Professional Documents
Culture Documents
Chương 6
Chương 6
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG
15ml 15ml
PCA
02 đĩa 02 đĩa
(PCA đã đun chảy và
0
làm nguội đến 47 C)
Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông
0
đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 30 C trong 72h ± 6h
Hình 6.1. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí
6.1.6. Các bước tiến hành
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu
lỏng của phần mẫu thử đại diện, với sai số cho phép ± 5% cho vào bao PE vô trùng (hoặc
bình tam giác).
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5%) vô trùng vào bao PE
(hoặc bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu
và dịch pha loãng SPW trong 2-3 phút.
Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch
pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng.
Bước 2. Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ống
nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1
cm.Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng.
Trộn đều bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 (đối
với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1). Nếu cần,
lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5,... cho đến khi đạt được
nồng độ pha loãng thích hợp.
Lưu ý: Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy
tiếp xúc với môi trường không được vượt quá 45 phút và thời gian kể từ khi chuẩn bị huyền
phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không
được vượt quá 30 phút.
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
- Nếu mẫu ở dạng lỏng: dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml.
- Nếu mẫu ở dạng rắn: dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml dịch huyền phù ban
đầu.
- Lặp lại như trên với các độ pha loãng tiếp theo (sử dụng pipet vô trùng khác đối với
mỗi dung dịch pha loãng tiếp theo, nếu cần)
- Chỉ chọn các bước pha loãng tới hạn (ít nhất hai dung dịch pha loãng liên tiếp) để
cấy các đĩa Petri thu khoảng từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri (hình
2.3). Trên đĩa thạch có số khuẩn lạc > 300 (hình 2.4) thì loại bỏ và cấy vào các đĩa petri ở
các độ pha loãng kế tiếp.
- Rót vào mỗi đĩa petri khoảng từ 12-15 ml môi trường PCA ở 440C đến 470C.
- Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay đều đĩa petri để cho hỗn hợp
đông đặc.
- Sử dụng 1 đĩa petri đối chứng để kiểm soát bằng cách lấy 1ml dung dịch pha loãng
cho vào đĩa Petri, thêm 12-15 ml môi trường PCA và nuôi ủ cùng điều kiện.
- Lật ngược các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ấm ở 30 ± 10C trong 72 ± 3 giờ. Lưu ý: không
xếp quá sáu đĩa và các đĩa cần được tách khỏi nhau, cách xa thành, nóc tủ.
Bước 4. Đếm khuẩn lạc
- Sau giai đoạn ủ qui định, đếm các khuẩn lạc trên các đĩa. Sử dụng dụng cụ đếm
khuẩn lạc (nếu cần). Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu, điều quan trọng là các khuẩn lạc
chính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc các chất kết tủa
trên đĩa. Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, khi cần nên dùng kính lúp có độ khuyếch
đại lớn hơn để phân biệt các khuẩn lạc với tạp chất lạ.
- Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu ít hơn ¼ đĩa mọc
dày lan rộng, thì đếm các khuẩn lạc trên đĩa phần còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa.
Nếu quá ¼ đĩa bị mọc dày lan rộng thì loại bỏ đĩa đó và không đếm (hình 2.5)
Hình 6.2. Khuẩn lạc vi sinh Hình 6.3. Khuẩn lạc vi Hình 6.4. Khuẩn
vật hiếu khí trên môi sinh vật hiếu khí trên môi lạc mọc loang trên
trường PCA từ 15-300 KL trường PCA > 300 KL môi trường PCA
6.1.7. Kết quả
6.1.7.1. Tính kết quả
- Tính số lượng khuẩn lạcvi sinh vật có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ hai độ
pha loãng liên tiếp
C
N= (CFU/g hay CFU/ml)
V x [n1 + (0,1 x n2)] x d
Trong đó
N: là số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu
C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng
liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại
- Trường hợp có hai đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc
C
N=
Vxnxd
(CFU/g hay CFU/ml)
Trong đó
N: Số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa;
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n: Số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n=2).
d: Độ pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của độ pha loãng thứ nhất đã được cấy
hoặc được giữ lại [d=1 khi sản phẩm dạng lỏng].
6.1.7.2. Biểu thị kết quả
- Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa
Sau khi tính kết quả, nếu chữ số thứ 3 nhỏ hơn 5 thì không thay đổi chữ số đứng trước
nó; nếu chữ số thứ 3 lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước lên 1 đơn vị tương
ứng của 10, hoặc làm tròn số với 2 chữ số có nghĩa.
Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là luỹ thừa tương
ứng của 10, hoặc làm tròn số với 2 chữ số có nghĩa.
