1990, nguyên lý phát triển từ phương pháp kéo dài primer trực tiếp
mạch khuôn để sàng lọc các SNP và các đột biến điểm. Khi kéo dài một primer
bằng DNA polymerase trong sự hiện diện của các dideoxynucleotide được đánh
dấu, sẽ cho phép xác định trạng thái tự nhiên của base tức thời 3’ của primer
88
đang giải trình tự. Để dễ dàng phát hiện tín hiệu, một số chất phát huỳnh quang
được sử dụng, hay tiến hành tách riêng các phản ứng phát hiện với một chất đánh
dấu khác.
- Pyrosequencing: là một phương pháp tổng hợp đầu tiên cho việc giải trình
tự được giới thiệu năm 1993. Suốt quá trình tổng hợp DNA, pyrophosphate (PPi)
được giải phóng mà bắt cặp với các enzyme sulfarylase và luciferase để tạo sự
phát quang. Ánh sáng này tỉ lệ với số nucleotide kết hợp cho phép trình tự được
xác định tức thời.
- Khối phổ: nhiều nghiên cứu về sự ion hóa các biopolymer trong phase khí
cho phép hoàn thiện phương pháp khối phổ. Đây là phương pháp phân tích trình
tự DNA nhanh và chính xác. Một cách thức khác để giải trình tự MS, dường như
hứa hẹn nhất là MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time of
flight spectrometry).
Hình 2.24. Nguyên lý hoạt động của DNA biosensor

và DNA chip
89
2.6.5. Sử dụng chip trong phân tích
Các DNA biosensor và DNA chip đã kích thích sự quan tâm bởi tính hữu
dụng của chúng, đặc biệt là khả năng hiển thị các thông tin chuyên biệt trình tự
nhanh, đơn giản và ít tốn kém so với các phương pháp lai, hoặc giải trình tự
truyền thống. So với DNA chip, DNA biosensor có sự khác biệt ở chỗ chúng kết
hợp với lớp hoạt tính sinh học tại bề mặt của nhân tố nhận diện, chuyển sự kiện
nhận diện sinh học thành một tín hiệu có thể nhận biết được. Trong khi đó bề
mặt DNA chip phải được ghi nhận qua hình ảnh, hay quét sau khi lai, sau đó rửa
để đạt được kiểu lai hoàn toàn.
90
Chương 3: Ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán
3.1. Chẩn đoán bệnh nhiễm
Dạng bệnh nhiễm (infectious disease), hay bệnh truyền nhiễm

(communicable disease) có nguyên nhân từ sự xâm nhập của các tác nhân có thể
sao chép, nhân lên trong tế bào, mô của cơ thể chủ. Chúng thường được gọi
chung là tác nhân gây bệnh (pathogen). Các tác nhân gây bệnh phổ biến nhất là
vi khuẩn và virus, mặc dù một số vi sinh vật khác như nấm và động vật nguyên
sinh cũng gây bệnh. Các prion cũng có thể gây nên bệnh. Một bệnh nhiễm được
gọi là lây nhiễm nếu nó dễ dàng chuyển từ người này sang người khác thông qua
nhiều con đường khác nhau.
Chẩn đoán bệnh nhiễm là phát hiện sự hiện diện của tác nhân gây bệnh
trong cơ thể. Tuy nhiên, với nhiều trường hợp, như vậy vẫn chưa đủ mà cần phải
xác định thêm nhiều thông số khác như trạng thái tồn tại, số lượng… của các tác
nhân gây bệnh.
Có nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau đã được sử dụng, nói chung,
chúng có thể được xếp vào hai nhóm chính:
- Phát hiện trực tiếp mầm bệnh: sự hiện diện của vi sinh vật được phát hiện
bằng kiểu hình và kiểu gen đặc trưng của chúng.
- Phát hiện gián tiếp mầm bệnh: sự hiện diện của vi sinh vật được phát hiện
bằng sự đáp ứng đặc trưng của cơ thể đối chứng.
3.1.1. Quan sát thông qua kính hiển vi
Phương pháp này được tiến hành bằng cách đặt mẫu sinh phẩm lên một tấm
lame để quan sát dưới kính hiển vi. Người ta có thể quan sát để phát hiện vi sinh
vật trong mẫu sinh phẩm không cần nhuộm. Tuy nhiên, với một số mẫu việc cố
91
định và nhuộm là cần thiết. Các phương pháp phổ biến như nhộm Gram, hay
nhuộm Ziehl-Neelsen – phương pháp này dùng để nhuộm, nhằm kiểm tra mẫu
sinh phẩm với sự hiện diện của mycobacteria hay Cryptosporidium parvum. Các
hạt virus không thể quan sát được bằng kính hiển vi quang học, nhưng có thể
nhận diện chúng với kính hiển vi điện tử (electron microscope – EM).
3.1.2. Nuôi cấy và xác định
Nếu sau khi quan sát thấy có vi sinh vật trong mẫu sinh phẩm (có thể qua
nuôi cấy) thì câu hỏi tiếp theo cần trả lời: vi sinh vật đó là gì. Quá trình này gọi
là xác định.
Thông thường, phòng thí nghiệm bắt đầu bằng việc quan sát các tập đoàn vi
khuẩn (khuẩn lạc) trên đĩa nuôi. Bằng kinh nghiệm, người ta thao tác có thể đưa
ra quyết định đúng về sinh vật dựa vào kích thước, hình dạng và màu sắc của
khuẩn lạc, cũng như các tác động của khuẩn lạc lên môi trường xung quanh.
Bước tiếp theo là nhuộm Gram. Quá trình này có thể ứng dụng đối với các
mảnh mô hay các khuẩn lạc nuôi cấy từ sinh phẩm. Kiểm tra hiển vi các tế bào
đã nhuộm có thể quan sát được màu sắc, hình dạng và kích thước của tế bào vi
khuẩn để đưa ra quyết định như: màu hồng (Gram âm), màu tía (Gram dương),
hình tròn (cầu khuẩn), hình que (trực khuẩn).
Xác định mầm bệnh dựa vào kiểu hình khi nuôi cấy:
- Kiểm tra khả năng của sinh vật khi chúng tạo ra được một hay nhiều chất
đặc biệt (như indole) trong môi trường.
- Kiểm tra nếu sinh vật luôn có sự hiện diện của enzyme đặc biệt kèm theo.
- Kiểm tra khả năng sinh vật có thể lên men (tạo ra khí hay acid) bằng cách
sử dụng một hay nhiều nguồn đường chuyên biệt như lactose trong môi trường
92
nuôi.
- Kiểm tra ngưỡng nhiệt độ mà sinh vật có thể phát triển.
- Kiểm tra sự nhạy của sinh vật khi chúng kháng lại các chất kháng sinh.
- Kiểm tra nếu sinh vật có một hay nhiều protein hay kháng nguyên bề mặt.
Tất cả các xét nghiệm này được xem là xác định đặc tính của sinh vật. Sau
đó, kiểm tra những đặc tính kiểu hình nào đặc trưng hơn hay các tipe nào đặc
trưng loài.
Nuôi cấy virus (và một số vi khuẩn) cần có mẫu sinh phẩm và tế bào sống
trong môi trường. Có thể suy đoán được loại virus từ loại tế bào kí chủ đặc trưng
cho sự phát triển của chúng. Việc nuôi cấy virus ngày càng trở nên ít quan trọng
trong ứng dụng chẩn đoán bởi tốn nhiều thời gian và tiền bạc. Thay vào đó, có
thể phát hiện virus và các chủng vi khuẩn không thông thường bằng các phương
pháp miễn dịch (như Chlamydia spp. và Mycoplasma spp.), hay phương pháp
khuếch đại nucleic acid.
3.1.3. Tìm kiếm bằng chứng qua sự đáp ứng của cơ thể
Không chuyên biệt: Tìm kiếm bằng chứng của sự viêm và tổn thương.
Ở một số bệnh nhiễm, sự đáp ứng của cơ thể như viêm và tổn thương sẽ
phản ánh được tác nhân bệnh. Chẳng hạn, ở người nhiễm HIV sẽ có sự giảm
đáng kể số lượng tế bào bạch cầu. Do vậy, việc xác định số lượng bạch cầu ở
người nghi nhiễm cũng là một phương pháp xác định bệnh nhiễm. Để xác định
số lượng tế bào (đặc biệt là tế bào máu), người ta có thể sử dụng kính hiển vi và
buồng đếm hồng cầu, tuy nhiên, phương pháp này chậm, mất nhiều thời gian.
Thay vào đó, phương pháp dùng máy flow cytometry tỏ ra hiệu quả hơn trong
việc xác định số lượng các tế bào máu, nhờ vậy, chúng được dùng trong chẩn
93
đoán nhiệu loại bệnh nan y như HIV, leukemia, hay ung thư tế bào bạch cầu. Về
đại thể, những xét nghiệm này không cho phép khẳng định chắc chắn loại vi sinh
vật chuyên biệt nào gây bệnh.
Kháng thể chuyên biệt: Phương pháp này có mục đích tìm kiếm sự hiện
diện của sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (cho kháng thể trong hầu hết các trường
hợp).
Nếu một người nhiễm một vi sinh vật, chúng sẽ tạo một đáp ứng miễn dịch
đặc hiệu với các thành phần lạ của chính vi sinh vật đó. Chẳng hạn, sự hiện diện
của kháng thể đặc hiệu với bệnh sởi là bằng chứng xác thực để cho rằng bệnh
nhân đã nhiễm virus sởi. Nếu có nhiều kháng thể hay nếu có kháng thể chủ yếu
là IgM hay IgA cho thấy rằng cơ thể mới bị nhiễm gần đây.
Một hạn chế lớn khi chẩn đoán bệnh nhiễm bằng cách phát hiện đáp ứng
miễn dịch đặc hiệu là sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu thường tốn chừng mười
ngày, hay cũng có thể phát hiện sau khi nhiễm, cho nên xét nghiệm có thể thỉnh
thoảng âm tính với người mới nhiễm, nhưng sau đó lại dương tính trong tiến
trình bệnh, thậm chí ngay sau khi hồi phục sức khỏe.
3.1.4. Phương pháp miễn dịch
Các phương pháp miễn dịch có thể được ứng dụng để phát hiện những
kháng nguyên vi sinh vật (nhằm tìm kiếm một nhóm tác nhân gây bệnh), đồng
thời để phát hiện sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ ở thời điểm nào hay ở
mức độ nào. Nếu muốn pháp hiện sự đáp ứng kháng thể của cơ thể chủ, người ta
cần tiến hành thử nghiệm với kháng nguyên đặc hiệu, kết quả sẽ cho dương tính
nếu mẫu sinh phẩm chứa kháng thể gắn với kháng nguyên này. Ngược lại, nếu
muốn phát hiện kháng nguyên sinh vật, cần tiến hành kiểm tra vơi kháng thể đặc
hiệu và kết quả sẽ cho dương tính nếu mẫu sinh phẩm ấy có chứa kháng nguyên
94
gắn với kháng thể đặc hiệu.
Để chuẩn bị kháng thể cho việc phát hiện vi sinh vật quan tâm, vi sinh vật
ấy hay một phần cấu trúc tinh sạch của nó (vị trí quyết định tính kháng nguyên)
sẽ được tiêm vào chuột để phát động hệ miễn dịch chuột tạo kháng thể đặc hiệu.
Có thể thu nhận kháng thể đó để sử dụng phát hiện vi sinh vật quan tâm trong
mẫu sinh phẩm.
Vì kháng thể thu được theo cách trên không đồng nhất do nhiều dòng tế bào
lympho sản xuất, đáp ứng lại với nhiều vị trí nhận diện khác nhau, cho nên sử
dụng kháng thể này trong chẩn đoán sẽ có nhiều khó khăn. Thông thường, trong
chẩn đoán dựa vào miễn dịch, người ta sử dụng kháng thể đơn dòng.
Các phương pháp miễn dịch khác được sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán
phân tử là ELISA, miễn dịch huỳnh quang, Western blot.
3.1.5. Phương pháp sử dụng nucleic acid
Các phương pháp truyền thống xác định tác nhân gây bệnh thông qua nuôi
cấy là yếu tố quan trọng để tìm hiểu nguyên nhân cũng như mối liên hệ giữa
kháng nguyên với các bệnh đặc biệt. Tuy nhiên, nhiều tác nhân gây bệnh nhiễm
không thể phát triển, hoặc phát triển chậm trong nuôi cấy in vitro. Trong trường
hợp này, các phương pháp mô học và huyết thanh học có thể xác định tác nhân
nhiễm hiệu quả hơn. Tuy nhiên, các phương pháp này thường chỉ cung cấp bằng
chứng gián tiếp.
Hiện nay, các nhà bệnh lí học có nhiều phương pháp chuyên biệt, nhanh, độ
nhạy cao để phát hiện tác nhân nhiễm bằng cách ghi nhận sự hiện diện các trình
tự DNA và RNA đặc hiệu của sinh vật. Những tiến bộ này đã rút ngắn thời gian
cần thiết để xác định tác nhân gây bệnh cho người, đồng thời tăng độ chính xác.
95
Hai kỹ thuật phân tử cơ bản được sử dụng là lai nucleic acid (sự gắn của các
mẫu dò và mục tiêu của nó) với mẫu dò RNA và DNA chuyên biệt, kỹ thuật
khuếch đại nucleic acid. Nhiều phương pháp dựa vào mẫu dò cần phải tách chiết
DNA hay (trong một số trường hợp) RNA từ mẫu (dịch, tế bào bạch cầu, mô
sống…), hoặc từ nuôi cấy vi sinh vật. Việc kiểm tra dịch chiết có thể thực hiện
với các mẫu dò có sự hiện diện của DNA và RNA từ vi sinh vật đặc hiệu. Những
kỹ thuật này hữu ích cho sự phát hiện trực tiếp các vi sinh vật trong mẫu sinh
phẩm, hay để khẳng định các kết quả từ nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp lai
phân tử sẽ nhạy hơn và chuyên biệt hơn các xét nghiệm miễn dịch truyền thống.
Các kỹ thuật nucleic acid giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán các bệnh
nhiễm. Với khả năng khuếch đại các trình tự DNA, RNA của vi sinh vật chuyên
biệt trong hỗn hợp, cùng các DNA kí chủ làm chúng trở thành một công cụ mạnh
trong chẩn đoán bệnh nhiễm. Trong kỹ thuật khuếch đại nucleic acid, PCR cùng
với các biến tấu của nó (như realtime PCR, RT-PCR…) được sử dụng nhiều
nhất. Có hơn 100 bệnh có thể được chẩn đoán bằng PCR.
3.2. Chẩn đoán ung thư
3.2.1. Sàng lọc và phát hiện sớm
Chỉ một vài bệnh ung thư có thể phát hiện bằng các chương trình sàng lọc,
còn lại hầu hết các bệnh chỉ được phát hiện khi bệnh nhân đi bệnh viện vì bộc lộ
các triệu chứng hình thành khối u.
Sự sàng lọc thành công sẽ cải thiện đáng kể việc chữa trị nếu các khối u ác
tính được phát hiện sớm trước khi nó biểu hiện lâm sàng. Có 3 chương trình sàng
lọc cơ bản dựa vào trạng thái của khối u mục tiêu:
Một số chương trình sàng lọc được thiết kế để phát hiện các tổn thương tiền
96
thân sẽ được trị khỏi, trước khi chúng trở thành ung thư lan tràn (do nguyên nhân
di căn. Xét nghiệm Papanicolou (PAP) với ung thư cổ tử cung là mô hình cho
kiểu sàng lọc này, đóng góp quan trọng vào trị liệu, giảm tỉ lệ chết cho bệnh
nhân bằng cách xác định sớm tổn thương, khi chúng chưa lan tràn (Miller và cs,
2000).
Sàng lọc ung thư lan tràn “giới hạn trong cơ quan” là cần thiết, ví dụ phát
hiện ung thư tuyến tiền liệt nhờ mức cao kháng nguyên chuyên biệt tuyến tiền
liệt. Sàng lọc ung thư vú nhờ chụp X-quang phát hiện cả di căn nhỏ mà trước đó
không thể xác định bằng các kiểm tra bên ngoài, cũng như các khối u ống
(carcinoma) trước khi chúng lan tràn in situ.
97
Hình 3.1. Ảnh chụp hiển vi của khối u tuyến tiền liệt, loại acinar, là loại
ung thư tuyến tiền liệt phổ biến nhất.
+ Sàng lọc ung thư tuyến tiền liệt gồm 3 nguyên tắc:
1. Chụp cắt lớp vi tính vùng trực tràng.
2. Chất chỉ điểm khối u PSA.
3. Siêu âm qua đường trực tràng.
+ Sàng lọc ung thư vú gồm 2 giai đoạn:
1. Chụp nhũ ảnh.
2. Chụp ảnh cộng hưởng từ MRI.
Khi có các hiểu biết chuyên sâu về ung thư ở mức phân tử, thì kiểu chẩn
đoán thư ba của chương trình sàng lọc trở nên hữu ích, đó là việc xác định các
yếu tố bẩm sinh liên quan đến các kiểu ung thư bằng sàng lọc di truyền. Chẳng
hạn, các thành viên trong một gia đình có lịch sử về bệnh ung thư, có thể được
kiểm tra những đột biến liên quan đến các gen đến các gen như BRCA1 (ung thư
vú, buồng trứng), hay DCC (ung thư kết tràng).
98
Một khuyến cáo sau đó đối với các cá thể được sàng lọc dương tính là
chương trình sàng lọc bắt buộc. Cho tới nay, việc phát hiện trước triệu chứng
bệnh ung thư thường rất phức tạp, khó tiến hành, hơn nữa cần những xét nghiệm
hình ảnh đắt tiền.
3.2.2. Chẩn đoán thông thường

Đánh giá bệnh lí của bất kì khối u nào cũng bắt đầu bằng quá trình phân
biệt khối u lành tính hay ác tính. Trong hầu hết các trường hợp việc đánh giá
hình ảnh lát mô được tiến hành thông qua sinh thiết từ khối u và nhuộm HE, sau
đó các mẫu nhuộm được kiểm tra dưới kính hiển vi.
Đến nay, việc làm này vẫn là động thái đầu tiên khi chẩn đoán ung thư
(khối u được xác định kiểu hình cũng như cấu trúc mô và hình dạng tế bào).
Sauk hi xác định các vùng bất thường trên lát sinh thiết nhuộm tại các vị trí này,
người ta sẽ xác định các tế bào bất thường ở độ phóng đại lớn hơn. Những tế bào
bất thường được kiểm tra tính đồng nhất, cũng như các đặc tính khác của nhân
(kích thước, hình dạng nhân, đặc tính của màng nhân), độ đậm đặc tế bào chất,
kiểu NST, màu sắc của tế bào cũng như mối quan hệ của chúng với các tế bào
bên cạnh và với quần thể tế bào nền.
Tiếp theo có thể sử dụng nhiều phương pháp nhuộm chuyên biệt để phát
hiện có hay không các sản phẩm protein mà tế bào ác tính tiết ra. Nhiều phương
pháp hóa mô học khác có thể được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các tế
bào của khối u với các tế bào nền. Hầu hết các dữ liệu thu được đều từ nhuộm
HE, người thao tác mẫu đòi hỏi phải có kinh nghiệm trong việc này để vừa quan
sát, vừa hình dung nhớ lại các mẫu có biểu hiện bệnh đã xem trước đó, nhằm so
sánh và rút ra kết luận.
99
Tuy nhiện, người ta có thể đánh giá xếp loại khối u dựa vào các lát nhuộm
HE một cách thành thạo, nhưng vẫn nên kết hợp nhiều phương pháp khác nhau
như hóa mô miễn dịch hay chẩn đoán phân tử để góp phần làm tăng tính chính
xác của chẩn đoán. Nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng kính hiển vi điện tử
để phân loại khối u.
Việc chẩn đoán ung thư còn có thể dựa vào các marker khối u. Đó là các
phân tử, hay các chất được sản xuất bới khối u (hay đáp ứng lại khối u), được sử
dụng để phát hiện sớm, dự đoán tiến trình bệnh sinh, qua đó tiên lượng các liệu
pháp chữa trị.
Nhiều marker khối u, trước đó là những chất bình thường đã được sản xuất
từ các mô ban đầu (như kháng nguyên chuyên biệt tuyến tiền liệt hay α-
fetoprotein), nhưng chúng có thể tăng lên đáng kể khi phát sinh khối u, cho dù
lành tính hay ác tính.
Hình 3.2. Sinh thiết trong chẩn đoán ung thư da
Nguồn: http://www.mayoclinic.org/tests-procedures/skin-
biopsy/multimedia/punch-biopsy/img-20005764
100
Hình 3.3. Sinh thiết kim trong chẩn đoán ung thư phổi
Hình 3.4. Sinh thiết nội soi trong chẩn đoán ung thư dạ dày
Nguồn: http://www.mayoclinic.org/tests-
procedures/endoscopy/multimedia/endoscopy/img-20007299
101
3.2.3. Chẩn đoán phân tử
Các kỹ thuật phân tử đầu tiên trong chẩn đoán ung thư là xác định sự hình
thành tập đoàn do sự khuếch đại của các bạch cầu, đây cũng là một công cụ đầy
tiềm năng trong chẩn đoán bệnh u bạch huyết (lymphoma). Các gen mã hóa
protein miễn dịch (Ig) và các receptor tế bào T sẽ tái sắp xếp trong suốt quá trình
trưởng thành của tế bào lympho. Trong các quá trình hoạt hóa, có sự phát triển
của nhiều dòng tế bào lympho, nhưng chú ý là sự tăng sinh, hình thành khối u
chỉ bắt đầu từ một tế bào bạch huyết đơn. Thời gian đầu, phân tích Southern blot
được sử dụng để phát hiện sự tái sắp xếp các gen, nhưng hiện nay phương pháp
PCR được sử dụng phổ biến hơn
 Southern blot:
 Kỹ thuật Southern blot được phát triển bởi Edward Southern năm 1975
 “Southern blot” là kỹ thuật dựa vào sự lai chuyên biệt của các đoạn DNA
mạch đơn của mẫu cần nghiên cứu với các mẫu dò nhằm kiểm tra sự có mặt của
trình tự đích trong hỗn hợp sản phẩm khuếch đại.
 Kỹ thuật Southern blot cho biết:
 Sự có mặt của đoạn DNA giữa một hỗn hợp nhiều DNA dựa vào một
mẫu dò đặc hiệu cho phân tử DNA đó.
 Trình tự tương tự giữa đoạn DNA mục tiêu và mẫu dò.
 Số bản sao DNA.
 Độ lớn của đoạn DNA.
 Nguyên tắc phát hiện:
Dựa trên việc chuyển và cố định các đoạn DNA cần dò lên một màng rắn,
102
sau đó đoạn DNA mục tiêu được lai với mẫu dò dựa trên các trình tự bổ sung.
Nhờ sự phát hiện mẫu dò, đưa ra kết luận về sự có mặt của đoạn DNA cần dò.
 PCR
 Kỹ thuật PCR do Kary Mullis phát triển năm 1983 được ứng dụng để
phát hiện nhanh các gen đặc hiệu, gen kháng nguyên của nhiều loại virus gây
ung thư, giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân ung thư.
 Nguyên lý: PCR dựa trên khả năng của một DNA polymerase nhân bản
một mạch DNA bằng việc kéo dài mạch bổ sung, bắt đầu từ một cặp mồi
(oligonucleotide primer) (Mullis và Faloona, 1987).
 Chu trình của kỹ thuật PCR:
Có 3 giai đoạn chính trong kỹ thuật PCR và chúng được lặp lại 20-40 lần.
103
Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã xây dựng được một số quy trình chẩn
đoán nhanh bệnh ung thư vòm họng, ung thư gan ... bằng kỹ thuật PCR.
 Chẩn đoán bệnh ung thư vòm họng: Sử dụng kỹ thuật PCR. Với cặp
mồi đặc hiệu TH1 và TH2. Trình tự cặp mồi TH1 và TH2:
- Mồi TH1: 5’-AGCCAATTGTCCTAGGGAGGG-3’
- Mồi TH2: 5’-GCTTGGATGGCCGAGTCACGG-3’
 Chẩn đoán bệnh ung thư gan do virus: sử dụng kỹ thuật PCR lồng
(Nested PCR) với 2 cặp mồi HBV P1 và HBV P2:
Cặp mồi 1:
- Mồi dương (HBV P1): 5’-AGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCC-3’
- Mồi âm (HBV M1): 5’-AGTTGGCGAGAAAGTGAAAGCCTG-3’
Cặp mồi 2:
104
- Mồi dương (HBV P2): 5-GAACATGGAGAGCACAACATCCAGG-3’
- Mồi âm (HBV M2): 5’- GCATATAAGGCATCAAAGGCAGG-3’
 Tách chiết DNA từ các tế bào gan người bệnh, thực hiện kỹ thuật PCR
lồng, có thể chẩn đoán ung thư gan nhanh.
Bảng 3.1. Một số Marker khối u phổ biến
Khó khăn trong việc thu nhận các mẫu mô tương đối tinh khiết cho phân
tích đã cản trở việc ứng dụng rộng rãi các kỹ thuật phân tử, đặc biệt với các khối
u rắn. Không giống với u bạch huyết và nhiều sarcoma phát triển như những
khối u tương đối tinh khiết, độc lập, đối với hầu hết các ung thư biểu mô lại có
sự hòa trộn thân mật giữa các tế bào khối u với các tế bào viêm và các tế bào mô
nền. Phân tách các quần thể tế bào ác tính bởi vi phẫu tích chụp laser là một
phương pháp để tách các quần thể tế bào khối u tương đối tinh sạch, phục vụ cho
nghiên cứu (Simone và cs, 1998). Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng phụ thuộc vào sự
nhận diện hình dạng của các tế bào ác tính và tốn công, nên ít sử dụng trong chẩn
đoán truyền thống.
3.3. Chẩn đoán bệnh di truyền
105
3.3.1. Chẩn đoán trước làm tổ (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD)
Khoảng hai thập niên gần đây, thụ tinh trong ống nghiệm và kiểm tra di
truyền đã trở thành một chiến lược điều trị quan trọng đối với các cặp vợ chồng
hiếm muộn, cũng như mong ước có một gia đình hoàn toàn khỏe mạnh với sự hỗ
trợ khoa học và công nghệ mới. PGD là chiến lược chẩn đoán bệnh di truyền ở
phôi trước khi làm tổ (giai đoạn trước khi hatching – bám vào tử cung). Đây là
sự kết hợp giữa thụ tinh in vitro và chẩn đoán bệnh, Các phôi thụ tinh thường
được tiến hành PGD là IVF và ICSI.
Quy trình PGD gồm hai bước: sinh thiết phôi (embryo biopsy) được tạo in
vitro và chẩn đoán tế bào, hay phân tử trên các tế bào sinh thiết.
Sinh thiết phôi là phương pháp thu nhận tế bào từ phôi nhưng không làm
ảnh hưởng đến sức sống của phôi. Người ta có thể thu nhận tế bào phôi bằng các
sinh thiết thể cực, hay sinh thiết thu nhận blastomere với khối lượng tối thiểu.
Sinh thiết thể cực tiến hành bằng cách tách một hay các thể cực của trứng
đã được thụ tinh. Hai bất lợi lớn nhất của sinh thiết thể cực là: (1) các gen có
nguồn gốc từ người bố không được xác định, nên các đột biến liên quan đến di
truyền trên người bố không thể phát hiện, (2) hiện tượng trao đổi chéo giữa các
đoạn tương đồng ở giảm phân I trong quá trình hình thành trứng có thể gây nên
chẩn đoán sai, khi các khiếm khuyết di truyền dị hợp tử (vì chỉ kiểm tra di truyền
tế bào chị em, không kiểm tra trực tiếp di truyền các tế bào đóng vai trò trực tiếp
trong phát triển cá thể).
Sinh thiết tế bào phôi thường được thực hiện ở phôi giai đoạn phôi cắt (phôi
từ 6 – 8 tế bào) hay phôi giai đoạn blastocyst. Tuy bất lợi lớn nhất của việc thu
106
nhận ở giai đoạn này là vật liệu di truyền quá ít, khó tiến hành các chẩn đoán sau
này, nhưng đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất.
Sinh thiết phôi giai đoạn blastocyst cũng được thực hiện nhưng không phổ
biến. Phôi blastocyst chứa khoảng 100 tế bào. Các tế bào của phôi blastocyst
chia thành hai nhóm, nhóm lớp lá ngoài phôi (TE) sẽ phát triển thành nhau thai
và lớp ICM sẽ phát triển thành tất cả các cơ quan của cơ thể. Ở giai đoạn này, có
thể tiến hành sinh thiết thu nhận các tế bào lớp TE hay lớp ICM làm vật liệu cho
chẩn doán. Thuận lợi chính của sinh thiết phôi giai đoạn blastocyst là thu được
nhiều tế bào hơn sinh thiết từ thể cực hay giai đoạn phôi cắt, điều này sẽ làm
giảm khả năng chẩn đoán sai do quá ít nguyên liệu di truyền nên dễ mất trong
quá trình thao tác. Song, phương pháp này lại gặp trở ngại lớn nhất là hiệu quả
phát trển thấp của phần phôi còn lại sau khi sinh thiết, các phôi thụ tinh thường
dừng lại ở giai đoạn phôi 8 tế bào nên rất khó phát triển tiếp theo đến giải đoạn
blastocyst. Nhiều báo cho biết việc thu nhận khoảng chừng 10 tế bào TE sẽ
không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi người.
Tương tự việc sinh thiết thể cực, có hai bước để lấy mẫu sinh thiết tế bào
phôi giai đoạn phôi cắt hay blastocyst: (1) khoan màng zona (zona drilling) và
(2) hút tế bào phôi (blastomere aspiration). Quá trình này được thực hiện với sự
hỗ trợ của thiết bị vi thao tác. Tuy không khó về mặt kỹ thuật, nhưng tỉ lệ các
phôi bị nén lại ở giai đoạn 8 tế bào sau khi bị sinh thiết vẫn cao, cũng như hiện
tượng phân mảnh các tế bào sinh thiết lại phổ biến hơn, mặc dù hiếm có trường
hợp một phôi bị phá hủy. Kỹ thuật này phụ thuộc rất nhiều vào sự thành thạo của
người thao tác.
Sàng lọc và chẩn đoán: Có hai phương pháp chính được dùng để thực hiện
chẩn đoán trên các tế bào sinh thiết là PCR và FISH. PCR được sử dụng để sàng
107
lọc gen bị khiếm khuyết, các đột biến trội, xác định giới tính cho các bệnh liên
kết với NST X, và chẩn đoán các đột biến gen lặp lại bộ ba. Sự phát triển của kỹ
thuật chẩn đoán mới đã bị chậm lại vì PCR một tế bào đã gặp phải một số vấn
đề, chẳng hạn sự tạp nhiễm và khuếch đại ưu tiên hay mất allele (allele dropout –
ADO). Khuếch đại ưu tiên hay mất allele xảy ra khi một allele được khuếch đại
ưu tiên hơn những allele khác. Nếu cả vợ và chồng mang cùng một đột biến,
điều này sẽ không dẫn đến chẩn đoán nhầm một phôi mang bệnh. Tuy nhiên, đối
với các đột biến trội, nếu allele đột biến không được khuếch đại, phôi sẽ được
chẩn đoán là bình thường. Do đó, các quy trình PCR phải chắc chắn là loại bỏ
được các khuếch đại ưu tiên và sự tạp nhiễm.
Các kỹ thuật dùng để khuếch đại và phân tích DNA từ một tế bào đã được
cải thiện nhiều trong những năm gần đây. Các phương pháp như cắt giới hạn
(restriction endonuclease digestion), phân tích dị kép (heteroduplex analisis),
SSCP, điện di gel gradient chất biến tính (denaturant gradient gel
electrophoresis) và PCR huỳnh quang (fluorescent PCR) đã được sử dụng. Thêm
nữa, các đoạn STR (short tandem repeat) có thể dùng để khẳng định rằng, DNA
được khuếch đại là của phôi và các marker nối (linked marker) có thể được sử
dụng khi các đột biến nào đó chưa được biết. Các phương pháp trên đã được đưa
vào ứng dụng, nhằm vượt qua các giới hạn của phân tích tế bào đơn như
multiplex PCR, và khuếch đại cả bộ gen. Bằng việc khuếch đại cả bộ gen, người
ta sẽ có đủ DNA để thực hiện nhiều phản ứng PCR và các kỹ thuật như lại bộ
gen so sánh (comparative genomic hybridization – CGH).
108
Việc phân lập các đặc điểm NST ở một nhân đơn của phôi còn rất mơ hồ và
do đó, FISH đã được sử dụng để kiểm tra các NST từ phôi trước khi làm tổ cho
PGD. Ban đầu, FISH được dùng để xác định giới tính phôi cho các cặp vợ chồng
có nguy cơ di truyền bệnh liên kết với NST X cao, dùng probe cho NST X và Y,
nhưng gần đây nó đã được dùng cho các cặp vợ chồng mang các bất thường trên
NST như các hoán vị và cho những phụ nữ cao tuổi, để tìm sự bất thường về số
NST (aneuploidy).
Đối với các cặp vợ chồng có nguy cơ di truyền một đột biến di truyền liên
kết với NST X vẫn chưa có phương pháp chẩn đoán cụ thể nào, các phương pháp
đang được điều trị là xác định giới tính thai nhi và phá thai nam, trong đó một
nửa có thể sẽ mắc bệnh. Cũng có một số cặp vợ chồng phải phá thai liên tục, dù
có hay không có một chẩn đoán cụ thể nào. Do đó, dùng PGD để xác định giới
tính phôi được coi là một giải pháp khác cho những cặp vợ chồng này.
Một số khiếm khuyết do gen chuyển sang thế hệ con được phân tích bằng
chẩn đoán di truyền sau khi sinh thiết thể cực và phôi, chẳng hạn một loạt bệnh
109
như kém phát triển sụn (Achondroplasia), Agamaglobulinemia, bệnh lõi trung
tâm (Central core disease), bệnh Gaucer, Sick-cell anemia, bệnh Alport, bệnh teo
cơ tủy sống (Spinal muscular atrophy), khiếm khuyết nhân tố o-1-antitrypsin,
MELAS, khiếm khuyết dehydrogenase hydroxyacyl CoA chuỗi dài, khiếm
khuyết ornithine transcarbamilase, Neurofibromatosis I và II, khiếm khuyết các
protein chức năng của ti thể, Multiple endocrine neoplasia kiểu II, Multiple
epiphyseal dyplasia, Osteogensis imperfect I và dạng IV, Myotonic dystrophy,
Familial adenomatous polyposis coli, Becker’s muscular dystrophy, Duchenne’s
muscular dystrophy, bệnh về Rhesus (Rh D), Haemofilia A và B, Tuberous
sclerosis, Epidermolisis bullosa, Crouzon’s syndrome, Exclusion HD, bệnh Di
George’s syndrome, FAP-Gardner, Hunter’s syndrome MPS II, bệnh
Phenylketonuria, Lesh-Nyhan’s syndrome, các chứng Cis fibrosis, Mafan’s
syndrome, Hyperinsulinemic hypoglycemia PHH1, Fragile X syndrome, Earli
onset Alzheimer’s disease, Wilskott-Aldrich syndrome, Charcor-Marie-Tooth’s
disease 1 và 2A, Thalasemia ..
3.3.2. Chẩn đoán tiền sinh (Prenatal diagnosis)
Chẩn đoán tiền sinh là những kỹ thuật nhằm xác định sức khỏe và các điều
kiện của thai trước khi sinh. Những thông tin từ chẩn đoán tiền sinh giúp cả thai
nhi và bà mẹ có thể tránh được những hậu quả nghiêm trọng khi sinh hay sau khi
sinh. Các bất thường bẩm sinh được xác định chiếm chừng 20 – 25%, và thai nhi
chết trước khi sinh.
Chẩn đoán tiền thai được tiến hành qua hai bước: (1) thu nhận các sinh
phẩm ( tế bào, protein…) của thai; (2) sàng lọc, chẩn đoán bệnh. Hiện nay có
nhiều kỹ thuật xâm lấn (invasive) và không lấn (non invasive), được sử dụng để
thu nhận các sinh phẩm của thai trong chẩn đoán tiền thai. Mỗi phương pháp có
thể được sử dụng trong một thời kì phát triển thích hợp nào đó của thai.
110
3.3.2.1. Một số kỹ thuật thu nhận sinh phẩm
Siêu âm (Ultrasonography): là kỹ thuật không xâm lấn, nhưng có hại đến

