Professional Documents
Culture Documents
DKH 2013 144091
DKH 2013 144091
VŨ ĐỨC HOÀN
HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ ĐỨC HOÀN
HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian làm việc khẩn trương được sự giúp đỡ tận tình của các
thầy cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp
“Nghiên cứu tổng hợp L-dopa từ nguyên liệu trong nước”.
Với tất cả sự kính trọng, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
Thầy giáo PGS.TS Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận
tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi nghiên cứu thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS. Phạm Thị Hiền, DS.
Nguyễn Văn Giang và CN. Phan Tiến Thành của Tổ môn Tổng hợp Hóa dược
- Bộ môn Công nghiệp Dược đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt
nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận vừa qua.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến tất cả thầy, cô thuộc Bộ môn Công
nghiệp Dược, cũng như các thầy, cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và đã dạy
bảo tôi tận tình trong suốt năm năm học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố
mẹ tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể
thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình
thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp.
Vũ Đức Hoàn
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Tổng quan về bệnh Parkinson ..........................................................................2
1.1.1. Định nghĩa và sinh lý bệnh Parkinson ........................................................2
1.1.2. Triệu chứng .................................................................................................4
1.2. Tổng quan về L-dopa .........................................................................................5
1.2.1. Cấu trúc hóa học .........................................................................................5
1.2.2. Tính chất lý hoá...........................................................................................6
1.2.3. Tác dụng dược lý và chỉ định ......................................................................6
1.2.4. Các phương pháp sản xuất L-dopa .............................................................8
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...............................................................................15
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu .........................................................15
2.1.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu ................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................17
2.3. Phương pháp thực nghiệm ..............................................................................18
2.3.1. Thực hiện các phản ứng hoá học để tổng hợp L-dopa ..............................18
2.3.2. Sử dụng các phương pháp vật lý, hoá lý để chiết tách và tinh chế các sản
phẩm tạo thành. ...................................................................................................18
2.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc................................................................18
Chương 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................20
3.1. Kết quả thực nghiệm ........................................................................................20
3.1.1. Tổng hợp (2S)- methyl 2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat ............20
3.1.2. Tổng hợp (2S)- 2-acetamido-3-(4-acetoxyphenyl)propanoat ...................22
3.1.3. Tổng hợp β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin ....................24
3.1.4. Tổng hợp L-dopa.......................................................................................27
3.2. Xác định các thông số vật lý và cấu trúc các chất trung gian và sản phẩm
tạo thành ..................................................................................................................29
3.2.1. Xác định nhiệt độ nóng chảy ....................................................................29
3.2.2. Kết quả phân tích phổ ...............................................................................30
3.3. Bàn luận ............................................................................................................33
3.3.1. Với phản ứng acyl hóa ..............................................................................33
3.3.2. Với phản ứng chuyển vị Fries ...................................................................34
3.3.3. Với phản ứng oxy hóa và phản ứng thủy phân .........................................34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................35
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ac Acetyl
BB Nhân bụng bên đồi thị
CÐpđ Chất đen phần đặc
CÐpl Chất đen phần lưới
CNpn Cầu nhạt phần ngoài
CNpt Cầu nhạt phần trong
GABA Acid gama amino butyric
IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
KL Khối lượng
MeOH Methanol
MS Phổ khối lượng phân tử (Mass spectroscopy)
NDÐ Nhân dưới đồi thị
1
H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic
resonance spectroscopy)
Rf Hệ số lưu giữ (Refension of factor)
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TB Trung bình
DANH MỤC CÁC BẢNG
Hình 1.1: Sơ đồ đường dẫn truyền tr ực tiếp và gián tiếp của hạch nền trên ng ười
bình thường và hội chứng Parkinson ..........................................................................3
Hình 3.1: SKLM của phản ứng tổng hợp (2S)- methyl 2-amino-3-(4-
hydroxyphenyl)propanoat (6)....................................................................................20
Hình 3.2: Sơ đồ quy trình tổng h ợp (2S)-methyl 2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)
propanoat (6) .............................................................................................................21
Hình 3.3: SKLM của phản ứng tổng hợp β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-
alanin (4) ...................................................................................................................25
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình tổng h ợp β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-
alanin (4) ...................................................................................................................26
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình tổng hợp L-dopa (1)........................................................28
Hình 3.6: SKLM của phản ứng tổng hợp L-dopa (1) ...............................................29
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trên thế giới có khoảng 6,3 triệu người mắc bệnh Parkinson và rất
khó xác định yếu tố nguy cơ cho bệnh này vì nguyên nhân của bệnh vẫn chưa được
biết rõ. Tuổi là yếu tố nguy cơ duy nhất được biết đến hiện nay. Bệnh thường bắt
đầu lúc đã trên 60 tuổi, tuy nhiên có khoảng 1/10 số bệnh nhân bị khởi bệnh trước
50 tuổi và rất hiếm khi có người khởi phát ở 30 tuổi. Tuổi càng cao càng dễ mắc
bệnh Parkinson. Tuy nhiên, có một số trường hợp bệnh Parkinson (khoảng 5%)
khởi phát ở người trẻ. Một số nghiên cứu cũng cho rằng những người tiếp xúc lâu
dài với vài yếu tố môi trường như thuốc trừ sâu, hóa chất... có thể tăng nguy cơ phát
triển bệnh Parkinson [6].
Liệu pháp điều trị bệnh Parkinson có hiệu quả nhất là levodopa (L-dopa) kết
hợp với chất ức chế decarboxylase ngoại biên. Một số thuốc khác tác động tại sinap
dopaminergic cũng hữu ích, đặc biệt khi phối hợp với levodopa. Ở Việt Nam,
levodopa vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong điều trị bệnh Parkinson. Một số
thuốc thuộc nhóm đồng vận dopamin, tác dụng kích thích trực tiếp thụ thể dopamin
nhưng hiệu quả giảm triệu chứng không bằng levodopa [2].
Như vậy nhu cầu sử dụng L-dopa để điều trị là rất lớn. Nhưng hiện nay ở
Việt Nam, nguyên liệu L-dopa để sản xuất thuốc điều trị Parkinson đều có nguồn
gốc nhập khẩu. Do vậy, để góp phần nghiên cứu nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng L-
dopa làm nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin”.
Với các mục tiêu như sau:
Nghiên cứu tổng hợp được L-dopa từ L-tyrosin là nguồn nguyên liệu
trong nước.
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tổng hợp L-dopa từ
L-tyrosin.
2
bụng bên, nhân bụng trước, nhân trung tâm giữa từ đó giảm kích thích lên võ não
vùng trán, trước vận động và vùng vận động phụ.
Thứ hai là thụ thể D1 không còn bị kích thích. Như vậy, ức chế của hệ
GABA lên thể nhạt trong và phần lưới của liềm đen bị giảm, tiếp sau là hai tổ chức
này gia tăng ức chế lên đồi thị.
Từ hai hệ quả trên làm tăng các xung động dẫn truyền đi của hệ GABA-ergic
từ thể vân và góp phần làm các động tác nghèo nàn và chậm chạp. Sự suy giảm
chức năng của cầu nhạt dẫn đến sự vô động hay giảm động là biểu hiện của sự thiếu
hụt dopa. Tăng trương lực cơ ngoại tháp có bản chất phản xạ do sự đáp ứng thêm
vào mang tính chất pha đối với những thông điệp sinh ra khi kéo dài các cơ [6].
Hình 1.1: Sơ đồ đường dẫn truyền trực tiếp và gián tiếp của hạch nền trên người
bình thường và hội chứng Parkinson
4
NH2
HO
1
Ức chế enzym decacboxylase ở ngoại biên làm tăng rõ rệt lượng L-dopa
uống vào chưa chuyển hóa để qua hàng rào máu não và giảm được tác dụng không
mong muốn ở đường tiêu hóa [2,7].
Dược động học
Tuy có một lượng đáng kể levodopa bị chuyển hóa trong dạ dày và ruột,
nhưng thuốc được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa. Khi uống cùng với
thức ăn, thuốc được hấp thu ở đường tiêu hóa chậm hơn. Levodopa phân bố rộng rãi
trong phần lớn các mô. Thời gian bán thải của levodopa trong huyết tương khoảng 1
giờ. Khi uống phối hợp carbidopa và levodopa, thời gian bán thải của levodopa
trong huyết tương tăng lên khoảng 1,5 - 2 giờ. Ða phần lượng levodopa được hấp
thu bị khử carboxyl thành dopamin. Carbidopa chỉ ức chế sự khử carboxyl của
levodopa ở ngoại biên, vì giống dopamin, carbidopa không qua được hàng rào máu
- não. Khoảng 80 - 85% liều levodopa bài xuất qua nước tiểu trong vòng 24 giờ [2].
1.2.3.2. Chỉ định
- Tất cả các thể hội chứng Parkinson (ngoại trừ các trường hợp hội chứng ngoại
tháp do thuốc gây ra).
- Bệnh Parkinson tự phát.
- Hội chứng Parkinson sau viêm não.
- Hội chứng Parkinson do xơ cứng động mạch não.
- Hội chứng Parkinson sau tổn thương hệ thần kinh trung ương do nhiễm độc
cacbon mono oxyd hoặc bởi mangan [2,7].
1.2.3.3. Dạng thuốc và hàm lượng
- Viên nén 10mg, 20mg, 25mg, 250mg.
- Dạng giải phóng ổn định chứa 50mg-200mg.
- Viên nang phóng thích chậm 125mg, hộp 100 viên, viên nang 250mg, hộp 60
viên [2,7].
1.2.3.4. Liều lượng và cách dùng
Liều tối ưu của levodopa cần được xác định với từng người bệnh. Một khi đã
xác định được liều thì duy trì cần được giảm khi ng ười bệnh càng cao tuổi . Liều
8
khởi đầu là 125mg, 2 lần/ngày, tăng dần cách 3 đến 7 ngày 1 lần tuỳ theo đáp ứng,
có thể tới 8g/ngày chia làm nhiều lần [2,7].
1.2.3.5. Biệt dược
Madopa (Roche), Nacom (Bristol-Myers Squibb), Stalevo (Novartis), Doparl
(Kyowa Hakko), Parkopa (Schwarz), … [7]
1.2.4. Các phương pháp sản xuất L-dopa
1.2.4.1. Các phương pháp sinh tổng hợp L-dopa
L-dopa đã được sinh tổng hợp từ L-tyrosin và dẫn xuất bằng cách sử dụng
enzym tyrosinase có trong các loài nấm Aspergillus. L-dopa thu được bằng phương
pháp này thường lẫn L-tyrosin và sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột. Tuy
nhiên quy trình sinh tổng hợp L-dopa theo phương pháp này thường bị ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố như chủng vi sinh vật lựa chọn, nhiệt độ, nồng độ và hiệu suất của
quá trình lên men thấp. Hơn thế nữa, thời gian sinh nuôi cấy vi sinh vật kéo dài , sản
phẩm lẫn tạp khó tinh chế [14,17,20,22,25].
1.2.4.2. Các phương pháp tổng hợp hóa dược
a) Phương pháp của H. Bretscheneider (1973)
Đầu tiên acyl hóa L-tyrosin (2) bằng anhydrid acetic trong dung dịch NaOH
2N. Sau khi phản ứng kết thúc, acid hóa hỗn hợp phản ứng về pH= 2 thu được kết
tủa là acid (S)-2-acetamido-3-(4-acetoxyphenyl)propanoic (3). Acid (S)-2-
acetamido-3-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)propanoic (4) được tổng hợp từ nguyên
liệu 3 với xúc tác là acid Lewis AlCl3 trong môi trường nitrobezen ở 1000C. Tiến
hành thủy phân hợp chất 4 trong môi trường acid HCl 2N thu được chất acid 2-
amino-3-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)propanoic (5). Hợp chất 5 cũng được tổng hợp
trực tiếp từ L-tyrosin (2) với hỗn hợp xúc tác AlCl3/CH3COCl trong môi trường
nitrobenzen ở 1000C. L-dopa (1) được tổng hợp nhờ phản ứng oxy hóa hợp chất 5
với H2O2 trong môi trường NaOH 1N [27].
Quy trình phản ứng như sau:
9
(CH3CO)2O
HO CH2 CH COOH H3CCOO CH2 CH COOH
NH2 NHCOCH3
2 3
AlCl3/CH3COCl
AlCl3 / 1000
1000
HCl 2N
HO CH2 CH COOH HO CH2 CH COOH
NH2 NHCOCH3
O CCH3 5 O CCH3 4
H2O2 / NaOH
HO CH2 CH COOH
NH2
HO 1
Nhận xét:
Ưu điểm: Quy trình này bắt đầu từ L-tyrosin nên sản phẩm thu được là dạng
đồng phần L có hoạt tính sinh học. Nguyên phụ liệu của quy trình đều thông dụng
dễ tìm, dễ thu mua số lượng lớn nên thuận tiện khi triển khai ở quy mô công nghiệp.
Đặc biệt phương pháp đã có cải tiến rõ rệt trong giai đoạn sử dụng tác nhân
AlCl3/CH3COCl để rút ngắn quy trình.
Nhược điểm: Quy trình phản ứng có sử dụng một số tác nhân và một số dung
môi có độc tính cao, gây ô nhiễm môi trường như các loại acid đặc, kiềm đặc, acetyl
clorid. Vì vậy cần đặc biệt chú ý đến vấn đề an toàn lao động.
b) Phương pháp của B. Luigi và G. Onofrio (1970)
Acyl hóa methyl 2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat (6) bằng anhydrid
acetic trong pyridin khan thu được sản phẩm methyl 2-acetamido-3-(4-
acetoxyphenyl)propanoat (7). Thực hiện phản ứng chuyển vị Fries với tác nhân
AlCl3, nguyên liệu là hợp chất 6 trong nitrobenzen thu được acid 2-acetamido-3-(3-
acetyl-4-hydroxyphenyl)propanoic (4). Thực hiện phản ứng oxy hóa 4 với H2O2
trong môi trường NaOH 1N thu được acid 2-acetamido-3-(3,4-
10
dihydroxyphenyl)propanoic (8). Thủy phân 8 trong dung dịch acid HBr 48% thu
được tinh thể L-dopa (1). Lọc, rửa sạch bằng nước lạnh và sấy chân không thu được
sản phẩm 1 [23].
COOCH3 COOCH3
(CH3CO)2O
NH2 NHCOCH3
HO pyridin H3CCO
6 7
O
O
HO COOH
H3CC COOH H2O2 /NaOH
AlCl3
NHCOCH3
nitrobenzen NHCOCH3 HO
HO
4 8
2. NaOH NH2
HO
1
Nhận xét:
Ưu điểm: Phương pháp này đi từ nguồn nguyên phụ liệu, tác nhân thông
dụng, dễ tìm đặc biệt là nguyên liệu L-tyrosin do có thể chiết tách từ sừng, lông,
móng động vật. Cũng do nguyên liệu là dạng đồng phân L, quy trình tổng hợp
không gây racemic hoá nên sản phẩm L-dopa thu được là dạng đồng phân L có hoạt
tính sinh học.
Nhược điểm: Quy trình có sử dụng một số tác nhân và dung môi có khả năng
ăn mòn hoặc độc tính cao như acid đặc, kiềm đặc, pyridin, nitrobenzen nên cần chú
ý đến vấn đề an toàn lao động.
c) Phương pháp của Donald F.Reinhold và cộng sự (1986)
Acid 2-amino-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propanoic (10) được tổng hợp
từ nguyên liệu 5-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)imidazolidin-2,4-dion (9) bằng phản
ứng trong dung dịch NaOH 1N. Sau đó, acyl hoá 10 với anhydrid acetic trong dung
dịch NaOH 5N thu được hỗn hợp đồng phân racemic của acid 2-acetamido-3-(4-
acetoxy-3-methoxyphenyl)propanoic (11). Hỗn hợp đồng phân racemic đư ợc tách
ra và hợp chất 12 được thu lấy để tổng hợp L-dopa. Thuỷ phân 12 trong môi trường
11
acid HCl 12N thu được L -dopa (1). Đồng phân R 13 được tái sử dụng bằng cách
cho phản ứng với Ac 2O để tạo 14. Thuỷ phân 14 trong môi trường acid để tái tạo
nguyên liệu 11 cho quá trình tổng hợp L-dopa [24].
Nhận xét:
Phương pháp trải qua nhiều giai đoạn, quy trình tổng hợp phức tạp và còn có
nhiều hạn chế cần khắc phục như hiệu suất còn thấp, sản phẩm thu được là một hