ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------o0o-------

ĐẶNG NGỌC BÁCH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
LOÀI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2014
 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐẶNG NGỌC BÁCH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
LOÀI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

Mã số : 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoài Nam

PGS.TS. Phan Minh Giang

HÀ NỘI – 2014
 LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong khuôn khổ Đề tài nghiên
cứu cơ bản định hướng ứng dụng: “Nghiên cứu quy trình phân lập các hoạt chất có
tác dụng diệt tế bào ung thư, kháng viêm và kháng khuẩn từ một số loài thuộc lớp
Sao biển (Asteroidea), Hải sâm (Holothuroidea), Cầu gai (Echinoidea) thuộc ngành
Da gai (Echinodermata) ở biển Việt Nam”.
Trước tiên, với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
TS. Nguyễn Hoài Nam, Viện Hóa Sinh Biển và PGS. TS. Phan Minh Giang,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tận tình hướng
dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đặc biệt là tập
thể cán bộ phòng Dược liệu biển đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa hoc - Trường
ĐHKHTN, ĐHQGHN đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại
trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong quá trình học
tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng
nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy kính mong nhận
được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô.

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Đặng Ngọc Bách

 LỜI CAM ĐOAN

Luận văn “Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học
loài cầu gai Diadema savignyi”. là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Hoài Nam và PGS. TS. Phan Minh Giang.
Tôi xin cam đoan Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực, không
trùng lặp và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khác.

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Đặng Ngọc Bách

 MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai ............................................................ 3
1.1.1. Động vật học ................................................................................................. 3
1.1.2. Phân bố sinh thái ........................................................................................... 3
1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm ............................................................ 4
1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai .................................. 5
1.2 Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam ..................................................... 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 12
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ............................................................... 13
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC) ................................................................................ 13
2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế ............................................................................ 13
2.2.3. Sắc kí cột (CC)............................................................................................ 13
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất .............................. 13
2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ........................................................ 14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 16
3.1. Kết quả .......................................................................................................... 16
3.1.1. Xử lý mẫu và tạo dich chiết tổng .................................................................. 16
3.1.2. Phân lập các hợp chất ................................................................................. 17
3.2. Thảo luận ........................................................................................................ 20
3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất....................................................... 20
3.2.1.1. Hợp chất DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol ..................................... 20
3.2.1.2. Hợp chất DS2: Cholest-5-en-3β,7α-điol .................................................... 25
3.2.1.3. Hợp chất DS3: Cholest-5-en-3β,7β-điol .................................................... 28
3.2.1.4. Hợp chất DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol ............................................. 32
3.2.1.5. Hợp chất DS5: cholest-5-en-3β-ol ............................................................. 36
3.2.1.6. Hợp chất DS6: Natri cholest-5-en-3β-sunfat ............................................. 40
3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất .................................... 45
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48
 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ

1 CC Column Chromatography
2 COSY Correlation Spectroscopy
3 DEPT Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer

4 SKLM Sắc kí lớp mỏng

5 TLC Thin Layer Chromatography
6 NMR Nuclear Magnetic Resonance
13
7 C-NMR Cacbon-13-Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
1
8 H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
1
9 H-1H COSY 1
H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy
10 HMQC Heteronuclear Multiple Quantum
Coherence
11 HMBC Heteronuclear Multiple Bond
Connectivity
 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Cầu gai S. droebachiensis 4

Hình 1.2. Cầu gai D. setosum 5
Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi 12
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Cầu gai Diadema savignyi 19
Hình 3.1.a. Phổ 1H-NMR của DS1 20
Hình 3.1.b. Cấu trúc hóa học của DS1 20
13
Hình 3.1.c. Phổ C-NMR của DS1 21
Hình 3.1.d. Phổ HMQC của DS1 21
Bảng 3.1. Các số liệu phổ NMR của DS1 22
Hình 3.1.e. Phổ HMBC của DS1 23
Hình 3.1.f. Phổ COSY của DS1 24
Hình 3.1.g. Các tương tác COSY (▬) và HMBC ( ) chính của DS1 24
Hình 3.2.a. Phổ 1H-NMR của DS2 25
Hình 3.2.b. Cấu trúc hóa học của DS2 25
Hình 3.2.c. Phổ 13C-NMR của DS2 26
Hình 3.2.d. Phổ HMQC của DS2 26
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của DS2 27
Hình 3.2.e. Phổ HMBC của DS2 28
Hình 3.2.f. Các tương tác HMBC chính của DS2 28
Hình 3.3.a. Phổ 1H-NMR của DS3 29
Hình 3.3.b. Cấu trúc hóa học của DS3 29
13
Hình 3.3.c. Phổ C-NMR của DS3 30
Hình 3.3.d. Phổ HMQC của DS3 30
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của DS3 31
Hình 3.3.e. Phổ HMBC của DS3 32
Hình 3.3.f. Các tương tác HMBC chính của DS3 32
Hình 3.4.a. Phổ 1H-NMR của DS4 33
Hình 3.4.b. Cấu trúc hóa học của DS4 33
13
Hình 3.4.c. Phổ C-NMR của DS4 34
Hình 3.4.d. Phổ HMQC của DS4 34
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của DS4 35
Hình 3.4.e. Phổ HMBC của DS4 36
Hình 3.4.f. Các tương tác HMBC chính của DS4 36
Hình 3.5.a. Phổ 1H-NMR của DS5 37
Hình 3.5.b. Cấu trúc hóa học của DS5 37
Hình 3.5.c. Phổ 13C-NMR của DS5 38
Hình 3.5.d. Phổ HMQC của DS5 38
Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của DS5 39
Hình 3.5.e. Phổ HMBC của DS5 40
Hình 3.5.f. Các tương tác HMBC chính của DS5 40
Hình 3.6.a. Phổ 1H-NMR của DS6 41
Hình 3.6.b. Cấu trúc hóa học của DS6 41
Hình 3.6.c. Phổ 13C-NMR của DS6 42
Hình 3.6.d. Phổ HMQC của DS6 42
Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của DS6 43
Hình 3.6.e. Phổ HMBC của DS6 44
Hình 3.6.f. Các tương tác HMBC chính của DS6 44
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 46
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

LỜI MỞ ĐẦU

Diện tích bề mặt trái đất vào khoảng 510.072.000 km2 trong đó đại dương
bao phủ hơn 3/4 tổng diện tích bề mặt. Đại dương không chỉ là nơi sinh sống của
hàng ngàn loài động vật biển khác nhau mà còn ẩn chứa trong đó vô vàn điều bí ẩn
chờ đợi con người tìm hiểu và khám phá.

Việc nghiên cứu khai thác và sử dụng các nguồn lợi từ biển luôn là chủ đề
nóng bỏng đối với các nhà khoa học trên khắp thế giới. Trong những năm gần đầy
Việt Nam đã và đang có các công trình khoa học nghiên cứu về sinh vật biển, một
trong các xu hướng mới mở ra là tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
sinh học cao từ sinh vật biển. Từ đó nghiên cứu thành phần, cấu trúc và tổng hợp
nên các hợp chất có giá trị y học cao. Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới,
có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều
loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Hơn thế với bờ biển kéo dài và
thềm lục địa rộng lớn đó là nơi cất giấu kho nguyên liệu khoáng vật khổng lồ dưới
dạng hòa tan, nắng đọng dưới đáy và vùi kín dưới đại dương. Trong sự đa dạng của
sinh vật biển thì loài cầu gai là một trong những loài nhận được sự quan tâm đặc
biệt của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Ở Việt Nam cầu gai không những
có giá trị ẩm thực mà con mang giá trị y học. Các công trình khoa học nghiên cứu
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới cho thấy các hợp chất tách ra
từ cầu gai có hoạt tính sinh học cao như kháng khuẩn kháng nấm, kháng viêm đặc
biệt là khả năng ức chế các tế bào gây ung thư. Tuy nhiên ở nước ta những thông tin
khoa học về loài này vẫn còn nhiều hạn chế, chưa có các nghiên cứu cụ thể làm
sáng tỏ giá trị dược dụng của dược liệu quý này. Do đó, nội dung nghiên cứu của đề
tài nhằm phát hiện các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học quý báu góp phần
minh chứng giá trị dược dụng của loài. Kết quả nghiên cứu sẽ làm tăng giá trị khoa
học và thực tiễn góp phần khai thác và bảo tồn một cách có hợp lý nguồn tài nguyên
cầu gai phong phú của đất nước.