thai và mẹ. Các sóng tần số cao được dùng tạo hình ảnh rõ ràng, và kiểu các âm
thanh được tạo ra do các cơ quan và các mô biệt hóa (kể cả của đứa trẻ trong
khoang dịch ối) sẽ được ghi nhận. Phôi phát triển có thể được quan sát hiệu quả
đầu tiên ở thời điển sáu tuần tuổi. Sự nhận diện các bất thường trong một số nội
quan chính chỉ có thể đạt được giữa tuần 16 – tuần 20 của thai.
Mặc dù kiểm tra siêu âm có thể hầu như hữu dụng để xác định kích thước
và sự định vị của thai, hay của nhau thai, lượng dịch ối vàn hững biểu hiện khác
của giải phẫu học thai, nhưng cũng có những giới hạn với quy trình này. Hàng
loạt các bất thường khó thấy có thể không phát hiện được trong quá trình phát
triển của thai.
Chọc hút ối: Đây là kỹ thuật xâm lấn, một mũi kim được đâm xuyên qua
bụng dưới của mẹ vào khoang màng ối bên trong tử cung. Dịch ối đủ hiện diện
để tiến hành chọc hút bắt đầu vào tuần 14 của thai. Do vậy, hầu hết việc chọc hút
dịch ối được tiến hành giữa tuần 14 và tuần 20 trong chu kì mang thai. Việc kiểm
tra siêu âm luôn được tiến hành trước khi chọc ối để xác định tuổi thai, sự định
vị thai và nhau thai, đồng thời xác định khối lượng dịch ối đủ để hút hay chưa.
Lơ lửng trong dịch ối là quần thể các tế bào thai (hầu hết có nguồn gốc từ các tế
bào da của thai), chúng có thể phát triển trong nuôi cấy để phân tích NST, phân
tích sinh hóa và phân tích sinh học phân tử.
Trong quý thứ ba của thai kì, dịch ối có thể được phân tích để xác định sự
trưởng thành của phổi thai. Phổi thai giao lưu trực tiếp với dịch ối, do đó thành
phần đặc trưng của một số khiếm khuyết chức năng hô hấp có thể hiện diện
trong dịch ối. Chẳng hạn sự xuất hiện các chất ức chế hoạt tính bề mặt niêm mạc
111
phổi có thể dự báo rằng sau khi sinh, đứa trẻ có thể sẽ phát triển hội chứng đau
hô hấp (Respiratory distress syndrome) từ bệnh màng trong suốt. Dịch ối có thể
được phân tích bằng sự phân cực phát quang (fluorescence polarization) (fpol),
với lectin sphingomyelin (LS), hay với phosphatidyl glycerol (PG).
Thu nhận mẫu lông nhung

của màng đệm (Chondrionic villus
sampling – CVS): Được hỗ trợ
của siêu âm, một ống thông được
xuyên qua âm đạo vào cổ tử cung
và vào trong tử cung để đến nhau
thai (các cách tiếp cận khác là
transvaginal và transabdomial).
Việc đưa ống thông cho phép thu
nhận mẫu tế bào từ các lông
nhung màng đệm. Những tế bào
này có thể được phân tích bởi các kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên phổ biến nhất là
phân tích NST để xác định kiểu nhân của thai, sau đó là phân tích sinh học phân
tử và sinh hóa nếu cần thiết. CVS chỉ có thể được tiến hành an toàn giữa tuần 9,5
và 12,5 của thai kì.
CVS có bất lợi là một kỹ thuật xâm lấn, do vậy nếu có một tỉ lệ nhỏ gây
bệnh (nhưng quan trọng) cho thai từ 0,5 – 1%, cao hơn tỉ lệ mất thai do chọc hút
ối. Cũng có khả năng các tế bào máu mẹ trong nhau thai đang hình thành sẽ được
thu nhận nhầm thay vì các tế bào thai và do đó làm thất bại kết quả phân tích
NST. Việc chẩn đoán CVS thường chỉ có giá trị tương đối, trong một phổ hạn
hẹp các biến đổi di truyền.
112
Thu nhận mẫu máu mẹ để để phân tích tế bào máu con: Đây là một kỹ thuật
mới tận dụng hiện tượng các tế bào máu thai có thể được chuyển vào hệ tuần
hoàn của mẹ thông qua lông nhung nhau thai. Thông thường, chỉ một lượng nhỏ
tế bào thai đi vào hệ tuần hoàn mẹ theo kiểu này. Các tế bào thai có thể được
tách ra từ quần thể tế bào máu mẹ và được phân tích bằng các kỹ thuật khác nhau
để tìm kiếm các trình tự DNA đặc biệt. FISH là kỹ thuật chuyên biệt được dùng
để xác định các NST đặc biệt của tế bào máu thai, nhằm chẩn đoán các thể bội
lệch như ba NST và monosomy X.
Khó khăn ở chỗ kỹ thuật này là khó thu nhận nhiều tế bào máu thai. Vì vây,
lượng tế bào thường không đủ để xác định các bất thường của kiểu nhân thai và
các thử nghiệm khác.
Anpha-fetoprotein huyết thanh mẹ (MSAFP): Máu thai trong thời kì phát

triển có 2 protein chính là albumin và α-fetoprotein (AFP). Khi đã trưởng thành
chỉ có albumin trong máu, kiểm nghiệm MSAFP có thể được sử dụng để xác
định các mức độ của AFP của thai. Lúc đầu, chỉ có một phần nhỏ AFP chuyển
qua dịch ối và xuyên qua nhau thai đến máu mẹ. Tuy nhiên, khi có khiếm khuyết
ống thần kinh thai (từ việc hư hỏng một phần ống thần kinh phôi đến sự đóng
lại ), thì sẽ có nhiều AFP chuyển vào dịch ối. Khiếm khuyết ống thần kinh làm
thiếu hụt mô não và xuất hiện sự chẻ đôi tủy sống (spina bifida). Xác suất cùa
khiếm khuyết này xảy ra chừng 1/1000 – 2/1000 trẻ (ở Mỹ). Tuy nhiên, MSAFP
có thể được đánh giá cho các nguyên nhân khác không liên quan đến ống thần
kinh thai các khiếm khuyết thành bụng, do đó kiểm nghiệm này không đặc hiệu
100% cho một sai lệch di truyền nào.
Nếu sử dụng kết hợp sàng lọc MSAFP và siêu âm, thì hầu như tất cả các
trường hợp thiếu hụt não có thể được phát hiện, đặc biệt với các trường hợp chẻ
113
đôi tủy sống. Các khiếm khuyết ống thần kinh còn có thể được phân biệt từ các
khiếm khuyết thai khác (chẳng hạn khiếm khuyết thành bụng), nhờ việc tiến
hành các xét nghiệm đặc hiệu với enzyme acetylcholinesterase thu ở dịch ối. Nếu
acetylcholinesterase không được phát hiện, rất có thể tiềm ẩn nhiều khiếm
khuyết di truyền khác trong thai.
MSAFP có thể hữu ích trong sàng lọc hội chứng Down và những bệnh ba
NST.
β-hCG huyết thanh mẹ: Kiểm nghiệm này thường được sử dụng phổ biến để
kiểm tra sự mang thai. Sau một tuần làm tổ, phôi bám chắc chắn vào tử cung, lớp
nuôi phôi (trophoblast) sẽ sản xuất β-hCG (tiểu phần β của gonadotropin màng
đệm) được tiết ra đủ để có thể được phát hiện trong chẩn đoán sự mang thai. Do
đó, khi chu kì kinh nguyệt đầu tiên bị đình trệ, β-hCG sẽ là bằng chứng đánh giá
dương tính khi thử nghiệm nước tiểu người mẹ, β-hCG cũng có thể được định
lượng trong huyết thanh máu mẹ, và điều này cũng được sử dụng trong chần
đoán sớm các sai lệch của quá trình mang thai (chẳng hạn lượng β-hCG sẽ thấp
hơn bình thường).
Vào tháng thứ 5 hay 6 của thai, β-hCG có thể được sử dụng kết hợp với
MSAFP để sàng lọc những bất thường NST và hội chứng Down. Nếu β-hCG gia
tăng kết hợp với kết quả MSAFP sút giảm, rất có thể phát sinh hội chứng Down.
Nếu hCG ở mức độ rất cao, thai có khả năng bệnh về trophoblast. Nếu thai
bị mờ nhạt, khó quan sát khi siêu âm cùng với hàm lượng hCG cao trong máu,
rất có thể diễn tiến tiềm ẩn bệnh hydatidiform mole.
Estradiol huyết thanh mẹ: Lượng estradiol trong huyết thanh của mẹ phụ
thuộc vào thai, nhau thai và tình trạng sức khỏe của bà mẹ. Cơ chất cho estradiol
bắt đầu khi dehydroepiandrosterone (DHEA) được tiết ra bởi tuyến thượng thận
114
thai. Sau đó, chúng được chuyển hóa thành estradiol trong nhau thai. Estradiol có
thể chuyển sang máu và tiết ra từ thận của mẹ vào nước tiểu, hay bởi từ gan mẹ
vào muối mật. Việc đo lường estradiol theo thứ tự trong quý ba sẽ cho biết dấu
hiệu tình trạng sức khỏe chung của thai. Nếu mức độ estradiol giảm, thai có khả
năng bị đe dọa và cần cấp cứu khẩn cấp.
Inhibin-A: Inhibin được tiết ra bởi nhau thai và corpus luteum. Inhibin-A có
thể được do trong huyết thanh máu mẹ. Mức độ tăng của inhibin-A được kết hợp
với rủi ro gia tăng đối với sự tam nhiễm của NST 21. Inhibin-A cao có thể gây
đẻ non.
Protein A huyết tương kết hợp với thai (PAPP-A): Các mức độ thấp của
PAPP-A trong huyết thanh mẹ ở quý đầu tiên của thai kì có thể liên quan tới
những bất thường của NST thai bao gồm ba NST 13, 18 và 21. Thêm vào đó, có
thể dự báo một hậu quả bất lợi như SGA (small for gestational age baby) hay
chết thai, nếu mức độ của PAPP-A quá cao có thể dự đoán hiện tượng LGA
(large for gestational age baby).
Sự sàng lọc “bộ ba” hay “bộ bốn”: là quá trình kết hợp các thử nghiệm
huyết thanh mẹ có thể giúp làm tăng tính nhạy, sự chính xác chuyên biệt cho
việc phát hiện các bất thường của thai. Sàng lọc bộ 3 gồm MSAFP, β-hCG và
stradiol. Sàng lọc bộ 4 gồm MSAFP, β-hCG, estradiol và inhibin-A.
3.3.2.2. Kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán
Kiểm tra đại thể: là kỹ thuật đơn giản quan sát thai hay những phần thai.
Trước đây, kiểm tra thai toàn bộ là quan trọng nhất, mặc dù kiểm tra các thành
phần của thai cũng cho nhiều thông tin. Kiểu bất thường đại thể dễ nhận thấy là
những bất thường NST hay một hội chứng nào đó. Những bất thường khác có
thể khó phát hiện, đặc biệt khi thai ở giai đoạn sớm. Việc kiểm tra nhau thai rất
115
quan trọng, bởi nhiều nguyên nhân sẩy thai xuất phát từ nhau.
Các cuộc tư vấn về di truyền người hoặc bệnh lí sinh sản nên được tiến
hành thường xuyên hơn. Việc này đem lại nhiều lợi ích cho gia đình và xã hội.
Kiểm tra vi thể: Các phát hiện vi thể ít được dùng hơn kiểm tra đại thể cho
thai. Nhưng kiểm tra vi thể nhau thai rất quan trọng bởi cho phép xác định tuổi
thai, sự nhiễm khuẩn, sự phát sinh của khối u, hay các biểu hiện bất thường về sự
hình thành, phát triển cơ quan…
Chụp X-quang: Những hình ảnh chụp bằng tia X rất cần thiết cho sự phân
tích bộ xương thai. Chụp tia X cho các thông tin hữu dụng để so sánh với siêu
âm tiền sinh và giúp xác định những bất thường (khi các phẫu thuật không thể
tiến hành được), giúp xác định các vị trí để kiểm tra vi thể. Chẳng hạn, nhờ ảnh
chụp bằng tia X, có thể phát hiện các bất thường về xương, khiếm khuyết ống
thần kinh,những thay đổi mô mềm, sự chậm phát triển thai…
Nuôi cấy vi sinh: được tiến hành để ứng dụng trong chẩn đoán hay khẳng
định sự nhiễm. Nhiều dạng nhiễm bẩm sinh thường gặp trong thai: T
(toxoplasmosis), O (Listeria monocytogenes, group B streptococcus, syphilis), R
(các Rubella), C (nhóm cytomegalovirus), H (herpes simplex, human
immunodeficiency virus – HIV)… đều có thể được kiểm tra.
Kiểu nhân (Karyotype): Kiểu nhân là một tập hợp hoàn chỉnh tất cả các
NST của một tế bào ở bất kì sinh vật nào. Các NST này được sắp xếp và thể hiện
(thường là trên hình) với định dạng chuẩn theo từng cặp, có thứ tự theo kích
thước và sự định vị của centromere thuộc các NST cùng kích thước. Kiểu nhân
được kiểm tra trong các nghiên cứu về sự bất thường NST và có thể được sử
dụng để xác định những khía cạnh kiểu hình nhận thấy được của từng cá thể,
chẳng hạn như giới tính (XX so với XY).
116
Kiểu nhân người bình thường có 46 XX (ở nữ) và 46 XY (ở nam). Tuy
nhiên, một số cá thể chứa những kiểu nhân khác biệt, chẳng hạn nhiều hơn hay ít
hơn như 47 XYY, 47 XXY, 47 XXX và 45 Õ. Kiểu nhân 45 Y không có vì phôi
không sống nếu không có NST X.
FISH: Ngoài việc xác định khiểu nhân, FISH có thể còn nhiều hữu ích khác.
Một số mẫu dò thương mại khác nhau đã có sẵn, rất tiện lợi cho việc phát hiện
các bất thường NST.
Hình 3.7. Hệ thống máy Flow cytometry

(Hãng Becton Dickinson, Mỹ)
Phân tích khuếch đại DNA: Rất nhiều bệnh di truyền với các gen gây bệnh
đã được phát hiện, qua đó, các kiểm nghiệm thông qua phân tích, khuếch đại
DNA chuyên biệt cho các bệnh này đã được phát triển và ứng dụng hiệu quả.
Tuy không thể phát triển hết tất cả các bệnh di truyền, nhưng kỹ thuật khuếch đại
gen cần được quan tâm hơn và nên kết hợp song hành với các kỹ thuật phát triển
đột biến, như SSCP hay RFLP để có thể ứng dụng trong chẩn đoán tiền sinh
ngay trong giai đoạn phôi sớm.
117
Phân tích sinh hóa: Các mô có thể được thu nhận để nuôi hay tách chiết
hợp chất, từ đó tiến hành xác định lỗi trong quá trình chuyển hóa bẩm sinh.
Chẳng hạn, acid béo chuỗi dài, các amino acid…Tuy nhiên phương pháp này có
nhiều hạn chế như thời gian tiến hành dài, nhiều kết quả không chính xác, dễ bị
nhiễm.
Flow cytometry: là hệ thống thiết bị hiện đại, máy có khả năng nhận diện,
sàng lọc các đặc điểm khác nhau của tế bào đã tỏ ra rất hữu dụng cho việc định
lượng DNA và có thể xác định được các bất thường NST, ví dụ phát hiện ta, bội
NST.
3.3.2.3. Một số khiếm khuyết thai và nhau thai có thể chẩn đoán tiền sinh
Các tế bào sẽ được thu nhận từ dịch ối, hay nhau thai bằng chọc hút có sự
hỗ trợ của siêu âm. Thông qua các kỹ thuật nhuộm tế bào và nhuộm băng NST,
các khiếm khuyết thai và nhau thai có thể phát hiện bằng chẩn đoán tiền sinh
như: ba NST 21 (gây bệnh Down), ba NST 18, NST 13 và ba NST 16, một NST
X (OX – hội chứng Turner), hội chứng XXY (Klinefelter), khiếm khuyết ống
thần kinh phù thai (hydrops fetalis), nhiễm khuẩn, virus bẩm sinh, bất thường
nhau, bất thường xương…
118
Chương 4: Một số khái niệm cơ bản trong liệu pháp gen
4.1. Giới thiếu
Con người đã ứng dụng một loạt các thành tựu khoa học (của di truyền học
phân tử, khoa học bộ gen người và kỹ thuật thao tác trên gen…) vào mục đích
phòng trị bệnh. Đây là lĩnh vực mới, liên quan giữa khoa học cơ bản và y học
lâm sang, gọi là Liệu pháp gen (Gene theraphy). Vậy liệu pháp gen là một
phương thức chữa bệnh bằng kỹ thuật thao tác trên gen. Tuy vậy, với lịch sử
nghiên cứu gần nửa thế kỉ nhưng có rất nhiều nhà khoa học đưa ra các khái niệm
khác nhau về liệu pháp gen.
Theo Kerstin B Kaufmann, Hildegard Büning, Anne Galy, Axel Schambach