Ví dụ cách tính kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí:
Độ pha loãng 10-3 10-4
168 19
Số khuẩn lạc
173 15
Số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là:
- ở độ pha loãng d=10-3: đếm được 168 khuẩn lạc và 173 khuẩn lạc
- ở độ pha loãng d=10-4: đếm được 19 khuẩn lạc và 15 khuẩn lạc, ta có
C 168 + 173 + 15 + 19
N= = = 170454
V x [n1 + (0,1 x n2)] x d 1 x [2+ (0,1 x 2)] x 10-3
Làm tròn kết quả là 1,7 x 105CFU/g (hoặc CFU/ml).
6.2. Định lượng tổng nấm men-nấm mốc
6.2.1. Tổng quan về nấm men và nấm mốc
Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400,000
loài nấm nen và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào
là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm
vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp năng lượng từ môi trường bên
ngoài, vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu
dinh dưỡng khác. Ta có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như
sau:
- Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ chằng chịt phát triển rất
nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm.
- Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành
các khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng hoặc mờ trên bề mặt môi trường thạch nấmTrong
thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi
màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm,
một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm
men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môi trường
Dichloran 18% Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar
(DRBC). Môi trường DRBC được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn
nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0,95 như thịt, trứng, sản phẩm sữa (trừ sữa bột), rau, quả, các
loại pate tươi...Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95 như quả khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô,
cá muối, ngũ cốc, đậu đỗ và sản phẩm đậu đỗ, bột mì, quả hạch, gia vị...
Trong thực phẩm, khi có sự hiện diện của mốc và men, chúng phát triển làm thay đối
màu của thực phẩm, gây mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.
Một số loài có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
6.2.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 8275-1,2:2010 (ISO 21527-1,2:2008) dùng
để định lượng nấm men và nấm mốc trong các sản phẩm thực phẩm hoặc trong thức ăn
chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0,95% và hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95%.
6.2.3. Nguyên tắc
Xác định số lượng nấm mốc hay nấm men trong mẫu bằng kỹ thuật pha loãng và đổ
đĩa, một khối lượng mẫu xác định được cấy trang trên môi trường DG 18 (Dichloran
Glycerol Agar) hay DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar). Sau khi ủ
25oC trong 5 – 7 ngày, đếm số khuẩn lạc nấm men và nấm mốc.
6.2.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.2. Môi trường và hóa chất
-1
Pha loãng -2
Dịch mẫu [10 ] Dịch mẫu [10 ]
Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô
trùng cho đến khi khô bề mặt thạch.Ủ 250C/3-5 ngày.
a x 10n
a: số thập phân tương ứng có giá trị từ 1,0 đến 9,9
n: số mũ phù hợp của 10
6.2.7.2 Biểu thị kết quả
Ví dụ cách tính tổng nấm men, nấm mốc:
Độ pha loãng 10-2 10-3
Số khuẩn lạc 89 13
97 8
Số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là:
- ở độ pha loãng d=10-2: đếm được 83 khuẩn lạc và 97 khuẩn lạc
- ở độ pha loãng d=10-3: đếm được 13 khuẩn lạc và 8 khuẩn lạc, ta có
C 89 + 97
X= = = 93000
V x n1 x d 0,1 x 2 x 10-2
Làm tròn kết quả là 9,3 x 104CFU/g hoặc CFU/ml.
6.3. Định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp đếm đĩa
6.3.1. Định lượng Coliforms
6.3.1.1. Tổng quan về Coliforms
Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn về vi sinh
trong thực phẩm. Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms và E. coli trong thực phẩm là điều
không mong muốn, tuy nhiên rõ ràng không thể loại bỏ chúng hoàn toàn khỏi nhiều thực
phẩm đông lạnh hoặc tươi sống. Vấn đề ở chỗ số lượng chúng đến mức nào có thể coi là
không an toàn cho thực phẩm.
Coliforms là nhóm những trực khuẩn đường ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu
khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong
vòng 24-48 giờ.
Nhóm Coliforms gồm 4 giống:
- Escherichia (với 1 loài duy nhất là E. coli)
- Citrobacter
- Klebsiella
- Enterobacter
6.3.1.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 6848:2007 được áp dụng cho tất cả các
loại thực phẩm để xác định Coliforms tổng số.
6.3.1.3. Nguyên tắc
Số lượng Coliforms được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào một
môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch Violet Red Bile) có chứa lactose và một chất chỉ
thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ môi trường ở 37oC trong 24
giờ. Đếm các khuẩn lạc điển hình và khẳng định lại trong môi trường canh Brilliant Green
Bile Salt Lactose (BGBL), coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37oC trong 24 giờ.
Kết quả được biểu thị bằng số coliforms trên 1g mẫu chưa pha loãng.