Đặng Ngọc Bách 1 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Trên cơ sở đó, luận văn tốt nghiệp này tập trung vào: “Nghiên cứu thành
phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai Diadema savignyi”.
Mục tiêu của đề tài:
Nghiên cứu nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần làm
sáng tỏ tác dụng dược lý của nguồn dược liệu quý, đồng thời góp phần cho việc sử
dụng hợp lý, hiệu quả và bảo tồn nguồn nguyên liệu biển quý giá của đất nước.
Nội dung của đề tài:
1. Phân lập một số hợp chất từ loài cầu gai Diadema savignyi
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được
3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được.

Đặng Ngọc Bách 2 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai

1.1.1. Động vật học

Cầu gai hay còn gọi là nhím biển (hay nhum biển, chôm chôm biển) thuộc
lớp cầu gai (Echinoidea) ngành động vật da gai (Echinodermata), có hai phân lớp;
cầu gai đều xuất hiện vào kỉ Silua và cầu gai không đều xuất hiện vào kỉ Jura. Cầu
gai có khoảng 800 loài hiện sống và 2.500 loài đã tuyệt chủng [3].
Cầu gai còn được gọi là nhím biển hay cà ghim bởi xung quanh loài hải sản
này là hàng trăm que nhọn như lông nhím, có đối xứng tỏa tròn bậc 5 [2]. Nhím
biển sống gần các rạn san hô, rạn đá ven biển. Khi nhìn thoáng qua, thì Cầu Gai có
vẻ như một vật bất động, hay đúng hơn là không có khả năng di chuyển. Dấu hiệu
rõ ràng nhất để chứng minh chúng thật sự là động vật là ở những cây gai, tua tủa
dính vào vỏ bằng các nối kiểu một quả bóng gắn vào một hốc tế bào (ball-and-
socket), các gai này có thể chia về mọi phía. Có 2 loại gai là gai thường làm nhiệm
vụ vận chuyển và gai kìm làm chức năng tự vệ [2]. Khi chỉ bị chạm nhẹ, Cầu Gai
phản ứng bằng cách hướng hết gai về phía bị chạm. Cầu gai không có mắt, không
có chân, không có cơ quan để di chuyển nhưng chúng lại di chuyển rất dễ dàng
bằng cách dùng các ống dính, nối kết với xương sống của chúng.
Cầu gai sống ở nhiều độ sâu khác nhau từ đới gian triều tới biển sâu. Hiện
biết khoảng hơn 70 loài thuộc các chi Salmacis; Temnopleurus; Diadema;
Clypeaster [3].
1.1.2. Phân bố sinh thái [3,5,7]

Có mặt ở hầu hết các vùng biển trên thế giới; Sống trong rạn san hô, từ vùng
triều đến độ sâu khoảng 70 mét, sống trên thềm biển, đáy đá và vùi trong cát biển.
- Trong nước: Ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa; Ở vùng biển
Côn Đảo, phát hiện được 13 loài thuộc 9 họ; Ở Vịnh Nha Trang phát hiện 7

Đặng Ngọc Bách 3 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

loài; Tại vùng biển Vịnh Phong Vân – Bến Gỏi, Vĩnh Thái Lan, Phú Yên,
Khánh Hòa, Phan Thiết, thường xuất hiện nhiều loài có giá trị kinh tế cao.
- Thế giới: Loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, vùng
biển Bắc Đại Tây Dương từ eo biển Anh Quốc sang New Jersey (Hoa Kỳ).
1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm [7]

+ Vùng biển Ðịa Trung Hải: Tại Ðịa Trung Hải, cầu gai ăn được nổi tiếng nhất là
Paracentrotus lividus. Loài này được xem là một món ăn ngon đặc biệt, bán tại các
nhà hàng ở các thành phố ven biển nơi chúng bị đánh bắt; Chúng có thể đến tận
vùng biển phía Nam Ái Nhĩ Lan, đường kính có thể đến 8 cm. Vỏ ngoài thường
được bán để làm quà lưu niệm.
+ Vùng Bắc Ðại Tây Dương: Tại vùng biển Bắc Ðại Tây Dương, từ eo biển Anh
quốc (English Channel) sang đến New Jersey (Mỹ), loài thường gặp nhất là
Strongylocentrus droebachiensis. Tuy nhiên chúng không được nhiều nơi ưa thích.
Loài này xuất hiện rất nhiều tại vùng biển Maine (Mỹ). Thị trường tiêu thụ của loài
động vật da gai này tương đối giới hạn chỉ tại một vài chợ buôn bán hải sản quanh
New York như Fulton Fish Market. Việc chuyên chở cũng khiến cho thị trường
không phát triển.

Hình 1.1. Cầu gai S. droebachiensis (nguồn www.wallawalla.edu)

Xa hơn về phía Nam Ðại Tây Dương, có nhiều loại cầu gai nhỏ hơn, ít ăn
được trừ loài Cidaris tribuloides trong vùng West Indies.

Đặng Ngọc Bách 4 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

+ Vùng Á Châu, Ðông Nam Á: Tại Ðông Nam Á, đa số cầu gai chỉ to bằng cỡ quả
táo tây, loài Diadema setosum tuy rất dồi dào nhưng cũng chỉ được tiêu thụ tại một
số địa phương (ngay tại Thái Lan loài này chỉ được dân tại đảo Kor Samuy ăn), có
lẽ do ở con vật có nhiều gai dài (có thể đến 20 cm) và nhọn đâm thấu qua da. Gai rất
dễ gãy. Mỗi gai được bao bọc bởi những lớp tế bào hạch tiết ra một dịch có chất
độc. Ðây là loài cầu gai đen tại Việt Nam. Vùng ven biển Phan Thiết (Bình Thuận)
được xem là xứ của Cầu Gai (Nhum), do đó có một số địa danh liên hệ đến Nhum
như sông Nhum, cầu Nhum, bến Nhum… Loài Diadema palmeri (Palmer's needle-
spined urchin), vỏ có đường kính khoảng 10 cm, gai dài đến 10 cm. Vỏ và gai đều
màu đỏ. Loài Diadema savignyi, có vỏ đường kính 10 cm, gai dài đến 13 cm, vỏ
màu lam-đen, có khi có đốm trắng trên gai. Tại Việt Nam, Cầu Gai là một ăn thuộc
loại “đặc sản” tại các vùng ven biển Phan Thiết.

Hình 1.2. Cầu gai D. setosum (nguồn en.wikipedia.org)

1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai
Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đã được
công bố trên thế giới cho thấy, thành phần hóa học chủ yếu của các loài da gai là
các hợp chất steroit, saponin và cerebrosit. Trong số năm lớp sinh vật thuộc ngành
da gai, hai lớp sao biển (Asteroitea) và hải sâm (Holothuroidea) đã được tiến hành
nghiên cứu khá chi tiết. Rất nhiều công trình khoa học đã được công bố về thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai lớp sinh vật biển này, đặc biệt là các

Đặng Ngọc Bách 5 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

công bố về thành phần asterosaponin và cerebrosit từ các loài sao biển và các hợp
chất saponin dạng khung holostan từ các loài hải sâm [6].
Tuy nhiên, hiện còn rất ít các công trình nghiên cứu được công bố về thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển thuộc lớp cầu gai. Từ
những năm 1980, các hợp chất sắc tố dạng quinoit đã được công bố từ các loài cầu
gai Diadema setosum và D. savignije [8].
Năm 2004, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh đã công bố sự phân
lập và xác định cấu trúc của hai hợp chất steroit là 5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol (1)
và cholesterol cùng với glycerol 1-palmitat và glyxerol 1,3-đioleat-2-stearat từ cặn
chiết metanol của loài cầu gai D. setosum thu thập tại Hạ Long, Việt Nam. Kết quả
đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hợp chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế
bào mạnh trên 3 dòng tế bào ung thư người được thử nghiệm là KB (human
epidermoid carcinoma - biểu mô), FL (fibrillary sarcoma of the uterus - màng tử
cung) và Hep-2 (Hepatocellular carcinoma - gan) với giá trị IC50 lần lượt là 2,0,
3,93 và 2,4 g/ml [9].