và Manuel Grez (EMBO molecular medicine 2013): Liệu pháp gen liên quan đến
việc sử dụng các axit nucleic (DNA hoặc RNA) để điều trị và chữa bệnh hoặc
ngăn ngừa các rối loạn di truyền của con người.
Liệu pháp gen được định nghĩa là một "kỹ thuật cho phép sửa chữa khiếm
khuyết các gen chịu trách nhiệm cho sự phát triển bệnh".
Theo các bác sĩ đại học y khoa Florida thì khái niệm về liệu pháp gen cho
bệnh di truyền là: bản sao chức năng của các gen khiếm khuyết được đưa vào để
thay thế các chức năng còn thiếu.
Gen liệu pháp hay gen trị liệu (Therapeutic gene) là thuật ngữ dùng để chỉ
các gen có chức năng, có thể sử dụng vào mục đích điều trị và chữa bệnh cho
con người.
Những nghiên cứu liệu pháp gen đã được tiến hành trên các mô hình động
vật để thử nghiệm lâm sang hay điều trị bệnh, từ đó hình thành nên thuốc phân
tử. Thuốc phân tử được sử dụng trong nhiều mục đích y học, bao gồm trị một số
119
bệnh hiểm nghèo, nghiên cứu di truyền bệnh, chẩn đoán bệnh, thiết kế mô hình
thích hợp cho việc tiếp cận liệu pháp gen, ứng dụng các quy trình đã được thử
nghiệm và kiểm tra đánh giá tác động lâm sàng…
Liệu pháp gen có tiềm năng lớn trong chữa trị các bệnh di truyền, ung thư,
bệnh nhiễm hay một số hội chứng thay đổi tính trạng của cơ thể. Liệu pháp gen
sửa chữa những gen sai hỏng, bất hoạt những gen không mong muốn, chèn vào
những gen mã hóa các tính trạng mong muốn ở chính cơ thể bệnh nhân.
Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm và chức năng khác nhau cụ thể là:
- Các gen hoạt động bình thường (còn gọi là gen lành) có thể đưa vào tế bào
sống để thay thế các gen hỏng, gen mất chức năng, khôi phục hoạt động bình
thường của tế bào và sự sống của cơ thể.
- Là nhưng gen có khả năng mã hoá một protein đặc hiệu, khi đưa vào tế
bào sống có thể tạo nên các loại protcin đặc hiệu. Các loai protein đặc hiệu có
thể ức chế hoạt động của một gen khác trong tế bào, kìm hãm khả năng phân
chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh.
- Những gen khi đưa vào tế bào hoạt động đồng thời với các gen bệnh (gen
bị đột biến trong tế bào), làm hạn chế tác dộng của gen bệnh hoặc hỗ trợ, bù đắp
cho các gen bị hỏng.
- Gen liệu pháp còn là “các gen bị bất hoạt” được đưa vào tế bào thay thế
cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản phẩm không cần thiết của gen lành
hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái mới, có tác động chống lại bệnh tật.
- Gen liệu pháp có thể là những đoạn Oligonucleotid, có tác động kìm hãm
hoạt động của gen bị hỏng, bị đột biến trong tế bào.
120
Một số chiến lược của liệu pháp gen đã được phát triển hay đang trong
nghiên cứu:
- Một gen bình thường được đưa vào tế bào để thay thế cho những gen mất
chức năng. Đây là phương pháp thông thường nhất.
- Ức chế sự biểu hiện của gen bệnh: các sản phẩm của gen bệnh có thể là
những độc tố và cần ngăn cản sự biểu hiện của chúng bằng các gen ức chế.
- Sửa chữa (không thay thế) gen hỏng bằng các kỹ thuật thao tác trên gen.
- Tiêu diệt tế bào bệnh bằng gen tự sát hay gen sản xuất chất độc: các gen
đưa vào tế bào bị bệnh (tế bào ung thư, tế bào nhiễm virus), chúng gây chết tế
bào bệnh.
- Chuyển gen vào tế bào chức năng để tác động lên hệ miễn dịch, tấn công
tác nhân gây bệnh ngoại lai (ví dụ các kháng nguyên).
Ba phương thức đầu có bản chất sửa chữa những khiếm khuyết di truyền.
Hai phương thức sau có bản chất chữa trị bệnh và được xem như là liệu pháp ung
thư (cancer therapy) và liệu pháp miễn dịch (immunotherapy), cả hai đều có mục
đích giết tế bào bệnh hay tế bào lạ, nhưng thực hiện theo cách trực tiếp hay gián
tiếp.
4.2. Tế bào mục tiêu
4.2.1. Tế bào sinh dưỡng
Đây là những tế bào có vai trò trong sự sinh trưởng và phát triển của cá thể,
chúng có chức năng sinh học khác với các tế bào sinh dục. Liệu pháp gen thường
chọn đối tượng tế bào sinh dưỡng làm mục tiêu chuyển gen.
Tuỳ các bệnh xảy ra ở mô, cơ quan nào, để chọn lựa tế bào mục tiêu thích
121
hợp. Một trong các tế bào sinh dưỡng thường được sử dụng là bạch cầu. Ngoài
ra, liệu pháp gen soma có thể sử dụng một số loại tế bào như: tế bào lympho
(lymphocyte), nguyên bào sợi (fibroblast), tế bào gốc (Stem cells), tế bào gan
(hepatocyle), tế bào biểu bì (keratinocyte )... Liệu pháp gen soma đến nay đã
chữa và điều trị khỏi hoặc hạn chế biểu hiện bệnh cho một số lượng tương đối
lớn người bệnh, với nhiều loại bệnh hiểm nghèo như: thiếu hụt miễn dịch tổ hợp
trầm trọng (SCID), ung thư, thiếu máu hồng cầu liềm, u xơ nang …
Liệu pháp gen ở tế bào sinh dưỡng được tiến hành vào năm 1990. Bé gái 4
tuổi Ashanti Desilva mắc bệnh suy giảm miễn dịch trầm trọng do khiếm khuyết
gen adenosine deaminase (ADA), là bệnh nhân đầu tiên chữa trị thành công bằng
liệu pháp gen với tế bào sinh dưỡng.
4.2.2. Tế bào sinh dục
Các tế bào sinh dục là trứng, tinh trùng (gamete) và những tế bào tiền thân
của chúng có vai trò sinh sản, duy trì nòi giống và các phôi sớm. Liệu pháp gen
liên quan đến việc thay đổi cấu tạo di truyền của một gen dòng mầm, thay đổi
vật chất di truyền trong trứng hay tinh trùng trước khi thụ tinh, hoặc thay đổi đặc
điểm di truyền của phôi trong giai đoạn đầu của sự phân chia.
Nguyên lý như sau: thu nhận trứng (hay tinh trùng) của cặp vợ chồng có ý
định sinh con nhưng có bệnh di truyền, họ được sửa chữa các sai hỏng đó bằng
liệu pháp gen, sau đó các trứng (hay tinh trùng) này được thụ tinh in vitro (hay
tiến hành các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản khác) để tạo phôi bình thường.
Liệu pháp gen trên tế bào sinh dục được tiến hành đầu tiên vào năm 2001,
với 30 đứa trẻ chào đời bằng công nghệ chuyển chất nhân (ooplasm). Chất nhân
của trứng bình thường được chuyển vào chất nhân của trứng khiếm khuyết. Bằng
122
cách này, một lượng nhỏ DNA ti thể ở trứng bình thường được đưa vào tế bào
trứng bệnh, giúp sửa chữa các khiếm khuyết xảy ra trong DNA ti thể của tế bào
trứng. Kết quả, đứa trẻ sinh ra có DNA của mẹ, cha và cả của người cho chất
nhân trứng.
Liệu pháp gen tế bào dòng mầm hiện nay còn là vấn đề đang được tranh
luận ớ nhiều nước trên thế giới, chủ yếu vì lý do đạo đức và nhân đạo như vấn đề
nhân bản người. Liệu pháp gen dòng mầm bị cấm hoàn toàn ở Úc, Thụy Sỹ.
123
Chương 5: Liệu pháp gen
5.1. Lịch sử nghiên cứu liệu pháp gen
Kể từ khi Gregor Mendel lần đầu tiên mô tả yếu tố di truyền từ các thí
nghiệm với đậu Hà Lan của mình, khoa học đã có những bước tiến lớn trong di
truyền học. Phát minh cấu trúc xoắn kép của phân tử DNA bởi James Watson và
Francis Crick năm 1953, đã mở ra một kỷ nguyên mới của di truyền phân tử và
công nghệ sinh học phân tử. Cùng với hàng loạt các thành tựu của nhiều ngành
khoa học, liệu pháp gen bắt đầu được hình thành và phát triển nhanh chóng trở
thành một xu hướng mới trong y học hiện đại.
Vào những năm 1960 dự án đầu tiên đề xuất sử dụng gen trong sản xuất các
chế phẩm điều trị bệnh ở người được thành lập.
Những năm 1970 và 1980 đã chứng kiến sự xuất hiện của liệu pháp gen liên
quan đến vị trí và chức năng của một gene vào các tế bào đảo ngược rối loạn
chức năng của tế bào hoặc tạo ra các chức năng tế bào mới (Cotrim và Baum
2008). Xâm nhập của các gen này vào một tế bào được thực hiện bằng việc sử
dụng một vector virus như adenovirus, virus adenoassociated, retrovirus,
lentivirus, hoặc thông qua các phương pháp tiếp cận nonviral (Edelstein et al.
2007). Việc tạo ra DNA tái tổ hợp (rDNA) năm 1972 (Cohen 1973) dẫn đến sự
tiến bộ đáng kể trong việc nghiên cứu liệu pháp gen. Ý tưởng về liệu pháp gen
đã được giới thiệu bởi Joshua Lederberg năm 1963; nhưng về tổng thể, nghiên
cứu về di truyền học con người đã không đẩy nhanh cho đến những năm 1980.
Năm 1980, Tiến sĩ Martin Cline đã trở thành người đầu tiên tiến hành thí
nghiệm liệu pháp gen đối với con người. Nghiên cứu Cline là về βthalassemia,
bệnh huyết học gây nên bởi đột biến của một gen lặn trên nhiễm sắc thể 11. Làm
124
suy giảm sản xuất chuỗi βglobin dẫn đến tạo hồng cầu không hiệu quả và tan
huyết là nguyên nhân gây ra bệnh thiếu máu huyết tán (Inati et al 2006;. Quek và
Thein 2007; Smith và Byers 2002). Liệu pháp gen với cột mốc Cline không
thành công, là tiêu điểm của những lời chỉ trích dữ dội với những cáo buộc về
những nỗ lực có chủ ý của mình để thực hiện thử nghiệm liệu pháp gen với
người nước ngoài để phá vỡ các luật lệ và quy định liên quan đến thử nghiệm
lâm sàng trên người của Hoa Kỳ. Được mệnh danh là rào cản Cline, nó là một
khởi đầu khó khăn cho các nhà nghiên cứu liệu pháp gen (Smith và Byers,
2002). Cũng trong năm 1980, một nhóm nhà khoa học thuộc Đại học Y Bayler ở
Houston, Texas (Mỹ), thử nghiệm liệu pháp gen để chữa trị bệnh Lesch-Nyhan,
một khiếm khuyết thần kinh hiếm gặp. Họ tiêm gen mã hoá enzyme đặc biệt vào
trong một nhóm tế bào với giả thiết gen này sẽ sửa chữa các sai hỏng gây nên
bệnh.
Năm 1990 thành công liệu pháp gen đầu tiên của William Anderson,
Michael Blaise, và Ken Culver đánh dấu một bước tiến mới trong lĩnh vực ứng
dụng kỹ thuật gen trong điều trị bệnh cho con người. Bằng công trình liệu pháp
gen đầu tiên chữa bệnh suy giảm miễn dịch trầm trọng ở người do thiếu hụt
enzym ADA (Adenosine Deaminasc Deficiency) gây nên, đã mở ra một thời kỳ
mới của y - sinh học hiện đại trong chữa bệnh cho con người.
Tháng 9 năm 1990, thành công đầu tiên sử dụng liệu pháp gen chữa bệnh
cho con người của French Andeison và R. Michael Blaese. F. Anderson và
Michael Blaese đã diều trị bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng (SCID -
Severe Combined Immimodcficiency) do thiếu hụt enzym ADA gây nên cho
bệnh nhân Ashanti 4 tuổi, đã mở ra một kỷ nguyên mới của Y-Sinh học hiện đại.
Cuối năm 1990, Cynihia 9 tuổi mắc bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng
125
như Ashanti cũng được cứu chữa thành công.
Liệu pháp gen ung thư sử dụng antisense IGF-I RNA đã được giới thiệu
năm 1992/93
Số loại bệnh được chữa trị bằng liệu pháp gen ngày càng nhiều, bao gồm
hàng loạt bệnh hiểm nghèo như bệnh ung thư, bệnh thiếu hụt enzym ADA, bệnh
xơ nang, bệnh thiếu máu hồng cầu liềm, bệnh lão hoá sớm... Số lượng bệnh nhân
bị bệnh hiểm nghèo, được diều trị bằng liệu pháp gen ngày một tăng.
Năm 1999 vấp phải một khó khăn vô cùng lớn với sự cố Jesse Gelsinger 18
tuổi tử vong khi tham gia điều trị bằng liệu pháp gen chữa bênh di truyền do
thiếu hụt enzym Omithin Transcarboxylaza (OTCD). Jesse bị chết sau 4 ngày trị
liệu vì có sự đáp ứng miễn dịch mãnh liệt với vật mang là Adenovirut dẫn đến cơ
thể bị huỷ hoại nghiêm trọng.
Năm 2000, bác sĩ French đã chữa trị thành công mười đứa trẻ mắc bệnh suy
giảm miễn dịch trầm trọng kết hợp NST X (X-SCID), đôi khi gọi là hội chứng
Buble Boy. Tuy nhiên, 2 trong 10 đứa trẻ đã mắc thêm bệnh Leukemia sau khi
trị liệu. Vào năm 2002 các nhà khoa học báo cáo thử nghiệm chữa trị thành công
hồng cầu hình liềm trên chuột và cũng thành công trong tạo ra vector liposome
siêu nhỏ giúp dễ dàng đưa gen trị liệu qua lỗ màng nhân.
Một sự kiên trọng đại nữa là tháng 1 năm 2003, FDA ra lệnh tạm dừng tất
cả các liệu pháp gen sử dụng vector retrovirus trong các tế bào nguồn của máu.
Sở dĩ có sự cố này là do sau khi một em bé người Pháp khi xử lý bằng GTL lại
phát bệnh giống như bệnh bạch cầu (Leukemia). Điều đáng nói là cả 2 em bé đều
phát bệnh giống nhau khi dùng liệu pháp gen điều trị thành công bệnh thiếu hụt
miễn dịch tổ hợp nghiêm trọng SCID hay còn gọi là hội chứng “Bubble Baby”
126
vào tháng 8 năm 2003.
Cũng vì lý do này nên ủy ban cố vấn sinh học của FDA cũng bàn luận về
khả năng có thể định số lượng gen trị liệu có sử dụng Retrovirus để đảm bảo sự
an toàn cho liệu pháp.
Mặc dù gặp nhiều trở ngại, nhưng liệu pháp gen vẫn có những bước tiên
đáng ghi nhận. Chỉ tính đến cuối 1994 đã có hơn 500 bệnh nhân được điều trị
bằng gen trị liệu với nhiều loại bệnh khác nhau, trong đó số người bị ung thư
được điều trị với liệu pháp này chiếm tới 69% (năm 2001), bệnh HIV-AIDS
11,8%.
Cho tới nay số bệnh được điều trị bằng gen trị liệu ngày càng nhiều, ngoài
các bệnh ung thư, SCID, hàng loạt bệnh khác cũng đã sử dụng gen trị liệu như
xơ nang, thiếu máu do hồng cầu hình liềm, bệnh lão hoá sớm, bệnh máu khó
đông, bệnh thiếu hụt trầm trọng enzym OTG (do một gen trên NST giới tính X),
bệnh Huntington (chữa bằng antisens RNA) (New scientist .Com- march
13.2003). Kỹ thuật tạo ra các Liposom có kích thước siêu nhỏ (khoảng 25 nm)
dễ dàng mang các gen qua lỗ màng nhân, hoặc sử dụng vector Liposom được
bao bởi một lớp vỏ polyethylene glycol-PEG đưa các gen vào tế bào não để chữa
các bệnh Parkinson…(New Scientist .Com —May 12-2002).
Vào năm 2006 nghiên cứu liệu pháp gen đạt nhiều thành công: Tháng ba sử
dụng thành công liệu pháp gen để điều trị hai bệnh nhân trưởng thành mắc bệnh
u hạt mãn tính liên kết với NST X, tháng năm phát hiện cách ngăn chặn hệ thống
miễn dịch đáp ứng với gen liệu pháp bằng cách sử dụng các miRNA che mắt các
thụ thể của tế bào miễn dịch, tháng tám điều trị thành công khối u ác tính ở hai
bệnh nhân khi sử dụng các tế bào T-CD8 nhằm mục tiêu di truyền học để tấn
công các tế bào ung thư, trong tháng 11 sử dụng VRX496, một liệu pháp miễn
127
dịch dựa trên gen để điều trị HIV có sử dụng một lentivirus vector để cung cấp
một antisense gene chống lại vỏ capsis của HIV. Trong một giai đoạn thử
nghiệm lâm sàng, năm bệnh nhân nhiễm HIV mãn tính đã không đáp ứng với ít
nhất hai phác đồ ARV đã được điều trị. Liệu pháp gen được truyền tĩnh mạch
một lần duy nhất của tế bào T-CD4 tự thân biến đổi gen VRX496 được dung nạp
tốt. Tất cả các bệnh nhân đã ổn định hoặc lượng virus giảm; bốn trong số năm
bệnh nhân có số lượng tế bào T- CD4 ổn định hoặc tăng lên. Tất cả năm bệnh
nhân đã ổn định hoặc tăng đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên HIV và các tác
nhân gây bệnh.
Năm 2007 thử nghiệm liệu pháp gen đầu tiên cho bệnh thái hóa võng mạc
di truyền, hoạt độngthử nghiệm đầu tiên đã được thực hiện trên một bệnh nhân
nam người Anh 23 tuổi, Robert Johnson, vào đầu năm 2007.
5.2. Chiến lược liệu pháp gen
5.2.1. Liệu pháp in vivo
Liệu pháp gen in vivo là phương pháp đưa trực tiếp gen liệu pháp vào trong
tế bào của mô riêng biệt trên cá thể bị bệnh. Gen liệu pháp được dòng hoá vào
trong một vector. Vector này được đưa trực tiếp vào tế bào, mô của cơ thể bệnh.
Hình 5.1. Chiến lược điều trị liệu pháp in vivo
128
Phương pháp in vivo có thuận lợi căn bản là không cần lấy tế bào bị bệnh ra
ngoài cơ thể sống, ít thao tác liệu pháp hơn, nhưng hiệu quá thường không rõ rệt
do không kiếm soát được mức dộ hoà nhập của các gen liệu pháp trong tế bào bị
bệnh.
Phương pháp in vivo gồm một số bước cơ bản sau:
- Bước 1: Căn cứ đặc điểm của bệnh, loại tế bào hoặc mô bị bệnh để chọn
vector liệu pháp thích hợp với loại tế bào bị bệnh (tế bào đích).
- Bước 2: Tách dòng gen liệu pháp thích hợp, tạo các vector tái tổ hợp mang
gen liệu pháp.
- Bước 3: Bằng kỹ thuật vi tiêm, đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp
vào tế bào bệnh hoặc mô bị bệnh.
- Bước 4: Kiểm tra, theo đõi chặt chẽ hoạt động của các vector tái tổ hợp
trong cơ thể người bệnh, cũng như mọi thay đổi về mức độ biển hiện bệnh, trạng
thái sức khỏe...
Phương pháp in vivo các thường sử dụng loại vector liệu pháp là: adenoviral
vector, retroviral vector, AAV vector, HSV-1 vector, DNA trần, và liposom.
Nhiều loại bệnh có thể được điều trị bằng liệu pháp in vivo, trong đó điều trị
bệnh ung thư cho kết quả tốt nhất.
5.2.2. Liệu pháp ex vivo
Phương pháp thao tác chuyển gen vào tế bào bên ngoài cơ thế sống hay còn
gọi là liệu pháp ex vivo. Liệu pháp ex vivo là phương pháp lấy tế bào bị bệnh có
gen hỏng ra khỏi cơ thể, thực hiện các liệu pháp gen ngoài cơ thể tạo các tế bào
đã thay các gen lành cho gen bị hỏng (gen gây bệnh), sau đó tế bào lành được
nhân lên một khối lượng đủ lớn rồi đưa trở lại cơ thể. Liệu pháp ex vivo có thể
129
làm hạn chế biểu hiện bệnh hoặc chữa khỏi bệnh hoàn toàn.
Liệu pháp ex vivo được ứng dụng chữa và điều trị nhiều loại bệnh có kết
quả tốt. Thành công đầu tiên của liệu pháp gen chữa bệnh cho con người (1990)
là sử dụng liệu pháp ex vivo để chữa bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng
ADA - SCID. Bệnh ADA - SCID do bị hỏng gen mã hoá enzym ADA
(Adenosine Deaminase Deticiency). Gen mã hoá enzym ADA có kích thước
32kb gồm 12 exon, nằm trên nhiễm sắc thể số 22 của người. Khi gen này bị hỏng
gây mất chức năng các tế bào lympho T và B, gây rối loạn chức năng miễn dịch
của cơ thể, làm cho cơ thể miễn dịch rất kém. Được các bác sỹ French Anderson
và R. Mìchael BLaese điểu trị bằng liệu pháp gen ex vivo, hai bệnh nhân Ashanti
4 tuổi và Cynthia 9 tuổi được chữa khỏi bệnh thiếu hụt miễn dịch năm 1990.
Liệu pháp ex vivo tiến hành qua các bước cơ bản sau:
- Bước 1: Bằng kỹ thuật sinh thiết, lấy các tế bào từ các mô bị bệnh ra khỏi
cơ thể người bệnh, nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp đảm bảo các tế bào bị
bệnh vẫn phân chia bình thường.
- Bước 2: Tách dòng gen liệu pháp và chọn lọc các vector liệu pháp thích
hợp với tế bào bị bệnh (tế bào đích). Tạo nên các vector tái tổ hợp mang gen liệu
pháp (gen lành), bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.
- Bước 3: Đưa vector tái tổ hợp mang gen lành vào tế bào đích, nuôi cấy các
tế bào đích trong những điều kiện thích hợp, đảm bảo khả năng phân chia bình
thường của các tế bào.
- Bước 4: Kiểm tra, theo dõi chặt chẽ các thế hệ tế bào đích mới tạo nên
trong quá trình nuôi cấy. Chọn lọc những tế bào khoẻ mạnh bình thường là
những tế bào bị bệnh đã được thay thế gen bệnh bằng gen lành.
130
- Bước 5: Nuôi cấy riêng các tế bào bình thường đã chọn lọc được, tiếp tục
theo dõi biểu hiện của gen lành trong tế bào, kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch
và các hiệu ứng phụ... để chọn lọc các tế bào hoàn toàn đáp ứng yêu cầu chữa
bệnh.
- Bước 6: Nuôi cấy tế bào khoẻ mạnh, để các tế bào phân chia đạt một số
lượng cần thiết, sau đó đưa các tế bào này quay trở lại cơ thể người bệnh. Tiếp
tục theo dõi hoạt động của các tế bào khỏe mạnh trong cơ thể người bệnh.
Hình 5.2. Sơ đồ liệu pháp gen in vivo
Liệu pháp ex vivo thường được áp dụng điều trị trong các liệu pháp gen tế
bào dòng soma (somatic gcne therapy). Liệu pháp ex vivo thường sử dụng các
loại vector liệu pháp như: adenoviral vector, retroviral vector, lentiviral vector,
AAV vector, DNA trần, liposome, polycation. Các loại tế bào đích thường dùng
là các tế bào xoma như tế bào tuỷ xương, tế bào gan, tế bào gốc, tế bào biểu bì.
131
5.3. Vector có bản chất virus dùng trong liệu pháp gen
Liệu pháp gen thường được tiến hành bằng cách chuyển một gen mã hóa
cho protein chức năng hay một thực thể sinh học nào đó vào tế bào, nhằm làm
thay đổi sự biểu hiện của một gen nội sinh. Chuyển thành công các gen vào tế
bào là yêu cầu tiên quyết để có thể đạt được hiệu quả mong muốn trong liệu
pháp gen,
Các vector là phương tiện vận chuyển thông tin di truyền vào tế bào, chúng
có thể được chia thành hai kiểu hệ thống, gồm vector có bản chất virus (dựa trên
virus) và hệ thống vector không có bản chất virus (không dựa trên virus)
Hệ thống chuyển gen có bản chất virus thường được biến đổi từ các
retrovirus, adenovirus và virus kết hợp-adeno (Adeno associated virus – AAV).
Một số virus có bản chất virus khác, nhưng ít được sử dung hơn: Herpes simple
virus 1 (HSV_1), virus đậu nùa hay Baculovirus…
Những vector không có bản chất virus bao gồm các plasmid của vi khuẩn
và các hợp chất được tổng hợp hóa học hay tương tự.
Việc chọn lựa các vector và phương pháp chuyển gen tùy thuộc:
(1) Tế bào mục tiêu và những đặc tính của nó, chẳng hạn khả năng tải nạp
ex vivo và dung hợp vào bệnh nhân.
(2) Thời gian biểu hiện cần thiết.
(3) Kích thước của vật liệu di truyền cần chuyển.
5.3.1. Vector có bản chất virus
132
Sử dụng virus trong chuyển gen có lợi thế là chúng không làm thay đổi sự
điều hòa hoạt động của gen chủ, tuy nhiên các vector virus này rất có khả năng
tạo ra các loại virus mới, thậm chí virus mới mạnh và nguy hiểm hơn rất nhiểu.
Trong chu kì sống của virus, chúng sử dụng dạng virion để chuyển thông
tin di truyền một cách rất hiệu quả. Các virus được chọn làm vector phải có khả
năng tái tổ hợp và sản xuất ra các virus mới, các virus mới có khả năng tái tổ hợp
và sản xuất ra các virus mới, các virus mới có khả năng sao chép theo kiểu đa
vòng tròn. Hầu hết các nghiên cứu liệu pháp gen đều sử dụng các vector virus
chứa các nhân tố của một virus thiếu khả năng sao chép độc lập. Các gen sớm
của một virus bị cắt bỏ, thay thế bằng trình tự promoter và trình tự gen mong
muốn. Để có khả năng sao chép, các virus này cần có sự hỗ trợ của các tế bào
đóng gói gọi là các virus giúp đỡ. Tế bào đóng gói cung cấp gen của virus đã bị
cắt bỏ.
Đối với các virus này, các receptor bề mặt hiện diện ở virus hoang dại cũng
biểu hiện ở các tiểu phần vector virus. Do vậy, nếu các virus hoang dại có khả
năng nhiễm được vào những kiểu tế bào nào đó, thì các tiểu phần vector virus
cũng dễ nhiễm vào các tế bào ấy. Trong một số trường hợp, có thể biến đổi gen
mã hóa cho các protein bề mặt bằng các gen mã hóa bề mặt của các virus khác,
nhằm có thể gắn và nhiễm vào các kiểu tế bào được chọn. Việc sử dụng protein
của virus khác để làm thay đổi kiểu tế bào mục tiêu được gọi là “kiểu virus giả”.
5.3.2. Vector retrovirus (Rv)
 Cấu trúc:
+ Đường kính trung bình khoảng 100nm và có một vỏ.
133
+ Vỏ bọc chứa những phân tử glycoprotein, các phân tử này sẽ quyết định
tính chuyên biệt cho các tế bào mục tiêu qua sự gắn kết tương đồng lên receptor
của tế bào đích. Có 2 loại:
 Glycoprotein vỏ bên ngoài (SU): Kháng nguyên chủ yếu của virus, có
chức năng bám vào các nội quan.
 Glycoprotein màng(TM): Bám vào protein SU ở vỏ, chịu trách nhiệm

đối với sự dung hợp.
+ Bên trong chứa:
 Hai bản sao của mạch RNA đơn dương dài khoảng 5 - 10kb. Thường
nhận gắn gen chuyển (transgene) dài khoảng 8kb. Gen này chủ yếu sử dụng
trong nghiên cứu in vivo.
 Protein cơ bản (MA), không định hình. Protein này bao lấy capsid
(CA). CA là protein phong phú nhất trong hạt virus (chiếm 33% trọng lượng
tổng số), có hình khối 20 mặt. Bên trong capsid là lõi, thường có hình nón, bao
gồm: RNA genome, protein nucleocapsid (NC), enzym phiên mã ngược (reverse
transcripase) và enzyme hợp nhất (intergrase).
Chia làm 7 giống dựa vào các đặc điểm khác nhau: cấu trúc nucleotit vỏ,
cấu hình nucleocapsid, kiểu prion, trình tự nucleotide.
 Quy trình sử dụng một Retrovirus gồm các giai đoạn:
(1) Nhiễm virus vào tế bào đích.
(2) Sao chép ngược bộ gen RNA tạo thành DNA nhờ enzym reverse
transcriptase.
(3) Chuyển DNA của virus vào trong nhân.
134
(4) DNA của virus sát nhập vào bộ gen tế bào chủ.
(5) DNA virus phiên mã thành mRNA bởi promoter mạnh trong trình
tự 5’-LTR.
(6) Dịch mã trong cytoplasm tạo thành các protein Gag, Pol, Env.
(7) Sự hình thành và đóng các gói capsid với hai mạch RNA virus và
các phân tử reverse transcriptase.
(8) Các virion làm “nổ” các tế bào và giải thoát ra ngoài.
 Ưu điểm:
+ Gắn chèn gen mục tiêu vào NST của tế bào quan tâm Sự biểu hiện
của gen mục tiêu ổn định.
+ Ít nhạy cảm với hệ thống miễn dịch.
+ Sử dụng đối với các dòng tế bào có khả năng phân chia mạnh.
 Nhược điểm:
+ Gắn chèn gen mục tiêu một cách hoàn toàn ngẫu nhiên.
+ Không có khả năng chuyển nhiễm lên các dòng tế bào không phân
chia.
+ Sự biểu hiện bắt đầu giảm đi sau một thời gian biểu hiện ổn định.
+ Sự biểu hiện của gen có thể bị gián đoạn trong nhiều ngày hoăc nhiều
tuần bởi NST vẫn đang bị cuộn nên gen cần chuyển không đến được ngay khu
vực phiên mã.
135
Hình 5.3. Dòng tế bào đóng gói các vector retrovirus (Saimin và cs; 1991)
Hình 5.4. Vector retroviruse
136
5.3.2.1. Murine Leukimia Viruse (MLV)
Đây là retrovirus đơn giản với bốn gen gag, pro, pol, env. Gen gap mã hóa
một nhóm các protein đặc biệt cấu thành lõi của virus. Cơ chất Gag được cắt
thành 4 chuỗi polypeptide (10, 12, 15 và 30 kD) bằng protease virus (PR). Đoạn
15 kD thường kết hợp với màng, cần thiết cho sự hình thành “chồi” của các tiểu
phần virus. Đoạn 12 kD là một phosphoprotein chức năng chưa được xác định.
Đoạn 30 kD hình thành lõi của virion, còn đoạn 10 kD gắn vào RNA genome
trong tiểu phần virus.
Virus được tạo ra có hai đầu là hai đoạn gen lặp lại (long terminal repeat –
LTR), trên cùng genome của proviruse. Các gen này có thể được dịch mã bằng
cách đọc tên codon kết thúc mỗi gen. Bộ gen RNA có thể bị cắt tạo các đoạn nhỏ
hơn, sau đó tiến hành dịch mã.
Hệ thống vector retrovirus đầu tiên từ virus gây bệnh bạch cầu ở chuột
(murine leukemia virus-MLV) đã và đang được sử dụng trong các tiến trình lâm
sàng. Có nhiều lý do để lựa chọn MLV làm hệ thống vận chuyển gen:
(1) Các đặc tính sinh học của MLV đã được hiểu rõ
(2) Bộ gen của MLV là bộ gen retrovirus được tạo dòng sớm nhất
(3) Những virus này có khả năng xâm nhiễm vào tế bào chủ rất hiệu quả.
Đặc biệt, đa số MLV chỉ có khả năng xâm nhiễm vào các tế bào của các loài
gặm nhấm, chúng không xâm nhiễm vào tế bào người, ngoại trừ các trường hợp
được thiết kế để xâm nhiễm vào con người (tuy nhiên có một số loại virus MLV
khác có khả năng xâm nhiễm vào nhiều kiểu tế bào của người và các loài gặm
nhấm.
Một hệ thống vector retrovirus gồm hai thành phần:
137
(1) Cấu trúc vector mang gen: chứa trình tự promoter, trình tự cần cho sự
+
sát nhập vào bộ gen chủ và trình tự cần thiết cho sự đóng gói vỏ, kí hiệu .
(2) Dòng tế bào cung cấp protein vỏ virus cần thiết cho sự sản xuất virus tái
tổ hợp gọi là dòng tế bào đóng gói (packing cell line). Các tế bào đóng gói chứa
các gen mã hoá cho protein vỏ cần sự đóng gói (Gag và Env) nhưng lại không
-
chứa trình tự cần thết cho sự đóng gói .
LTR Gag p Pol Env
9kb 5’ Gag 3’
9kb 5’ Pro Pol 3’
3kb 5’ 3’
Env
Hình 5.5. Biểu đồ virus MLV
Để sản xuất các virion vector retrovirus tái tổ hợp, cấu trúc vector mang
gen liệu pháp (therapeutic gen – TG) sẽ được biến nạp vào trong các tế bào đóng
gói bằng phương pháp vật lý như điện biến nạp, siêu âm...Các gen của dòng tế
bào đóng gói sẽ sản xuất các protein và các enzyme. Nhờ trình tự đóng gói nằm
trên cấu trúc gen nên các tế bào đóng gói sẽ bao bọc vỏ capside cho các vector
138
và hình thành các tiểu phần virus. Những tiểu phần này sẽ đội màng tế bào đóng
gói, thoát ra ngoài, khuếch tán vào môi trường nuối cấy.
Môi trường chứa các virus sẽ được lọc để tách các tế bào hay mảnh vỡ hoặc
tinh sạch virus ra khỏi môi trường, sau đó virus được nhiễm vào tế bào đích.
Sau khi các virus bám lên các receptor của các tế bào mục tiêu, vỏ capside
đi vào tế bào, RNA của nó được phiên mã ngược thành DNA và sát nhập vào
DNA tế bào chủ. Các gen của proviruse sẽ phiên mã, tổng hợp protein, đó chính
là protein liệu pháp mong muốn.
Vector retrovirus thường được sử dụng trong liệu pháp ex vivo. Nhiều loại
tế bào sinh dưỡng đã được dùng để biến nạp gen ex vivo, chẳng hạn tế bào gốc
máu, các lymphocyte, tế bào gan, các fibroblast, tế bào keratin… những vector
retrovirus cũng được sử dụng trong liệu pháp in vivo.
Với nhiều mô, việc tải nạp các vector retrovirus e gặp khó khăn khi các tế
bào đã biệt hóa và chúng không thể tăng sinh được. Do vậy, liệu pháp gen sử
dụng vector retrovirus trên các cơ quan đích phải cảm ứng để tế bào phân chia.
Một cách khác để sử dụng các vector retrovirus trong liệu pháp in vivo là biến
nạp vào tế bào không phân chia. Những nghiên cứu sử dụng virus HIV làm
vector đã được tiến hành, bởi chúng có khả năng tải nạp vào các tế bào không
phân chia.
5.3.2.2. Lentiviruse
- Đây là một họ phụ của retroviruse, trong đó có HIV.
- Được sử dụng làm vector chuyển gen.
- Được bao bọc bởi một lớp đôi lipid chứa những protein xuyên màng.
Một trong những loại protein này là gp120. Tế bào chủ nhận diện protein gp120
139
và cho virus xâm nhập. Protein gp120 tác động tới protein receptor CD4 trên tế
bào Th của hệ miễn dịch người.
Hình 5.6.
gp120 trên virus

HIV
- Vật chất di truyền của retrovirus gồm có hai mạch RNA. Sau khi bộ gen
virus sát nhập vào DNA bộ gen của tế bào chủ, chúng được chuyển đổi thành
DNA. Hai enzyme cần thuyết cho sự sao chép virus là:
+ Enzyme sao chép ngược (reverse trascriptase) tổng hợp mạch DNA thứ
nhất từ RNA khuôn. Sau đó, DNA polymerase ở tế bào chủ sẽ tổng hợp mạch
thứ hai.
+ Enzyme sát nhập (integrase) chèn một bản sao của DNA virus vào
trong bộ gen tế bào chủ, giúp bảo vệ virus khỏi sự tấn công của hệ miễn dịch, đó
cũng chính là lí do “bền vững” của retrovirus khi chúng đã nhiễm tế bào chủ.
Vector HIV được tạo thành bởi 3 loại plasmid. Loại vector này được tạo ra
khi sử dụng một phần cấu trúc tiền virus HIV (provirus HIV). Thành phần đó có
chứa trình tự chèn để ngăn cản sự sao chép bên trong hệ thống tế bào của virus.
+ Plasmid 1 (gọi là vật liệu được đóng gói) là một thành phần chính của
virus, kí hiệu là pCMVAR9. pCMVAR chứa virus cự bào người (hCMV), thành
phần này cần thiết cho sự biểu hiện của protein virus trong suốt quá trình dịch
140
mã. Tín hiệu đóng gói cũng như các trình tự lân cận quanh nó bị hủy bỏ (trừ
vùng 5’ không mã hóa protein). Đoạn 3’LTR được thay bằng chuỗi poliadenine.
Thành phần chịu trách nhiêm đóng gói DNA virus bị tách khỏi những phần hoạt
hóa chúng. Bởi vậy, virus không có khả năng sinh sản sau khi đã nhiễm vào tế
bào chủ.
+ Plasmid 2 (plasmid mã hóa cho protein env) mã hóa hai loại protein vỏ
khác nhau. Cả hai loại này có tác dụng làm vector ổn định hơn.
+ Plasmid 3 (vector chuyển): trong vector này, cấu trúc vẫn còn giữ lại
những cặp base của gen gag và RRE (tìm thấy trong gen env). Lợi ích của việc
lấy đi một số cặp base là làm giảm khả năng đóng gói của virus. Vector vận
chuyển chứa vị trí để có thể chèn vào các đoạn gen mong muốn.
Hình 5.7. Quá trình đóng gói vector retrovirus
141
5.3.2.3. Một số vector retrovirus khác
Ngoài hai loại kể trên, một số retroviruse khác cũng được dùng tùy vào
mức độ khác nhau và phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm sinh học của chúng.
Bảng 5.1. Đặc điểm các virus được sử dụng để tạo vector
Loét miệng, mụn

152kb, DNA Hơn 18 cóc viêm bộ
HSV-1 Ø~110nm
thẳng - kép loại protein phận sinh dục,
viêm não
Virus được làm

Hơn 198 Chữ nhật
Virus đậu 190kb, DNA nhược độc, điều
khung dọc 350 – 270 nm
mùa thẳng - kép chế vaccine cho
(ORF) có vỏ bọc
bệnh đậu mùa
Không gây bệnh

Chữ nhật
Baculovirus 130kb, DNA Hơn 60 ở động vật có vú,
270 – 45nm,
e vòng – kép protein gây bệnh côn
có vỏ bọc
trùng
Bảng 5.2. Một số vector retrovirus e thường dùng
142
5.3.2.4. Rủi ro khi sử dụng các vector retrovirus
Hai rủi ro lớn nhất của việc sử dụng liệu pháp gen người là:
(1) Đột biến chèn
+ Xảy ra khi vector virus chèn vào bên trong hay kề gen nội bào.
+ Có thể gây ra sự phát triển các khối u khi đột biến chèn làm bất hợp các
gen ức chế khối u hay hoạt hóa các proto-oncogene.
143
+ Tuy nhiên, khả năng cảm ứng khối u không xuất hiện khi sử dụng các
retrovirus vốn không có khả năng sao chép.
(2) Tạo những virus hoang dại, ở 3 hình thức :
+ Sự tái tổ hợp trong quá trình đóng gói giữa dòng tế bào đóng gói và
vector sẽ tạo thành các virus hoang dại.
+ Sự tái tổ hợp có thể xảy ra ở các virus có khả năng sao chép.
+ Sự tái tổ hợp giữa các vector virus không có khả năng sao chép với các
virus nội sinh in vitro.
Hình 5.8. Sự sản sinh các virus hoang dã sao chép
144
theo phương pháp tái tổ hợp
5.3.2.5. Ứng dụng của các vector retrovirus

Vector retrovirus là cần thiết cho liệu pháp gen, đã được sử dụng có hiệu
quả trong nhiều liệu pháp gen chữa bệnh cho người như suy giảm miễn dịch do
thiếu hụt enzyme ADA, ung thư, tiểu đường, thiếu máu,...
Các vector retrovirus khác nhau đã được thiết kế để tạo động vật chuyển
gen và gà chuyển gen đặc biệt (Ronfort, Legras và Verdier, 1997). Các vector
này mang các trình tự env có khả năng nhận biết các tế bào phôi gà. Chúng được
tiêm vào trứng gà mới đẻ. Ở giai đoạn này, các tế bào vẫn còn đa năng và có thể
tham gia vào việc tạo thành giao tử, truyền gen ngoại lai cho thế hệ sau. Phương
pháp này cho hiệu quả không cao. Phôi ở giai đoạn này chứa khoảng 60.000 tế
bào. Chỉ một tỉ lệ nhỏ các tế bào này có cơ hội mang gen chuyển nhờ vector
retrovirus . Gà chuyển gen tạo thành ở dạng thể khảm và có rất ít cơ hội truyền
gen chuyển của chúng cho thế hệ sau. Một phương pháp khác đã chứng tỏ có
hiệu quả hơn. Việc tiêm gen được thực hiện ở giai đoạn phôi 16 tế bào tại vùng
lân cận của các tế bào gốc nguyên thủy. Các tế bào này được tiêm một cách ưu
tiên, tạo ra các động vật chuyển gen có cơ hội truyền gen chuyển của chúng cho
thế hệ sau.
Vector retrovirus cũng được sử dụng để chuyển gen vào noãn bào của bò
và khỉ (Chen, 1998, 2001). Ðể tiến hành công việc này đòi hỏi hai điều kiện đặc
biệt. Vỏ của vector là protein G của VSV (vesicular somatitis virus) có chức
năng nhận biết màng phospholipid và vì vậy cho phép tiêm vào nhiều loại tế bào
khác nhau. Các hạt virus được tiêm vào giữa màng trong (zona pellucida) và
màng noãn bào vào lúc màng nhân đã biến mất, tạo cho genome virus cơ hội tốt
nhất để có thể đến được genome tế bào chủ.
145
Lentivirus là một phân lớp của retrovirus. Chúng có khả năng hợp nhất vào
genome của các tế bào ở pha nghỉ, cả các tế bào tăng sinh và tế bào không tăng
sinh. Khả năng này có được là do sự có mặt của một tín hiệu ở một trong số các
protein virus. Protein virus này nhằm tới genome của virus ở vùng nhân.
Lentivirus phức tạp hơn các retrovirus đơn giản, chứa thêm 6 gen tat, rev, vpr,
vpu, nef và vif. HIV là một loại lentivirus. Vector lentivirus được nghiên cứu
nhiều do tiềm năng sử dụng của chúng trong liệu pháp gen.
Hình 2.9. Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển gen
Genome virus mang gen ngoại lai được đưa vào tế bào tổng hợp protein
virus khuyết. Các hạt virus được sử dụng để tiêm vào noãn bào động vật có vú
(bò, khỉ), các tế bào mầm nguyên thủy của gà hoặc phôi một tế bào của chuột.
146
Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng vector lentivirus tiêm vào phôi một
tế bào hoặc ủ với phôi đã được loại bỏ màng trong là có hiệu quả đặc biệt đối với
việc chuyển gen vào chuột (Lois, 2003). Các vector này ngày càng được cải tiến
tinh vi hơn. Genome của chúng có nguồn gốc từ lentivirus đã tạo ra các hạt virus
tái tổ hợp có khả năng nhiễm vào tế bào phân chia hoặc tế bào không phân chia.
Vector này chứa LTR đã được sửa đổi dẫn đến sự tự bất hoạt genome virus đã
hợp nhất. Ðiều này làm giảm đáng kể khả năng tái tổ hợp tạo ra virus xâm nhiễm
mang gen ngoại lai với phương thức không kiểm soát. Các loại vector này không
có các gen tăng cường. Sự vắng mặt các gen tăng cường làm cho nó có thể thay
thế cho một promoter nội sinh điều khiển gen mong muốn hoạt động mà không
lệ thuộc vào ảnh hưởng của các gen tăng cường LTR. Vector này cũng chứa một
yếu tố điều hòa sau phiên mã ưu tiên cho việc biểu hiện gen và một đoạn của
virus HIV mà đoạn này cho phép genome virus đi vào nhân của tế bào không
phân chia và hợp nhất vào DNA chủ.
Các vector này cũng có thể điều khiển sự biểu hiện gen FGFP của chuột,
tạo ra màu xanh huỳnh quang ở tất cả các loại tế bào hoặc chỉ ở tế bào cơ khi
promoter hoạt động ở tất cả các loại tế bào hoặc chỉ ở tế bào cơ.
Khoảng 80% chuột sinh ra là chuột đã được chuyển gen. Khoảng 90% số
chuột này biểu hiện gen chuyển của chúng ở một số thế hệ. Protein VSV đã được
sử dụng như là một vỏ bọc cho phép xâm nhiễm hiệu quả vào phôi.
Ưu điểm chính của vector này là hiệu quả biến nạp cao, thao tác đơn giản,
sự xâm nhiễm có thể được thực hiện bằng cách ủ phôi đã loại bỏ màng trong với
thể virus. Phương pháp này được mở rộng đối với các động vật có vú khác mà
không có vấn đề đặc biệt. Phương pháp này thuận lợi một cách đặc biệt cho việc
chuyển gen vào chuột trong khi phương pháp vi tiêm là rất khó sử dụng ở đây.
147
Hạn chế của vector này cũng không ít. Các hạt virus phải được kiểm soát an
toàn sinh học bằng biện pháp thích hợp. Bước này ngày càng được tiêu chuẩn
hóa nhằm tăng cường sử dụng các loại vector này cho liệu pháp gen. Các đoạn
DNA có kích thước không vượt quá 7-9kb có thể được đưa vào vector này. Sự
biểu hiện của gen reporter là tương đối thấp trong trường hợp này. Mặt khác, sự
hợp nhất độc lập của vector xảy ra trong cùng một phôi dẫn đến động vật chuyển
gen thể khảm.
5.3.2.6. Triển vọng