6.3.1.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.3. Môi trường và hóa chất
15ml 15ml
VRB
02 đĩa 02 đĩa
(VRB đã đun chảy và
0
làm nguội đến 47 C)
Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông
0
đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 37 C trong 24 giờ
Cấy 5 khuẩn lạc nghi ngờ vào các ống nghiệm chứa BGBL, ủ ở
0
tủ ấm 37 C trong 24 giờ
(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4)
X= (CFU/g hay CFU/ml)
V x (n1+ 0,1 x n2) x d
C1,2,3,4: Số khuẩn lạc Coliforms đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha
loãng liên tiếp được giữ lại.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: Độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp được
giữ lại.
6.3.2. Định lượng E. coli
6.3.2.1. Tổng quan về E. coli
Escherichia coli là một trong những vi sinh vật thường gặp trong môi trường. Nhiều
người không coi E. coli là vi sinh vật gây bệnh do thực phẩm song những nghiên cứu gần
đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự có khả năng gây bệnh lây lan qua thực phẩm
rất nghiêm trọng.
E. coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến
trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người người và động vật. Chúng thuộc
loại glucose và lactose dương tính, indol và methyl red dương tính song có phản ứng VP
và citrate âm tính.
6.3.2.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 16649-2:2001 được áp dụng cho tất cả
các loại thực phẩm
6.3.2.3. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) có
chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ
môi trường ở 44oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc E. coli điển hình trên môi trường TBX.
Kết quả được biểu thị bằng số E. coli trên 1g mẫu chưa pha loãng.
6.3.2.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.4. Môi trường và hóa chất
Môi trường – Hóa chất Mục đích
Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu
TBX Nuôi cấy E. coli
HCl 10% Chỉnh pH
NaOH 10%
6.3.2.5. Quy trình phân tích
10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng +
90/225ml Saline Peptone Water
15ml 15ml
TBX
02 đĩa 02 đĩa
(TBX đã đun chảy và
0
làm nguội đến 47 C)
Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông
0
đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 44 C trong 24 giờ
C
X= (CFU/g hay CFU/ml)
V x (n1+ 0,1x n2) x d
C: Tổng số khuẩn lạc E. coli đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
6.4. Định lượng Staphylococcus aureus
6.4.1. Tổng quan về vi khuẩn S. aureus
S. aureus là loài cầu khuẩn gram dương, không sinh bào tử, không di động, thường tụ thành
chum nho, có khả năng lên men và sinh sucrose, mannitol và sinh sắc tố vàng, chịu mặn
(có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl), có khả năng đông tụ
huyết tương (phản ứng coagulase (+)). Nhiệt độ thích hợp 35÷37oC; độ pH 6÷7 và hoạt độ
nước tối ưu 0,83÷0,9. S. aureus phân bố khắp mọi nơi như: da, mũi, tóc và lông của các
động vật máu nóng...S. aureus sinh độc tố đường ruột enterotoxin, đây là loại độc tố bền
nhiệt và không bị phân huỷ ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa
độc tố này, sau 4÷6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng như: tiêu chảy nôn mửa kéo
dài 6÷8 giờ. Ngoài ra, S. aureus còn gây nổi mụn nhọt, làm đông huyết tương, từ đó gây
nên các bệnh như viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, viêm tủy xương ở
người. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp và
các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp, xúc xích, lạp xưởng… S. aureus cũng phát triển tốt
trong môi trường có nồng độ đường cao (50÷60%). Chúng lên men và phân giải đường
nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm.
6.4.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theoTCVN 4830 -1: 2005 (ISO 6888-1:1999) dùng để
định lượng S. aureus cho tất cả các loại thực phẩm.
6.4.3. Nguyên tắc
- Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc một lượng mẫu qui định (sản phẩm ở dạng
lỏng hoặc huyền phù).
- Ủ các đĩa trong kiện hiếu khí ở 370C và kiểm tra sau 24h hoặc 48h.
- Tính số lượng S. aureus trong một mililit hoặc một gram mẫu từ những khuẩn lạc
điển hình và không điển hình trên các đĩa ở độ pha loãng khác nhau và khẳng định bằng
kết quả thử coagulase dương tính.
6.4.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.5. Môi trường và hóa chất
Cách tiến hành: Hút 0,1ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm có kích thước 10mm
x 75mm đã chứa 0,3ml huyết tương thỏ (hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất), ủ ở 37 ±
10C. Kiểm tra sự đông tụ của huyết tương sau 4, 6, 8, 24h. Phản ứng được coi là dương
tính khi thể tích đông tụ chiếm ¾ .