5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol (1)
Đến năm 2008, nhóm nghiên cứu của các tác giả Nhật Bản tiếp tục công bố
một dẫn xuất gangliosit mới là 1-O-[9-O-metyl-(N-axetyl-α-D-neuraminozyl)-
(2→6)-β-D-glucopiranozyl]-ceramit (DSG-A, 2), cùng với bốn gangliosit đã biết.
Các hợp chất này thể hiện hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi (neuritogenic
activity) trên dòng tế bào thần kinh nội tiết ở tủy tuyến thượng thận của chuột PC-
12 (rat pheochromocytoma cell line) với sự có mặt của nhân tố phát triển dây thần
kinh (nerve growth factor). Một điều đáng quan tâm là hợp chất 2 có nhóm metoxi ở
đơn vị đường NeuAc thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Điều này cho thấy, nhánh axit

Đặng Ngọc Bách 6 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

sialic bị O-metyl hóa đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính tạo tế bào thần kinh
hình sợi của các hợp chất gangliosit phân lập được từ các loài da gai [10].

DSG-A (2)
Gần đây nhất, sự có mặt của các hợp chất sắc tố dạng napthoquinon trong các
loài cầu gai Tripneustes gratilla, Diadema setosum và Paracentrous lividus cũng
được đánh giá bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA
(photodiode array detector) ghép nối khối phổ ESI (electrospray ionization). Kết
quả phân tích cho thấy, loài D. setosum có sự xuất hiện của các sắc tố spinochrom E
(3), một sản phẩm oxi hóa của echinochrom A, echinochrom A và 6-etyl-2,7-
đihiđroxi-3-metoxinaphthazanrin ; loài T. gratilla có sự xuất hiện của 3, spinochrom
D (4), 2,3-đihiđro-2,3,7-trihiđroxi-2,3-epoxi-6-etylnapthazarin, echinochrom A,
anhiđroetyliđen-6,6’-bis-(2,3,7-trihiđroxinaphtazarin) (5), etyliđen-6,6’-bis-(2,3,7-
trihiđroxi-naphtazarin); loài P. lividus có sự xuất hiện của 3 và echinochrom A [11].

spinochrom E (3) spinochrom D (4) anhiđroetyliđen-6,6’-bis-(2,3,7-

trihiđroxinaphtazarin) (5)

Đặng Ngọc Bách 7 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

1.2 Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam [1]
Steroit là lớp hợp chất thiên nhiên phổ biến nhất và lý thú nhất về phương
diện hóa học, là nhóm chất phân bố rộng khắp trong cơ thể động vật. Chúng gồm
các hợp chất thiên nhiên có nhiều tính chất quan trọng được dùng trong điều trị
bệnh điều hòa hệ thống nội tiết, chữa viêm khớp. Hiện nay, steroit còn dùng điều
chế thuốc tránh thai. Nhiều ứng dụng của steroit trong chăn nuôi và nông nghiệp
ngày càng được công nhận. Do tác dụng sinh lý của steroit nó không những là mối
quan tâm khoa học quan trọng mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng
dược học.
Nhóm chất steroit được tìm thấy ở hầu hết các mẫu nghiên cứu thuộc ba
nhóm hải miên, san hô mềm và da gai ở Việt Nam. Hợp chất có hàm lượng cao và
xuất hiện trong hầu hết các loài sinh vật biển thu thập được là cholesterol. Hợp chất
này được phân lập từ loài san hô mềm Cladiella sp. sao biển Archaster tyicus, hải
miên Xestospongia testudinaria và Gellius varius.

cholesterol

Ngoài ra, các dẫn xuất của cholesterol như 7α-hiđroxi-cholesterol, 7β-
hiđroxi-cholesterol và dẫn xuất mới 7α-metoxi-cholesterol được phân lập từ loài
rong sụn Kappaphycus alvarezii. Nghiên cứu thành phần hóa học loài hải miên
Dysidea cinerea cho thấy sự phong phú của nhóm chất steroit như các hợp chất
ostreasterol, isofucosterol và 5,8-epiđioxicholest-6-en-3β-ol. Hợp chất này cũng
được phân lập từ loài hải miên Varius, X. testudinaria và cầu gai Diadema setosum.
Nghiên cứu thành phần hóa học của loài hải miên Haliclona clathrata đã
phân lập được hợp chất mới là 24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol cùng với (24R)-
24-etylcholest-4-en-3,6-đion, (24R)-24-etylcholest-3,6-đion. Ngoài ra, các hợp chất

Đặng Ngọc Bách 8 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

cholest-7-en-3β,5α,6β-triol và 6β-metoxicholest-7-en-3β,5α-điol cũng được phân

lập từ loài hải miên G. varius. Saringosterol, cholest-7-en-3-on cũng được xác định
từ loài hải miên X. testudinaria. Một điều đáng quan tâm là hợp chất saringosterol
được các nhà khoa học trên thế giới công bố có hoạt tính kháng vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis rất mạnh với giá trị nộng độ tối thiểu (MIC-Minimum
inhibitory concentration) là 0,25µg/ml và đây là giá trị MIC nhỏ nhất trong các hợp
chất thiên nhiên được chiết tách tính đến năm 2001. Giá trị này tương đương với giá
trị MIC của thuốc chữa lao rifampin. Ngoài ra, hợp chất này có độ độc thấp và tính
đặc hiệu cao.

saringosterol 24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol

Gần đây, ba hợp chất steroit mới có cấu trúc vòng propan ở mạch nhánh là
petrosterol-3,6-đion, 5α,6α-epoxipetroterol, iantheketal A cùng với petrosterol và
aragusterol B được phân lập từ loài hải miên Ianthella sp.

petrosterol-3,6-đion 5α,6α-epoxipetroterol

Từ loài san hô mềm Cladiella sp đã phân lập được hợp chất 9,11-
secosteroitglycozit mới là cladiasterol cùng với 3β,6α,11-trihiđroxi-24-metyl-9,11-
secocholest-7-en-9-on. Tại thời điểm đó, hợp chất trên là hợp chất đầu tiên được
phân lập từ thiên nhiên. Tiếp theo, hợp chất 9,11-secosteroit là sarcomilasterol cùng
với sarcoaldesterol B và ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol từ loài san hô mềm

Đặng Ngọc Bách 9 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Sarcophyton mililatensis; Các hợp chất 3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11-

secocholestan-5-en-9-on, (24S)-ergostan-3β,5α,6β,25-tetraol được phân lập từ san
hô mềm Lobophytum compactum.

cladiasterol sarcomilasterol

(24S)-ergostan- 3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11-
-3β,5α,6β,25-tetraol -secocholestan-5-en-9-on

Gần đây, một số steroit mới là lobophytosterol cùng với (22S,24S)-24-metyl-

22,25-epoxifurost-5-en-3β,20β-điol, (24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol, pregnenolon
cũng đã được phân lập từ san hô mềm Lobophytum laevigatum. Các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng hợp chất lobophytosterol thể hiện hoạt tính mạnh trên ba dòng tế bào
ung thư được thử nghiệm là phổi, ruột và máu.

Đặng Ngọc Bách 10 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

lobophytosterol (24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol

Bên cạnh đó, các nghiên cứu về thành phần steroit của các loài da gai cũng
thu được một số kết quả đáng quan tâm. Các hợp chất steroit mang nhiều nhóm
hiđroxi như 2α,3β,12α,21,24R,25-hexahiđroxilanost-8-en được tìm thấy từ loài hải
sâm H. scabra. Từ loài sao biển A. typicus đã tiến hành phân lập được các hợp
chất steroit gồm; 27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,24R-octol, 27-
norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24R-nonol, ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,
14α,15α,22E,24R,25R,26-nonol.

27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β, ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α,
14α,15α,24R-octol 15α,22E,24R,25R,26-nonol

Đặng Ngọc Bách 11 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Tên Việt Nam: Cầu gai Sa-vít
- Tên khoa học: Diadema savignyi
(Diadematidae).
- Thời gian thu mẫu: 12/2011.
- Địa điểm thu mẫu: Nha Trang.
- Người giám định loài: ThS. Nguyễn Thị
Mỹ Ngân, Viện Hải Dương học Nha Trang.