Các vector retrovirus là những vật chuyển gen thông dụng nhất trong gen
trị liệu lâm sàng, tính đến tháng 6 - 1996 đã có 969 bệnh nhân được trị liệu với
vector này (Marcel và Grausz, 1996). Tuy nhiên, mới chỉ vài năm gần đây các
vector retrovirus vẫn chưa xây dựng được nền móng vững chắc trong khi đó các
vector adenovirus lại có độ chuẩn và phổ xâm nhiễm cao hơn. Nhưng với các
thành tựu đương thời thì người ta lại quan tâm nhiều hơn tới các vector
retrovirus.
Những thành tựu đã đạt được là:
(1) Cải tiến nâng cấp mô hình thiết kế chung.
(2) Đã thiết lập được các vector cơ sở lentivirus.
(3) Đã thấu hiểu hơn về tính ổn định và sự sản sinh retrovirus, do đó hy

vọng sẽ tạo được độ chuẩn cao hơn.
(4) Các hệ thống vector an toàn hơn đảm bảo chắc chắn rằng không sản
sinh ra các virus sao chép cao.
Tuy nhiên vẫn chưa thể đòi hỏi về một vector retrovirus hoàn thiện và có lẽ
phải phấn đấu nhiều nữa mới có được thành quả đó. Hệ thống vector tổng hợp
148
nhân tạo sẽ giải quyết được nhiều vấn đề có liên quan đến hệ thống vận chuyển
như hiện nay. Nhưng chắc chắn trong tương lai trong thành phần của retrovirus
sẽ có cả hệ thống vector nhân tạo.
5.3.3. Vector adenovirus (Ad)
Từ “Adeno” xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là “tuyến”, vì lần đầu tiên
virus này được phân lập từ amidan và tuyến vòm họng của người. Adenovirus
gây các bệnh về đường hô hấp, chúng có thể nhiễm vào nhiều kiểu tế bào người
không phân chia. Virus này đã được sử dụng rộng rãi như là một vaccine sống,
để chống lại sự lây nhiễm qua đường hô hấp và viêm dạ dày, ruột mà không có
tác dụng phụ. Những đặc điểm nói trên khiến adenovirus có triển vọng làm
vector chuyển gen một cách hiệu quả và an toàn.
5.3.3.1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền
Denovirus là một loại virus có capsid đa diện 20 mặt, phần lõi chứa DNA
mạch kép. Vỏ capsid của virus chứa 3 loại protein: hexon, fiber và base penton.
Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt 20 mặt, trong khi các
penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 chóp ngoài vỏ virus đóng
vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử.
149
Hình 5.10. Adenoviruse
Nguồn: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:Adenojpg.gif
Bộ gen của adenovirus là một chuỗi DNA mạch kép thẳng, dài khoảng 36
kb, đầu 5’ chứa đoạn cuối lật ngược, dài 100 – 1800 nucleotid (gọi là trình tự
IRT). Bộ gen virus gồm các thành phần sau: vùng gen cuối lật ngược (IRT), các
gen sớm E (earli gene), các gen muộn L (late gene), tín hiệu đóng gói P
(packaging signal).
Có năm gen sớm gồm: E1A, E1B, E2, E3 và E4, chúng được phiên mã và
dịch mã sau một thời gian ngắn, khi các virus xâm nhiễm vào tế bào và sau đó,
tạo thành các chuỗi polypeptid. Các protein khởi đầu là những protein điều
khiển. Các protein vỏ và protein lõi được mã hóa bởi các gen phiên mã sau gọi là
150
gen muộn L. Các gen muộn L sẽ tạo thành 11 protein khác nhau với 7 protein ở
vỏ và 4 protein ở lõi bộ gen.
Hệ vector này chuyển gen tốt nhưng không bền, do vậy tần số biểu hiện gen
thấp. Ở những Ad thuộc thế hệ đầu tiên mang gen chuyển (và các gen khác của
virus), sự biểu hiện của các gen đó thường dẫn tới phản ứng gây độc tế bào T
cytotoxic-T-lymphocyte (CTL), phản ứng này trực tiếp bất hoạt gen chuyển.
Ad cho hiệu quả chuyển gen đặc biệt trong gan hoặc vùng đệm địa phương,
một số protein bề mặt... Ad có thể gây phản ứng viêm và đáp ứng miễn dich
mạnh.
Adenovirus vector thích hợp cho vận chuyển gen do:
- Tính an toàn và sản xuất vector khá dễ.
- Khả năng nhiễm các tế bào động vật đang phân chia hoặc không phân chia
và cảm ứng mạnh sự biểu hiện gen ngoại lai.
- Nguy cơ gắn với genome vật chủ tối thiểu.
- Khả năng tạo titers lớn trong nuôi cấy mô.
- Có sẵn những dòng tế bào được phép sử dụng để nhân virus và kỹ thuật để
tinh sạch qui mô lớn.
- Đặc tính vốn có của virus như một chất bổ trợ bằng cách hoạt hóa miễn
dịch bẩm sinh.
- Tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cao để phản ứng lại
vector được đưa vào qua đường màng nhày hoặc toàn thân.
5.3.3.2. Phân loại
151
Các vector adenovirus thế hệ thứ nhất được tạo ra bằng cách thay thế trình
tự 3kb của gen E1 bằng một promoter và một gen liệu pháp. Các gen trong vùng
E1 cần cho sự hoạt hóa promoter của virus và sự biểu hiện các gen sớm và
muộn. . Loại bỏ vùng E1 tạo ra virus không có khả năng tái tạo. Ngoài ra, vùng
E1 mã hóa cho chức năng gây ung thư của virus. Có thể loại vùng E1 bởi có
những dòng tế bào cung cấp chức năng này in trans, điển hình là dòng tế bào
293 (dòng tế bào thận phôi thai của người) được biến nạp vùng E1 adenovirus.
Loại bỏ vùng E1 có thể gắn gen ngoại lai khoảng 5,1kb vào vector. Các gen E3
không cần thiết cho sinh trưởng của virus in vitro, vì vậy rất nhiều vector thế hệ
thứ nhất cũng bị loại vùng E3, và khi loại bỏ vùng này cùng vùng E1, cho phép
gắn gen ngoại lai tới 8,2 kb. Mặc dù vector này biểu hiện ở mức cao trong các cơ
quan khác nhau nhưng chỉ trong một thời gian ngắn. Biểu hiện ngắn là kết quả
sự đáp ứng miễn dịch của các tế bào mục tiêu với các protein virus.
Thế hệ các vector adenoviruses au này được thiết kế bằng cách bỏ các gen
E1, E2, E3 và E4. Điều này làm giảm đi sự biểu hiện của các gen muộn, do vậy
giảm đáp ứng miễn dịch. Một thuận lợi khác là tăng thêm không gian cho các
gen liệu pháp chèn vào. Các vector đã hủy bỏ các gen E2 và E4 cần các dòng tế
bào thể hiện tốt gen E2 và E4 cùng với E1. Các vector hủy bỏ vùng E3 có thể
được sản xuất bởi dòng tế bào 293 vì cùng E3 không mã hóa bất kì gen nào cần
thiết cho sự sao chép in vitro. Vùng E3 giúp virus tránh được sự đáp ứng miễn
dịch của tế bào chủ bằng cách khóa MHC I trình diện kháng nguyên virus. Do
vậy, hủy bỏ vùng E3 sẽ tăng cường sự trình diện kháng nguyên và sự đáp ứng
miễn dịch của tế bào chủ. Sản phẩm của gen E2 là một protein gắn DNA mạch
đơn, cần cho sự sao chép DNA và thể hiện gen.
152
Việc hủy bỏ gen E4 làm giảm sự ổn định DNA adenoviruse in vivo và mất
khả năng biểu hiện promoter CMV ở gan. Sử dụng động vật gặm nhấm làm mô
hình cho thấy, loại bỏ một phần hoặc toàn bộ proteins E4 ảnh hưởng đến mức độ
và thời gian biểu hiện của gen ngoại lai, nhưng sự điều khiển này phụ thuộc vào
mô và promotor đặc hiệu. Ad vector có thể được sử dụng trong liệu pháp gen,
biểu hiện protein tái tổ hợp với mục đích chủng ngừa, hoặc đơn giản là truyền
tính trạng (transducing) cho các dòng tế bào không truyền nhiễm được bằng các
phương pháp khác.
Hình 5.11. Sơ lược các Ad vector tái tổ hợp
A) Genome của Ad vector thế hệ thứ nhất: Vector này không có vùng mã
hóa E1 hoặc loại bỏ cả E1 và E3.
B) Genome của Ad vector thế hệ sau này: Các vector này bị loại bỏ một số
vùng mã hóa, ví dụ, E1, E3 và cả E2 (thanh trên cùng) hoặc E4 (thanh giữa) hoặc
chỉ E1 và E4 (thanh dưới).
153
C) Genome Ad vector công suất lớn: Tất cả các trình tự mã hóa của virus bị
loại bỏ, chỉ còn lại các trình tự đầu cuối đảo lặp lại (ITRs) và tín hiệu gói (ψ)
được giữ lại.
Ad vector phụ thuộc (helper-dependent Ad vector hoặc high capacity Ad

vector): trong Ad vector này, tất cả các trình tự mã hóa cho protein virus được
loại bỏ, chỉ để lại các trình tự đảo nhắc lại đầu cuối (viral inverted terminal
repeats) và tín hiệu gói (pakaging signal ψ), tổng khoảng 500 bp (hình 2.7C).
Loại bỏ các gen của virus giảm mạnh đáp ứng độc tế bào của vật chủ, kéo dài sự
biểu hiện transgen (đến 2,5 năm ở chuột và hơn 1 năm ở khỉ đầu chó). Trong quá
trình sản xuất HD-Ad có 2 hạn chế chính ngăn cản sự tiến bộ của quá trình là:
(1) khó sản xuất vector, đặc biệt với lượng lớn; (2) sự nhiễm virus helper. Rất
khó để tách HD-Ad khỏi helper virus có cùng kích thước.
Oncolytic vector: các chiến lược sửa chữa gen đòi hỏi vector chuyển gen
phải đến được mô đích và các tế bào chuyển đổi (transduce) tồn tại. Ad vector có
mục đích giết các mô đích chọn lọc gọi là oncolytic hoặc adenovirus sao chép có
điều kiện (conditionally replicating adenoviruses-CRAds) đã được sản xuất để
điều trị ung thư. Các tế bào ác tính thường có những đột biến trong các gen ức
chế khối u, những gen cần thiết để điều chỉnh tiến triển của chu trình tế bào như
gen p53 và Rb1. Sự sao chép chọn lọc của oncolytic Ad nằm ở chỗ chúng có khả
năng sao chép chỉ ở trong các tế bào có các điểm kiểm soát chu trình tế bào bị
phá vỡ. Vector này đã được thử nghiệm trên mô hình động vật và lâm sàng
vàcho thấy triển vọng tiêu diệt các mô ác tính của chúng.
5.3.3.3. Nguyên lý thiết kế vector adenovirus
Vector adenovirus là vector liệu pháp gen từ các adenovirus tái tổ hợp. Để
tạo vector adenovirus đầu tiên cần tạo các adenovirus tái tổ hợp có khả năng
154
xâm nhiễm và chuyển gen liệu pháp vào tế bào vật chủ, nhưng mất khả năng tái
bản trong tế bào vật chủ. Để thiết kế vector adenovirus cần loại bỏ gen E1 của
adenovirus, thay thế bẳng phức hợp promoter – gen liệu pháp và các gen cần
thiết điều khiển quá trình biểu hiện của gen liệu pháp trong tế bào chủ. Gen E3
của adenovirus cũng đươc loại bỏ. Bộ gen adenovirus sau khi đã loại bỏ các
đoạn gen E1, E3 được đưa vào tế bào đóng gói (packaging cell) đồng thời với
gen liệu pháp.
Hình 5.12. Sơ đồ quá trình hình thành vector adenovirus
Trong tế bào đóng gói, quá trình tái tổ hợp ở những điểm tương đồng tạo
nên bộ gen adenovirus tái tổ hợp chứa gen liệu pháp và thiếu mất gen E1. Sản
phẩm của gen E1 được cung cấp bởi tế bào chủ sẽ phát động sự sản sinh ra
những thành phần của virus, những thành phần này sẽ được gộp lại và giải phóng
sau khi làm tan tế bào chủ. Các hạt virus được tạo ra luôn mang gen liệu pháp,
nhưng không mang trình tự E1, nên không thể tự sao chép.
Hình 5.13. Vector adenoviruse
155
Adenovirus tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen liệu pháp nhưng mất khả
năng tái bản DNA gọi là vector adenovirus. Sự tái tổ hợp giữa gen E1 tế bào chủ
và DNA adenoviruse tái tổ hợp để tạo thành các virus có khả năng sao chép rất
hiếm xảy ra. Trong tế bào mục tiêu, DNA tái tổ hợp không sát nhập vào bộ gen
của tế bào chủ nên không bền. Vì vậy, liệu pháp dựa trên adenoviruse cần phải
bổ sung các adenoviruse tái tổ hợp vào cơ thể một cách định kì.
Trong liêu pháp gen có 2 loại vector adenovirus là FG (first generation) và

HD (helper dependent) được sử dụng nhiều nhất. Vector FG (vector thế hệ thứ
nhất) kích thước khoảng 8,3kb, trong đó các vùng gen quan trọng của E1 và E3
được thay thế bằng gen liệu pháp và các gen cần thiết khác. Vector HD (vector
phụ thuộc và helper) bị cắt bỏ phần lớn gen của adenovirus, do vậy có thể cho
phép cài gắn các gen liệu pháp có kích thước lớn hơn. Đặc điểm quan trọng của
vector HD là ít gây đáp ứng miễn dịch và chỉ có thể tái bản trong các tế bào bị
virus helper xâm nhiễm.
5.3.3.4. Cơ chế hoạt động
Adenovirus là một loại virus xâm nhiễm cả tế bào không phân chia và các tế
bào đang phân chia. Vector adenovirus có thể mang các gen liệu pháp kích thước
lớn từ 8 kb đến 30 kb, không gây đột biến gen của các tế bào đich.
Vector adenovirus có khả năng xâm nhiễm và chuyển gen in vivo vào phổi,
gan, cơ, mạch máu, màng hoạt dịch, mắt, màng bụng, não, khối u ở động vật.
Khi xâm nhiễm vào trong tế bào chủ, phần lõi mang bộ gen virus và gen liệu
pháp chui qua lỗ màng nhân. Bộ gen của adenovirus, cũng như các gen của
vector adenovirus không có khả năng gắn với bộ gen của tế bào. Trong nhân của
tế bào chủ các gen của adenovirus thực hiện quá trình phiên mã, quá trình dịch
156
mã trong tế bào chất của tế bào chủ tạo nên protein liệu pháp và các loại protein
cần thiết cho virus.
Hình 5.14. Cơ chế hoạt động của vector adenovirus
Giới hạn chính khi sử dụng vector adenoviruse là thời gian biểu hiện của
gen chuyển ngắn (ít hơn một tháng), do sự đáp ứng miễn dịch đối với các thành
phần protein còn lại của virus. Sự đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh chóng loại bỏ các
tế bào nhận gen chuyển, thậm chí có thể gây viêm hay rối loạn chức năng của cơ
quan tại vị trí nhận gen. Một chiến lược nhằm kéo dài sự biểu hiện của gen
chuyển là ức chế sự đáp ứng miễn dịch đối với các vector adenoviruse. Các mô
hình chuột suy giảm miễn dịch cho thấy sự biểu hiện của các gen chuyển được
kéo dài hơn và chuyển gen thứ cấp có thể được thực hiện.
157
Hiện nay có thể sử dụng một loại vector adenovirus có khả năng tái bản
DNA, vector này được sử dụng trong liệu pháp gen chữa bệnh ung thư. Khi thiết
kế các vector adenovirus này, chỉ cần thêm vài gen liệu pháp mã hóa các protein
đặc hiệu có thể tiêu diệt các tế bào u một cách chọn lọc, đồng thời gây bất hoạt
các gen độc và gen có hại của adenovirus. Protein liệu pháp tạo ra trong tế bào
đích làm ngừng quá trình phát triển của khối u, hoặc tiêu diệt khối u.
Hình 5.15. Sử dụng vector adenoviruse trong liệu pháp gen
 Có 3 rủi ro tiềm ẩn khi sử dụng các Vector adenoviruse:
(1) Sốt và gây rối loạn chức năng cơ quan do sự đáp ứng miễn dịch với các
tế bào bị biến nạp gen. Khi làm suy giảm đáp ứng miễn dịch hay làm các Vector
adenovirus thích ứng được hệ miễn dịch sẽ giảm được sốt.
(2) Sự phát triển của cơ chế dung nạp các vector adenovirus có thể gây nên
các bệnh bạo phát, khi nhiễm virus hoang dại có cùng serotipe.
158
(3) Sự phát triển của những kiểu virus hoang dại in vivo, có khả năng sao
chép, gây bệnh. Cần lưu ý, vector virus thế hệ đầu có thể gây độc nếu dùng liều
cao
Liệu pháp gen chữa ung thư: Ad vector được sử dụng rộng rãi trong thay
thế đột biến và các phương pháp hóa trị liệu phân tử, mục đích là diệt trừ tế bào
bị chuyển đổi (transduced). Ad vector chuyển các gen khác nhau để chữa ung
thư như gen ức chế khối u p53, p16, antisense DNA, ribozyme và các kháng thể
đơn chuỗi, gen tự chết herpes simplex virus thymidine kinase và
cytosinedeaminase. Sản phẩm liệu pháp gen thương mại đầu tiên dựa trên
adenovirus serotype 5 của người được thiết kế để biểu hiện gen p53. Sản phẩm
này của Gendicine (Trung Quốc) được phê chuẩn bởi State Food and Drug
Administration of China để chữa bệnh ung thư tế bào vảy cổ và đầu (head and
neck squamous cell carcinoma) và đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn
cuối cho các loại u ác tính khác.
Liệu pháp gen cho các bệnh di truyền: Đã sử dụng adenovirus được thiết kế
đặc biệt (sử dụng cationic lipids và calcium phosphate co-precipitates, chimeric
adenovirus vector, giữ gen E4 trong vector) để chữa các bệnh như xơ nang
(cystic fibrosis), các bệnh về phổi. Ngoài ra, adenovirus cũng được sử dụng
trong loạn dưỡng cơ.
Liệu pháp hỗ trợ: Adenoviruses với khả năng nhiễm tế bào sau phân bào có
tơ (postmitotic) đồng thời với hiệu quả truyền tính trạng cao và khả năng gây
bệnh thấp tại điểm tiêm chủng của hệ thần kinh trung ương, sẽ là những vector
hiệu quả cho liệu pháp gen thần kinh. Có 2 chiến lược chính đã được kiểm tra để
chuyển gen: tiêm vector trực tiếp vào não hoặc sử dụng liệu pháp gen ex vivo,
159
nơi tế bào có thể thay đổi bằng cách nhiễm vector in vitro và sau đó được cấy
vào vùng tương ứng của não. Đối với các bệnh của tuổi già như Parkinson's,
Huntington's, đây sẽ là một phương pháp chữa bệnh hiệu quả. Adenovirus vector
rất hiệu quả trong việc làm sáng tỏ vai trò của cytokines và các bước của chúng
trong quá trình tiến triển của bệnh khớp. Trên mô hình chuột, đã sử dụng
adenovirus vector mang thụ thể TNFa và cytokine IL-1, cho thấy tác dụng hỗ trợ
trực tiếp và gián tiếp để chữa bệnh khớp.
5.3.4. Hệ thống vector virus kết hợp với Adeno
5.3.4.1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền
Adeno - Associated Virus (AAV) là loại virus có kích thước nhỏ thuộc
nhóm parvovirus không gây bệnh cho người. Khả năng sao chép của AAV phụ
thuộc vào một loại virus khác gọi là virus giúp đỡ (helper virus) ví dụ như
adenoviruse. Khi không có mặt của một loại virus trợ giúp khác, AAV có thể
xâm nhiễm các tế bào không phân chia, gắn bộ gen của AAV vào tế bào người ở
vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 19 tạo nên tiền virus (provirus). Provirus tồn
tại cùng bộ gen người một thời gian dài trong tế bào, khi gặp một điều kiện nào
đó AAV tách khỏi bộ gen người, thực hiện các quá trình phiên mã tái bản tạo
nên vô số hạt virion AAV trong tế bào, chuẩn bị chu trình xâm nhiễm tế bào
khác.
Bộ gen của AAV là DNA sợi đơn, được bao bọc trong lớp vỏ capsid. Bộ
gen AAV có kích thước khoảng 4,5 - 4,7Kb, hai đầu là các trình tự tận cùng đảo
ngược ITR gồm 145bp. Bộ gen AAV gồm 2 nhóm gen chính là gen rep và gen
cap, phần cuối bộ gen là trình tự poly Adenin – poly A. Gen cap mã hóa cho 3
chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử 85 kDa (VP1), 72kDa (VP2) và 61 kDa
(VP3) trong cấu trúc vỏ capsid của AAV. Gen rep mã hóa cho 4 chuỗi
160
polypeptide có khối lượng phân tử 78, 68, 52, và 40 kDa. Những protein này có
vai trò điều hòa sự sao chép và sát nhập vào bộ gen tế bào chủ.
Hình 5.16. A – Sơ đồ cấu trúc bộ gen của Adeno - Associated Virus.
B – Sơ đồ cấu trúc vector AAV.
5.3.4.2. Nguyên lý thiết kế
Khi thiết kế các vector AAV phải loại bỏ các gen rep, gen cap của AAV
đồng thời thay thế vào vị trí đó là gen liệu pháp và promoter thích hợp. Việc loại
bỏ cả hai gen rep và cap sẽ làm giảm đáp ứng miễn dịch của cơ thể với vector.
Thiết kế vector AAV cần lưu ý chỉ sử dụng các gen liệu pháp có kích thước nhỏ,
kích thước gen liệu pháp quá lớn làm mất khả năng hoạt động của vector. Bộ gen
của AAV có kích thước nhỏ, chỉ thích hợp với các gen liệu pháp kích thước dưới
4 kb, khi gen liệu pháp kích thước lớn hơn 5 kb gây mất tác dụng của vector.
161
Quá trình thiết kế vector AAV cần sự có mặt của virus trợ giúp (helper virus),
thường sử dụng là các adenovial helper giúp quá trình tái tổ hợp đồng thời với
gen liệu pháp, gọi là sự đồng chuyển nhễm (contransfection). Hiện nay thiết kế
vector AAV người ta sử dụng đồng thời ba thành phần chủ yếu gồm: vector
plasmid mang gen liệu pháp và các đoạn IRT, virus Adeno - associated virus
(AAV) và virus trợ giúp là adenoviral helper.
Hình 5.17. Sơ đồ quá trình thiết kế vector AAV
Quá trình chuyển nhiễm đồng thời làm cho quá trình tái tổ hợp giứa plasmid
mang gen liệu pháp, AAV và adennoviral helper, tạo nên vector mang AAV
mang gen liệu pháp và các dạng adenovirus lai. Bằng kỹ thuật xử lý nhiệt để gây
bất hoạt các adenovirus lai (do vector AAV bền nhiệt hơn), sau đó sử dụng kỹ
thuật siêu ly tâm phân đoạn, có thể tách được các vector AAV mang gen liệu
pháp cần thiết.
162
Hình
Vector AAV được đánh giá là loại vector liệu pháp gen 5.18. Quy
có những đặc điểm
trình tạo vector
tốt, phù hợp với yêu cầu sử dụng: AAV tái tổ hợp
- Đặc điểm quan trọng nhất là vector AAV có hiệu quả rất cao, không gây
bệnh cho người, mặt khác protein virus không được biểu hiện do đó không gây
đáp ứng miễn dịch trong tế bào hoặc gây hiệu ứng viêm trên cơ thể.
- Virus AAV kiểu dại và vector AAV chỉ có thể tái bản khi có mặt các virus
trợ giúp (helper virus) nên không gây lan rộng.
- Vector AAV chỉ có khả năng gắn, chèn các gen ở một số vị trí rất hạn chế,
nên giảm khả năng gắn sai vị trí của vector, hoặc giảm hiệu quả đột biến gây ung
thư như các loại vector khác.
- Các vector nhóm này cũng có thể chuyển gen hiệu quả lúc tế bào đang
nghỉ hoặc đang phân chia.
Tuy nhiên vector AAV còn nhiều hạn chế, do vậy cần khắc phục để nâng
cao hiệu quả của biện pháp:
- Do kích thước của vector AAV nhỏ nên chỉ có thể cho cài gắn và chuyển
những gen liệu pháp có kích thước nhỏ, sau khi cài gen liệu pháp thường gây ức
chế tái bản DNA của vector AAV, làm hạn chế hiệu quả sử dụng của vector
AAV.
- Trong quá trình tạo vector AAV, sự tái tổ hợp tạo ra những vector AAV
mang một vài gen của virus trợ giúp, có thể gây các đáp ứng miễn dịch không
mong muốn, do vậy kỹ thuật tạo vector AAV cần hết sức nghiêm ngặt.
- Việc sản xuất số lượng lớn các vector AAV để ứng dụng lâm sàng vẫn còn
nhiều khó khăn. Chuẩn bị một lượng lớn các plasmid chứa ITR không dễ dàng
bởi trình tự panlindrom đã bị hủy bỏ. Độc tố của protein rep làm hạn chế khả
163
năng tạo ra những dòng tế bào đóng gói ổn định, dùng để khuếch đại các vector.
5.3.4.3. Cơ chế hoạt động
Khi vector AAV tiếp cận tế bào ở các thụ thể đặc trưng (receptor), toàn bộ
các gen qua lỗ màng nhân vào trong nhân tế bào. Trong nhân tế bào chủ, một số
gen mã hóa các protein enzym (protein sớm) được phiên mã và dịch mã, giúp
cho quá trình tái bản DNA và gắn DNA vào vị trí đặc hiệu trên bộ gen của tế bào
chủ, gen liệu pháp trong vector cũng được nhân lên, phiên mã và dịch mã tạo nên
các protein liệu pháp, giống như các viral vector khác.
Vector AAV được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư, bệnh xơ nang (Cytic
fibrosis), bệnh nghẽn mạch vành tim và nhiều loại bệnh khác có hiệu quả. Vector
AAV còn có nhiều ưu điểm được coi là loại vector triển vọng trong liệu pháp
gen.
5.3.5. Hệ thống vector virus simplex herpes
5.3.5.1. Đặc điểm cấu tạo và và di truyền của virus simplex herpes
Virus simplex herpes (Herpes Simplex Viruse – HSV) là một nhóm virus
lớn, có bộ gen là DNA mạch kép, gây nhiều loại bệnh ở người và động vật. Đặc
biệt trong đó, virus simplex herpes-1 (HSV1) có thể nhiễm và tồn tại rất lâu
trong tế bào thần kinh không phân chia, đồng thời chúng có khả năng sinh sản
trong nhân.
HSV được cấu trúc cơ bản từ bốn thành phần: vỏ bọc, teguenzymt, capsid
và nhân. Đường kính virus khoảng 150 nm, trung tâm là nhân đậm đặc chứa
DNA mạch đôi, một capsid bao bọc bên ngoài có cấu trúc 20 mặt, bao gồm 162
tiểu phần. Bên ngoài capsid là một lơp vỏ định hình có tên là teguenzymt, cấu
164
trúc sợi đặc trưng cho HSV. Bên ngoài teguenzymt có một lớp vỏ nữa với bề mặt
có nhiều tua nhỏ.
Bộ gen của HSV chứa nhiều vùng dài và vùng ngắn duy nhất gọi là các
vùng UL (long unique region) và US (short unique region), mỗi bên được bao bởi
các trình tự lật ngược. Sự phiên mã các gen sớm nhờ nhân tố phiên mã VP16
hiện diện trong virion. HSV chứa 3 điểm khởi sự sao chép (Ori). Một Ori nằm
giữa vùng UL gọi là OriL, Ori thứ hai nằm trong vùng lật ngược U S gọi là OriS.
Ori thứ ba nằm trong mạch kép cuộn tròn cần cho sự sao chép. DNA virus được
đóng gói thông qua trình tự đóng gói nằm trong vùng gen cuối của bộ gen.
Hình 5.19. Cấu trúc virus simplex herpes
5.3.5.2. Nguyên lý thiết kế vector HSV
Phần lớn hệ thống chuyển gen nhờ HSV đều dựa vào các virus giúp đỡ để
cung cấp các protein cần cho sự sao mã và gắn kết các bộ phận của virus. Bộ gen
của virus giúp đỡ được biến đổi để không đóng gói được. Vì vậy các hạt virus
165
hoang dại không được tạo thành. Để sản xuất các vector, một amplicon plasmid
được biến nạp vào trong tế bào chủ đã nhiễm helper HSV. Amplicon plasmid là
vector có cấu trúc bao gồm các thành phần nguyên thủy của HSV như: trình tự
khởi sự sao chép và dấu hiệu đóng gói được kết hợp chặt chẽ vào trong plasmid
của E.coli. HSV có bộ mã sao chép tương tự như ở phage lamda và trong suốt
quá trình sao chép DNA, mạch vòng ở trong làm khuôn, sự sinh tổng hợp DNA
bắt đầu từ đầu 3’OH. Quá trình sao chép tạo ra DNA mạch đôi thẳng, phân tử
này gồm nhiểu bản sao của amplicon. Bởi mỗi amplicon có chiều dài khoảng 15
kb, một bộ gồm nhiều bản sao nối tiếp nhau sẽ bằng kích thước bộ gen HSV, sau
đó được đóng gói trong vỏ capsid của HSV.
Hình 5.20. Hệ thống vector HSV
166
Một cách khác dùng để tạo ra HSV tái tổ hợp là đồng nhiễm vào tế bào chủ
virus hoang dại HSV và plasmid mang gen liệu pháp. Sau quá trình sao chép của
DNA plasmid và DNA HSV hoang dại diễn ra trong nhân tế bào chủ, sự tái tổ
hợp giữa bộ gen của của HSV và trình tự tương đồng của HSV trong plasmid tạo
nên bộ gen của HSV có cấu trúc đầy đủ và chúng mang gen trị bệnh. Sự đóng
gói diễn ra với cả hai hạt virus hoang dại và virus tái tổ hợp. Sau khi làm tan tế
bào chủ, cả hai virus đều được giải phóng vào môi trường.
Các virus tái tổ hợp mang gen liệu pháp được chọn lọc qua phân tích bằng
PCR hoặc lai DNA. Vector HSV được sử dụng để chuyển gen vào não, tủy sống
và cơ, nhưng đến nay vẫn chưa sử dụng liệu pháp này trên đối tượng người.
Hình 5.21. Sự tạo thành của vector