6.4.7. Báo cáo kết quả
6.4.7.1 Tính kết quả
- Tính tỉ lệ giữa số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase dương
tính (+) trên tổng số khuẩn lạc điển hình (Ht) và tỉ lệ giữa khuẩn lạc không điển hình cho
thử nghiệm coagulase dương tính (+) trên tổng số khuẩn lạc không điển hình (Ha)
- Tính mật độ S. aureus trung bình trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu:
10 x (NtHt + NaHa)
X= (CFU/g hay CFU/ml)
F1 + F2
Trong đó:
- F1 và F2: 2 độ pha loãng liên tiếp
- Nt: tổng số khuẩn lạc điển hình trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2
- Na: tổng số khuẩn lạc không điển hình trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2
- Ht: tỉ lệ giữa số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase dương tính
(+) trên tổng số khuẩn lạc điển hình được thử nghiệm.
- Ha: tỉ lệ giữa số khuẩn lạc không điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase
dương tính (+) trên tổng số khuẩn lạc không điển hình được thử nghiệm.
Chú ý: Thực hiện song song với một mẫu đối chứng (gồm có chứng âm và chứng dương
với S. aureus). Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase có hiện tượng
đông tụ giống như chứng dương trong khi đó mẫu đối chứng âm không xuất hiện khối đông
tụ.
6.4.7.2 Biểu thị kết quả
Ví dụ:
Bảng 6.6. Ví dụ về biểu thị cách tính kết quả S. aureus
Số khuẩn Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc thử
Độ pha Số phản ứng
lạc điển không điển nghiệm phản Ht Ha
loãng coagulase (+)
hình (Nt) hình (Na) ứng coagulase
30 5 5 5/5
-2
10
47 5 2 2/5
5 5 5 5/5
-3
10
8 5 1 1/5
Ure Broth
Tryptone Water
Kligler Iron Agar(KIA)/TSI
Đĩa giấy ONPG
Dung dịch creatine Thuốc thử các phản ứng sinh
hóa
Kháng huyết thanh
Dung dịch - naphtol
KOH 40%
Thuốc thử Kovac’s
HCl và NaOH 10% Chỉnh pH
6.5.5. Quy trình phân tích
Thử kháng
Tryptone
Ure agar
ONPG
broth
huyết thanh
LDC
TSI
VP
Dương tính
Ủ ở (37±1)0C/(24±3)h Báo cáo kết quả
(24±3) h
Không phát hiện
Âm tính
Salmonella trong 25g/25ml
mẫu thử
Hình 6.9 Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm
6.5.6. Các bước tiến hành
Cân một lượng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số cho
phép ± 5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác), bổ
sung 225ml môi trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) trong 60
giây.
Bước 1. Tiền tăng sinh (tăng sinh sơ bộ)
Mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ ở 370C
± 3h trong khoảng 18h ± 3h.
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
Trộn đều dịch tiền tăng sinh, chuyển 0,1ml vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường
RVS, ủ ở 41,5 ± 10C trong 24 ± 3h; đồng thời chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 10ml môi
trường MKTTn, ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Cẩn thận không được để vượt quá nhiệt độ ủ
tối đa (42,50C).
Bước 3. Phân lập
Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ mỗi canh thang tăng sinh chọn lọc RVS và
MKTTn lên mỗi đĩa thạch chứa môi trường chọn lọc XLD và HE. Sau khi cấy, lật ngược
các đĩa sao cho đáy hướng lên trên và ủ ở 370C± 10C trong 24 ± 3h.
Sau khi ủ 24 ± 3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình và các
khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi ngờ là Salmonella. Trên môi trường XLD (hình
1.3) khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm màu
đen. Trên môi trường HE (hình 1.3) khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh lam, có
hoặc không có tâm đen. Đánh dấu vị trí các khuẩn lạc này trên đáy đĩa.
Bước 4. Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường phân lập
XLD và HE. Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ,
thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA. Ủ ở 37 ± 10C
trong 24 ± 3h.
- Trường hợp 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử
nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu.
- Trường hợp 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù
hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc này
cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu và
ngược lại thì kết luận không phát hiện Salmonella trong mẫu.
Bước 5. Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh
Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi trường
sau:
Thạch TSI
Nguyên tắc: xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết hợp với môi
trường tăng trưởng căn bản, có hoặc không có sinh hơi và hydrogen sulfide (H2S).
Cách cấy mẫu: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy. Ủ
ở 37± 10C trong 24h ± 3h. Diễn giải những thay đổi trong môi trường như sau:
Cấy đâm sâu
- Màu vàng glucose dương tính (sử dụng glucose).
- Màu đỏ hoặc không đổi màu glucose âm tính (không sử dụng glucose).
- Màu đen sinh hydro sunfua. Bọt hoặc vết rạn sinh khí từ glucose.
Cấy bề mặt nghiêng của thạch
- Màu vàng lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặc sucrose).
- Màu đỏ hoặc không đổi màu lactose và sucrose âm tính (không sử dụng lactose
cũng như không sử dụng sucrose).
Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng
của thạch và khi cấy đâm sâu mang tính acid (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và (với
khoảng 90% trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen).