Mô tả, nhận dạng Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi

Màu sắc của con trưởng thành thường đen, kể cả toàn bộ chóp nón hậu môn.
Khi sống, trong ánh sáng ban ngày, các đốm mắt tạo thành một vòng xanh quanh hệ
thống đỉnh. Cũng có những đốm trắng xuất hiện trên mặt lưng trong mỗi đường xen
tia, mặc dù không rõ ràng. Những con non gai tay có băng ngang, ngay cả khi
đường kính ngang của vỏ đến 30 mm, điều này trái với màu đen của các gai ở D.
setosum.
Mỗi mảnh xương ở vùng chân ống mang 3 đôi lỗ, vùng lỗ ở gần miệng trụi
gai và rộng ra, có 2 hàng nấm gai nguyên thủy. Mỗi vùng trung gian có 2 hàng nấm
gai nguyên thủy, thường có 4-5 nấm gai trong mỗi hàng ngang. Vỏ trụi gai còn cho
thấy các đường sọc xanh ở giữa các mảnh gián tiếp.
Kích thước: đường kính ngang thường gặp của vỏ ở con trưởng thành từ 40-65 mm
(có khi đạt tới 100 mm), chiều cao từ 20-40 mm.
Loài này rất giống D. setosum, nhưng có thể phân biệt được nhờ màu sắc hậu
môn. Trên hậu môn D. setosum có 1 vòng màu cam, trong khi hậu môn D. savignyi
hoàn toàn đen.
Sinh học -Sinh thái học

Đặng Ngọc Bách 12 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Diadema savignyi sống ở các vùng nước nông. Sống trong rạn san hô, từ
vùng triều đến độ sâu khoảng 70 mét.
Phân bố
Trong nước: ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa.
Thế giới: loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Marck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun
đếu trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khi xuất hiện màu.
2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế
Sắc kí lớp mỏng điếu chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel
60G F254 (Merck, kí hiệu là 105875), phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254nm và 368nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch là
H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định
vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc kí cột (CC)
Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo.
Silica gel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica
gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.).
2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (600 MHz), 13
C-NMR (150
MHz), HMQC và HMBC được đo trên máy Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer
của Viện Nghiên cứu khoa học cơ bản Hàn Quốc (KBSI).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện đại
và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của hợp chất, kể cả
cấu trúc lập thể của phân tử.

Đặng Ngọc Bách 13 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là
sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và 13
C dưới tác dụng của từ
trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển
hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa vào
tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
+ Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các
proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa
của nguyên tử cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà
ta xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
13
+ Phổ C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử
cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau.
Thang đo phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang độ rộng 0-230ppm.
+ Phổ 2D-NMR: đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương tác của
các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu
thường được sử dụng trong luận văn gồm:
Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác
trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ một là
trục phổ 1H-NMR, còn trục còn lại là 13
C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên
đỉnh các ô vuông trên phổ.
1
Phổ H-1H COSY (Homocosy), (1H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton
đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với
nhau.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu
diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này
mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính diệt tế bào ung thư của các hợp chất sẽ được xác định theo phương
pháp MTT (3-[4,5-đimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom) [12]. Ba dòng tế

Đặng Ngọc Bách 14 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

bào ung thư người dự kiến sẽ sử dụng là HL-60 (human acute promyeloid leukemia
- ung thư máu), PC-3 (human prostate cancer - ung thư tuyến tiền liệt), SNU-C5
(human colon cancer - ung thư ruột kết) được nuôi cấy trong môi trường RPMI
1640 bổ sung 10% huyết thanh phổi bò (fetal bovine serum) và
penicillin/streptomycin (tương ứng 100 U/mL và 100 mg/mL) ở 37 °C trong môi
trường 5 % CO2 được làm ẩm. Các tế bào phát triển theo cấp số nhân được sử dụng
trong các thí nghiệm.
Phương pháp MTT được tiến hành như sau: Các dòng tế bào ung thư người
(HL-60; 3 × 105 tế bào/mL, PC-3; 5 × 105 tế bào/mL, and SNU-C5; 1 × 105 tế
bào/mL) được xử lý trong 3 ngày với các hợp chất ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và
100 μM hoặc với các cặn chiết ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 μg/mL. Sau
quá trình ủ, 0,1 mg (50 L của dung dịch 2 mg/mL) MTT (Sigma, Saint Louis, MO,
USA) được bổ sung vào mỗi giếng và các tế bào sau đo tiếp tục được ủ ở 37°C
trong 4h. Các phiến được tiến hành ly tâm ở 1000 vòng/phut trong 5 phút ở nhiệt độ
phòng và sau đó môi trường được loại bỏ một cách cẩn thận. Sau đó,
đimetylsunfoxit (150 L) được cho vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan.
Các phiến được đọc ngay sau đó ở bước sóng 540 nm trên thiết bị đọc vi phiến
(Amersham Pharmacia Biotech., USA). Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành
lặp lại 3 lần và giá trị trung bình được tính toán. Kết quả được biểu thị là phần trăm
ức chế đã tạo ra sự giảm cường độ hấp phụ khi xử lý với các chất thử so sánh với
đối chứng âm. Đường cong phụ thuộc nồng độ được xây dựng và nồng độ ức chế 50
phần trăm (IC50) được xác định cho các mẫu thử cũng như cho từng dòng tế bào.
Giá trị IC50 < 100 M với chất sạch và IC50 < 100 g/ml với các cặn chiết được coi
là có hoạt tính.

Đặng Ngọc Bách 15 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả
3.1.1. Xử lý mẫu và tạo dich chiết tổng
a. Quy trình xử lý mẫu
Mẫu sinh vật biển sau khi thu về được tiến hành bảo quản theo quy trình
thống nhất sau:
- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất để loại muối và tạp bẩn.
- Để ráo nước ở nhiệt độ phòng, ép nhẹ bằng giấy lọc bản để thấm hết nước.
- Cho từng mẫu vào các túi ni lông sạch, kèm theo ký hiệu mẫu được ghi
bằng bút chì trên giấy nến để tránh bị mờ hoặc rách nát khi tiếp xúc với nước và ở
điều kiện lạnh âm sâu.
- Lập danh sách mẫu sinh vật biển với ký hiệu mẫu.
Các túi mẫu được lưu giữ trong tủ lạnh âm sâu (Frigor 3000 l, ở -20oC) để
đảm bảo mẫu không bị phân hủy bởi vi sinh vật.
b. Quy trình tạo dịch chiết
Các mẫu sinh vật biển được chiết theo quy trình sau:
Bước 1: Lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh: Trong quá trình lấy mẫu phải rất thận trọng
vì trong tủ lạnh âm sâu do có sự tạo tuyết nên các túi mẫu sẽ bị dính vào nhau do đó
rất dễ bị rách khi lấy mẫu ra. Nếu túi bị rách sẽ có thể làm mất kí hiệu mẫu gây ra
sự cố không xác định được mẫu hoặc nhầm lẫn giữa các mẫu với nhau.
Bước 2: Mẫu lấy ra được để giải đông ở nhiệt độ phòng sau đó rửa lại nhiều
lần bằng nước cất trước khi tiến hành cắt nhỏ và xay mẫu.
Bước 3: Mẫu sau khi rửa được cân, được cắt nhỏ và xay trên máy xay mẫu
(tuỳ theo loại mẫu sử dụng các thiết bị xay và nghiền mẫu phù hợp).
Bước 4: Mẫu đã xay được tiến hành chiết 3 lần bằng MeOH trên thiết bị
chiết siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) ở nhiệt độ 40-50oC, thời gian chiết mỗi lần
tối thiểu 60 phút.