HSV tái tổ hợp
167
5.3.5.3. Cơ chế hoạt động của vector HSV-1
Vector HSV-1 là loại vector liêu pháp gen có nhiều ưu thế, có khả năng gắn
và chuyển những gen liệu pháp kích thước tương đối lớn từ 30-50 Kb. Vector
HSV-1 xâm nhiễm tế bào chủ nhanh, thời gian tiềm ẩn dài, đồng thời không gây
hoặc ít gây đáp ứng miễn dịch không mong muốn ở tế bào chủ. Với kích thước
152kb, DNA của virus mã hóa cho hơn 75 loại protein khác nhau. Quá trình
nhiễm diễn ra khi virus bám vào bộ phận đặc biệt của tế bào chủ giúp cho capsid
sau đó lọt vào bên trong để chuyển tới nhân của tế bào. Các thành phần của virus
sẽ tương tác ức chế các quá trình sinh tổng hợp của tế bào chủ.
Hình 5.22. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của HSV
 Có 2 rủi ro chính khi sử dụng các vector HSV-1:
(1) Độc tố của những virus nhược độc
(2) Sự phát triển của các virus hoang dại. Sử dụng liều cao các vector
HSV-1 hủy bỏ một gen sẽ có nguy cơ gây bệnh tế bào. Các vector HSV-1 hủy bỏ
168
bốn gen cho thấy sẽ ít độc hơn. Sự phát triển virus hoang dại sẽ gây nhiều bệnh
nguy hiểm chẳng hạn như viêm não, tủy sống...
5.3.6. Những vector virus khác
Một số virus khác cũng được sử dụng như các phương tiện cho việc chuyển
gen. Baculoviruse là virus có nhân DNA vòng mạch kép từ 80kb- 230kb, sao
chép trong tế bào côn trùng in vitro và in vivo, hiện đang được sử dụng nhiều
làm vector trong chuyển gen liệu pháp. Hoặc virus đậu mùa có DNA mạch kép
dài 191kb, chúng có hơn 198 ORF và có thể được chèn vào bộ gen tế bào qua sự
tái tổ hợp tương đồng. Tuy nhiên đây là các virus độc, trong thao tác cần hết sức
thận trọng
5.4. Vector không phải virus dùng trong liệu pháp gen
Những vector không có bản chất virus bao gồm tất cả phương tiện mang
những phân tử nucleic acid không liên quan đến việc tạo ra những tiểu phần
virus. Chúng được chia thành 2 dạng cơ bản dựa vào thành phần phân tử:
(1) Các phân tử DNA và RNA tại chỗ được khuếch đại trong tế bào vi
khuẩn hay các tế bào eukaryote khác.
(2) Những oligodeoxyribonucleic hay những phân tử tương tự khác được

tổng hợp in vitro bằng phương pháp nhân tạo.
5.4.1. DNA và RNA được khuếch đại trong vi khuẩn và tế bào eukaryote
Các phân tử DNA hay RNA mục tiêu được dòng hóa trong các plasmid, hay
các NST nhân tạo, tại đây chúng được khuếch đại trong các tế bào vi khuẩn hay
tế bào eukaryote. Sau đó, một lượng lớn plasmid hay NST nhân tạo được thu
nhận, gọi chung là các DNA trần (naked DNA) mang gen liệu pháp. Các DNA
trần này sẽ được biến nạp vào trong tế vào mục tiêu (in vitro hay in vivo) bằng
169
nhiều các thức khác nhau.
5.4.1.1. Các vector
Một số điểm cần phải lưu ý đối với các vector không virus, được khuếch đại
trong các tế bào prokaryote hay eukaryote:
(1) Kích thước đoạn gen chèn.
(2) Cách chuyển các vật liệu di truyền vào trong tế bào đích hiệu quả.
(3) Duy trì vật liệu di truyền trong tế bào để có thể biểu hiện trong thời
gian dài.
Để có thể khuếch đại được đoạn gen mong muốn, kích thước đoạn gen mục
tiêu thường phụ thuộc các tế bào chủ khác nhau. Vi khuẩn thường khuếch đại
các plasmid, bacteriphage, cosmid và NST nhân tạo của vi khuẩn (BAC).
Plasmid là phân tử DNA dạng vòng tròn có nguồn gốc từ vi khuẩn, chúng chứa
trình tự cần thiết cho sao chép gọi là trình tự ORI (origin of replication). Các
plasmid có thể nhận một trình tự dài chừng 15kb của các gen ngoại sịnh.
Bacteriophage là phân tử DNA của virus dạng mạnh kép thẳng, có thể nhận
được đoạn gen ngoại sinh dài 20kb.
Cosmid là phân tử plasmid được biến đổi mang trình tự cần thiết cho sự
đóng gói DNA vào trong tiểu phần bacteriophage, chúng có thể nhận đoạn gen
ngoại sinh dài đến 45kb.
BAC chứa các nhân tố của một NST bình thường và có khả năng sao chép
độc lập, chúng mang được những đoạn gen chèn ngoại lai đến 100kb.
NST nhân tạo của nấm men (YAC) chứa telomere, vùng cần thiết cho sự
sao chép và những trình tự quan trọng khác có khả năng điều hòa các hoạt động
170
độc lập của gen trong tế bào nấm men. YAC có thể mang một trình tự gen ngoại
lai dài đến 1000kb (1Mb). Tuy nhiên, YAC không khuếch đại trong tế bào động
vật có vú. Gần đây, một số công trình báo cáo đã tiến hành sản xuất thành công
các NST nhân tạo nhỏ của người (human artificial minichromosome).
Trên cơ sở lí thuyết, NST nhân tạo người có thể là một vector mang gen
chữa bệnh rất tốt. Chúng có khả năng mang một được một đoạn DNA kích thước
lớn, điều này cho phép đưa một loạt các nhân tố điều hòa ổn định, nhằm biểu
hiện của một hoặc nhiều gen chữa bệnh vào trong tế bào của người.
Có ba yếu tố cần thiết trong một NST nhân tạo là hai telomere, một
centromere và một vị trí khởi đầu sao chép phải được cấu trúc đầy đủ và có khả
năng hoạt động mạnh. Cấu trúc phân tử của telomere NST người đã được biết
tương đối rõ, trái lại, có rất ít các thông tin về centromere và vị trí khởi đầu sao
chép. Việc thiếu các hiểu biết sơ khai về một trong những nhân tố chức năng của
NST sẽ rất khó khăn trong việc tạo ra một NST nhân tạo người có hoạt tính
mong muốn.
NST nhân tạo người ở dạng thẳng và ổn định. Các “microchomosom” đã

được tạo thành và duy trì sau khi nhiễm tế bào trong môi trường nuôi cấy với:
(1) một trình tự DNA tổng hợp lặp đi lặp lại dài khoảng một Mb, trình tự này
xuất hiện ở vùng centromere của NST Y của người, (2) mảnh của DNA bộ gen
người có khối lượng phân tử, (3) cuối cùng, đó là những trình tự DNA telomere
của người.
Một gen kháng neomycin đã được gắn với centromere trước khi cho nhiễm
vào tế bào để hợp chất G418 có thể được dùng như tác nhân chọn lọc.
171
Ngày nay, liệu pháp gen sử dụng chủ yếu các plasmid DNA để chuyển gen,
bởi chúng dễ dàng khuếch đại thành nhiều bản sao trong vi khuẩn cũng như dễ
dàng chuyển vào tế bào mục tiêu do kích thước nhỏ.
5.4.1.2. Biến nạp các vector vào tế bào
Việc biến nạp các phân tử DNA plasmid vào trong tế bào rất khó đạt hiệu
quả cao, tuy nhiên các vector không virus này vẫn có thể được chuyển vào tế bào
theo các cách in vivo và ex vivo. Đối với phương thức ex vivo, các gen được
chuyển vào tế bào bằng cách sử dụng calciphosphat, điện biến nạp, các lipid tích
điện dương hay các liposome. Với hầu hết các tế bào, hiệu quả nhận gen chuyển
chỉ đạt khoảng 5 – 10%. Các tế bào chuyển nhiễm thành công sẽ được chọn lọc
sau đó dựa trên các marker chuyên biệt, thường chúng nằm trên đoạn DNA
chuyển. Các đoạn DNA có kích thước lớn sẽ kém hiệu quả hơn so với những
đoạn DNA nhỏ hơn trong chuyển gen.
Việc chuyển gen in vivo thường kém hiệu quả hơn việc chuyển gen ex invo.
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng liposome, các lipid tích điện âm hay dương để tăng
cường vận chuyển DNA vào trong tế bào. Các thử nghiệm khác tạo ra phức hợp
phân tử DNA và một tiểu phần virus đã bị bất hoạt, nhằm lợi dụng các protein
dung nạp màng. Chẳng hạn, kết hợp giữa DNA với virus Sendai
(Hemagglutinating viruse – HJV) bị bất hoạt bởi nhiệt. Các adenoviruse bất hoạt
cũng có tiềm năng đưa DNA vào trong tế bào. Một tiến bộ khác trong lĩnh vực
này là kỹ thuật bọc các hạt vàng hay các tiểu phần nhỏ bởi các tiểu phần nhỏ
khác bởi DNA và bắn vào tế bào, gọi là bắn gen hay bắn DNA.
 Một số cách biến nạp:
(1) Để thu nhận chọn lọc các DNA nhằm đưa chúng vào tế bào, mô hay cơ
quan chuyên biệt, phân tử DNA phải được gắn với một phân tử X chuyên biệt có
172
khả năng kết hợp với các receptor nào đó, chẳng hạn receptor asialoglycoprotein.
Trước hết, cần kết hợp thành công DNA vào trong phức hợp với phân tử poly-L-
Lysine, sau đó phức hợp này sẽ được gắn với asialoglycoprotein. Phương pháp
liên hợp DNA và phân tử được phát triển để chuyển các phân tử DNA lớn
(>10kb) bằng con đường vận chuyển nhập bào, nhờ đó tránh được sự thủy phân
DNA bởi hệ thống lysosome.
Trong phương pháp này, poly-L-lysine sẽ liên kết hóa học với một phân tử
X, chính là phân tử X này sẽ gắn vào receptor đặc biệt của tế bào. Tiếp theo,
DNA thêm vào và nối với poly-L-Lysine, dẫn đến hình thành vòng xoắn với
những vị trí gắn nhận diện của receptor. Mặc dù phức hợp DNA-phân tử có tính
đặc hiệu cao nhưng hiệu quả biến nạp lại không cao.
Hình 5.23. Hệ thống chuyển gen DNA và phân tử liên hợp
173
(a) Poly-L-Lysine (gắn với receptor trên bề mặt tế bào) sẽ kết hợp với phân
tử DNA mang sẵn gen trị liệu, hình thành nên một vòng xoắn DNA-poly-L-
Lysine với các receptor hướng ra bên ngoài;
(b) DNA và phân tử liên hợp được gắn với receptor của một tế bào chuyên
biệt (1) và được khảm vào trong tế bào hình thành nên một endosome nhằm bảo
vệ DNA và phân tử liên hợp khỏi sự thủy phân bởi enzyme lysosome (2); Một số
DNA bên trong endosome sẽ được giải phóng và chúng đi vào trong nhân tế bào
(3) nơi đây gen trị liệu được biểu hiện.
(2) Bắn DNA vào trong tế bào mục tiêu là phương pháp được phát triển đầu
tiên để chuyển gen vào tế bào thực vật và hiện nay được mở rộng ở tế bào động
vật có vú và các mô sống khác. DNA plasmid bao bọc bên ngoài các tiểu phần
bằng vàng/ hạt tungsten. Lực bắn được tạo ra bởi dòng điện có hiệu điện thế cao,
các tia lửa điện (hoặc sự phóng Helium) sẽ đẩy các hạt có mang DNA vào trong
mô. Kỹ thuật này đã thành công trong công việc chuyển gen vào da, mô cơ, gan
và các cơ quan khác. Tuy nhiên có nhiều tế bào sẽ bị hư hại với phương pháp
chuyển gen này, do đó, nó ít được sử dụng trong liệu pháp gen.
Nhìn chung, những vector chuyển gen không dựa trên virus có hai hạn chế
chính: thứ nhất tần số biến nạp thường thấp, do đó hiệu quả chữa bệnh thấp. Thứ
hai, thời gian gen liệu pháp thể hiện quá ngắn, do đó không cho hiệu quả chữa
bệnh tốt.
Lí do khiến thời gian biểu hiện của gen liệu pháp ngắn là các vector không
phải virus thường không ổn định được cấu trúc của mình trong tế bào đích.
Nhiều phương pháp được đưa ra nhằm ổn định DNA trong tế bào để kéo dài tác
động lâm sàng in vivo, chẳng hạn thay thế trình tự cần thiết cho sao chép của
virus vào trong các vector. Những plasmid chứa các trình tự này ổn định hơn các
174
plasmid tương ứng trong cả điều kiện in vitro và in vivo. NST nhân tạo được
thiết kế chứa các nhân tố ổn định trong tế bào cũng là một giải pháp khả thi. Do
vậy, nếu việc khuếch đại và chuyển gen với các vector là các NST nhân tạo được
giải quyết, thì đây sẽ là vector thích hợp hơn cả, được lựa chọn cho việc chuyển
gen liệu pháp. Hiện tại, liệu pháp gen sử dụng plasmid như vector đang được nỗ
lực nghiên cứu để thực nghiệm, trước hết nhằm chữa trị các bệnh suy thoái cơ và
ung thư.
5.4.1.3. Những rủi ro
Hai rủi ro chính khi sử dụng các vector nói trên trong liệu pháp gen:
(1) Đột biến chèn có thể gây hoạt hóa các oncogene, hay ức chế chính các
gen ức chế khối u, nếu plasmid sát nhập vào bộ gen.
(2) Các chất kích thích cho cơ chế vận chuyển DNA có thể sẽ phát sinh tác
dụng độc lên tế bào đích.
Thuận lợi lớn nhất của việc sử dụng các vector không phải virus là tránh
được việc tạo ra các virus hoang dại thông qua sự tái tổ hợp. Hơn nữa, các
plasmid sẽ không gây đột biến chèn nếu chúng không sát nhập vào bộ gen của tế
bào đích. Tuy nhiên, các plasmid có thể sát nhập vào bộ gen trong một số quy
trình, và cơ chế này thường diễn ra trong một thời gian dài, nhất là với liệu pháp
gen ex vivo. Thật vậy, khi cấy những tế bào myoblast được nhiễm DNA plasmid
và sau đó chọn lọc in vitro, người ta đã thấy sự xuất hiện của khối u trong cơ.
Rủi ro thứ hai, chẳng hạn các lipid tích điện dương sẽ gây độc tế bào in vivo và
in vitro khi sử dụng ở liều cao, do vậy, phải thận trọng khi sử dụng các chất này
trong trị liệu gen in vivo.
5.4.2. Oligonucleotide
175
Nhóm thứ hai của các vector không dựa vào virus là các oligonucleotide và
những polymer khác của nucleotide. Oligodeoxynucleotide là một phân tử DNA
dài chừng 20 – 25 nucleotide, chúng điều hòa sự biến đổi gen trong tế bào bằng
nhiều cách khác nhau. Oligodeoxynucleotide được chia thành năm loại:
- Antisense-oligonucleotide.
- Ribozyme.
- Liệu pháp triplex.
- RNA interference (RNAi).
- SMaRT (spliceosome Mediated RNA trans splicing: Sự cắt nối chéo của
các phân tử RNA thông qua Spliceosome)
Năm loại phân tử trên được xếp vào ba nhóm chính dựa vào mục tiêu của
liệu pháp gen. Nhóm một gồm các kỹ thuật antisense (Antisense oligonucleotide,
Ribozyme, RNAi), đây là những phương cách khác nhau, nhằm mục đích ngăn
cản sự biểu hiện của các gen đã bị đột biến. Nhóm hai có SMaRT-là phương
pháp sửa chữa cho chính các đột biến điểm trên gen. Nhóm ba là liệu pháp
triplex.
5.4.2.1. Khái quát kỹ thuật antisense
Kỹ thuật antisense dựa vào sự tổng hợp các trình tự nucleic acid ngắn, mạch
đơn hay dài (RNA hay dựa vào DNA) của các trình tự nucleotide đặc biệt. Kỹ
thuật này trước hết phải lựa chọn trình tự thích hợp, chẳng hạn những antisense
oligonucleotide, hay các oligo có thể gắn vào DNA (tại một vị trí gen chuyên
biệt), hay thông thường hình thành các duplex với mRNA đặc biệt. Sự tương tác
trong hầu hết các trường hợp là thông qua sự bắt cặp bổ sung của các cặp base.
Sự bắt cặp này ngăn cản sự phiên mã hay dịch mã của các gen, hoặc ngăn cản sự
176
tổng hợp các sản phẩm gen.
Antisense là những đoạn oligonucleotide dài chừng 15 - 20 nucleotide,

được sử dụng để ức chế sự biểu hiện của gen mục tiêu, bằng cách gắn chuyên
biệt trình tự mRNA (mRNA gọi là mạch sense) thông qua sự bắt cặp Watson-
Crick. Chúng được sử dụng cho các mục đích xác định hệ gen chức năng, đánh
giá vai trò gen và liệu pháp gen.
Khả năng của oligonucleotide hoạt động như một tác nhân antisense ức chế
sự nhân lên của virus trong nuôi cấy tế bào được phát hiện bởi Zamecnik và
Stephenson năm 1978. Đến nay, kỹ thuật antisense phát triển như một công cụ
mạnh cho mục đích liệu pháp. Trên lí thuyết, các phân tử antisense có thể được
sử dụng để điều trị bất kì bệnh nào gây nên do sự biểu hiện của những gen bệnh
như nhiễm virus, ung thư và những bệnh viêm.
Năm 1998, thuốc antisense đầu tiên với thương hiệu Vitravene
(Fomivirsen) ra đời, thông qua sự chấp nhận bởi Cơ quan Thực phẩm và Thuốc
của Mĩ - FDA.
Có ba chiến lược chính của kỹ thuật sử dụng anti-mRNA. Khác với các
phương pháp điều trị cổ điển, thuốc gắn vào protein làm thay đổi tính chất của
nó, các antisense hoạt động ở mức mRNA, làm biến đổi các mRNA không cho
chúng dịch mã thành các protein.
Chiến lược thứ nhất là sử dụng các antisense-oligonucleotide (AS-ON) để

bắt cặp bổ trợ với các mRNA.
Chiến lược thứ hai sử dụng ribozyme và DNA enzyme để phân hủy các
RNA mục tiêu.
Chiến lược thứ ba sử dụng các đoạn oligonucleotide kích thước nhỏ để can
thiệp (interference), ức chế sự biểu hiện gen trong tế bào động vật có vú gọi là
177
các iRNA hay siRNA (small interference RNA) (Elbashir và cs, 2001).
Hình 5.24. Một số chiến lược antisense
Hai cơ chế hoạt động chính của các antisense là hầu hết các AS-ON được
thiết kế để hoạt hóa các RNase H, cắt một mạch RNA của mạch kép DNA-RNA
và dẫn đến sự phân hủy các mRNA mục tiêu. Thứ hai là nếu những AS-ON
không cảm ứng được các RNase H, nó sẽ được sử dụng để ức chế sự dịch mã do
khóa cấu hình không gian, ngăn cản sự di chuyển của ribosome. Khi các AS-ON
gắn lên đầu 5’, bộ máy dịch mã sẽ hoàn toàn bị ngăn cản hoạt động, các gen hư
hỏng không biểu hiện được.
Những phân tử RNA dài hình thành nên cấu trúc bậc hai và cấu trúc bậc
bốn, do đó, nhiệm vụ đầu tiên để có thể thành công trong chiến lược antisense là
xác định được những vị trí mục tiêu dễ bị ảnh hưởng trên phân tử mRNA. Trung
bình, chỉ 1/8 các AS-ON là gắn hiệu quả và đặc hiệu vào các mRNA mục tiêu
(Stein, 2001).
178
Hình 5.25. Một số vị trí hoạt động chính của các antisense oligonucleotide
Những mô hình cấu trúc dựa trên phần mềm máy tính của các phân tử RNA
dài, không giống cấu trúc RNA bên trong tế bào sống và đến nay, sử dụng máy
tính vẫn bị hạn chế trong việc thiết kế cấu trúc của những AS-ON một cách
chính xác.
Khi sử dụng thư viện ON và RNase H đã cho thấy một bức tranh toàn cảnh
các vị trí mục tiêu dễ bị ảnh hưởng trên mRNA. Qua đó, dạng biến thể của chiến
179
lược này sẽ được phát triển, các AS-ON chuyên biệt mục tiêu được tạo ra bằng
cách mạch DNA khuôn. Một phương pháp khác đơn giản hơn, nhằm cung cấp
thông tin so sánh về cấu trúc của các RNA mục tiêu, là sàng lọc lượng lớn các
ON đặc hiệu với sự phiên mã khi hiện diện RNase H, qua đó ước lượng phạm vi
cắt được cảm ứng với từng ON riêng rẽ (Kurreck và cs, 2002).
Nhiều báo cáo đã thiết kế DNA array để xây dựng bản đồ RNA cho các vị
trí lai của ON. Bởi cấu trúc của mRNA trong hệ thống sinh học có thể khác với
cấu trúc của phân tử RNA được mô tả in vitro và đồng thời, các protein gắn
RNA trở thành tấm chắn cho các vị trí chuyên biệt mục tiêu trong tế bào, do đó
việc sàng lọc các ON trong dịch chiết tế bào, hay trong nuôi cấy tế bào có thể
thuận tiện hơn (Bost và cs, 2002)
Khi thiết kế ON cho các thử nghiệm antisense, một vài “hầm bẫy” (pitfall)
cần phải tránh. Nếu AS-ON chứa bốn đầu guanosine liên tiếp thì không nên sử
dụng vì chúng có thể tạo thành G-quarter, thông qua liên kết các cặp base
Hoogsteen. Sự hình thành các bộ bốn G sẽ làm giảm nồng độ của ON và có thể
gây ra những ảnh hưởng không mong muốn. Các guanosine đã được biến đổi
(như 7-deazaguanosine không hình thành các bắt cặp bas Hoogsteen) có thể
được sử dụng để cải thiện vấn đề này.
Các ON chứa các motif CpG được loại bỏ trong các thí nghiệm in vivo bởi
motif này sẽ kích thích sự đáp ứng miễn dịch trong hệ thống tế bào động vật có
vú. Bộ đôi nucleotide CG được thấy thường xuyên trong DNA vi khuẩn và virus
hơn là trong bộ gen người. Do vậy, nó được đề nghị là marker cho hệ miễn dịch
để xác định sự xâm nhiễm. Coley Pharmaceuticals đã tạo ra các ON chứa CG
như tác nhân kích thích miễn dịch để chữa bệnh ung thư, hen và các bệnh nhiễm
khác (Dove, 2002).
180
Hình 5.26. Các cơ chế hoạt động antisense
5.4.2.2. Thiết kế các antisense oligonucleotide
Việc thiết kế và lựa chọn tốt những antisense oligonucleotide thích hợp là
một bước quan trọng và cũng là thử thách chính trong việc ứng dụng thành công
kỹ thuật antisense. Biết được cấu trúc thứ cấp RNA, ái lực của antisense cũng
như thành phần hóa học của chúng là những vấn đề mấu chốt trong thiết kế và
chọn lựa antisense. Các mRNA không tồn tại ở dạng xoắn ngẫu nhiên. Mạch đơn
ở dạng cấu trúc bậc hai hay bốn, luôn giữ vai trò quan trọng trong việc quyết
định hiệu quả hoạt động của các phân tử antisense oligonucleotide (Gryaznov và
cs, 1994).
Thông thường, một đoạn vào khoảng 10-30 nucleotide trên mạch mRNA
được chọn làm mục tiêu cho các antisense. Các mảnh mRNA đã lựa chọn trước
đó cũng hình thành các cầu nối nội phân tử giữa các cặp base, giúp tạo nên các
cấu trúc bậc hai và bậc bốn. Điều nay làm cho phần lớn các mRNA không thể
tương tác với các antisense oligonucleotide. Số dạng cấu hình của chúng tăng lên
theo và phụ thuộc nhiều vào chiều dài của chuỗi. Chẳng hạn, số lượng kẹp tóc
(hairpin) tăng từ 138 đối với chuỗi gồm 10 nucleotide, nhưng chúng sẽ lên tới
181
24666 đối với chuỗi 16 nucleotide.
Sự gấp cuộn và những vòng thắt mRNA có thể được dự đoán bằng chương
trình phần mêm máy tính như mfold (Braasch và cs, 2002) mặc dù rất khó khăn.
Hơn nữa, những nhân tố trong tế bào cũng ảnh hưởng lên cấu trúc của các
mRNA. Chẳng hạn, sự kết hợp AUF1- một nhân tố gắn vào vị trí giàu A+U- với
cơ chất RNA sẽ gây cảm ứng để hình thành nên các cấu trúc của chính RNA,
điều này khiến phân tử soắn chặt lại (condense) (Wahlestedt và cs, 2000).
Spliceosome sẽ tách riêng rẽ các cấu trúc intron từ các pre-mRNA bằng cơ chế
tái thiết lập cấu trúc của phân tử RNA.
Có bốn sự tiếp cận khác nhau được phát triển gần đây được áp dụng trong
thiết kế các phân tử antisense, mặc dù việc thực hiện còn gặp nhiều lỗi. Trước
hết, kỹ thuật đi bộ trên mRNA (mRNA walking), hay giải trình bằng phương
pháp đi bộ, dựa trên việc tổng hợp nhiều trình tự khác nhau để có thể bắt cặp với
những vùng khác nhau trên trình tự dã có sẵn. Thông thường có khoảng 100
trình tự khác nhau sẽ được kiểm tra trong phương pháp tiếp cận này, và chỉ
khoảng vài trình tự cho kết quả tốt (Fluiter và cs, 2003). Thuận lợi chính của
cách tiếp cận này là có thể thu nhận được một lượng lớn các trình tự antisense
thích hợp và hiệu quả trong ứng dụng liệu pháp. Phương pháp tiếp cận nói trên
tốn kém, mất thời gian và công sức, nhưng thích hợp với mục đích sàng lọc các
thuốc antisense với quy mô lớn.
Cách tiếp cận thứ hai là sàng lọc được trợ giúp bởi máy tính. Dựa vào dự
đoán sự gấp cuộn mRNA, có thể xác định được những vị trí dễ bị ảnh hưởng của
mRNA (Lacerra và cs, 2000). Tuy việc dự đoán cấu trúc chưa thật chính xác,
nhưng phương pháp này rẻ nhanh và dễ tiến hành vì chỉ sàng lọc một số trình tự.
Cách tiếp cận này có thể tìm được những trình tự cần, mặc dù trình tự đó có thể
không hiệu quả nhất.
182
Gần đây các oligonucleotide aray và tính mẫn cảm với RNase H của chúng
trở thành tiêu trí quan trọng, để chọn lọc các phân tử antisense.
Trong cách tiếp cận scan trên oligonucleotide array, tất cả các
oligonucleotide bổ trợ với các vị trí trên mRNA được tổng hợp và lai với những
mRNA phiên mã in vitro, (Brassch và Corey, 2001). Cách này giúp tạo ra sự
tương quan tốt giữa các antisense với tế bào, nhất là ái lực gắn của antisense với
mRNA in vitro.
Cách tiếp cận cuối cùng là thiết kế antisense dựa vào các ngyên lý cắt thông
RNase H ra khỏi phân tử mRNA mục tiêu, sau khi tiến hành gắn ngẫu nhiên với
thư viện oligonucleotide. Sau đó, tiếp tục phân tích các vị trí gắn oligonucleotide
bằng điện di trên gel (Renneberg và cs, 2002). Cách thức này có thuận lợi lớn là
thư viện oligonucleotide dễ được tổng hợp và thích hợp với bất kì mRNA mục
tiêu nào.
Có bốn sự tiếp cận khác nhau được phát triển gần đây được áp dụng trong
thiết kế các phân tử antisense, mặc dù việc thực hiện còn gặp nhiều lỗi.
Trước hết kỹ thuật đi bộ trên mRNA (mRNA walking), hay giải trình bằng
phương pháp đi bộ, dựa trên việc tổng hợp nhiều trình tự khác nhau để có thể bắt
cặp với những vùng khác nhau trên trình tự dã có sẵn. Thông thường có khoảng
100 trình tự khác nhau sẽ được kiểm tra trong phương pháp tiếp cận này, và chỉ
khoảng vài trình tự cho kết quả tốt (Fluiter và cs, 2003). Thuận lợi chính của
cách tiếp cận này là có thể thu nhận được một lượng lớn các trình tự antisense
thích hợp và hiệu quả trong ứng dụng liệu pháp. Phương pháp tiếp cận nói trên
tốn kém, mất thời gian và công sức, nhưng thích hợp với mục đích sàng lọc các
thuốc antisense với quy mô lớn.
Cách tiếp cận thứ hai là sàng lọc được trợ giúp bởi máy tính. Dựa vào dự
183
đoán sự gấp cuộn mRNA, có thể xác định được những vị trí dễ bị ảnh hưởng của
mRNA (Lacerra và cs, 2000). Tuy việc dự đoán cấu trúc chưa thật chính xác,
nhưng phương pháp này rẻ nhanh và dễ tiến hành vì chỉ sàng lọc một số trình tự.
Cách tiếp cận này có thể tìm được những trình tự cần, mặc dù trình tự đó có thể
không hiệu quả nhất.
Gần đây các oligonucleotide aray và tính mẫn cảm với RNase H của chúng
trở thành tiêu trí quan trọng, để chọn lọc các phân tử antisense.
Trong cách tiếp cận scan trên oligonucleotide array, tât cả các
oligonucleotide bổ trợ với các vị trí trên mRNA được tổng hợp và lai với những
mRNA phiên mã in vitro (Brassch và Corey, 2001). Cách này giúp tạo ra sự
tương quan tốt giữa các antisense với tế bào, nhất là ái lực gắn của antisense với
mRNA in vitro.
Cách tiếp cận cuối cùng là thiết kế antisense dựa vào các ngyên lý cắt thông
RNase H ra khỏi phân tử mRNA mục tiêu, sau khi tiến hành gắn ngẫu nhiên với
thư viện oligonucleotide. Sau đó, tiếp tục phân tích các vị trí gắn oligonucleotide
bằng điện di trên gel (Renneberg và cs, 2002). Cách thức này có thuận lợi lớn là
thư viện oligonucleotide dễ được tổng hợp và thích hợp với bất kì mRNA mục
tiêu nào.
184
Hình 5.27. Thiết kế các antisense oligonucleotide
5.4.2.3. Những biến đổi của antisense oligonucleotide
Một trong những thử thách lớn trong sự tiếp cận kỹ thuật antisense, là sự ổn
định các oligonucleotide (ON) vì chúng bị phân hủy nhanh chóng trong dịch thể
sinh học bởi các nuclease. Một lượng lớn nucleotide đã biến đổi hóa học được sử
dụng trong kỹ thuật antisense.
185
Nhìn chung, có thể tiến hành theo ba phương pháp biến đổi chính, trên ba vị
trí khác nhau của một nucleotide là: các cấu trúc base không tự nhiên, phân tử
đường biến đổi (đặc biệt vị trí 2’ của ribose), hay thay đổi sườn phosphate. Một
số biến đổi khác cũng đã được đề cập và thử nghiệm nhằm làm chắc chắn sự liên
kết giữa các cặp base, từ đó tăng sự ổn định cấu hình của xoắn kép giữa
antisense và mRNA mục tiêu.
- AS-ON thế hệ thứ nhất:
Phosphorothioate (PS) oligonucleotide là thế hệ đầu tiên của DNA đã được

sử dụng trong AS-ON một cách rộng rãi. Ở thế hệ thứ nhất, một trong các
nguyên tử oxy không cầu nối trong liên kết phosphodiester được thay thế bằng
nguyên tử lưu huỳnh.
Hình 5.28. Những vị trí biến đổi hóa học của ribonucleotide
PS DNA ON đầu tiên được tổng hợp vào những năm 1960 bởi Eckstein, sau
đó được Matsukura (1987) sử dụng chúng như các AS-ON ,nhằm ức chế sự nhân
lên của virus HIV. Phosphorothioate trong ON tác dụng làm tăng tính kháng với
các nuclease. Thời gian bán phân hủy của PS DNA trong huyết thanh người
khoảng 9 - 10 giờ, trong khi đó đối với các nucleotide (không bị biến đổi) thời
gian này là 1 giờ (KUrreck và cs, 2002).
186
Hơn nữa, các PS DNA hình thành những cặp base bắt cặp theo kiểu
Watson-Crick, chúng hoạt hóa RNase H và mang điện tích âm, giúp dễ dàng vận
chuyển vào tế bào, đồng thời biểu lộ đặc tính dược học cần thiết cho cơ thể.
Hình 5.29. AS-ON thế hệ thứ nhất
Bất lợi chính của PS ON là khả năng gắn của chúng với các phân tử protein,
đặc biệt là sự tương tác với polyanion như các protein gắn heparin không được
thuận lợi. Ngyên nhân dẫn đến sự tương tác không đặc hiệu chưa rõ ràng, nhưng
nó có thể gây độc tố cho tế bào (Levin, 1999). Một nhược điểm nữa của PS ON
là sự giảm nhẹ ái lực đối với các phân tử RNA bổ trợ, so với các phân tử
oligonucleotide bình thường .
- AS-ON thế hệ thứ hai:
Những vấn đề chưa ổn ở AS-ON thế hệ thứ nhất được giải quyết ở thế hệ
thứ hai. Các AS-ON thế hệ thứ hai là những nucleotide có biến đổi ở vị trí 2’
ribose. Các 2’-O-methyl RNA và 2’-O-methoxy-ethyl RNA là thành viên quan
trọng của lớp này. AS-ON ít độc hơn PS ON, và ái lực mạnh hơn với RNA bổ
trợ (KUreck và cs, 2002).
187
Tuy nhiên, các tác động ngược lại của 2’-O-alkyl RNA đã không thể cảm
ứng RNase H cắt RNA mục tiêu, bởi 2’-O-alkyl RNA ON không chiêu mộ được
các RNase H, nên hoạt động ức chế của antisense là sự dịch mã của ribosome.
Hiệu quả của cơ chế này lần đầu tiên được nhận thấy, khi sự biểu hiện của các
phân tử bám dính gian bào 1 (ICAM-1) được ức chế một cách hiệu quả bởi AS-
ON (đã bị biến đổi 2’-O-methoxy-ethyl độc lập với RNase H để gắn với vùng 5’-
cap) (Barker và cs, 1997).
Hình 5.30. AS-ON thế hệ thứ hai
Một cách tiếp cận khác đối với các ON không hoạt hóa được các RNase H,
là thay đổi quá trình cắt nối (splicing). Khác với vai trò thông thường của AS-
ON-ức chế sự biểu hiện của protein thì các AS-ON lại được sử dụng để khóa các
vị trí cắt nối, nhằm có thể làm gia tăng sự biểu hiện của các loại protein cắt nối
khác. Kỹ thuật này đang được áp dụng để chữa trị bệnh khiếm khuyết máu di
truyền β -thalassemia.
Trong hầu hết các cách tiếp cận kỹ thuật antisense, công việc hàng đầu là
RNA mục tiêu phải bị cắt bởi các RNase H, nhằm làm tăng khả năng của
188
antisense. Do đó, kỹ thuật Gapmer đã được phát triển để thực hiện mục đích này.
Gapmer chứa một đoạn DNA trung tâm, hay các monomer DNA PS. Ngoài ra,
chúng còn mang các nucleotide được biến đổi như 2’-O-methyl RNA tại hai bên
đầu. Sự phối hợp này sẽ ngăn cản quá trình phân hủy từ hai bên đầu của các
phân tử antisense (và một đoạn gồm bốn hay năm deoxy giữa những 2’-O-
methyl nucleotide hai bên sườn), do vậy sẽ hoạt hóa một cách hiệu quả RNase H
ở người, cũng như của E. coli. Bên cạnh đó, việc sử dụng các Gapmer còn có thể
giải quyết nhiều vấn đề khác nảy sinh từ AS-ON, chẳng hạn trường hợp ‘’sự cắt
không hợp lý’’ (irrelevant cleavage) và nhiều trường hợp khác.
- AS-ON thế hệ thứ ba:
Gần đây, các nucleotide biến đổi khác đã được phát triển để cải thiện nhiều
đặc tính như ái lực mục tiêu, kháng lại nuclease và dược lực (pharmacokinetics).
Peptide nucleic acid (PNA) là những phân tử DNA tương tự dùng thay thế,
được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất (ngoại trừ PS DNA và 2’-O-alkyl RNA).
Trong PNA, sườn deoxyribose phosphate được thay thế bởi các liên kết
polyamide. PNA đầu tiên được đưa ra bởi Nielsen và cs, 1991 có những đặc tính
lai hữu dụng và sự ổn định sinh học cao, nhưng không phát động cơ chế cắt
RNA bởi RNase H. Hơn nữa, chúng là những phân tử trung hòa điện, nên sự tan
và chuyển vào tế bào luôn nảy sinh nhiều vấn đề quan trọng, cần phải vượt qua
khi đưa ra quyết định sử dụng PNA như là tác nhân antisense ứng dụng trong
liệu pháp.
Vận chuyển vào trong nội bào các PNA được cải thiện bằng cách ghép cặp
PNA với những oligomer tích điện âm, lipit hay các peptide được tế bào cấp
nhận (Braasch và Corey, 2001). Theo các nghiên cứu in vivo, cho đến nay, PNA
dường như không độc vì chúng là những phân tử không tích điện, ái lực thấp với
189
protein, gắn được với nucleic acid. Đó cũng có thể là ưu điểm đầu tiên của AS-
ON thế hệ thứ ba.
Hình 5.31. AS-ON thế hệ thứ ba
N3’-P5’phosphoramidate (NP): N3’-P5’ (NP) là một ví dụ về sườn

phosphate bị biến đổi, trong đó nhóm 3’-hydroxyl của vòng 2’-deoxyribose được
thay thế bằng nhóm 3’-amino. NP vừa có ái lực cao đối với mạch RNA bổ trợ và
vừa kháng lại nuclease. Bởi NP không cảm ứng vơi sự cắt của RNase H đối với
RNA, nên chúng được sử dụng chủ yếu cho cơ chế can thiệp vào quá trình cắt
nối của mRNA.
190
2’-Deoxy-2’-fluoro-β-D-arabino nucleic acid (FANA): là các AS-ON (chứa
nhiều phân tử đường) được biến đổi đồng nhất đầu tiên, có khả năng cảm ứng sự
cắt bởi RNase H đối với phân tử RNA bị gắn.
Các nucleic acid bị khóa (locked nucleic acid-LNA): đây là một trong
những nucleotide biến đổi mang lại nhiều hứa hẹn nhất được tổng hợp đầu tiên ở
phòng thí nghiệm Wengel và Imanishi. LNA là một ribonucleotide chứa cầu
methylene nối nguyên tử 2’-oxy của đường ribose với nguyên tử 4’-carbon.
Dùng các LNA trong DNA ON sẽ cảm ứng sự thay đổi cấu hình của liên kết
DNA-RNA đối với chuỗi xoắn kép kiểu A và do đó, ngăn cản sự cắt của RNase
H với mạch RNA. Nếu để phân hủy mRNA, gapmer DNA-LNA khảm phải chứa
đoạn dài 7-8 DNA monomer trong trung tâm để có thể cảm ứng hoạt động
RNase H. Các LNA đã được chứng minh có nhiều ứng dụng, đặc biệt là ức chế
sự biểu hiện gen.
Morpholino oligonucleotide (MF): Morpholino ON là những phân tử tương

tự DNA, trong đó một nửa phân tử đường ribose bị thay thế bởi morpholino và
những liên kết phosphoroamidete giữa các tiểu phần được sử dụng, thay vì các
liên kết phosphodieste. MF không hoạt hóa RNase H, do đó để ức chế biểu hiện
của gen nào đó, chúng phải gắn vào vùng 5’ không được dịch mã, hay gắn vào
25 base đầu tiên xuôi dòng của codon mở đầu đẻ khóa sự dịch mã (nhằm ngăn
chặn ribosome gắn vào).
Vì không tích điện nên MF không thể hình thành các mối tương tác không
mong muốn với các protein gắn nucleic acid.
Cyclohexene nucleic acid (CeNA): thay thế vòng 5’-furanose bởi vòng 6- là
cấu trúc cơ bản của cyclohexene nucleic acid, làm cấu hình của các oligomer có
độ cứng cao. CeNA hình thành nên xoắn kép ổn định với DNA hay RNA bổ trợ
191
và bảo vệ các ON khỏi sự phân hủy bởi các nuclease. Hơn nữa, có thể tiến hành
thể lai CeNA-RNA, thử nghiệm này đã được báo cáo hoạt hóa RNase H, mặc dù
hiệu quả thấp hơn 600 lần so với xoắn kép DNA-RNA (Verbeure và cs, 2001).
Tricycle-DNA (tcDNA): là nucleotide khác, với khả năng gắn kết mạnh vào
trình tự bổ trợ, được tổng hợp bởi Leumann và cs. tcDNA không hoạt hóa RNase
H cắt mRNA.
Bảng 5.3. Một số AS-ON được sản xuất
192
5.4.2.4. Chuyển các AS-ON vào trong tế bào
 Nhiều phương pháp in vivo và in vitro được phát triển để chuyển ON

vào trong tế bào.
- Đến nay hệ thống chuyển phổ biến và thành công nhất là sử dụng các
liposome và lipid tích điện. Chúng hoặc sẽ bao lấy các nucleic acid, hoặc hình
thành các phức hợp lipid-nucleic acid như là kết quả của sự tích điện trái dấu.
Các phức hợp này sẽ chuyển AS-ON bằng quá trình nhập bào (endocytosis). Để
giải phóng các ON hiệu quả từ các ngăn nhập bào, nhiều tác nhân chuyển nhiễm
chứa những lipid giúp đỡ làm phá hủy cấu trúc màng và từ đó, các ON được tự
do. Một số tác nhân chuyển các đại phân tử được phát triển thông qua cơ chế
nhập màng tế bào một cách hiệu quả và bảo vệ các ON khỏi sự phân hủy của các
dịch sinh học, ví dụ các dendrimer, các polymer phân hủy sinh học và các thể
nano gắn ON.
- Chiến lược khác để tăng hiệu quả vận chuyển của các AS-ON chuyên biệt
các mô hay cơ quan là nhập bào thông qua các receptor. Với kỹ thuật này, các
193
ON được kết hợp với kháng thể hay các ligand (nối phối tử) chuyên biệt với các
tế bào, các mô hay cơ quan cần chuyển vào. Gần đây, một số nhóm nghiên cứu
đã chuyển thành công các ON in vivo mà không cần sử dụng bất kì hệ thống
chuyển nào. Hoặc cũng có thể chuyển thành công các AS-ON đã được đánh dấu
huỳnh quang vào tế bào thần kinh hạch rễ ở lưng, sau khi tiêm dưới màng mà
không cần sử dụng các tác nhân chuyển trung gian (Schmajuk và cs, 1999).
- Vận chuyên xuyên màng tế bào: Khi các oligonucleotide trần tiếp cận tế
bào thường không thể xuyên qua màng. Một mảnh nhỏ có thể được nhập bào vào
tế bào thông qua sự hấp phụ. Vận chuyển các oligonucleotide bằng cách này có
hiệu quả thấp vì việc chúng mang điện tích âm đi qua màng rất khó khăn. Vì thế,
nhiều nỗ lực tiến hành biến đổi các oligonucleotide để loại bỏ điện tích âm, hi
vọng sẽ cải thiện sự hấp phụ. Tuy nhiên, tăng khả năng hấp phụ không cải thiện
được hiệu quả của các antisense, bởi vấn đề nằm ở chỗ: sự thoát ra khỏi các
endosome (cũng giống như quá trình vận chuyển các oligonucleotide vào
cytosol)- tức qua màng, đây là một bước quan trọng ảnh hưởng tới hiệu quả của
quá trình vận chuyển.
- Cũng có thể bỏ qua sự ảnh hưởng của màng nguyên sinh chất bằng kỹ
thuật vi tiêm (microinjection), khoang lỗ màng (electroporation) hay tăng tính
thấm của màng với các tác nhân hóa học. Ngoài ra, có thể chuyển các
oligonucleotide được làm dễ dàng hóa thông qua các vector như liposome,
polymer và các peptide. Các phương tiện này thích hợp để vượt qua rào cản
màng nguyên sinh chất. Bằng cách này các oligonucleotide cần được kết hợp với
các liposome hay các polymer và có thao tác kích thích sự hấp phụ các phức hợp
này vào màng tế bào nguyên sinh chất.
194
Hình 5.32. Quá trình vận chuyển các oligonucleotide vào tế bào
 Giải phóng các AS-ON ra khỏi các endosome
Các AS-ON trần không thể thấm qua màng endosome. Do vậy, làm xáo
trộn tính ổn định của màng endosome là bước cần thiết trong quá trình chuyển vị
195
của các AS-ON, và các liposome mang điện tích dương có vai trò quan trọng
trong quá trình làm mất ổn định này. Liposome mang điện tích dương điều tiết
DNA thông qua sự tương tác tĩnh điện trong một cấu trúc phức tạp gọi là
Hình 5.33. Phức hợp RNA aptamer streptomycin
lipoplexe (Meurer và cs, 2001). Liposome mang điện tích dương không chỉ kích
thích sự thu nhận các AS-ON hơn 100 lần, mà còn kích thích sự chuyển vị của
chúng xuyên qua màng endosome.
 Chuyển các AS-ON qua màng nhân
Sau khi vi tiêm vào cytosol hay sau khi thoát ra khỏi những endosome, các
AS-ON tích lũy trong nhân bằng sự khuếch tán thụ động xuyên qua màng nhân,
trong khi đó màng của các bào quan khác lại hoạt động như một vật chắn hiệu
quả. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tốc độ khuếch tán phụ thuộc vào chiều
dài của AS-ON (Lukacs và cs, 2000). Sự khuếch tán của các mảnh lớn thì chậm,
ít hay không khuếch tán được đối với các nucleotide chiều dài trên 200bp.
Những ON kích thước dài vài trăm nucleotide dễ dàng vào trong nhân.
Trong nhân, các mảnh nucleic acid thuộc tất cả các kích thước gần như bất
động vài phút, trong khi các phân tử dextran FITC có kích thước tương tự chừng
580 kDa khuếch tán tự do trong nhân. Vì vậy có thể cho rằng, các ON nhanh
chóng bị làm bất động khi tương tác với các thành phần của nhân như các phân
tử histon mang điện tích dương. Những nghiên cứu khác cũng cho rằng trong
nhân, các ON đã gắn vào các chất nền RNA nhân (Shi và cs, 2003)
Vẫn còn nhiều tranh luận về sự di động của các ON, chúng có thể di chuyển
từ cytosol vào nhân và ngược lại (Lorenz và cs, 2000). Do đó, khi các ON được
vi tiêm vào một nhân (của tế bào hai nhân), vẫn có khả năng tìm thấy các ON
xuất hiện ở các nhân kia. Giả thiết sự di chuyển này do kích thước của ON và
(hoặc) vị trí mục tiêu không thích hợp cho chúng đến.
196
 Sự phân phối của phức hợp AS-ON trong nhân và các mối liên quan tới
hoạt động antisense
Một khi các ON xuyên qua màng nhân, chúng sẽ phân phối xuyên qua các
lumen của nhân. Kiểm tra bằng kính hiển vi quang học cho thấy, các ON không
di chuyển đến các hạch nhân (nucleous) - nơi mà các RNA ribosome được phiên
mã. Thật vậy, các ON có thể hình thành nên các thể có dạng hình cầu (150 -
300nm) với chức năng chưa rõ. Một số ý kiến cho rằng sự tích tụ các ON như
các thể nhân là sự đáp ứng của tế bào để cô lập các ON ngoại lai, nhằm làm giảm
độc tính.
Sự định vị chính xác của các ON trong nucleoplasm là vấn đề lớn chưa
được giải quyết. Một số dữ liệu cho thấy rằng, các ON gắn rộng khắp với cả các
cấu trúc không phải chromatin trong nhân (thường gọi là chất nền của nhân -
nuclear matrix)
 Gặp gỡ các mục tiêu trong nhân và xác định số phận của các mục tiêu
Mục tiêu ban đầu của các phân tử antisense là các phân tử mRNA bổ trợ với
chúng. Mặc dù các AS-ON có thể lai với các mRNA phiên mã in vitro hay tổng
hợp bổ trợ với các RNA hay DNA, nhưng bằng chứng cho thấy sự kiện này hiếm
xảy ra trong tế bào.
Một nhóm nhà khoa học đã đạt được kết quả sau: đưa những trình tự AS-
ON và những trình tự tổng hợp với nhiều mismatch đã đánh dấu huỳnh quang
hay phóng xạ vào trong nhân, cả hai loại ON này đều gắn vào chất nền của nhân
như đã đề cập ở trên. Sau đó, toàn bộ RNA được tách chiết thu nhận và xử lý với
hỗn hợp các AS-ON. Kết quả là các ON mitmatch trên cho thấy các trình tự
antisense thể hiện ái lực cao với các mRNA mục tiêu, nhưng không thể hiện với
197
các mRNA khác. Trong khi đó các ON mitmatch không thể hiện tính chất này
với các mRNA mục tiêu (Shi và cs, 2003). “Kịch bản” này có thể phù hợp với
quan điểm lai của AS-ON với phân tử mRNA mục tiêu, sự phân hủy được cảm
ứng xảy ra và sự tổng hợp protein bị đình trệ.
Quan trọng hơn, việc cắt các mRNA mục tiêu trong tế bào bởi sự gắn của
các AS-ON cũng được chứng minh ở một số nghiên cứu khác (Shi và cs, 2003).
Aptamer: Bởi phân tử nucleic acid có thể gắn với protein, cho nên có thể
dùng một oligonucleotide gắn với protein nhưng lại không gắn với nucleic acid,
kết quả là ngăn cản chức năng của protein. Loại oligonucleotide này gọi là
‘aptamer’
Ví dụ, một aptamer gắn với enzyme làm đông máu có thể là một cách ngăn
cản cục máu đông sau phẫu thuật. Trên thực tế, thuật ngữ “aptamer” dùng để chỉ
những phân tử nhỏ mà chúng có khả năng gắn kết vào các phân tử khác.
Aptamer được chia thành hai loại chính là (1) DNA hay RNA aptamer và (2)
peptide aptamer. DNA hay RNA aptamer có thể hình thành liên kết đặc hiệu với
phân tử nucleic acid, protein hay các hợp chất hữu cơ nhỏ khác. Các peptide
aptamer cũng có khả năng tương tác với các phân tử protein khác trong tế bào.
Với lập luận trên, một aptamer antithrombin hiệu quả có thể được cô lập
theo cách sau: một hồ chứa oligonucleotide mà mỗi oligonucleotide có hai vùng
18 base (trình tự mồi) với vùng trung tâm gồm 60 nucleotide với bất kì
nucleotide nào tại vùng này được tổng hợp hóa học. Theo lí thuyết, mẫu
oligonucleotide có khoảng 1,3x1036 (460) vùng trung tâm khác nhau. Tiếp theo hồ
này được chuyển qua chất nền chứa vùng thrombin. Oligonucleotide gắn với
thrombin sẽ được tách rửa. Aptamer trong những mẫu ban đầu được chọn lọc lại
qua nhiều lần bằng cách đưa vào các hồ có chứa thrombin. Bước cuối cùng trong
198
việc tạo thành aptamer thrombin là nhân nên bằng phản ứng PCR hoặc nhân
dòng. Những đặc điểm lí tính và sinh học của mỗi aptamer này, được xác định có
lực hấp dẫn, tính chuyên biệt cao và hoạt tính ức chế tốt.
Đã có một số aptamer antithrombin hữu hiệu được thu nhận bằng cách này.
Tuy nhiên, oligonucleotide có cuộc sống rất ngắn trong cơ thể người, vì vậy nó
có thể chỉ sử dụng để sản xuất vật liệu cần cho sự ức chế thrombin nhất thời
(ngược lại với anghioplasti, thời gian điều trị dài hơn với tác nhân chống lại sự
tạo thành cục). Một cách rõ hơn, những hoạt động trong ống nghiệm để lựa chọn
aptamer thrombin được sử dụng với bất cứ một protein đích nào đó.
5.4.3. Ribozyme
5.4.3.1. Hoạt động của ribozyme
Cech và cs (1981) đã phát hiê ̣n được mô ̣t số hoạt tính cắt của nhóm intron I
thuô ̣c Tetrahymena thermophilia và dùng thuâ ̣t ngữ ribozyme để gọi những
enzyme có bản chất RNA này. Sau đó, Altman phát hiê ̣n vai trò, hoạt tính của
thành phần RNA ở enzyme RNase P trong quá trình trưởng thành của tRNA. Các
ribozyme có khả năng phân giải các phân tử RNA khi chúng gắn lên vị trí thích
hợp của phần tử.
Sự phát triển của các ribozyme cắt trans đã khích lê ̣ viê ̣c sử dụng ribozyme
cho mục đích liê ̣u pháp. Mô ̣t số ribozyme xúc tác có tồn tại trong tự nhiên:
hammerhead (ribozyme đầu búa), hairpin (ribozyme kẹp tóc), ribozyme có
nguồn gốc từ virus gây bê ̣nh viêm gan ở người (Hepatitis delta virus - HDV),
phân tử RNA vê ̣ tinh Varkud (Varkud Satellite – VS), và các intron nhóm I và
nhóm II (Khan và cs, 2001), tiểu phần RNA của enzyme RNase P (Cobeleda và
cs, 2000). Thêm vào đó, các phân tích hóa học và phân tích cấu trúc gần đây
199
khẳng định chắc chắn rằng RNA ribosome là mô ̣t enzyme (Cech và cs, 2000).
Tương tự, đã có bằng chứng cho rằng, thành phần RNA của spliceosome có thể
những đă ̣c tính của mô ̣t enzyme (Collins và cs, 2000).
Phát hiê ̣n các ribozyme và những nghiên cứu nền tảng về cơ chế của quá
trình tự cắt-nối đã cho thấy những chi tiết về lõi xúc tác và cấu trúc bâ ̣c hai, bâ ̣c
bốn của RNA, dẫn đến sự cắt thông qua ribozyme của RNA. Lúc đầu, các
ribozyme được tin tưởng là các metalloenzyme, nghĩa là hoạt đô ̣ng của nó đòi
hỏi các ion kim loại có hóa trị hai xúc tác, thông qua mô ̣t cơ chế giống nhau. Tuy
nhiên gần đây, “ribozyme kẹp tóc” thể hiê ̣n hoạt tính giống như mô ̣t ribozyme
mà không cần các ion kim loại hóa trị hai (Murray và cs, 1998). Do đó, trong tự
nhiên, nhiều kiểu ribozyme khác nhau thể hiê ̣n những cơ chế cắt khác nhau phụ
thuô ̣c vào cấu trúc của từng ribozyme.
Trung tâm xúc tác của ribozyme kết hợp với phân từ RNA antisense và thể
hiê ̣n sự cắt chuyên biê ̣t với cơ chất mục tiêu RNA. Hoạt tính enzyme của trung
tâm xúc tác ở ribozyme với thời gian đủ dài, sẽ gây nên sự cắt và phá hủy, hay
bất hoạt chức năng RNA mục tiêu. Khi phân tử mục tiêu bị cắt và tái thiết lâ ̣p trở
lại chu trình gắn-cắt-tách. Khả năng ribozyme cắt phân tử mục tiêu và sau đó
phục hổi có nhiểu thuâ ̣n lợi bởi các RNA antisense chỉ bất hoạt với các RNA
mục tiêu, mà không phân hủy nó (khác với ribozyme). Sự kết hợp của kĩ thuâ ̣t
antisense và ribozyme đã tạo ra nhiều hi vọng cho những ứng dụng trong lĩnh
vực y sinh học (Khan và cs, 1998).
200
Hình 5.34. Hoạt động kết hợp các RNA antisense và ribozyme
5.4.3.2. Các kiểu ribozyme
Dựa vào kích thước, ribozyme được xếp thành hai nhóm lớn và nhỏ.
Những hê ̣ thống khác được thiết kế gần đây cho phép hoạt hóa gen đáp ứng
lại thuốc mà trước đó, chúng được điều hòa bởi các tác nhân bên ngoài. Hê ̣ thống
này dựa trên các ribozyme allosteric cắt chuyên biê ̣t lên RNA của chúng, khi
vắng mă ̣t thuốc và bị bất hoạt khi có hiên diện của thuốc điều hòa (Kurz và cs,
1999).
201
Nếu các ribozyme kiểu này được chèn mô ̣t cách thích hợp vào trong các
mRNA phiên mã thì chúng nhanh chóng cắt các mRNA, khi các thuốc điều hòa
không hiê ̣n diê ̣n. Những RNA xúc tác có thể được thiết kế bao gồm các
ribozyme đã biết cùng với các trình tự điều hòa được gọi là aptamer (Famulok và
cs, 2000) như đã trình bày ở phần trên. Những nucleotide monophosphate vòng
được phát hiê ̣n là có khả năng họat hóa các ribozyme allosteric ở nồng đô ̣ 100
µM.
- Ribozyme kích thước lớn: Nhìn chung, đó là các ribozyme thuô ̣c intron I,
II và tiểu phần RNA của enzyme RNase P. Chúng được tìm thấy trong vi khuẩn
và các bào quan của tế bào thực vâ ̣t bâ ̣c cao, nấm và tảo (Khan và cs, 2000). Các
intron này sẽ được cắt ra khỏi hnRNA của chúng bằng cơ chế hai bước. Bước
thứ nhất, vị trí được cắt 5’ bị tấn công bởi phức hợp 3’-OH của nhóm guanosine
bên ngoài (nhóm I). Trong khi đó, intron nhóm II bị tấn công bởi 2’-OH của đầu
adenosine bên trong hay bởi ion hydroxide. Ở bước hai, nhóm 3’-OH đầu tâ ̣n
cùng 3’ của exon ngược dòng gắn vào vị trí cắt 3’ để tạo ra sản phẩm cắt.
RNase P là mô ̣t endonuclease phân giải từ đàu 5’ của các tRNA trưởng
thành. Trong RNase P vi khuẩn, tiểu phần RNA (RNase P ribozyme) có hoạt tính
xúc tác và là thành phần protein quan trọng được biết, chỉ hoạt đô ̣ng làm dễ dàng
quá trình gắn của RNase P ribozyme mang điê ̣n tích âm vào cơ chất của nó.Tuy
nhiên, các đô ̣t biến hoă ̣c trên gen mã hóa cho RNA, hoă ̣c trên gen mã hóa cho
phần từ protein có thể bất hoạt RNase P in vivo, điều đó đã cho thấy cả hai thành
phần này đều quan trọng cho hoạt tính xúc tác của enzyme này. Trong suốt quá
trình cắt RNase P ribozyme, phosphate đều ở vị trí có thể tách ra được ( scissile-
202
site phosphate), và chúng có thể được gắn bởi ion hydroxide để cắt 3’-oxygen
và tạo đầu mút 5’-phosphate.
- Ribozyme kích thước nhỏ: Lớp phân tử này bao gồm cấu trúc ribozyme
đầu búa (hammerhead), ribozyme kẹp tóc HDV (hepatitis delta viroid) và VS
ribozyme.
Hình 5.35. Cấu trúc bậc hai của RNase P ribozyme
Hình 5.36. Mô hình cấu trúc bậc hai hammerhead và 10-23 DNA enzyme
Mỗi ribozyme tồn tại trong tự nhiên sẽ xúc tác viê ̣c cắt RNA thông qua mô ̣t
cơ chế liên quan tới phản ứng gắn kết, thuô ̣c nhóm 2’-OH lên nguyên tử phospho
203
của nối phosphodiester, tạo ra nhóm 5’-OH và đầu mút 2’,3’-phosphate vòng.
Phản ứng cắt xúc tác bởi các ribozyme này có vẻ được bắt đầu bằng sự đảo
ngược hình dạng cấu trúc phân tử tại nguyên tử phosphor.
Phân tử nhỏ nhất là ribozyme hammerhead có trong mô ̣t vài RNA vê ̣ tinh
(RNAsatellite) của virus thực vâ ̣t, viroid, những mRNA phiên mã của các DNA
vê ̣ tinh (DNA satellite) và nhân tế bào của loài sa giông (mô ̣t tiểu phần
riboprotein của khoảng 12S trong tế bào trứng)…
Hoạt đô ̣ng của ribozyme hammerhead cần các ion kim loại hóa trị hai
(Mg2+). Cơ chế hoạt đô ̣ng của ion kim loại hóa trị hai như mô ̣t acid Lewis, chúng
kết hợp trực tiếp với nhóm 2’-OH và nguyên tử oxy còn lại ờ đầu 5’ để hoạt hóa
nucleophile, tạo sự ổn định của phân tử. Điều này cũng được dùng để giải thích
những phản ứng được xúc tác bởi các hammerhead ribozyme. Murray và cs
(1998) đã chứng minh các cation hóa trị mô ̣t ở nồng đô ̣ cao hơn có thể thay thế
ion Mg2+. Do vâ ̣y, về bản chất, các hammerhead ribozyme có thể không phải là
metalloenzyme.
HDV ribozyme được thu nhâ ̣n từ các RNA kháng bô ̣ gen (antigenomic
RNA) và RNA bô ̣ gen (genomic RNA) của HDV (Khan và cs, 2001). Trong
phản ứng xúc tác bởi HDV ribozyme, nhiều nghiên cứu cho rằng, nhóm chứ nô ̣i
năng phân tử, N3 tại C76 trong ribozyme HDV kháng bô ̣ gen, và N3 tại C 75 trong
ribozyme HDV có thể hoạt đô ̣ng như là mô ̣t chất xúc tác thực sự (Feere và cs,
1998). Tuy nhiên, tùy vào vai trò khác nhau của N3, hai cơ chế trên được đă ̣t tên
là xúc tác base và xúc tác acid.
Ribozyme kẹp tóc được thu nhâ ̣n từ mạch âm của các RNA vê ̣ tinh ở virus
đốm vòng thuốc lá (sTRSV), virus đốm vàng ở rau diếp kiểu I (sCYMV1) và
virus khảm arabis (sArMV) (Hampel và cs, 1990). Ribozyme hammerhead và
204
hairpin có thể xúc tác phản ứng nối các sản phẩm cắt, hiê ̣u quả nối của những
ribozyme kẹp tóc cao hơn ribozyme hammerhead. Phản ứng nối ngược với phản
ứng cắt khi dùng chung các đầu mút do phản ứng cắt tạo ra. Ribozyme kẹp tóc
thường có ưu thế với phản ứng nối hơn. Ngược lại, ribozyme hammerhead có ưu
thế với phản ứng cắt (phản ứng cắt xảy ra nhanh hơn 100 lần so với phản ứng
nối, trong khi đó ở ribozyme kẹp tóc phản ứng nối xảy ra nhanh 10 lần so với
phản ứng cắt) (Hegg và cs, 1995). Mô ̣t số công bố hoạt tính xúc tác không cần
ion kim loại của enzyme ribozyme kẹp tóc, chúng có thể là lớp duy nhất hoạt
đô ̣ng không cần ion kim loại như cofactor (Murray và cs, 1998).
Ribozyme VS được thu nhâ ̣n từ ti thể Neurospora (Collins và cs, 1990).
Phản ứng xúc tác của ribozyme VS cần ion kim loại hóa trị 2 như Mg2+, nhưng
vẫn có hoạt tính tốt với cation hóa trị 1 (Murray và cs, 1998) hoạt đô ̣ng của
ribozyme có lẽ không phụ thuô ̣c pH. Nhiều vùng quan trọng giữ vai trò chủ đạo
trong sự xúc tác đã được xác định (Collins và cs, 2001). Nhưng những nhóm xúc
tác trong phản ứng cắt chưa được xác định.
5.4.3.3. Những biến đổi của các ribozyme
Ứng dụng trong nuôi tế bào in vitro hay in vivo, ribozyme có thể được
phiên mã từ các plasmid bên trong tế bào mục tiêu hoă ̣c có nguồn gốc ngoại
sinh. Yêu cầu đầu tiên là phải thiết kế những cassette biểu hiê ̣n với mô ̣t promoter
RNA polymerase III và cấu trúc nút thắt thân (stem-loop) để ổn định ribozyme
(Michienzi và cs, 2001).
Vì sử dụng các ribozyme tổng hợp hóa học ít phức tạp hơn so với ribozyme
tự nhiên, nên các nghiên cứu liê ̣u pháp dựa trên ribozyme tổng hợp nhân tạo
được tiến hành nhiều. Tuy nhiên, các RNA nhanh chóng bị phân hủy trong môi
205
trường nô ̣i bào, do vâ ̣y những ribozyme tổng hợp trước hết, phải kháng lại sự
phân hủy bởi các nuclease để có thể dùng trong nuôi cấy tế bào in vivo.
+ Đảm bảo sự ổn định của ribozyme khó hơn là bảo vê ̣ các AS-ON, vì khi
đưa những nucleotide biến đổi vào trong tế bào thường dẫn đến sự thay đổi cấu
hình, làm mất hoạt tính xúc tác. Mối quan hê ̣ giữa chức năng và trình tự trong
ribozyme đầu búa rất có ý nghĩa, để có thể sử dụng các nucleotide biến đổi khác
nhau, cần ổn định cấu trúc của ribozyme cũng như hoạt tính của nó khi đã bị
biến đổi (Beigelman và cs, 1995).
Bảng 5.4. Một số ribozyme tổng hợp hóa học được sử dụng thử nghiệm
lâm sàng
Những ribozyme kháng lại nuclease chứa năm nucleotide không biến đổi,
mô ̣t 2’-allil uridine tại vị trí 4 và 2’-O-methyl RNA tại tất cả các vị trí còn lại,
ngoài ra, đầu 3’ được bảo vê ̣ bởi mô ̣t thymidine đảo ngược. Thời gian bán phân
hủy của những ribozyme đã được ổn định tăng hơn 10 ngày so với thời gian bán
phân hủy của RNA ribozyme chưa biến đổi. Phiên bản cải tiến của các ribozyme
này với bốn nối phosphorothioate trong “cánh tay” nhâ ̣n diê ̣n cơ chất và mô ̣t
đường deoxyabasic đảo ngược. Hiê ̣n nay, ribozyme này được ứng dụng nhiều
trong điều trị lâm sàng.
206
Sự phát triển của những thư viê ̣n dữ liê ̣u đã mở ra con đường để tạo ra các
ribozyme mới với nhiều thuâ ̣n lợi hơn (dễ dàng tiếp câ ̣n được những mục tiêu
mới, hoạt tính cao ở điều kiện nồng đô ̣ Mg2+ và được tăng cường ổn định sinh
học…). Mô ̣t trong số những công ti đứng đầu trong lĩnh vực này là Ribozyme
Pharmaceuticals (Boulder, CO, USA) đã tiến hành nhiều thử nghiê ̣m lâm sàng,
với những ribozyme hammerhead khác nhau đã được ổn định.
5.4.3.4. RNAi
- Cơ chế hoạt đô ̣ng của RNAi: Hiê ̣n tượng RNA tác đô ̣ng như là cơ chế có
thể làm “im lă ̣ng” gen sau phiên mã, đáp ứng lại khi tiêm các RNA mạch đôi dài,
được phát hiê ̣n đầu tiên ở giun tròn Caenorhabditis elegans (Fire A và cs, 1998),
gọi là sự can thiê ̣p của RNA (interference RNA- RNAi).
RNAi đang nổi bâ ̣t như là mô ̣t chiến lược mới để “tắt có chọn lọc” sự biểu
hiê ̣n sau phiên mã của các mRNA, cơ chế này được duy trì mô ̣t các tiến hóa từ
nấm men đến tế bào đô ̣ng vâ ̣t. Khả năng làm “im lă ̣ng” mô ̣t cách chọn lọc, nhanh
chóng của các sản phẩm gen trong hê ̣ thống sinh học phức tạp, rõ ràng đã mở ra
con đường mới trong lĩnh vực virus học và nghiên cứu ung thư, tạo thuâ ̣n lợi để
tìm hiểu sâu hơn các khiếm khuyết di truyền, thiết kế thuốc…
RNA mạch đôi (dsRNA) khi

được tổng hợp bên trong tế bào đô ̣ng
vâ ̣t có vú sẽ đi vào quá trình “chế
biến” bởi mô ̣t hê ̣ enzyme giống RNase
kiểu III gọi là Dicer. Kết quả của quá
trình này là hình thành các đoạn
207
dsRNA dài khoảng 21 nucleotide, đó là những RNAi nhỏ siRNA (small
interfering RNA).
Hình 5.37. Nguyên tắc hoạt động

của RNAi
Khi bắt că ̣p với các protein trong tế bào, các siRNA hình thành phức hợp
RISC (RNA-interfering silencing complex) và phần đầu được sử dụng để nhâ ̣n
diê ̣n các mRNA nô ̣i bào. RISC sẽ gắn với các trình tự bổ sung trên mRNA và
dẫn đến sự cắt các phân tử mRNA. Gần đây, RISC được tinh sạch từ dịch chiết
của tế bào Drosophila bao gồm: mô ̣t protein đơn, Argonaute 2 với hoạt tính cắt
mRNA.
Cơ chế hoạt đô ̣ng của RNAi có thể tóm lược qua các bước:
(1) Các dsRNA dài được cắt thành các phân tử siRNA bởi enzyme Dicer.
(2) Sát nhâ ̣p các phân tử nói trên vào phức hợp làm “im lă ̣ng” cảm ứng
RNA-RISC đã được hoạt hóa từ dạng tiềm tàng RISC (sự hoạt hóa này bao gồm
bước tháo đô ̣c lâ ̣p ATP của các siRNA để tạo các phức hợp RISC với siRNA
mạch đơn).
(3) Các RISC với siRNA mạch đơn bổ trợ các trình tự mRNA mục tiêu và
cắt RNA mục tiêu này. Kết quả cuối cùng của viê ̣c cắt nói trên dẫn đến “knock
down” sự biểu hiê ̣n của gen và chức năng của nó.
- Mô ̣t số phương pháp làm “im lă ̣ng” gen: Có nhiều phương pháp khác
nhau được đưa ra để “tấn công” RNA mục tiêu bằng RNAi, với mục đích làm
cho các gen chuyên biê ̣t nào đó phải im lă ̣ng, không biểu hiê ̣n. Về nguyên tắc, sự
biểu hiê ̣n của bất kì protein nào đó đều có thể bị ức chế. Về phương thức, RNAi
được tiến hành bằng cách đưa ra các siRNA- bổ trợ với mRNA vào tế bào nuôi
208
cấy, mô, cơ quan hay mô ̣t cơ thể. Có năm phương pháp cảm ứng sự im lă ̣ng của
những gen chuyên biê ̣t:
(1) Chuyển nhiễm các siRNA được tổng hợp hóa học.
(2) Chuyển nhiễm các siRNA được phiên mã in vitro.
(3) Chuyển nhiễm các siRNA “cocktail” được tạo ra bằng sự phân hủy
những dsRNA dài (do phiên mã in vitro).
(4) Biểu hiê ̣n các siRNA trong tế bào sử dụng vector plasmid hay virus.
(5) Biểu hiê ̣n các siRNA trong tế bào sử dụng mảnh hoạt tính phiên mã
PCR đưa vào tế bào bằng chuyển nhiễm.
Hình 5.38. Tạo các

dsRNA và cắt
thành siRNA bằng
enzyme Dicer
209
Để tổng hợp hoặc biểu hiê ̣n siRNA, bước đầu tiên phải chọn trình tự
mRNA tối ưu gắn vào mục tiêu. Thao tác đơn giản gồm:
(1) Scan trình tự mRNA mục tiêu (xuôi dòng từ codon mở đầu AUG) để
chọn lấy mô ̣t trình tự 21 nucleotide với AA.
(2) Xác định và loại bỏ những trình tự 21 nucleotide không chuyên biê ̣t (ví
như những trình tự tương đồng với những mRNA khác) bằng cách tìm kiếm các
trình tự từ cơ sở dữ liê ̣u của bô ̣ gen (ví dụ BLAST).
(3) Tiếp theo, chọn khoảng 3 – 4 trình tự mục tiêu dài chừng 21 nucleotide,
từ những vùng khác nhau của mRNA.
Ngoài ra, cần tâ ̣n dụng những đă ̣c điểm quan trọng trong viê ̣c kết hợp với
siRNA gồm: thành phần G/C thấp, sự ổn định vùng bên trong thấp tại đầu 3’
mạch sense, thiếu trình tự lă ̣p lại đảo ngược, và các đă ̣c điểm khác… (Reynolds
và cs, 2004).
- Tổng hợp hóa học các siRNA: Khi trình tự siRNA được chọn, chúng có
thể được tiến hành tổng hợp từ những nucleotide riêng rẽ ban đầu. Cần phải tạo
ta khoảng 3 – 5 siRNA để dễ dàng kiểm tra, lựa chọn chúng sao cho có thể tối ưu
hóa sự im lă ̣ng của gen.
- Phiên mã in vitro các siRNA: Vì sự tổng hợp hóa học các siRNA chi phí
cao, phương pháp in vitro đơn giản dựa trên nghiên cứu của Milligan và cs
(1987) cho phép tạo ra các siRNA trong 24 giờ với chi phí thấp nhất. Phương
pháp này bao gồm:
(1) Tạo ra mạch khuôn dsRNA của các trình tự mRNA mục tiêu dài 21bp
bên sườn của promoter T7.
210
(2) Phiên mã những mạch khuôn DNA sử dụng T7 RNA polymerase để tạo
ra các RNA mạch đơn nhỏ (ssRNA).
(3) Gắn các ssRNA với các trình tự antisense để tạo ra các dsRNA nhỏ.
(4) Tạo ra các siRNA trưởng thành bằng các xử lí với phản ứng DNase để
tách mạch khuôn DNA và RNase (tách những đầu tâ ̣n cùng nhô ra của các
ssRNA).
- Tạo ra các siRNA “cocktail”: Trong các đô ̣ng vâ ̣t bâ ̣c thấp (côn trùng,
giun tròn…) và thực vâ ̣t, RNAi có thể được tạo ra bằng cách chuyển nhiễm tế
bào với các dsRNA dài. Ở các đô ̣ng vâ ̣t có vú, sự chuyển nhiễm các siRNA là
cần thiết bởi dsRNA dài hơn 30 nucleotide biểu hiê ̣n hoạt hóa đáp ứng sự kháng
virus, dẫn đến ức chế và phân hủy các mRNA (Brigde và cs, 2003).
Hầu hết các phương pháp tạo dsRNA dài chứa RNA phiên mã từ mạch
khuôn DNA sử dụng T7 RNA polymerase. Để rạo ra siRNA cocktail, cDNA
nguyên vẹn được phiên mã để sản xuất mạch sense và antisense RNA. Mạch
khuôn cDNA hầu như được tạo bởi phản ứng PCR với primer đă ̣c hiê ̣u trình tự
chứa promoter T7 nhô ra ở cả hai đầu 5’ và 3’. Sự phiên mã của các mảnh PCR
bởi T7 polymerase sản xuất cả RNA sense và antisense để hình thành nên
dsRNA. Các mạch khuôn DNA sau đó được loại bỏ bởi Dnase
Cuối cùng, siRNA (21 – 23 nucleotide) được tạo in vitro bằng cách cắt
dsRNA với RNase III tái tổ hợp hay enzyme Dicer cho ra cocktail siRNA
(Myers và cs, 2003). Phân cắt các dsRNA dài thành các siRNA nếu sử dụng các
enzyme giống Dicer sẽ loại bỏ sự phỏng đoán trong quá trình chọn lọc trình tự
mục tiêu siRNA, tránh sự lãng phí khi siRNA không hiê ̣u quả. Tương tự, phương
pháp Dicer làm gia tăng cơ hô ̣i im lă ̣ng của gen khi so sánh với siRNA đơn, bởi
211
nó cho phép sản xuất hỗn hợp siRNA bao phủ cả toàn bô ̣ chiều dài của mRNA
mục tiêu
- Tạo siRNA sử dụng các vector biểu hiê ̣n: Mô ̣t chiến lược phát triển gần
đây để hoạt hóa sự ức chế gen cảm ứng RNAi, đưa đến viê ̣c sử dụng các vector
biểu hiê ̣n siRNA dưới dạng phân tử RNA loop kẹp tóc cuô ̣n lại phía sau như mô ̣t
RNA kẹp tóc ngắn (short hairpin RNA – shRNA) (Sui và cs, 2002). Vector
plasmid hay virus mã hóa các shRNA điển hình được đưa vào tế bào thông qua
các kĩ thuâ ̣t tải nạp hay chuyển nhiễm. Cấu trúc shRNA mang mã được biểu hiê ̣n
từ promotor polymerase III như U6 hay H1 promotor (Paddison và cs, 2002).
Sau khi biểu hiê ̣n, shRNA được chế biến trong cytoplasm thành các siRNA hoạt
đô ̣ng, sau đó chúng thu hút phức hợp RISC, dẫn đến phá hủy mRNA mục tiêu.
Hình 5.39. Tạo shRNA từ một cassette biểu hiện shRNA (Ketting và cs, 2001)
212
Trình tự mã hóa các shRNA (khoảng 50 nucleotide) chứa chừng 20
nucleotide bổ trợ với trình tự mục tiêu sau trình tự antisense của nó đă ̣t theo
hướng đảo ngược, chúng tách biê ̣t với nhau bằng khoảng trống để tạo ra mô ̣t
loop kẹp tóc. Những trình tự chèn DNA dài chừng 50 nucleotide được tổng hợp
như những oligonucleotide bổ trợ hai mạch, với các vị trí giới hạn tương thích
cho viê ̣c tạo dòng bên trong vector đã chọn. Những oligo nucleotide DNA sau đó
được tôi luyê ̣n và gắn vào các vector dạng thẳng (linearized vector).
Sử dụng các vector biểu hiê ̣n shRNA có những thuâ ̣n lợi đă ̣c biê ̣t, nhất là
với khu vực nào đó chứa mô ̣t gen cần sự ức chế trong thời gian dài.
Khi ảnh hưởng của siRNA chuyển nhiễm chỉ trong thời gian ngắn, sự biểu
hiê ̣n của mô ̣t shRNA từ những vector tải nạp có thể cho phép nghiên cứu sự im
lă ̣ng gen trong mô ̣t khoảng thời gian chủ đô ̣ng. Các vector thể hiê ̣n có thể cũng
cho phép chọn lọc các dòng tế bào ổn định với khả năng “knock down” sự biểu
hiê ̣n gen. Cũng có thể đạt được sự điều hòa quá trình “im lă ̣ng” gen bằng cách sử
dụng các promotor cảm ứng để tắt hoă ̣c mở các hoạt đô ̣ng gen, thông qua các thử
nghiê ̣m phức tạp (Wiznerowicz M và cs, 2003). Nhiều vector virus và plasmid
được thiết kế để biểu hiê ̣n shRNA và đã thương mại hóa.
- Các mảnh được tạo ra bởi quá trình PCR: Những tâ ̣p hợp biểu hiê ̣n
shRNA đầy đủ chứa mô ̣t promotor, và mô ̣t terminator cũng có thể được tạo ra
bằng phản ứng PCR. Viê ̣c này giản tiê ̣n vì không cần phải tạo dòng, biến nạp
vào vi khuẩn và chuẩn bị plasmid. Đầu tiên phải tổng hợp các oligo nucleotide
DNA hai mạch bổ trợ khoảng 50 nucleotide mã hóa các trình tự sense và
antisense shRNA và cũng chứa các vị trí giới hạn nhô ra. Tiếp theo, các oligo
nucleotide được tách mạch và gắn lại. Cuối cùng là phản ứng nối được tiến hành
bằng quy trình PCR, sử dụng các primer chứa trình tự promoter và terminator.
213
Bằng cách đó sẽ tạo ra các mảnh shRNA hoạt đô ̣ng ; sau cùng các mảnh được
tinh sạch và chuyển vào tế bào.
5.4.4 Triplex DNA
Hình 5.40. Các oligonucleotide gắn vào xoắn kép DNA
(Ba cách thay đổi sự biểu hiê ̣n của DNA : Các oligonucleotide (A) gắn vào
rãnh nhỏ xoắn kép DNA sử dụng các polyamide; (B) thay thế mô ̣t đoạn DNA ;
(C) gắn vào rãnh lớn thông qua sự bắt că ̣p Hoogsteen hay bắt că ̣p Hoogsteen
ngược, hình thành nên triplex).
Tuy ít phổ biến, nhưng viê ̣c sử dụng các oligonucleotide để làm thay đổi sự
biểu hiê ̣n của gen dựa trên sự gắn trực tiếp lên DNA (gọi là chiến lược triplex
DNA) sẽ là mô ̣t phương pháp có tiềm năng lớn. Đến nay, ít nhất có ba cách tiếp
câ ̣n khác nhau trong chiến lược này:
(1) Sử dụng các polyamide gắn vào các rãnh nhỏ của phân tử DNA mạch
kép.
(2) Sử dụng PNA để thay thế mô ̣t đoạn mạch xoắn kép DNA.
(3) Các oligonucleotide gắn vào rãnh lớn của xoắn DNA hình thành các
triplex.
214
Poliamide liên quan đến các polymer pyrrole-imidazole được gắn như các
dimmer đối song song vào trong rãnh nhỏ của xoắn kép DNA. Sự tương tác
chuyên biê ̣t các trình tự sẽ được tăng cường, thông qua sự bắt că ̣p cạnh - cạnh
của pyrrole và amino acid imadizole vào các că ̣p base nucleotide ở rãnh nhỏ
(White và cs, 1998).
Hình 5.41. Sự bắt cặp kiểu Wtson-Crick, Hoogsteen và Hoogsteen ngược
Nhiều báo cáo gần đây đã xác định đă ̣c tính của sự tương tác bắt că ̣p này.
Mục tiêu chủ yếu là các că ̣p 5 -7 của DNA, bởi vì ái lực của polyamide sẽ
giảm khi phải lựa chọn các mục tiêu lớn hơn (Dickinson và cs, 1998).
Nguyên lí hoạt đô ̣ng: PNA sẽ thay thế mô ̣t đoạn mạch của chuỗi xoắn kép
DNA. Dưới nhiều điều kiê ̣n, xoắn kép PNA-DNA ổn định hơn xoắn kép DNA-
DNA (Egholm và cs, 1993). Riêng cấu trúc PNA rất ổn định bên trong tế bào,
215
tuy nhiên mức đô ̣ thành công còn phụ thuô ̣c các tế bào phôi hay các tế bào đang
biê ̣t hóa.
Trong điều kiê ̣n nhất định, các oligonucleotide hình thành triplex (TFO) sẽ
gắn vào các rãnh lớn của xoắn kép DNA. Có hai motif gắn được biết đều liên
quan đến sự tương tác giữa các cấu trúc base của TFO với các base purine của
chuỗi polypurine / polypyrimidine thuô ̣c chuỗi xoắn kép DNA. Trong motif
pyrimidine, mô ̣t OND gắn song song vào mạch purine của chuỗi DNA (T gắn
với A của chuỗi A-T và C gắn với G cua chuỗi G-C).
Các nghiên cứu in vitro về quá trình tổng hợp DNA (sử dụng các DNA
polymerase khác nhau ) cho rằng triplex có thể ức chế sự tổng hợp DNA (Hacia
và cs, 1994). TFO có khả năng ức chế sự phiên mã ở cả in vitro và in vivo
(Bailey và Weeks, 2000). Tuy nhiên, sự sao chép in vivo của DNA có bị ức chế
bởi sự hình thành triplex DNA không thì chưa rõ (Maine, 1994), bởi khi xử lí các
tế bào nuôi với TFO không làm chu kì tế bào ngừng lại.
5.4.5. SMaRT
SMaRT được viết tắt từ thuâ ̣t ngữ “cắt nối chéo RNA thông qua
spliceosome” (spliceosome mediated RNA trans-splicing). Ở eukaruote, gen sau
khi được phiên mã tạo thành mRNA, chúng sẽ bị cắt bởi các phân tử cắt
spliceosome (mô ̣t ribozyme) chuyên biê ̣t, tạo các đoạn intron, exon và sau đó nối
các đoạn exon lại với nhau. Quá trình này gọi là sự trưởng thành của phân tử
mRNA, chúng được tiến hành bằng hai cách: (1) cắt nối cis và (2) cắn nối trans.
Sự cắt nỗi cis là quá trình trưởng thành chủ yếu của mRNA diễn ra trong
các tế bào eukaryote. Các intron bị cắt và các exon của cùng mô ̣t pre-mRNA
được ghép để tạo thành mRNA trưởng thành. Sự cắt nối trans (cắt nối chéo)
216
hiếm có trong tế bào đô ̣ng vâ ̣t. Quá trình này xảy ra trên 2 pre-mRNA khác
nhau, exon của mRNA này có thể ghép nỗi vào exon của mRNA khác. Liê ̣u
pháp SMaRT được tiến hành bởi cơ sở cắt nối nói trên. Cấu trúc SMaRT sẽ trực
tiếp sửa chữa những đô ̣t biến gen nhờ thay thế các đoạn exon bị đô ̣t biến bằng
các exon bình thường, thông qua sự cắt nối bởi spliceosome.
Hình 5.42. Chiến lược SMaRT
217
Chương 6: Sự tồn tạo gen liệu pháp trong tế bào và nhóm gen mục tiêu
6.1. Sự tồn tại gen liệu pháp trong tế bào
Khi gen liê ̣u pháp vào tế bào, chúng có nhiều cách để tồn tại. Nhưng hầu
như có ba khả năng: thứ nhất, chúng bị phân hủy bởi các nuclease, thứ hai là
DNA sẽ tồn tại trong nhân hay trong cytoplasm như là mô ̣t episome, cuối cùng
chúng có thể sẽ sát nhâ ̣p vào bô ̣ gen tế bào chủ và trở nên ổn định lâu dài, chỉ
mô ̣t số trường hợp trở thành mô ̣t phần genome không ổn định.
Khả năng thứ nhất thường xảy ra khi tế bào được trô ̣n trực tiếp với DNA
hay phân tử DNA dạng thẳng. Các nuclease thường phân hủy ở các đầu mút của
phân tử DNA và dẫn đến sự phân hủy hoàn toàn phân tử DNA. Mô ̣t cách khác là
do sự kết hợp của nuclease và DNA ligase dẫn đến sự kết nối của các DNA
mạch thẳng theo kiểu đuôi-đuôi hình thành nên mô ̣t multimer và được gọi là
concatemer. Do đó, hầu như viê ̣c chuyển những phân tử DNA dạng thẳng vào
trong tế bào rất khó thành công.
Để giải quyết vấn đề trên, có thể sử dụng những dạng cấu hình khác của
phân tử DNA, chẳng hạn như dạng siêu xoắn và dạng duỗi thẳng, trong trường
hợp này, DNA sẽ tồn tại tốt hơn sau khi trô ̣n với các tế bào mục tiêu. Viê ̣c
chuyển các DNA dạng này thường sử dụng phương pháp biến nạp CaCl2/ CaPO4
hay dextran, hoă ̣c dùng dòng điê ̣n làm tăng kích thước lỗ màng, khi đó cho phép
DNA vào trong tế bào. Mô ̣t phương pháp khác cũng thường được sử dụng là
dùng các liposome. Để chuyển vào tế bào theo cách này thì DNA thường tồn tại
dưới dạng episome hơn là sát nhâ ̣p vào bô ̣ gen. Với khả năng thứ hai, khi chuyển
DNA sẽ có mô ̣t số thuâ ̣n lợi trong viê ̣c thể hiê ̣n các gen chuyển.
218
Khả năng thứ ba là sau khi đi vào tế bào, DNA sẽ sát nhâ ̣p vào bô ̣ gen của
tế bào chủ. Để thực hiê ̣n, DNA thường được đóng gói trong các liposome hay
được trô ̣n với những hợp chất giúp cho viê ̣c sát nhâ ̣p. Tuy nhiên, sự sát nhâ ̣p
được tiến hành theo cách này xảy ra ở tần số thấp. Có mô ̣t cách giúp cho viê ̣c sát
nhâ ̣p hiê ̣u quả là sử dụng các virus như là phương tiê ̣n chuyển gen.
Những virus này sẽ chèn vào bô ̣ gen tế bào chủ và trở nên thân thiê ̣n đối với
bô ̣ gen tế bào chủ. Retroviruse rất thuâ ̣n lợi cho vai trò này. Tuy nhiên mô ̣t khó
khăn khác gă ̣p phải khi sử dung các retroviruse là sự chèn ngẫu nhiên của chúng
dễ làm gián đoạn hoạt đô ̣ng của gen và cũng có khi sự sát nhâ ̣p ngẫu nhiên này
sẽ khởi đô ̣ng các gen chưa hoạt đô ̣ng do sự chèn promoter lên trước vùng gen mã
hóa. Tuy vâ ̣y, hiê ̣u quả sự sát nhâ ̣p DNA vào bô ̣ gen chủ yếu là do retroviruse
vector.
6.2. Nhắm gen mục tiêu
Sự tồn tại của các gen liê ̣u pháp khi đưa vào cơ thể rất phức tạp, thế nhưng
sự biểu hiê ̣n của chúng trong tế bào còn phức tạp hơn nhiều. Ngay khi gen liê ̣u
pháp chèn được vào trong bô ̣ gen thì cũng có khả năng kiểm soát sự biểu hiê ̣n
của những gen này bởi sự định vị thiếu chính xác của gen chèn vào trong bô ̣
gen.
Hơn nữa, dọc theo chiều dai NST chứa nhiều vùng gen ngoại lai không thể
cư trú được. Trong những vùng “cằn cỗi” này, các gen chuyển vào hầu như bị im
lă ̣ng (không thể biểu hiê ̣n) hay bị tiêu hủy. Những kĩ thuâ ̣t điều hòa sự biểu hiê ̣n
gen hiê ̣n đại được vay mượn từ các enhancer, insualator và những vùng kiểm
soát các locus (Locus control region – LCR) giúp cải thiê ̣n số phâ ̣n của những
đoạn chèn ngẫu nhiên. Tuy nhiên, những thành công còn ít và sự biểu hiê ̣n của
gen có thể thay đổi.
219
Mô ̣t giải pháp cho vấn đề này là đưa trực tiếp gen chuyển vào trí đă ̣c biê ̣t
trên trong bô ̣ gen. Thuâ ̣t ngữ này được hiểu như là nhắm chọn mục tiêu gen
(gene targeting).
Khi mô ̣t gen thông qua tái tổ hợp gắn vào nhân thì nó sẽ cải thiê ̣n được sự
sát nhâ ̣p ngẫu nhiên. Các chiến lược của viê ̣c nhắm mục tiêu như sau:
- Mô ̣t gen bình thường chèn vào mô ̣t vị trí không đă ̣c hiê ̣u bên trong bô ̣ gen
để thay thế cho những gen mất chức năng. Đây là phương pháp thông thường
nhất.
- Mô ̣t gen hỏng sẽ được thay thế bằng mô ̣t gen bình thường thông qua cơ
chế tái tổ hợp tương đồng.
- Sửa chữa các khiếm khuyết trong NST.
Hai nhân tố có khả năng ảnh hưởng đến vấn đề này: sự tái tổ hợp sẽ xảy ra
đối với bất kì vị trí nào trên bô ̣ gen đã có sự tương hợp ở những đầu mút của
mảnh DNA, điều này sẽ làm vỡ cấu trúc mạch đôi của phân tử DNA. Hai là tỉ lê ̣
sát nhâ ̣p vào bô ̣ gen ở những vị trí chuyên biê ̣t và không chuyên biê ̣t.
Nhiều thí nghiê ̣m trên tế bào đô ̣ng vâ ̣t đã cho thấy, sự tái tổ hợp tương đồng
là khả thi, nhưng lại hiếm xảy ra.
6.3. Ứng dụng
6.3.1. Chữa bệnh di truyền
6.3.1.1. Một số bệnh di truyền có thể chữa trị bằng liệu pháp gen
 Thiếu enzyme Adenosine Deaminase (ADA)
a) Nguyên nhân gây bệnh
220
Do sự tàn phá của lymphocyte tạo ra sản phẩm trao đổi chất độc. Thiếu
hụt ADA là một bệnh lý di truyền hiếm, cơ thể tạo ra không đủ ADA. Điều này
Hình 6.1. Bệnh nhân suy giảm
dẫn đến sự tích tụ của các sản phẩm phụ độc hại (T oxic metabolites) và có thể
miễn dịch trầm trọng (SCID)
gây nặng bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp (SCID). Thiếu ADA cũng liên quan
đến bệnh viêm phổi, chết tế bào tuyến ức và kém hiệu quả thụ thể tế bào lympho
T. Trẻ sơ sinh thiếu ADA làm tổn thương hệ thống miễn dịch và không thể tồn
tại mà không có cấy ghép tủy xương.
b) Cơ chế gây bệnh: Thiếu enzyme thoái hóa purin gây tích lũy cơ chất
deoxyadenosine là chất gây độc các lympho bào gốc làm cho tế bào này không
phân chia được.
c) Cách điều trị: ADA được chèn vào bạch cầu tủy xương bằng vector virus
hoặc liposome.
Hiện nay, người ta có thể chữa bệnh này bằng liệu pháp gene ex vivo gồm
có bốn bước cơ bản sau:
 Lấy các tế bào lympho T từ máu của bệnh nhân ADA-SCID.
 Thiết kế vector liệu pháp retrovirus mang gen ADA bình thường.
221
Nguồn:http://vinastemcelllab.com/vi/downloads/KT-Nuoi-cay-TBDV/Bai
%209%20-%20Chuyen%20gen.pdf
 Trộn vector liệu pháp với tế bào lympho T để thực hiện quá trình
chuyển gen vào tế bào lympho T.
Nguồn: http://vinastemcelllab.com/vi/downloads/KT-Nuoi-cay-TBDV/Bai
%209%20-%20Chuyen%20gen.pdf
 Đưa các tế bào Lympho T mang gen liệu pháp trở lại cơ thể người
bệnh. Kết quả sau khi điều trị liệu pháp gen từ 5-6 tháng số tế bào miễn dịch
lympho T tăng dần lên, sau hai năm khả năng miễn dịch của bệnh nhân được
phục hồi.
a. Tăng cholesterol (Hyper cholesteremia)
Nguyên nhân:
Thiếu các receptor cho sự hấp thụ lipoprotein, do đó tích lũy một lượng lớn
cholesterol trong máu và gan.
Cơ chế:
- LDL cholesterol là loại cholesterol xấu được sản xuất tự nhiên bởi cơ thể.
Mức độ cao của cholesterol LDL có liên quan đến xơ vữa động mạch, đó là sự
222
tích tụ của mỡ giàu cholesterol trong động mạch, dẫn đến các động mạch bị thu
hẹp, bị tắc làm chậm hay ngăn chặn dòng chảy của máu đến các cơ quan, đặc
biệt là tim và não. Khi LDL cholesterol cao, cholesterol sẽ được vận chuyển từ
máu về thành động mạch gây xơ vữa động mạch và nồng độ cholesterol trong
máu cao.
- Nồng độ HDL cholesterol giúp loại bỏ cholesterol khỏi các động mạch và
đưa nó trở về gan.
a) Cách điều trị
Chuyển gen bình thường mã hóa cho receptor (gen LDL) vào gan. Từ đó ức
chế hoạt động của enzyme HMG-Co reductase cần thiết cho quá trình sản xuất
cholesterol. Sử dụng phương pháp ex vivo các tế bào gan được thu lượm và trộn
lẫn với các retrovirus có chứa gen receptor LDL nguyên vẹn và trả lại vào cơ thể
bệnh nhân.
223
b. Xơ nang (Cystic fibrosis - CF)
Xơ nang là bệnh rối loạn di truyền nguy hiểm, tỷ lệ tử vong cao, rất ít người
sống được trên 35 tuổi. Bệnh gây tổn thương các tuyến ngoại tiết, dẫn đến các
bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính và thiểu năng tụy ở trẻ nhỏ, viêm phế quản và giãn
phế quản mạn tính, vô tinh trùng do tắc nghẽn ở nam giới.
224
Bình thường Xơ nang (CF)
Nguyên nhân:
Do những biến đổi ở gen CFTR (cystic fibrosis transmembrance regulator

gene) là nguyên nhân chính gây bệnh xơ nang làm rối loạn dẫn truyền Cl- và
Na+ ở tế bào biểu mô ở nhiều cơ quan gây tăng hấp thu Na+. Ở các trường hợp
xơ nang, nhiều nghiên cứu cho thấy trong 1.480 acid amin thiếu đi một
phenylalanine của gen mã hóa xơ nang do sự biến dị nhánh dài của nhiễm sắc thể
7.
Cách điều trị:
- Chuyển nhiễm gen CFTR vào tế bào trong khoang mũi và phổi.
- Sử dụng vector liệu pháp mang gen trị liệu cDNA (do kích thước gen CF
lớn nên chỉ tổng hợp cDNA từ mRNA mã hóa protein CFTR và một số trình tự
đặc hiệu) làm cho gen liệu pháp gắn với NST tại vị trí đặc hiệu.
- Sửa chữa gen bằng vector mang các oligonucleotide để sửa chữa đột biến
trên gen CF.
- Sử dụng kỹ thuật episomal, chuyển các đoạn cDNA cần thiết vào tế bào,
sao cho cDNA vào nhân dính với hệ gen ở một điểm nào đó và tồn tại như một
đơn vị độc lập.
225
c. Hồng cầu lưỡi liềm (Sickle all anemia β – thalassemia)
Nguyên nhân:
Do đột biến gen globulin B mã hóa chuỗi hemoglobin B tạo ra protein

không bình thường.
Cơ chế:
Do đột biến trội xảy ra ở gen mã hóa chuỗi β làm thay thế cặp T-A bằng
cặp A-T làm cho codon CTC mã hóa acid glutamic (ở mạch mang mã gốc) trở
thành codon CAC mã hóa Valin, biến HbA (dạng bình thường) thành HbS. Valin
có tính chất điện khác acid glutamic làm giảm khả năng vận chuyển oxi của Hb,
đông thời, sự thay thế bằng Valin sẽ làm cho Hb bị khử oxi trở thành không hòa
tan, hình thành những bó sợi hình ống quánh đặc làm biến đổi dạng hình cầu.
226
Ngoài ra, người ta cũng phát hiện một số dạng đột biến khác làm biến đổi
cấu trúc của Hb, biến HbA thành HbC do acid glutamic thay thế bằng Lysine.
Một đột biến trội khác ở gen Hb beta trên NST 11 gây ra bệnh
thalassemiea. Khi ở dạng đồng hợp thường gây thiếu máu trầm trọng ở trẻ em do
làm vỡ hồng cầu, hàm lượng Hb giảm, có thể gây chết.
b) Cách điều trị
227
Chuyển nhiễm gen hemoglobin A (HbA) vào tủy xương, hoặc là cấy tủy
xương từ người cho giống kiểu gen HLA/MLC cho bệnh nhân bị bệnh hồng cầu
lưỡi liềm.
Các bước điều trị:
- Tách tế bào tủy xương của người bệnh và chiếu xạ để chọn các tế bào
khỏe mạnh, trộn chung với retrovirus vector mang gen bình thường để tạo các tế
bào tủy xương tái tổ hợp.
- Xạ trị và điều trị hóa dược để tiêu diệt bớt các tế bào tủy xương mang gen
đột biến.
- Chuyển các tế bào tủy xương mang beta gloibin bình thường vào bệnh
nhân. Sau một thời gian các tế bào này sinh trưởng và bệnh giảm dần. Tuy nhiên,
bệnh có thể bị tái phát nên phải điều trị liên tục.
d. Máu khó đông (Hemophilia B)
Nguyên nhân:
228
- Trong máu có một loại protein giúp kiểm soát sự chảy máu gọi là yếu tố
đông máu. Khi cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ các yếu tố này, nhất là yếu tố
VIII và IX thì sẽ bị mắc bệnh ưa chảy máu. Điều đáng nói là chỉ nhiễm sắc thể
giới tính X mới có gene sản xuất hai yếu tố đông máu này, và nó có tính di
truyền. Thiếu gen tạo nhân tố VIII cần thiết cho sự đông máu sẽ gây ra bệnh máu
khó đông.
Gen mã hóa cho nhân tố VIII được chuyển vào tế bào tủy xương.
e. Bệnh Gaucher’ s
Nguyên nhân:
Khiếm khuyết gen tại vị trí số 21

trên cánh dài NST thường số 1 là
nguyên nhân gây bệnh Gaucher. Gen
này quy định mã hóa cho
enzyme glucocerebrosidase (hay còn
gọi là acid β-glucosidase) trong
lysosome, có nhiệm vụ phân hủy
glucocerebroside (hay còn gọi là
glucosylceramide), một thành phần
cấu tạo của màng hồng cầu và bạch
cầu. Khi thiếu enzyme
glucocerebrosidase, glucosylceramide
sẽ tích tụ trong các cơ quan, đặc biệt
là các cơ quan tạo huyết như gan,
229
lách, tủy xương (vì có liên quan đến việc phân hủy hồng cầu và bạch cầu), gây
nên bệnh Gaucher.
Cơ chế:
Gen GBA quy định mã hóa cho enzym glucocerebrosidase trong lysosome
có nhiệm vụ phân hủy glucocerebroside tích tụ trong các cơ quan gan, lách, tủy
xương => gây bệnh Gaucher’s.
a) Cách chữa trị:
- Phương pháp nội khoa: Thay thế gen tái tổ hợp tổng hợp enzyme
glucocerebrosidase hay chèn gen mã hóa cho glucocerebroside vào tế bào tủy =>
giảm kích thước gan, lách và các bất thường về xương.
- Phương pháp ngoại khoa: Ghép tủy xương để thay thế các tế bào máu
nhằm khôi phục thể trạng.
f. Loạn dưỡng cơ (Muscular dystrophy)
Nguyên nhân:
DMD (duchenne muscular dystrophy)

là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, có
bản chất là do đột biến gene Dystrophin cần
thiết cho sự phát triển của tế bào cơ. Ở bệnh
nhân DMD/BMD, gen DMD bị đột biến
làm cho protein dystrophin không được sản
xuất hoặc giảm số lượng đáng kể trên màng
tế bào sợi cơ. Tuy nhiên, cơ chế gây bệnh
không chỉ đơn giản là do mất dystrophin
mà nhiều nghiên cứu cho thấy rằng có
230
nhiều glyco-protein tương tác với dystrophin cũng không hiện diện trong bệnh
DMD. Những protein kết hợp 26 với dystrophin có thể liên quan trực tiếp với
dòng canxi vào sợi dystrophin, do đó, mất dystrophin có thể chỉ là bước đầu tiên
của quá trình dẫn đến loạn dưỡng cơ.
Cách chữa trị:
- Chuyển ghép nguyên bào cơ: lấy cơ trưởng thành của người thân không
mắc bệnh DMD (thường là từ bố) nuôi cấy in vitro, sau đó được tiêm vào cơ
loạn dưỡng của bệnh nhân để thay thế các tế bào cơ bị bệnh.
- Gen dystrophin được chuyển vào tế bào cơ bằng cách tiêm trực tiếp DNA
vòng hoặc RNA và sử dụng các vector virus.
- Thiết kế vector mang gen mini hoặc micro dystrophin: thiết kế các vector
chuyển gen đột biến xóa một số trình tự lặp lại như micro dystrophin xóa vùng
R4-R23, mini dystrophin xóa vùng H2-R19.
Bình thường Loạn dưỡng cơ (protein màng tế bào

xấp xỉ 0.01% protein cơ xương)
g. Khối u ác tính (Malignant melanoma)
Nguyên nhân:
Hư hỏng nhiều gen điều hòa hoạt động của tế bào.
231
Nguồn: Nguồn:
http://micro2tele.com/2014/01/23/hist http://www.slideshare.net/sariu2055/
oquarterly-superficial-spreading- malignant-melanoma-2791215
malignant-melanoma/
Cơ chế:
Sự hư hỏng nhiều gen điều hòa đã làm cho tế bào hoạt động không bình
thường, mô tăng sinh bất thường, tạo nên 1 khối tế bào thừa xâm lấn vào lãnh địa
của tế bào binh thường. Ban đầu, khối u ác tính phát sinh ở 1 số vị trí , sau đó
các tế bào ác tính di chuyển đến những nơi khác trên cơ thể gọi là di căn.
c) Cách điều trị:
232
Nhiễm gen B7 để tăng bạch cầu chống lại tế bào ung thư.
h. Bệnh bạch cầu tủy bào cấp tính (Acute myelogenous leukemina-
AML)
Nguyên nhân:
Bệnh về máu do biểu hiện quá mức của gen làm tăng sinh quá mức các
bạch cầu non chưa phân hóa hay phân hóa kém và ảnh hưởng đến việc tạo các tế
bào máu bình thường.
Cơ chế
Việc sản xuất các tế bào của tủy xương bị gián đoạn tạo ra các tế bào tủy
chưa trưởng thành (gọi là các tế bào non của bạch cầu) các tế bào này sẽ dồn ép
tế bào tủy bình thường dẫn đến sự suy giảm các tế bào máu bình thường, chúng
tích tụ lại và xâm nhập các cơ quan máu.
233
Nguồn: http://medrevise.co.uk/index.php?title=Acute_myeloid_leukaemia
c) Cách điều trị
Thay đổi di truyền tế bào bằng cách thay gen bất hoạt hay thêm đoạn
antisense để khóa hoạt động của gen ung thư.
i. Leukemia (bệnh bạch cầu)
Nguyên nhân:
Do đột biến chuyển đoạn cân bằng giữa NST số 9 (gen ABL) và NST số 22
(gen BCR) tạo ra gen đột biến BCR-ABL gây ra.
Các tế bào bạch cầu gốc (LCS) được hình thành do sự biến đổi trong quá
234
trình hình thành tế bào tạo máu và tế bào lympho. Các tế bào LSC có khả năng
tự làm mới như các tế bào gốc tạo máu (HSC), dẫn đến hình thành các tế bào
bạch cầu bệnh.
Sự chữa trị cho bệnh bạch cầu nặng với ligand CD40 và gen IL-2 làm biến đổi
các cục máu đông và các tế bào ung thư. Các nghiên cứu ở giai đoạn một của
kháng thể đơn dòng kháng CD45 của người ở các bệnh nhân bị bệnh bạch cầu
trước khi cấy các tế bào mầm đã được tiến hành. Có thể cấy tế bào gốc để hình
thành Allochimerism.
Hình 6.2. Cấy tế bào gốc để hình thành Allochimerism
Nguồn: http://lieuphaptebaogoc.com/lieu-phap-cay-ghep-te-bao-goc
235
k. Bệnh Hodgkin (u lympho hodgkin-HL)
Bệnh Hodgkin là bệnh ung thư hạch bạch huyết hay u lympho. Trong các tế
bào bạch huyết có chứa các tế bào Reed-sternberg.
Nguồn: http://ungbuouvietnam.com/benh-hodgkin-dac-diem-trieu-chung-
va-dieu-tri/
Nguyên nhân:
Do tế bào miễn dịch B đột biến trong DNA, các đột biến phân chia và phát
triển nhanh chóng trong hạch bạch huyết, gây ra hiện tượng xâm lấn các tế bào
khỏe mạnh.
- Phương pháp ex vivo: tách các tế bào T khỏi cơ thể người bệnh, nuôi cấy
và gắn thêm vào các phân tử thụ thể có khả năng nhận biết các tế bào bệnh, sau
đó đưa trở vào cơ thể người.
236
Hình 6.3. Điều trị ex vivo
Nguồn: http://vtc.vn/ung-thu-giai-doan-cuoi-song-sot-nho-lieu-phap-dieu-
tri-moi.321.595153.htm
- Ghép tế bào gốc (hay tủy xương): áp dụng cho các bệnh nhân ung thư
hạch bạch huyết tái phát. Người bệnh được hóa trị liệu liều cao để tiêu diệt hết tế
bào ung thư, sau đó lấy tế bào gốc đưa vào cơ thể người bệnh để kích thích sản
xuất các tế bào khỏe mạnh. Tuy nhiên, phương pháp này chưa được úng dụng
rộng rãi.
- Sự chữa trị bằng gen mã hóa cho kháng sinh neomycine được gắn trong
các tế bào T chuyên biệt với virus EBV (Epstein barr virus) cho các bệnh nhân bị
bệnh Hodgkin (dương tính với EBV tái phát). Đây như là một liệu pháp cho các
bệnh nhân nhận sự cấy ghép tủy xương ở bệnh Hodgkin dương tính EBV tái
phát.
237
Nguồn:http://yduocvn.com/?
x/=newsdetail&n=3508&/c/=13&/g/=50&/25/4/2010/bat-giu--xu-ly-va-trinh-
dien-khang-nguyen.html
l. Neuroblastoma (U nguyên bào thần kinh)
U nguyên bào thần kinh là một bệnh ung thư phát triển từ các tế bào thần
kinh được tìm thấy trong một số khu vực của cơ thể như bụng, cổ, ngực ...
238
Nguồn: Nguồn:
http://ungbuouvietnam.com/nhung- http://pedsurgzone.blogspot.com/201
phuong-phap-dieu-tri-u-nguyen-bao- 1/06/neuroblastoma-power-notes-
than-kinh-o-tre/ 1.html
Nguyên nhân:
Do đột biển di truyền trên tế bào bình thường mất kiểm soát và xâm lấn các
mô bên cạnh. U nguyên bào thần kinh bắt đầu từ tế bào thần kinh – tế bào thần
kinh chưa trưởng thành.
Điều trị:
- Ghép các tế bào gốc tạo máu: tủy xương sản xuất tế bào gốc trưởng thành
và phát triển thành các tế bào, thu thập các tế bào gốc qua hóa trị liệu liều cao
tiêu diệt các tế bào ung thư, sau đó tiêm vào cơ thể.
- Đang có nhiều nghiên cứu ở phase 1 của gen mã hóa cho Chemokine và
Cytokine, biến đổi các tế bào ung thư thần kinh để thử nghiệm chữa trị các bệnh
ung thư tế bào thần kinh dai dẳng, hay tái phát bằng cách sử dụng Vector
adenoviruse. Sự điều trị bằng gen mã hóa cho kháng sinh Neomycine được gắn
trong các tế bào T chuyên biệt với tế bào Neuroblastoma.
6.3.1.2. Các bệnh di truyền không phù hợp với chữa trị bằng liệu pháp gen
a. Sự mất trật tự của NST
Nguyên nhân:
- Do các tác nhân đột biến như phóng xạ, hóa chất... hoặc do môi trường nội
bào bất thường.
239
- Kết quả tác động tùy thuộc từng NST (NST thường hay giới tính), giai
đoạn hình thái của các NST.
Cơ chế:
- Cơ chế phát sinh: Tác nhân đột biến hay rối loạn nội bào làm quá trình
nhân đôi hoặc tiếp hợp của NST xảy ra bất thường. Nói chung, sự đứt đoạn là
dạng đột biến ban đầu, thường xảy ra khi NST ở dạng sợi mảnh, chưa xoắn đến
mức cao nên dễ đứt trong phân bào, từ đó có thể gây ra mất đoạn, lặp đoạn, đảo
đoạn và chuyển đoạn.
- Cơ chế di truyền: Nếu đột biến xảy ra trong giảm phân có thể sinh ra giao
tử khác thường. Giao tử mang NST đã đột biến kết hợp với giao tử khác (bình
thường hoặc có đột biến) tạo nên hợp tử mang đột biến từ đó sinh ra thể đột biến.
Bảng 6.1. Các bệnh do đột biến NST gây nên
TÊN BỆNH – TÍNH CHẤT

STT LOẠI ĐỘT BIẾN
HỘI CHỨNG BIỂU HIỆN
1 Bệnh ung thư Do đột biến mất đoạn NST 21 Biểu hiện cả ở
máu hoặc 22. nam và nữ
2 Hội chứng Do đột biến NST dạng thể ba ở Biểu hiện cả ở

Down NST 21 (có 3 NST 21), bộ NST nam và nữ,
có 47 NST hay do chuyển đoạn thường xảy ra ở
không cân bằng liên quan đến 2 những trẻ em
nhánh dài của NST 13,14 (chủ sinh ra từ người
yếu là 14) và NST 21 hoặc giữa mẹ ngoài 35 tuổi
NST 21 và 22.
3 Hội chứng Đột biến số lượng NST dạng thể Biểu hiện cả ở
240
Edward ba có 3 NST 18 do vậy có 47 nam và nữ.
NST.
4 Hội chứng Patau Đột biến số lượng NST dạng thể Biểu hiện cả ở
ba có 3 NST 13 do vậy có 47 nam và nữ
NST.
5 Hội chứng Siêu Đột biến số lượng NST dạng thể Chỉ gặp ở nữ.
nữ (XXX) ba nên có ba NST giới tính X.
6 Hội chứng Đột biến số lượng NST dạng thể Chỉ gặp ở nữ.
Turner (XO) một ở NST giới tính X.
b. Tính trạng trội và phức tạp
Ví dụ như sự thông minh hay sức bền thể chất do một loạt các gen ngấm
ngầm chi phối. Tính trạng trội: cũng như những bệnh về tính trạng lặn sẽ khó
khăn trong việc chữa trị bằng liệu pháp gen trong tương lai. Các bệnh về đột biến
gen tính trạng trội thường là sự thiếu một số loại enzyme nào đó cần cho cơ thể.
Phương pháp điều trị:
Các bệnh do tính trạng trội và phức tạp do một loạt các gen cùng chi phối vì
vậy để điều trị cần chèn một lượng lớn các gen vào tế bào, với các phương pháp
trong liệu pháp gen thì điều này là bất khả thi. Các phương pháp chuyển gen
được sử dụng trong liệu pháp gen chỉ cho phép chuyển gen có kích thước nhỏ,
mặt khác, khi đưa gen vào cơ thể cần đảm bảo gen đáp ứng miễn dịch cơ thể để
không bị đào thải nên việc đưa lượng lớn gen vào cùng lúc sẽ không thể kiểm
soát được.
241
 Khó khăn và triển vọng của liệu pháp gen trong điều trị các bệnh di
truyền
- Vấn đề an toàn: Liệu pháp gen là trường hợp đặc biệt của kỹ thuật chuyển
gen trực tiếp trên người bệnh, vì vậy cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy định để
giảm thiểu rủi ro.
- Một số rủi ro trong liệu pháp gen:
Trạng thái tự nhiên ngắn (hiệu quả ngắn).
Phản ứng miễn dịch làm giảm hiệu quả của liệu pháp gen và sự lặp lại liệu
pháp gen không có ý nghĩa.
Có nhiều bệnh do rối loạn đa gen gây ra (nhiều gen cùng tác động gây ra
bệnh).
Gắn sai vị trí gen hay gây đột biến gen lành.
 Gen mới được đưa vào không nằm trong phức hợp điều hòa nên có thể
được điều khiển một cách tùy tiện, không đúng vị trí (các tế bào hay mô đặc
hiệu) và không đúng thời điểm (đúng chu trình phát triển của cá thể), hay không
được biểu hiện.
 Một số loại vector liệu pháp khi đưa vào cơ thể người như Adenovirus,
Retrovirus... có thể biến đổi trở thành tác nhân gây bệnh của một số gen đột biến
vẫn chưa đầy đủ.
- Một số khó khăn hiện nay trong ứng dụng liệu pháp gen trong chữa trị các
bệnh:
Liệu pháp gen chỉ được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng, còn tế
bào sinh dục bị nghiêm cấm vì lý do đạo đức.
242
Kỹ thuật sử dụng trong liệu pháp gen phức tạp, đòi hỏi chính xác mà chỉ
một số phòng thí nghiệm tiên tiến mới thực hiện được. Vì vậy, liệu pháp gen
trong điều trị, chữa bệnh còn phải được nghiên cứu và cải tiến hơn mới có hiệu
quả rõ rệt.
- Triển vọng của liệu pháp gen
Trên thế giới, liệu pháp gen đã được nhiều nước tiên tiến thực hiện và đã
nghiên cứu, điều trị cho nhiều bệnh nhân mắc các bệnh di truyền như bệnh suy
giảm miến dịch trầm trọng, thiếu máu do hồng cầu hình liềm, bệnh xơ nang...
Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện nay hứa hẹn sẽ khắc phục
được các vấn đề khó khăn trong nghiên cứu cũng như ứng dụng liệu pháp gen
trong điều trị các bệnh, đặc biệt là các bệnh di truyền trên người.
6.3.2. Chữa bệnh ung thư
Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một
cách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng
cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn).
Những nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy quá trình điều hòa sự phân bào
của tế bào liên quan tới nhiều gen mã hóa cho protein. Có nhiều mối quan hệ
giữa gen bất thường (đột biến) và ung thư như sự hoạt hóa của các oncogene và
sự bất hoạt các gen ức chế ung thư.
243
Nguyên nhân gây ung thư: Là sự sai hỏng của DNA, tạo nên các đột biến ở
các gen thiết yếu điều khiển quá trình phân bào cũng như các cơ chế quan trọng
khác. Một hoặc nhiều đột biến được tích lũy lại sẽ gây ra sự tăng sinh không
kiểm soát và tạo thành khối u.
Các phương pháp điều trị ung thư phổ biến bao gồm phẫu thuật, hóa trị
liệu, xạ trị liệu, miễn dịch trị liệu. Các phương pháp này có nhược điểm: Phẫu
thuật không hiệu quả với các chứng di căn. Hóa trị liệu, xạ trị liệu và miễn dịch
trị liệu gây thương tổn đến các mô lành.
Biện pháp phẫu thuật ung thư Biện pháp xạ trị ung thư
244
Biện pháp hóa trị ung thư
 Liệu pháp gen điều trị ung thư thường

theo xu hướng tác động trực tiếp vào khối u
theo các phương thức khác nhau:
- Thay những gen bị thiếu hoặc bị thay đổi

bằng những gen khỏe mạnh.
- Tăng cường đáp ứng miễn dịch của bệnh

nhân từ đó kích thích khả năng tự nhiên của cơ
thể chống lại tế bào ung thư.
- Đưa gen vào trong các tế bào ung thư để làm chúng nhạy cảm hơn với hóa
trị, xạ trị và những phương pháp điều trị khác.
 Một số chiến lược của liệu pháp gen chữa các bệnh ung thư gồm:
Liệu pháp gen miễn dịch (immunogene therapy)
Điều trị ung thư bằng liệu pháp gen miễn dịch là bằng một cách nào đó kích
thích hệ miễn dịch của cơ thể gia tăng số lượng các tế bào miễn dịch,đặc biệt là
đại thực bào (Macrophage) và tế bào giết tự nhiên ''NK'' nhằm tăng cường khả
năng tiêu diệt tế bào ung thư và khống chế khả năng phát triển, di căn của khối u
ung thư.
245
Liệu pháp gen ức chế khối u (tumor suppressor gene therapy)
Việc ức chế khối u nhằm ngăn cho khối u tiếp nhận chất dinh dưỡng để
phát triển.
246
Liệu pháp gen hóa học (chemogene therapy)
Liệu pháp ức chế sự tạo mạch (aginogenesis therapy)
Khối ung thư rất cần mạch máu cho sự phát triển của chúng bởi máu là
nguồn cung cấp oxy và dinh dưỡng liên tục cho tế bào ung thư. Các khối u
thường tiết ra những yếu tố kích thích di căn, sự tăng trưởng nhanh và hình thành
247
mạch máu mới. Do đó các khối u không thể phát triển nếu không có hệ thống
mạch máu nuôi dưỡng nên việc ngăn chặn hình thành mạch (sự phát triển của
các mạch máu mới) đang là mục tiêu của điều trị ung thư.
Liệu pháp virus hủy khối u (oncolitic vius therapy)
VD: Bệnh bạch cầu lympho mãn tính được biểu hiện bởi sự tăng sinh bất
thường của một số bạch cầu đó là lympho bào B. Tận dụng một loại virus vô hại,
chúng gắn vào trong bộ mã gen của lympho T, gắn vào protein CD19, hiện diện
ở bề mặt lympho B. Sự gắn kết này gây ra hai hậu quả: lympho T phá hủy
lympho B và tự nhân bản. Sau đó lympho bào T bị biến đổi gen được tiêm vào
cơ thể bệnh nhân, tiêu diệt ung thư.
Trong liệu pháp gen ung thư, vector có bản chất virus và các vector khác
đều có thể sử dụng, nhưng các vector không có bản chất vius có hiệu quả biến
nạp in vivo thấp hơn, nên các vector virus thường được sử dụng hơn.
Đối với các vector virus thì vector retrovirus và vector adenovirus được
chú trọng hơn cả. Song, các vector retrovirus chỉ có thể nhiễm vào tế bào bị ung
248
thư và khi sát nhập vào tế bào chủ, chúng có thể gây đột biến chèn đoạn. Vì vậy,
hầu hết các quy trình liệu pháp gen bệnh ung thư chỉ nên sử dụng các
adenoviruse.
6.3.3. Chữa bệnh nhiễm, bệnh mắc phải
Các nhà khoa học đang tích cực nghiên cứu, ứng dụng liệu pháp gen trong
chữa trị các bệnh ở người bởi các tác nhân vi sinh vật, đặc biệt với các tác nhân
gây bệnh là virus. Trong hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người
(AIDS) do virus HIV gây ra đang được tìm hiểu nhiều nhất bởi tính nguy hiểm
của chúng.
Một số chiến lược liệu pháp gen cho bệnh AIDS:
- Can thiệp trực tiếp vào quá trình sao chép của virus bằng các nucleotide,
hay các protein chống virus.
- Cảm ứng quá trình chết của virus HIV ngay trong tế bào.
- Tăng cường miễn dịch bằng cách đưa những gen hay các chất vào cơ thể.
Công việc cần tiến hành là can thiệp vào con đường xâm nhập của virus
HIV. Sự gắn virus HIV lên bề mặt tế bào là bước đầu tiên trong quá trình sao
chép của virus. Mục đích đặt ra là khóa sự tương tác giữa virus HIV và receptor
CD4 hay những đồng receptor khác. Ở bước thứ hai, khóa sự phiên mã và dịch
mã của virus, việc này có thể sử dụng các antisense, các ribozyme…để phân hủy
gen hay sử dụng các protein trị liệu nhằm gắn kết, gây bất hoạt các protein của
virus, từ đó quá trình phiên mã và dịch mã không thể xảy ra. Gần đây, vaccine
DNA được nghiên cứu mã hóa cho những phân tử protein gây đáp ứng miễn dịch
khi đưa vào cơ thể.
249
Các DNA được sử dụng làm vaccine thường là những gen mã hóa cho các
phân tử protein đặc trưng, gây đáp ứng miễn dịch mạnh và không độc của virus.
Khi các hạt virus HIV thoát khỏi tế bào nhiễm thì bộ gen của nó vẫn còn
tốn tại trong tế bào chủ (đã được sát nhập vào bộ gen tế bào). Do vậy, để có thể
xóa sạch các dấu vết virus trong cơ thể phải cảm ứng tạo sự chết cho các tế bào
đã bị nhiễm. Đây là sự cảm ứng chết chọn lọc với những tế bào mới bị nhiễm
virus và với cả những tế bào có DNA virus đã sát nhập trong bộ gen.
Tăng cường đáp ứng miễn dịch cho tế bào có thể tiến hành ba phương
pháp sau:
(1) Đưa gen mã hóa cho thymidine kinase của virus herpes simplex vào tế
bào nhiễm virus HIV (HSV-tk), thông qua vector HIV-1. Những tế bào biểu hiện
gen HSV-tk sẽ bị tiêu diệt bởi ganciclovir. Đây là liệu pháp trước khi dùng thuốc
(produg).
(2) Sự biểu hiện nội bào của kháng thể, chuỗi nặng và nhẹ của mảnh Fab
sẽ bảo vệ được các tế bào limpho khỏi sự nhiễm của HIV.
(3) Tăng cường hệ miễn dịch bằng cách them vào các lymphokine và
cytokine, chẳng hạn interferon có tác dụng lên nhiều bước khác nhau trong chu
trình sống của virus HIV
6.3.4. Liệu pháp gen ứng dụng trong cấy ghép
Những thành tựu to lớn trong việc sử dụng các loại thuốc ức chế miễn dịch
như cyclosporine, corticosteroid, rapamycin… đã làm tăng tỉ lệ dung nạp mảnh
ghép thành công từ 70 – 85% và kéo dài thời gian dung nạp từ 1 – 5 năm. Tuy
nhiên, việc này luôn tiềm ẩn những rủi ro lớn như sự phát triển của ung thư, các
bệnh nhiễm… Do vậy, liệu pháp gen là chiến lược tốt, tối ưu hóa cho việc cấy
250
ghép, đồng thời giải quyết được những hạn chế hiện tại của các thuốc ưc chế
miễn dịch.
Trong lĩnh vực cấy ghép cơ quan, liệu pháp gen được ứng dụng nhằm ngăn
cản sự đào thải cấp tính, hay mãn tính các mô ghép bằng cách đưa những gen
mới có vai trò ngăn cản sự thải loại (như những gen mã hóa cho những phân tử
khóa sự đồng kích thích, những cytokine ức chế miễn dịch, hay các antisense
khóa sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các phân tử liên quan đến sự thải loại
mô ghép). Ngoài ra, các nhà khoa học còn thử nghiệm tiến hành đưa những gen
mã hóa các dị kháng nguyên (alloantigene) nhằm kích thích hơn nữa sự dung nạp
mô ghép.
Liệu pháp gen ứng dụng trong cấy ghép đầu tiên được tiến hành bởi
Haskova và Medawar (1958). Trong thí nghiệm của Medawar, DNA từ lách của
chủng chuột cho mô ghép (A) được tách chiết và tiêm 5mg vào khoang màng
bụng của chủng chuột nhận mô ghép (CBA). Sau 3 -5 ngày tiêm, tiến hành cấy
da của chuột cho mảnh ghép A cho chuột nhận mảnh ghép (CBA) và theo dõi.
Kết quả cho thấy mảnh ghép cấy trên chuột được tiêm DNA bị thải loại cùng tỉ
lệ với mảnh ghép cấy trên chuột không được tiêm DNA và không biểu hiện
những đáp ứng tăng cường. Ở thí nghiệm khác, Medawar tiến hành tiêm DNA
của chủng với liều cao vào các chuột mới sinh để cảm ứng sự dung nạp miễn
dịch. Kết quả cho thấy có sự dung nạp của mảnh ghép, tuy nhiên sự dung nạp
không kéo dài đến lần cấy ghép sau.
6.3.5. Liệu pháp gen và việc “thiết kế con người”
Đã từ lâu, nhiều gia đình mong muốn con cái khi sinh ra khỏe mạnh, thông
minh, ngoại hình đẹp… Sự kết hợp giữa chẩn đoán phân tử và liệu pháp gen giúp
thực hiện ước mơ đó. Chẩn đoán phân tử tiến sinh giúp sáng lọc và chọn lọc
251
những tính trạng mong muốn (chẳng hạn giới tính của trẻ), một số bệnh, đặc biệt
là bệnh di truyền mà đứa trẻ có thể mắc phải. Hơn nữa, liệu pháp gen còn có thể
giúp thay đổi tính trạng của đứa trẻ.
Để thay đổi tính trạng, phải xác định được tất cả (hay đủ) những gen đặc
biệt khác nhau mà sự hiện diện hay vắng mặt của nó sẽ đồng tương tác với
những tính trạng mong muốn như thông minh hơn, trí nhớ tốt hơn, chịu được
lạnh, chịu được nóng… Sau khi những gen này được xác định, thì tiến hành tách
chiết, sao chép, hay tổng hợp và sau đó chèn vào những tế bào phôi giai đoạn
sớm (blastomere) hay có thể vào tinh trùng hay trứng.
Bằng cách này, đứa trẻ ra đời sẽ mang tính trạng mong muốn. Tuy nhiên
các tính trạng mà con người mong muốn (ngoại hình đẹp, thông minh, trí nhớ
tốt…) thì hầu hết đều đa gen, nghĩa là phụ thuộc vào nhiều gen đặc biệt nào đó
tại một vài hay nhiều locus khác nhau. Mối quan hệ và tương tác giữa những gen
này cũng như ảnh hưởng giữa chúng và môi trường rất phức tạp. Do vậy, để có
thể “thiết kế con người” mong muốn, khoa học còn tiếp tục giải quyết nhiều khó
khăn đặt ra.
Ngoài ra, bằng liệu pháp gen, con người có thể tạo ra những sinh vật mới.
Sinh vật mới là kết quả của sự kết hợp những tính trạng của các cá thể khác
nhau. Tuy nhiên, việc thiết kế con người cũng như là tạo sinh vật mới đang gây
tranh cãi rất nhiều.
252

SH3060-Chẩn đoán phân tử và liệu pháp gen

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

SH3060-Chẩn đoán phân tử và liệu pháp gen

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

& LIỆU PHÁP GEN

1.1. Chẩn đoán.......................................................................................................5

1.2. Sàng lọc...........................................................................................................6

1.3. Đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u...................................................................................6

1.4. Các vấn đề cơ bản trong chẩn đoán................................................................8

1.4.1. Nhận diện mẫu.........................................................................................8

1.4.2 Lập luận xác suất.......................................................................................9

1.4.3. Ý kiến nguyên nhân.................................................................................9

Chương 2: Một số kỹ thuật chẩn đoán bệnh.....................................................10

2.1. Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm..............................................................................10

2.2. Kỹ thuật tế bào học.......................................................................................11

2.2.1. Nhuộm in vitro.......................................................................................11

2.2.2. Nhuộm in vivo........................................................................................19

2.3. Phương pháp miễn dịch học..........................................................................20

2.3.1. Western blot...........................................................................................20

2.3.2. Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry).........................................24

2.3.3. Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA)....................................26

2.3.4. Xét nghiệm ngưng kết (Agglutination test)............................................31

2.3.5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)....................................34

2.4.1. Các kiểu mẫu dò trong FISH.................................................................42

2.4.2. Hai kiểu tế bào sử dụng FISH................................................................43

2.5. Phương pháp FLOW CYTOMETRY...........................................................47

2.5.1. Khái niệm...............................................................................................47

2.5.2. Lịch sử....................................................................................................47

2.5.3. Nguyên tắc hoạt động............................................................................48

2.5.4. Phân tích kết quả....................................................................................55

2.6. Phương pháp khuếch đại nucleic acid...........................................................60

2.6.1. Chuẩn bị mẫu.........................................................................................61

2.6.2. Khuếch đại.............................................................................................64

2.6.3. Phát hiện và phân tích............................................................................72

2.6.4. Giải trình tự nucleic acid........................................................................85

2.6.5. Sử dụng chip trong phân tích.................................................................89

Chương 3: Ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán..................................................90

3.1. Chẩn đoán bệnh nhiễm..................................................................................90

3.1.1. Quan sát thông qua kính hiển vi............................................................90

3.1.2. Nuôi cấy và xác định..............................................................................91

3.1.4. Phương pháp miễn dịch.........................................................................93

3.1.5. Phương pháp sử dụng nucleic acid........................................................94

3.2.1. Sàng lọc và phát hiện sớm.....................................................................95

3.2.2. Chẩn đoán thông thường........................................................................98

3.2.3. Chẩn đoán phân tử...............................................................................101

3.3. Chẩn đoán bệnh di truyền...........................................................................105

3.3.1. Chẩn đoán trước làm tổ (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD)105

3.3.2. Chẩn đoán tiền sinh (Prenatal diagnosis).............................................109

Chương 4: Một số khái niệm cơ bản trong liệu pháp gen..............................118

4.1. Giới thiếu....................................................................................................118

4.2. Tế bào mục tiêu...........................................................................................120

4.2.1. Tế bào sinh dưỡng................................................................................120

4.2.2. Tế bào sinh dục....................................................................................121

Chương 5: Liệu pháp gen.................................................................................123

5.1. Lịch sử nghiên cứu liệu pháp gen...............................................................123

5.2. Chiến lược liệu pháp gen............................................................................127

5.2.1. Liệu pháp in vivo..................................................................................127

5.2.2. Liệu pháp ex vivo.................................................................................128

5.3.1. Vector có bản chất virus.......................................................................131

5.3.2. Vector retrovirus (Rv).........................................................................132

5.3.3. Vector adenovirus (Ad)........................................................................147

5.3.5. Hệ thống vector virus simplex herpes..................................................163

5.3.6. Những vector virus khác......................................................................168

5.4.4 Triplex DNA.........................................................................................214

6.1. Sự tồn tại gen liệu pháp trong tế bào..........................................................218

6.2. Nhắm gen mục tiêu.....................................................................................219

6.3. Ứng dụng.....................................................................................................220