Lysine decarboxylase
Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện vi khuẩn sinh các enzyme decarboxylase, các
enzyme này tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (-COOH) ở cuối, tạo thành
amine hay diamine và carbon dioxide (CO2).
Cách cấy mẫu: cấy ngay phía dưới của bề mặt môi trường lỏng, phủ một lớp paraffin
hay dầu khoáng lên trên bề mặt môi trường. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Salmonella có
phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau khi nuôi cấy, môi trường vẫn giữ nguyên
màu tím. Phản ứng âm tính khi môi trường có màu vàng.
Thạch Ure
Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt ure thành amoniac do hoạt tính
của enzyme urease từ VSV và kết quả là môi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra.
Cách cấy mẫu: cấy cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ±
3h. Nếu phản ứng là dương tính, môi trường từ màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó
chuyển thành màu đỏ hồng. Ngược lại, nếu phản ứng là âm tính thì môi trường không đổi
màu (vàng cam).
Môi trường phản ứng Indol
Nguyên tắc: phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol:Indol,
Skatol (methyl indol) và indol-acetate.
Cách cấy mẫu: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường tryptone water.
Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử kovac’s, nếu phản ứng dương
tính thì trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính,
xuất hiện màu khác là phản ứng âm tính.
Phát hiện β-galactosidase
Nguyên tắc: xác định khả năng lên men lactose của vi sinh vật
Cách cấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào trong ống vô trùng có
chứa 0,25ml dung dịch muối sinh lý. Thêm một giọt toluen và lắc ống. Đặt ống này vào
trong nồi cách thủy ở 370C và để trong vài phút (khoảng 5 phút). Thêm 0,25ml thuốc thử
để phát hiện β-galactosidase và lắc đều. Đặt lại ống vào nồi cách thủy để ở 370C và để
trong 24 ± 3h, kiểm tra ống thường xuyên. Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính. Phản
ứng thường xuất hiện sau 20 phút. Nếu sử dụng đĩa giấy bán sẵn, thì theo các chỉ dẫn của
nhà sản xuất.
Voges – Proskauer
Nguyên tắc: xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình
lên men glucose của một số vi sinh vật
Cách cấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào trong ống vô trùng có
chứa 3 ml môi trường VP. Ủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 3h. Sau khi ủ, thêm 2 giọt dung dịch
creatine, 3 giọt dung dịch α-naphthol và sau đó thêm 2 giọt dung dịch kali hydroxyde
(KOH), lắc đều sau mỗi lần thêm từng loại thuốc thử. Khi xuất hiện màu hồng đến màu đỏ
sáng trong 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính, còn phản ứng âm tính khi dịch vi khuẩn
vẫn không đổi màu.
Thử phản ứng kháng huyết thanh:
+ Loại trừ chủng tự ngưng kết: nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính thủy
tinh đã được làm sạch một cách cẩn thận, dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn
lạc cần thử, để thu được huyền phù đục và đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính từ 30÷60 giây.
Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp. Nếu có sự vón cục, không rời nhau
(ít hoặc nhiều) của vi khuẩn, thì chủng xem như tự ngưng kết, không cần thử phản ứng
huyết thanh tiếp theo. Nếu không có sự vón cục và vi khuẩn rời nhau, thì chủng xem như
không tự ngưng kết, cần phải tiếp tục thử phản ứng huyết thanh.
+ Kiểm tra O, H, ...
Nhỏ một giọt anti-O hoặc H lên một lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh khối
vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30÷60 giây,
quan sát trên nền đen. Phản ứng dương tính khi có hiện tượng ngưng kết xảy ra. Đôi khi
cần quan sát hiện tượng ngưng kết bằng kính lúp hay kính hiển vi với độ phóng đại thấp.
Ngược lại, nếu vi khuẩn phân bố đều trong huyết thanh, làm cho giọt dung dịch đục đều
được xem là kết quả âm tính.
Mẫu được kết luận dương tính với salmonella khi có khuẩn lạc đặc trưng trên các môi
trường phân lập và cho những những kết quả sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng, có/không
có H2S và sinh hơi; Ure (-); Indol (-); VP (-); ONPG (-); LDC (+).
6.5.7. Kết quả
Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng.
6.6. Định lượng Bacillus cereus giả định (B. cereus)
6.6.1. Tổng quan về B. cereus
B. cereus là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng tối ưu ở
35-40oC, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc vi khuẩn
này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại
thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, sản phẩm khô,...), chúng có thể tiết ra hai loại độc tố chính
là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra
bởi B. cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không giữ được trong điều kiện lạnh trong
vài giờ trước khi sử dụng.
6.6.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) dùng để
định lượng B. cereus giả định có khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm
khuẩn lạc ở 30oC. Phương pháp này có thể áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người và
thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
6.6.3. Nguyên tắc
- Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng
huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phảm ở dạng khác, lên bề mặt môi trường cấy đặc
chọn lọc đựng trong các đĩa petri.
- Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập
phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
- Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC trong khoảng 18-48 giờ.
- Tính số lượng B.cereus trong 1ml hoặc trong 1g mẫu từ số lượng khuẩn lạc khẳng
định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được
khẳng định theo pháp thử qui định.
6.6.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.8. Môi trường và hóa chất
Polymixin B
Egg Yolk
Cân 10g đối với mẫu rắn hoặc hút 10ml đối với mẫu lỏng + 90ml
Saline Peptone Water
-1
Pha loãng -2
Dịch mẫu [10 ] Dịch mẫu [10 ]
Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô
trùng cho đến khi khô bề mặt thạch. Ủ 300C/24 giờ
Khẳng định B.cereus giả định trên MT thạch máu cừu bằng phản ứng
Haemolysin, Ủ 300C/24 giờ
(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4)
X= (CFU/g hay CFU/ml)
V x (n1+ 0,1 x n2) x d
C1,2,3,4: Số khuẩn lạc B. cereus giả định đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ
pha loãng liên tiếp được giữ lại.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trong 4 đĩa petri được giữ lại ở hai
độ pha loãng liên tiếp
6.7. Phát hiện Shigella spp.
6.7.1. Tổng quan về Shigella spp.
Shigella spp. là trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, Shigella spp. không sinh bào tử
và thường hay bị nhằm lẫn với Salmonella trong quá trình kiểm tra vi sinh. Shigella spp.
không di động và không sinh bào tử, có phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính,
lactose âm tính, H2S âm tính, một vài chủng không sinh hơi khi lên men đường glucose.
Giống Shigella gồm 4 loài: Shigella dysenteriae (kháng huyết thanh nhóm A), Shigella
flexneri (kháng huyết thanh nhóm B, với 6 serovar và một ít serovar phụ), Shigella boydii
(kháng huyết thanh nhóm C, với 15 serovar phụ), Shigella sonei (kháng huyết thanh nhóm
D).
6.7.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 21567:2004 được áp dụng để phát hiện
Shigella trong tất cả các loại thực phẩm
6.7.3. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng chọn lọc. Từ môi trường này cấy
phân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, những khuẩn lạc nghi ngờ sẽ được
kiểm tra khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
6.7.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.9. Môi trường và hóa chất
XLD
LDC
Chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch dinh dưỡng/ủ
0
37 C, 20-24h
D-xycloserin
Thioglycolat lỏng
LS (lactose sunfit) Khẳng định C. Perfringenes
Lactose-gelatin
-1 -1 -2
Dịch mẫu [10 ] Dịch mẫu [10 ] Dịch mẫu [10 ]
02 đĩa petri
02 đĩa petri
TSC 02 đĩa petri 02 đĩa petri
TSC
15 – 20mL 15 – 20mL
15 – 20mL 15 – 20mL
Sau khi đông đặc thêm 10mL TSC mỗi đĩa, chờ đông đặc,
0
lật ngược đĩa ủ kỵ khí ở 37 C trong 20 ± 2 giờ
0
Thioglycolate broth, ủ kỵ khí 37 C, 18 – 24 giờ
0
Lactose sunfit hoặc Nitrat, Lactose-gelatin ủ hiếu khí 46 C/18–24h
động đối với loại mọc dọc theo đường cấy đâm sâu. Tính di động là bằng chứng phát triển
lan rộng vào môi trường cách xa đường cấy đâm sâu. Tiếp theo kiểm tra sự có mặt của
nitrit bằng cách thêm 0,2-0,5ml thuốc thử phát hiện nitrit vào từng ống môi trường nitrit
để kiểm tra sự có mặt của nitrit.
Tương tự cấy từng khuẩn lạc chọn lọc đã chọn ở trên sang môi trường lactose-gelatin,
ủ ở 37oC trong 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Kiểm tra các ống nghiệm về việc sinh khí và
có xuất hiện màu vàng cho thấy sự lên men lactoza. Làm lạnh các ống 1 giờ ở 5oC để kiểm
tra sự hóa lỏng gelatin, nếu môi trường đông đặc thì ủ lại thêm 24 giờ và kiểm tra lại sự
hóa lỏng gelatin.
6.8.7. Kết quả
Đối với kỹ thuật 1: vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch
TSC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là C. perfringenes. Trong
các trường hợp khác, các ống được coi là âm tính.
Đối với kỹ thuật 2: các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trong môi trường TSC
mà không di động, thường khử nitrat thành nitrit, sinh acid và sinh khí từ lactoza và hóa
lỏng gelatin được coi là C. perfringenes.
C. perfringenes trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức:
(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4)
X= (CFU/g hay CFU/ml)
V x (n1+ 0,1 x n2) x d
C1,2,3,4: Số khuẩn lạc C. perfringenes đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ
pha loãng liên tiếp.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên
tiếp.
6.9. Phát hiện Vibrio cholerae (V. Cholerae) và Vibrio parahaemolyticus (V.
parahaemolyticus)
6.9.1. Tổng quan về V. cholerae và V. parahaemolyticus
Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo hình hình dấu
phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men glucose nhưng không sinh hơi,
không sinh H2S. V. cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(-), LDC(+), lên men được
sucrose, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 0-3% naCl, không phát triển được
trong các môi trường chứa 6, 8, 10% muối. V. parahaemolyticus có phản ứng oxidase (+),
ADH (-), LDC (+), không lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác
để lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không có
muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường
chứa 10% muối.
6.9.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO 21872-1:2007)
dùng để phát hiện V. cholerae và V. parahaemolyticus trong thực phẩm và thức ăn chăn
nuôi.
6.9.3. Nguyên tắc
Phát hiện V. cholerae và V. parahaemolyticus trong thực phẩm được thực hiện bằng
cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch
khuẩn được cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc giống V. cholerae
và V. parahaemolyticus sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.
6.9.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.11. Môi trường và hóa chất
Lysine decarboxylase
TW (Tryptone Water)
ONPG
15ml 15ml
VRBG
02 đĩa 02 đĩa
(VRBG đã đun chảy và
0
làm nguội đến 47 C)
Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông
0
đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 37 C trong 24 giờ
(C1xR1)+(C2xR2)+(C3xR3)+(C4xR4)
X= (CFU/g hay CFU/ml)
V x (n1+ 0,1 x n2) x d
C1,2,3,4: Số khuẩn lạc Enterobacteriaceae đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai
độ pha loãng liên tiếp
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên
tiếp.
6.11. Định lượng Coliforms trong thực phẩm bằng phương pháp MPN
6.11.1. Tổng quan về Coliforms
Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn về vi sinh
trong thực phẩm, được áp dụng đầu tiên ở Mỹ từ năm 1920. Nhóm Coliforms hiện diện
rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms
trong thực phẩm là điều không mong muốn, tuy nhiên rõ ràng không thể loại bỏ chúng
hoàn toàn khỏi nhiều thực phẩm đông lạnh hoặc tươi sống. Nhóm Coliforms gồm bốn
giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E.coli; Citrobacter; Klebsiella và
Enterobacter.
Các bộ tiêu chuẩn về thực phẩm, nước uống luôn có mức giới hạn cho tiêu chuẩn này.
6.11.2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4882 : 2007 (ISO 4831 : 2006) dùng để
phát hiện và định lượng Coliforms trong thực phẩm.
6.11.3. Nguyên tắc
Cấy vào bộ 3 ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ kép một
lượng mẫu thử xác định (nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng) hoặc với một lượng huyền
phù ban đầu xác định (nếu các sản phẩm ở dạng khác).
Cấy vào bộ 3 hoặc 5 ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ
đơn một lượng mẫu thử xác định (nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng) hoặc với một lượng
huyền phù ban đầu xác định (nếu các sản phẩm ở dạng khác). Sau đó, trong cùng điều kiện,
cấy các ống tiếp theo chứa môi trường với các dịch pha loãng thập phân của phần mẫu thử
hoặc của huyền phù ban đầu.
Ủ ấm ở 300C hoặc 370C các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép
trong 24 giờ và các ống chứa môi trường nồng độ đơn 24 hoặc 48h và sau đó kiểm tra sự
sinh khí hoặc sự mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí trong các ống này.
Từ các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép và các ống chứa môi
trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn có sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc sinh khí,
cấy các dịch cấy vào một loạt các ống chứa môi trường khẳng định.
Ủ ấm các ống ở trên ở 300C hoặc 370C trong 24h hoặc 48h, và sau đó kiểm tra các
loạt ống này về sự sinh khí.
Tính số có xác suất lớn nhất của Coliforms có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu
(tức là số MPN) từ số ống có sinh khí trong loạt ống thử mới. Dùng bảng để xác định số
có xác suất lớn nhất.
6.11.4. Môi trường và hóa chất
Bảng 6.13. Môi trường và hóa chất
NaOH 10%
6.11.5. Quy trình phân tích
...
Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 220, dựa vào bảng 4.2 tra được số vi
khuẩn Coliformstrong 1 ml (g) mẫu là 2MPN /ml (g).
Ví dụ 2: Trong trường hợp pha loãng nhiều lần thì kết quả tra bảng sẽ nhân với số nghịch
của số pha loãng ban đầu.
Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 220, dựa vào bảng 4.2 có kết quả là 2.
Vậy ta có số vi khuẩn Coliformstrong 1 ml (g) mẫu là 2 x 103vi khuẩn /ml (g).
PHỤ LỤC
MỘT SỐ HÌNH ẢNH MÀU ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG BÀI GIẢNG
Thử nghiệm sinh hóa TSI Thử nghiệm sinh hóa LDC
Thử nghiệm sinh hóa Indol Thử nghiệm sinh hóa Ure
Thử nghiệm Oxy hóa-lên men Thử nghiệm Lên men đường
Khuẩn lạc YM trên Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí trên
môi trường DRBC môi trường PCA
0 0 0 0,0 2 2 2 3,5
0 0 1 0,2 2 2 3 4,0
0 1 0 0,3 2 3 0 3,0
0 1 1 0,6 2 3 1 2,5
0 2 0 0,5 2 3 2 4,0
1 0 0 0,4 3 0 0 2,5
1 0 1 0,7 3 0 1 4,0
1 0 2 1,1 3 0 2 6,5
1 1 0 0,7 3 1 0 4,5
1 1 1 1,1 3 1 1 7,5
1 2 0 1,1 3 1 2 11,5
1 2 1 1,5 3 1 3 10,5
1 3 0 1,6 3 2 0 9,5
2 0 0 0,9 3 2 1 15
2 0 1 1,1 3 2 2 20
2 0 2 2,0 3 2 3 30
2 1 0 1,5 3 3 0 25
2 1 1 2,0 3 3 1 45
2 1 2 3,0 3 3 2 110
2 2 0 2,0 3 3 3 140
2 2 1 3,0
Trường hợp pha loãng nhiều hơn, ví dụ: 1/100, 1/1000, 1/10000 thì kết quả tra bảng sẽ nhân với số nghịch
của số pha loãng ban đầu. Trong trường hợp này kết quả sẽ nhân với 100.
Ví dụ: Chỉ số dương là 321. Tra bảng có kết quả là 2,5. Vậy ta có số vi khuẩn trong 1ml (g) mẫu nguyên
chất là 2,5 x 100 = 250MPN/ml (g).
BẢNG TRA MPN TRONG NƯỚC DÙNG CHO LOẠT 3 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA
LOÃNG LIÊN TIẾP
10 1 0,1 10 1 0,1
0 0 0 - 2 0 0 9
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6 2 1 1 20
0 1 2 9 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6 2 2 0 21
0 2 1 9 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 4 3 0 0 23
1 0 1 7 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 1 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 -
BẢNG TRA MPN TRONG NƯỚC DÙNG CHO LOẠT 5 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG
ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP
10 1 0,1 10 1 0,1
0 0 0 0 4 0 2 20
0 0 1 2 4 0 3 25
0 0 2 4 4 1 0 17
0 1 0 2 4 1 1 20
0 1 1 4 4 1 2 25
0 1 2 6 4 2 0 20
0 2 0 4 4 2 1 25
0 2 1 6 4 2 2 30
0 3 0 6 4 3 0 25
1 0 0 2 4 3 1 35
1 0 1 4 4 3 2 40
1 0 2 6 4 4 0 35
1 0 3 8 4 4 1 40
1 1 0 4 4 4 2 45
1 1 1 6 4 5 0 40
1 1 2 8 4 5 1 50
1 2 0 6 4 5 2 55
1 2 1 8 5 0 0 25
1 2 2 10 5 0 1 30
1 3 0 8 5 0 2 45
1 3 1 10 5 0 3 60
1 4 0 11 5 0 4 75
2 0 0 5 5 1 0 35
2 0 1 7 5 1 1 45
2 0 2 9 5 1 2 65
2 0 3 12 5 1 3 85
2 1 0 7 5 1 4 115
2 1 1 9 5 2 0 50
2 1 2 12 5 2 1 70
2 2 0 9 5 2 2 95
2 2 1 12 5 2 3 120
2 2 2 14 5 2 4 150
2 3 0 12 5 2 5 175
2 3 1 14 5 3 0 80
2 4 0 15 5 3 1 110
3 0 0 8 5 3 2 140
3 0 1 11 5 3 3 175
3 0 2 13 5 3 4 200
3 1 0 11 5 3 5 250
3 1 1 14 5 4 0 130
3 1 2 17 5 4 1 170
3 1 3 20 5 4 2 225
3 2 0 14 5 4 3 275
3 2 1 17 5 4 4 350
3 2 2 20 5 4 5 425
3 3 0 17 5 5 0 250
3 3 1 20 5 5 1 350
3 4 0 20 5 5 2 550
3 4 1 25 5 5 3 900
3 5 0 25 5 5 4 1600
4 0 0 13 5 5 5 1800
4 0 1 17 - - - -