Đặng Ngọc Bách 16 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Bước 5: Dịch chiết của 3 lần chiết được lọc qua giấy lọc (sử dụng giấy lọc
Whatman đường kính 240nm, No 1) để loại sinh khối, gộp lại và tiến hành cất loại
dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50oC thu được dịch cô MeOH.
Bước 6: Bảo quản các lọ đựng cặn dịch chiết trong tủ lạnh âm sâu (-20oC) để
tránh bị vi sinh vật phân hủy.
3.1.2. Phân lập các hợp chất
Mẫu cầu gai Diadema savigyi (4,5 kg) được nghiền nhỏ và chiết bằng MeOH
ở nhiệt độ phòng thu được cặn chiết MeOH (8,1 g, ký hiệu A). Cặn này được hòa
vào nước và chiết phân bố với CH2Cl2. Cặn CH2Cl2 (3,2 g, ký hiệu B) được phân
tách trên sắc ký cột silica gel pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải
CH2Cl2 MeOH (50:1, 20:1, 10:1, 3:1, 1:1; v/v) thu được 4 phân đoạn ký hiệu B‒1
đến B‒4. Phân đoạn B1 (0,89 g) được phân tách tiếp trên cột sắc ký rây phân tử
Sephadex LH-20 sử dụng pha động là CH2Cl2 MeOH (1:3, v/v) thu được 3 phân
đoạn nhỏ ký hiệu là B‒1.1 đến B‒1.3. Sau đó, hai phân đoạn nhỏ B‒1.1 và B‒1.2
gộp lại và phân tách bằng MPLC sử dụng cột silica gel pha đảo (YMC Gel ODS-A,
60 Å, 400/500 mesh) rửa giải gradient MeOH–H2O (từ 6:4 đến 9:1, v/v) thu được
04 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu B‒1.2a đến B‒1.2d. Tinh chế phân đoạn B‒1.2b
(75,0 mg) trên sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng n-hexan‒EtOAc (15:1,
12:1, v/v/v) thu được hợp chất DS6 (5,5 mg). Phân đoạn nhỏ B‒1.2c (42,0 mg)
được tinh chế tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha đảo YMC RP-18 sử dụng hệ dung
môi rửa giải axeton H2O (5:1, v/v) thu được hợp chất DS1 (6,5 mg). Hợp chất DS5
(3,8 mg) được tinh chế từ phân đoạn B‒2 (0,75 g) bằng cách sử dụng sắc ký cột
silica gel pha thường rửa giải bằng n-hexan-axeton (9:1, v/v), sau đó tinh chế tiếp
bằng sắc ký cột silica gel pha đảo YMC rửa giải bằng MeOH H2O (4:1, v/v).
Phân đoạn B‒3 (67,0 mg) được phân tách trên sắc ký cột silica gel pha đảo
YMC RP-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH H2O (3.5:1, v/v), và tinh chế tiếp
bằng sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng CH2Cl2 axeton (15:1, v/v) thu
được các hợp chất DS3 (3,3 mg) và DS4 (4,4 mg). Phân đoạn B‒4 (0,69 g) được
phân tách thành 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu B‒4.1 đến B‒4.3 bằng sắc ký cột silica gel

Đặng Ngọc Bách 17 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

pha đảo YMC RP-18 rửa giải gradient axeton H2O (3:1 đến 1:1). Từ phân đoạn nhỏ
B‒4.2 (0,18 g) thu được hợp chất DS2 (4,5 mg) sau khi phân tách trên sắc ký cột
silica gel pha thường rửa giải bằng CH2Cl2 axeton (9:1) và tiếp tục tinh chế bằng
sắc ký cột silica gel pha đảo YMC RP-18 CC rửa giải bằng axeton H2O (2.5:1).

Đặng Ngọc Bách 18 Hóa hữu cơ

 Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Cầu gai Diadema savignyi (4,5 kg)

Chiết MeOH

A: Cặn chiết MeOH (8,1 g)

Bổ sung: H2O
Bổ sung: CH2Cl2

B: Cặn CH2Cl2 (3,2 g)

Silica gel CC

CH2Cl2/MeOH:50/1 10/1 3/1 1/1

B1 (0,89 g) B2 (0,75 g) B3 (67 mg) B4 (0,69 g)

Sephadex Silica gel CC YMC CC YMC CC
CH2Cl2/MeOH:1/3 C6H14/CH3OCH3: MeOH/H2O: CH3OCH3/H2O
9/1 3,5/1

B1.1 B1.2 B1.3 B2.1 B3.1 B4.1 B4.2 B4.3

0,69 g 0,18 g 4,3 g
YMC CC Silica gel CC
MeOH/H2O:4/1 Silica gel CC CH2Cl2/CH3OCH3:
CH2Cl2/CH3OCH3:15/1 9/1
MPLC - YMC CC
MeOH/H2O:
6/4 – 9/1 DS5 B4.2.1
3,8 mg DS3 DS4 0,18 g
3,3 mg 4,4 mg

B1.2b B1.2c
B1.2a 75 mg 42 mg B1.2d YMC CC
CH3OCH3/H2O:
Silica gel CC YMC CC 2,5/1
Hexan/EtOAc: CH3OCH3/H2O:5/1
15:1, 12:1

DS6 DS1 DS2

5,5 mg 6,5 mg 4,5 mg

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Cầu gai Diadema savignyi

Đặng Ngọc Bách 19 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

3.2. Thảo luận

3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
3.2.1.1. Hợp chất DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol
Hợp chất DS1 nhận được dưới dạng chất tinh thể hình kim màu trắng. Phổ
1
H-NMR của DS1 đặc trưng cho một hợp chất steroit, trong đó xuất hiện các tín
hiệu của 5 nhóm metyl tại H 0,73 (3H, s), 0,79 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,80 (3H, d, J =
7,0 Hz), 0,81 (3H, s), 0,83 (3H, d, J = 6,0 Hz); các proton olefin tại H 6,16 (1H, d,
J = 9,0 Hz) và 6,42 (1H, d, J = 8,0 Hz); một proton gắn với cacbon có nối với
nguyên tử oxi tại H 3,82 (1H, m) (Hình 3.1.a).

Hình 3.1.a. Phổ 1H-NMR của DS1

Hình 3.1.b. Cấu trúc hóa học của DS1

Đặng Ngọc Bách 20 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.1.c. Phổ 13C-NMR của DS1

Hình 3.1.d. Phổ HMQC của DS1

Đặng Ngọc Bách 21 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Bảng 3.1. Các số liệu phổ NMR của DS1

C a
δC δCb,c δHb,d HMBC (H→C)
dạng pic (J, Hz)
1 34,7 34,70 1,61/1,86 m

2 30,1 29,76 1,45/1,75 m

3 66,5 65,96 3,82 m

4 37,0 36,73 1,82/2,01 m

5 82,1 82,32 -

6 135,4 135,49 6,42 d (8,0) 5, 8, 10

7 130,8 130,67 6,16 d (9,0) 5, 8, 9

8 79,4 79,57 -

9 51,1 51,04 1,41 m

10 37,0 36,92 -

11 23,4 23,38 1,14/1,43 m

12 39,4 39,41 1,86

13 44,5 44,73 -

14 51,7 51,55 1,48 m

15 20,6 20,58 1,34/1,54 m 17

16 28,2 28,22 1,31/1,92 m 15, 17

17 56,4 56,39 1,10 m

18 12,6 12,59 0,73 s 12, 13, 17

19 18,2 18,14 0,81 s 1, 5, 9, 10

20 35,2 35,20 1,34 m

21 18,6 18,54 0,83 d (6,0) 17, 20

22 36,0 35,93 0,93/1,27 m 17

23 23,8 23,78 1,26/1,13 m 24, 28

24 39,4 39,41 1,11 18, 22

25 28,0 27,96 1,44 m 24, 26, 27

26 22,5 22,51 0,80 d (7,0) 24, 25, 27

27 22,8 22,78 0,79 d (7,0) 24, 25, 26

a
δC của 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol [13], bđo trong CDCl3, c150 MHz, d600
MHz

Đặng Ngọc Bách 22 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.1.e. Phổ HMBC của DS1

13
Phổ C-NMR xuất hiện các tín hiệu của một steroit 27 cacbon gồm có 4
cacbon bậc bốn, 8 nhóm metin, 10 nhóm metilen và 5 nhóm metyl. Một nối đôi bị
thế 2 lần được xác định tại C 130,67 (d)/135,49 (d); 2 cacbon bậc 4 nối với nguyên
tử oxi tại C 79,57 (s) và 82,32 (s), 1 cacbon metin gắn với nguyên tử oxy tại C

65,96 (d). Độ chuyển dịch hóa học tương đối cao tại các vị trí cacbon bậc bốn liên
kết với nguyên tử oxi gợi ý tới sự có mặt của một cầu peoxit.

Đặng Ngọc Bách 23 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.1.f. Phổ COSY của DS1

Hình 3.1.g. Các tương tác COSY (▬) và HMBC ( ) chính của DS1

Cuối cùng, cấu trúc hóa học của DS1 được xác định là 5α,8α-epiđioxi-
cholest-6-en-3β-ol bởi sự trùng khớp hoàn toàn ở các giá trị tương ứng về số liệu
phổ 1H-NMR và 13C-NMR với hợp chất này đã được công bố [13] và được khẳng
định thêm bằng kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều COSY và HMBC
(Hình 3.1.g).

Đặng Ngọc Bách 24 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

3.2.1.2. Hợp chất DS2: Cholest-5-en-3β,7α-điol

Hợp chất DS2 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Các phổ 1H-
NMR và 13C-NMR của nó cho phép xác định cấu trúc của hợp chất có sự xuất hiện
các tín hiệu của một liên kết đôi bị thế ba vị trí trên các phổ của DS2 ở các giá trị
C 146,30 (C, C-5) và C 123,75 (CH, C-6)/ H 5,54 (1H, dd, J = 1,0, 5,0 Hz, H-6).

Hình 3.2.a. Phổ 1H-NMR của DS2

Hình 3.2.b. Cấu trúc hóa học của DS2

Đặng Ngọc Bách 25 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.2.c. Phổ 13C-NMR của DS2

Hình 3.2.d. Phổ HMQC của DS2

Đặng Ngọc Bách 26 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của DS2

a δHb,d
C δC δCb,c HMBC (H→C)
dạng pic (J, Hz)

1 37,0 36,9 37.07 1,08/1,81 m

2 31,3 31,5 32,21 1,46/1,79 m

3 71,2 71,4 71,09 3,50 ddt (11,0; 11,0; 5,0; 4,0)

4 42,0 41,7 41,97 2,24/2,28 m 3, 5, 10

5 146,2 143,4 146,30 -

6 123,8 125,4 123,75 5,54 dd (5,0; 1,5) 4, 5, 7, 10

7 65,3 73,3 65,32 3,79 ddd (5,0; 3,5; 1,5) 5, 6, 8, 9

8 37,5 40,8 37,54 1,43 m 7, 9

9 42,2 48,2 42,27 1,18 m 7

10 37,4 36,4 37,43 -

11 20,7 21,0 20,75 1,40/1,48 m

12 39,1 39,5 39,22 1,04

13 42,1 42,9 42,18 -

14 49,4 55,4 49,43 1,38 m

15 24,3 26,4 24,31 1,09/1,66 m

16 28,2 28,5 28,34 123/1,85 m 15, 17

17 55,8 55,9 55,92 1,11 m

18 11,6 11,8 11,68 0,63 s 12, 13, 17

19 18,2 19,1 18,29 0,94 s 1, 5, 9, 10

20 35,7 35,7 35,83 1,35 m

21 18,7 18,7 18,78 0,88 d (7,0) 17, 20, 21

22 36,1 36,2 36,23 0,96/1,28 m

23 23,7 23,8 23,80 1,08 /1,29 m 24, 28

24 39,5 39,5 39,57 1,12/1,96 m

25 28,0 28,0 28,06 1,47 m 24, 26, 27

26 22,6 22,5 22,62 0,83d (7,0) 24, 25, 27

27 22,8 22,8 22,86 0,81 d (7,0) 24, 25, 26

a
δC của cholest-5-en-3β,7α-điol và cholest-5-en-3β,7β-điol [14], bđo trong CDCl3,
c
150 MHz, d600 MHz

Đặng Ngọc Bách 27 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.2.e. Phổ HMBC của DS2

Hình 3.2.f. Các tương tác HMBC chính của DS2

Phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình 3.2.f) cho phép xác định vị trí
của liên kết đôi bị thế 3 vị trí tại C-5/C-6 và hai nhóm OH tại C-3 và C-7. So sánh
13
số liệu phổ C-NMR của DS2 với các số liệu tương ứng của cholest-5-en-3β,7α-
điol và cholest-5-en-3β,7β-điol [14] khẳng định cấu hình của nhóm OH tại vị trí C-7
là α. Như vậy, hợp chất DS2 được xác định là cholest-5-en-3β,7α-điol.

3.2.1.3. Hợp chất DS3: Cholest-5-en-3β,7β-điol

Hợp chất DS3 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Các phổ 1H-
NMR và 13C-NMR của nó gần như trùng khớp với các phổ của DS2. Sự khác biệt

Đặng Ngọc Bách 28 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

dễ nhận thấy nhất là sự thay đổi lớn về giá trị độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR tại
vị trí C-7 giữa hai hợp chất, cho phép dự đoán DS3 có thể là một đồng phân lập thể
của DS2.

Hình 3.3.a. Phổ 1H-NMR của DS3

Hình 3.3.b. Cấu trúc hóa học của DS3

Đặng Ngọc Bách 29 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.3.c. Phổ 13C-NMR của DS3

Hình 3.3.d Phổ HMQC của DS3

Đặng Ngọc Bách 30 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của DS3

a δHb,d HMBC
C δC δCb,c
dạng pic (J, Hz) (H→C)
1 37,0 36,9 36,99 1,02/1,82 m

2 31,3 31,5 31,55 1,49/1,82 m

3 71,2 71,4 71,40 3,51ddt (11,0; 11,0; 5,0; 4,0)

4 42,0 41,7 41,72 2,26/2,31 m 3, 5, 10

5 146,2 143,4 143,57 -

6 123,8 125,4 125,46 5,26 t (2,2) 4, 5, 7, 10

7 65,3 73,3 73,36 4,13 dt (8,0; 2,2) 5, 6, 8, 9

8 37,5 40,8 40,90 1,37 m 7, 9

9 42,2 48,2 48,32 1,00 m 7

10 37,4 36,4 36,50 -

11 20,7 21,0 21,14 1,52/1,43 m

12 39,1 39,5 39,57 1,05

13 42,1 42,9 42,99 -

14 49,4 55,4 55,51 1,05 m

15 24,3 26,4 26,43 1,10/1,78 m

16 28,2 28,5 28,62 1,77 15, 17

17 55,8 55,9 56,02 1,10 m

18 11,6 11,8 11,89 0,66 s 12, 13, 17

19 18,2 19,1 19,21 1,02 s 1, 5, 9, 10

20 35,7 35,7 35,81 2,19 m

21 18,7 18,7 18,84 0,89 d (7,0) 17, 20, 21

22 36,1 36,2 36,27 0,99/1,30 m

23 23,7 23,8 23,90 1,32/1,10 m 24, 28

24 39,5 39,5 39,62 1,12/1,99 m

25 28,0 28,0 28,09 1,49 m 24, 26, 27

26 22,6 22,5 22,63 0,84d (7,0) 24, 25, 27

27 22,8 22,8 22,89 0,82 d (7,0) 24, 25, 26

a
δC của cholest-5-en-3β,7α-điol và cholest-5-en-3β,7β-điol [14], bđo trong CDCl3,
c
150 MHz, d600 MHz

Đặng Ngọc Bách 31 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.3.e. Phổ HMBC của DS3

Hình 3.3.f. Các tương tác HMBC chính của DS3

Phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình 3.3.f) kết hợp so sánh số liệu
13
phổ C-NMR của DS3 với các số liệu tương ứng của cholest-5-en-3β,7α-điol và
cholest-5-en-3β,7β-điol [14] cho phép xác định hợp chất DS3 là cholest-5-en-3β,7β-
điol.

3.2.1.4. Hợp chất DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol

Hợp chất DS4 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Các phổ 1H-
NMR và 13C-NMR của nó gần như trùng khớp với các phổ của DS3 ngoại trừ việc
xuất hiện thêm các tín hiệu của một nhóm metoxi tại C 56,78 và H 3,33 (3H, s).

Đặng Ngọc Bách 32 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.4.a. Phổ 1H-NMR của DS4

Hình 3.4.b. Cấu trúc hóa học của DS4

Đặng Ngọc Bách 33 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.4.c. Phổ 13C-NMR của DS4

Hình 3.4.d. Phổ HMQC của DS4

Đặng Ngọc Bách 34 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của DS4

a δHb,d
C δC δCb,c HMBC (H→C)
dạng pic (J, Hz)

1 36,9 36,79 1,15/1,80 m

2 31,6 31,50 1,50/1,82 m

3 71,6 71,48 3,60 m

4 42,5 42,15 2,27/2,33 m 2, 3, 5, 6, 10

5 146,2 146,19 -

6 120,9 120,80 6,06 dd (5,4; 1,2) 4, 7, 10

7 74,1 74,01 3,95 t (3,5) 5

8 37,3 37,25 1,47 m

9 42,9 42,80 1,28 m 7

10 37,6 37,50 -

11 20,9 20,88 1,39/1,44 m

12 39,2 39,12 1,20/1,94 m

13 42,2 42,35 -

14 49,2 49,12 1,48 m

15 24,4 24,34 0,96/1,60 m

16 28,8 28,32 1,85 m 15, 17

17 55,9 55,85 1,14 m

18 11,6 11,54 0,63 s 12, 13, 17

19 18,4 18,33 0,96 s 1, 5, 9, 10

20 36,0 35,87 1,37 m

21 18,9 18,81 0,89 d (7,0) 17, 20, 21

22 36,3 36,26 0,98/1,30 m

23 23,9 23,82 1,11/1,31 m 24, 28

24 39,7 39,62 1,07/1,15 m

25 28,2 28,11 1,50 m 24, 26, 27

26 22,7 22,65 0,85 d (7,0) 24, 25, 27

27 23,0 22,90 0,83 d (7,0) 24, 25, 26

OMe 56,9 56,87 3,68 s 7

a
δC của 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol [15], bđo trong CDCl3, c150 MHz, d600 MHz

Đặng Ngọc Bách 35 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.4.e. Phổ HMBC của DS4

HO OMe

Hình 3.4.f. Các tương tác HMBC chính của DS4

So sánh số liệu phổ 13C-NMR của DS4 (Bảng 3.4) với các số liệu tương ứng
của 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol [15] cho phép xác định vị trí của nhóm metoxi
xuất hiện thêm tại C-7. Ngoài ra, phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình
3.4.f) cho phép xác định hợp chất DS4 là 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol.

3.2.1.5. Hợp chất DS5: cholest-5-en-3β-ol

Các phổ 1H-NMR và 13
C-NMR của nó có dạng tương tự như các phổ của
DS2 và DS3. Sự khác biệt dễ nhận thấy nhất là sự mất đi các tín hiệu của một nhóm
oximetin trên các phổ của DS5.

Đặng Ngọc Bách 36 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.5.a. Phổ 1H-NMR của DS5

Hình 3.5.b. Cấu trúc hóa học của DS5

Đặng Ngọc Bách 37 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.5.c. Phổ 13C-NMR của DS5

Hình 3.5.d. Phổ HMQC của DS5

Đặng Ngọc Bách 38 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của DS5

a δHb,d
C δC δCb,c HMBC (H→C)
dạng pic (J, Hz)
1 37,5 37,33 1,05/1,82 m 3, 5, 10, 19

2 31,6 31,70 1,51/1,81 m 3, 4

3 71,3 71,85 3,49 m

4 42,4 42,38 2,22/2,27 m 2, 3, 5, 6, 10

5 141,2 140,82 -

6 121,3 121,77 5,32 dd (1,5; 3,0) 4, 7, 8, 10

7 32,0 31,97 1,41/1,99 m

8 32,0 31,97 1,47 m

9 50,5 50,20 0,90 m

10 36,5 36,57 -

11 21,2 21,16 1,42/1,48 m

12 40,0 39,86 1,98

13 42,4 42,38 -

14 56,9 56,23 1,07 m

15 24,3 24,36 1,05/1,54 m

16 28,3 28,31 1,23/1,81 m

17 56,5 56,83 0,98 m

18 12,0 11,94 0,65 s 12, 13, 14, 17

19 19,4 19,47 0,98 s 1, 5, 9, 10

20 35,8 35,86 1,37 m

21 18,8 18,79 0,89 d (6,5) 17, 20, 22

22 36,4 36,27 0,97/1,30 m

23 24,1 23,91 1,09/1,31 m

24 39,6 39,59 0,98/1,15 m

25 28,0 28,09 1,19 m

26 22,6 22,64 0,84 d (6,5) 24, 25, 27

27 22,9 22,90 0,83 d (6,5) 24, 25, 26

a
δC của cholest-5-en-3β-ol [16], bđo trong CDCl3, c150 MHz, d600 MHz

Đặng Ngọc Bách 39 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.5.e. Phổ HMBC của DS5

Hình 3.5.f. Các tương tác HMBC chính của DS5

Phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình 3.5.f) kết hợp so sánh số liệu
13
phổ C-NMR của DS5 với các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo
[16] cho phép xác định hợp chất DS5 là cholest-5-en-3β-ol.

3.2.1.6. Hợp chất DS6: Natri cholest-5-en-3β-sunfat

Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DS6 gần như trùng khớp so với các phổ
tương ứng của DS5. Sự khác biệt dễ nhận thấy nhất là sự dịch chuyển rất mạnh về
phía vùng trường thấp của các tín hiệu proton và cacbon tại C-3 trên các phổ của
DS6. Không có bất kỳ tín hiệu của một nhóm thế nào xuất hiện thêm trên các phổ
của DS6 cho phép khẳng định nhóm OH tại vị trí C-3 của DS6 đã bị sunfat hóa, một
quá trình xảy ra khá phổ biến ở các hợp chất thiên nhiên biển. Giá trị độ dịch

Đặng Ngọc Bách 40 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

chuyển 1H-NMR của H-3 ( H 4.14) hoàn toàn phù hợp với số liệu đã được công bố
của hợp chất cholesterol-3-sunfat tại H 4.22 [17].

Hình 3.6.a. Phổ 1H-NMR của DS6

Hình 3.6.b. Cấu trúc hóa học của DS6

Đặng Ngọc Bách 41 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.6.c. Phổ 13C-NMR của DS6

Hình 3.6.d. Phổ HMQC của DS6

Đặng Ngọc Bách 42 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của DS6

a δHb,d
C δC δCb,c HMBC (H→C)
dạng pic (J, Hz)
1 37,33 37,16 1,02/1,79 m 3, 5

2 31,70 28,85 1,57/1,99 m 3

3 71,85 79,09 4,14 m 3, 5, 6

4 42,38 39,22 2,28/2,45 m

5 140,82 140,02 -

6 121,77 122,53 5,30 br s 4, 7, 10

7 31,97 31,96 1,46/1,90 m 5, 6, 8, 14

8 31,97 31,07 1,36 m

9 50,20 50,07 0,85 m

10 36,57 36,22 -

11 21,16 21,07 1,43

12 39,86 39,77 1,47/1,90 m

13 42,38 42,35 -

14 56,23 56,19 1,03 m 13

15 24,36 24,32 1,08/1,27 m

16 28,31 28,26 1,19/1,78 m 15, 17

17 56,83 56,74 0,92 m

18 11,94 11,88 0,61 s

19 19,47 19.31 0,93 s

20 35,86 35,83 1,33 m

21 18,79 18,73 0,85 d (6,5) 17, 20

22 36,27 36,51 1,26/0,99 m

23 23,91 23,88 1,19/0,97 m

24 39,59 39,54 1,07/1,38 m

25 28,09 28,03 1,36 m 24

26 22,64 22,58 0,79 d (6,5) 24, 25, 27

27 22,90 22,84 0,80 d (6,5) 24, 25, 26

a
δC của DS5, bđo trong CDCl3, c150 MHz, d600 MHz

Đặng Ngọc Bách 43 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Hình 3.6.e. Phổ HMBC của DS6

Hình 3.f. Các tương tác HMBC chính của DS6

Phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình 3.f) cho phép xác định hợp
chất DS6 là natri cholest-5-en-3β-sunfat [17].

Đặng Ngọc Bách 44 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Tập hợp các chất đã phân lập được từ loài cầu gai Diadema savignyi

DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol DS2: cholest-5-en-3β,7α-điol

DS3: cholest-5-en-3β,7β-điol DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol

DS5: cholest-5-en-3β-ol DS6: natri cholest-5-en-3β-sunfat

3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất
Ung thư là một căn bệnh nan y mà cho tới nay các việc chữa trị vẫn còn gặp
nhiều khó khăn. Theo các số liệu thống kê gần đây, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư
ngày càng gia tăng. Chính vì vậy, bên cạnh việc đầu tư cho các chuẩn đoán sớm các
bệnh ung thư, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, các thuốc mới là vô
cùng cần thiết đặc biệt là các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên. Trong lĩnh vực
tìm kiếm các chất chống ung thư, việc tìm kiếm, sàng lọc và đánh giá các chất có
khả năng ức chế và tiêu diệt các tế bào khối u dựa trên khả năng gây độc các dòng
tế bào khối u thực nghiệm gây ung thư là vô cùng quan trọng.
Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng gây độc tế
bào của các hợp chất phân lập được từ loài cầu gai Diadema savignyi trên với ba

Đặng Ngọc Bách 45 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

dòng tế bào là HL-60 (ung thư máu), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và SNU-C5
(ung thư ruột kết). Kết quả được đưa ra trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Giá trị IC50 ( M)

Hợp chất
HL-60 PC-3 SNU-C5

DS1 4,95±0,07 6,99±0,28 6,14±0,22

DS2 7,89±0,18 29,22±0,17 30,70±0,27
DS3 22,36±0,84 27,94±0,63 31,20±1,04
DS4 5,33±0,03 9,22±0,67 23,73±0,75
DS5 - - -
DS6 26,41±0,81 68,87±6,08 -
Mitoxantronea 0,06±0,02 1,05±0,34 19,00±1,40
a
Chất chuẩn dương

Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, hợp chất DS1 thể hiện
hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên cả ba dòng tế bào ung thư người được thử
nghiệm là HL-60 (ung thư máu), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và SNU-C5 (ung thư
ruột kết) với giá trị IC50 tương ứng là 4,95, 6,99 và 6,14 µM. Hợp chất DS4 thể hiện
hoạt tính mạnh trên hai dòng tế bào là HL-60 (IC50 = 5,33 µM) và PC-3 (IC50 = 9,22
µM) và hoạt tính trung bình trên dòng SNUC-5 (IC50 = 23,73 µM). Hợp chất DS2
chỉ thể hiện hoạt tính mạnh trên dòng HL-60 với giá trị IC50 = 7,89 µM và hoạt tính
trung bình trên các dòng PC-3 (IC50 = 29,22 µM) và SNU-C5 (IC50 = 30,70 µM).
Ngoài ra, hợp chất DS3 thể hiện hoạt tính trung bình trên cả ba dòng tế bào
ung thư người được thử nghiệm. Hợp chất DS6 thể hiện hoạt tính trung bình trên
dòng HL-60, hoạt tính yếu trên dòng PC-3 và không thể hiện hoạt tính trên dòng
SNU-C5. Hợp chất DS5 không có biểu hiện hoạt tính trên cả ba dòng tế bào ung thư
đã thử nghiệm.

Đặng Ngọc Bách 46 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

KẾT LUẬN
1. Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, 06 hợp chất đã được phân lập từ
dịch chiết metanol của loài cầu gai Diadema savignyi.

2. Cấu trúc của 06 các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp
phổ hiện đại là; DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol; DS2: cholest-5-en-3β,7α-
điol; DS3: cholest-5-en-3β,7β-điol; DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol; DS5:
cholest-5-en-3β-ol; DS6: natri cholest-5-en-3β-sunfat.

3. Đây là lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập từ loài cầu gai
Diadema savignyi.

4. Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc đối với 3 dòng tế bào là HL-60
(ung thư máu), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và SNU-C5 (ung thư ruộ kết) đối với
các hợp chất đã phân lập được. Hợp chất DS1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào
mạnh trên cả ba dòng tế bào ung thư người, DS4 thể hiện hoạt tính mạnh trên hai
dòng tế bào là HL-60 (ung thư máu) và PC-3(ung thư tuyến tiền liệt). DS2 chỉ thể
hiện hoạt tính mạnh trên dòng HL-60 (ung thư máu), DS3 thể hiện hoạt tính trung
bình trên cả ba dòng tế bào, DS6 thể hiện hoạt tính trung bình trên dòng HL-60 (ung
thư máu) yếu trên dòng PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và không thể hiện hoạt tính
trên dòng SNU-C5 (ung thư ruộ kết). Hợp chất DS5 không có biểu hiện hoạt tính
trên cả ba dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm.

Đặng Ngọc Bách 47 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Châu Văn Minh, Nguyên Xuân Cường, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Phương
Thảo, Trần Hồng Quang, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn
Văn Hùng, Pham Văn Kiệm (2012), “Điểm lại các nghiên cứu hóa học và
hoạt tính sinh học một số loài sinh vật biển Việt Nam trong giai đoạn 2006-
2012”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50(6), tr. 827-829.

2. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Hoài Nam, Phạm
Văn Cường (2012), Dược liệu biển Việt Nam – Thực trạng và cơ hội phát
triển, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 55-56.

3. Phạm Thị Thùy (2010), Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất sản
phẩm trứng cầu gai lên men tự nhiên, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha
Trang.

4. Nguyễn Đình Triệu (2013), Các phương pháp vật lý hiện đại ứng dụng trong
hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tiếng Anh

5. http://animaldiversity.org/accounts/Diadema_savignyi/.

6. Dictionary of Natural Products on DVD, version 18.1, Copyright® 1982-2009

CRC Press.

7. http://gophuquoc.vn/vn/article_detail.aspx?mid=5&aid=294.

8. Kol'tsova EA, Maksimov OB (1981), “Pigments of sea urchins Diadema

setosum and Diadema savignije”, Quinoid pigments of echinoderms,
Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1, p. 115.

9. Minh CV, Kiem PV, Huong le M, Kim YH (2004), “Cytotoxic constituents of

Diadema setosum”, Arch Pharm Res, 27(7), pp. 734-737.

Đặng Ngọc Bách 48 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

10. Yamada K, Tanabe K, Miyamoto T, Kusumoto T, Inagaki M, Higuchi R

(2008), “Isolation and structure of a monomethylated ganglioside possessing
neuritogenic activity from the ovary of the sea urchin Diadema setosum”,
Chem Pharm Bull (Tokyo), 56(5), pp. 734-737.

11. Mishchenko NP, Fedoreyev SA, Van TTT, Hieu VMN, Ly BM (2013),
Identification of polyhydroxylated naphoquinone pigments from Nha Trang
Bay sea urchins, The 2nd international workshop on marine bioresources of
Vietnam, Hanoi, pp. 18-24.

12. Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB (1987),
“Evaluation of a Tetrazolium-based Semiautomated Colorimetric Assay:
Assessment of Radiosensitivity”, Cancer Research, 47(4), pp. 943-946.

13. Ioannou E, Abdel-Razik AF, Zervou M, Christofidis D, Alexi X, Vagias C,

Alexis MN, Roussis V (2009), “pidioxysterols from the gorgonian Eunicella
cavolini and the ascidian Trididemnum inarmatum: isolation and evaluation
of their antiproliferative activity”, Steroids, 74(1), pp. 73-80.

14. Carvalho JF, Cruz Silva MM, Moreira JN, Simoes S, Sa EMML (2009),
“Efficient chemoenzymatic synthesis, cytotoxic evaluation, and SAR of
epoxysterols”, J Med Chem, 52(13), pp. 4007-4019.

15. Tian X-R, Tang H-F, Li Y-S, Lin H-W, Chen X-L, Ma N, Yao M-N, Zhang P-
H(2011), “New cytotoxic oxygenated sterols from the marine bryozoan
Cryptosula pallasiana”, Marine Drugs, 9(2), pp. 162-183.

16. J. Buchanan H, J. Cox P, M. S. V. Doidge-Harrison S, Alan Howie R, Jaspars

M, L. Wardell J (1997), “Syntheses and structures of 3-stannylcholest-5-ene
species”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, (24), pp.
3657-3664.

17. D'Auria MV, Finamore E, Minale L, Pizza C, Riccio R, Zollo F, Pusset M,

Tirard P (1984), “Steroids from the starfish Euretaster insignis: a novel

Đặng Ngọc Bách 49 Hóa hữu cơ

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

group of sulphated 3β,21- dihydroxysteroids”, Journal of the Chemical

Society, Perkin Transactions 1, pp. 2277-2282.

Đặng Ngọc Bách 50 Hóa hữu cơ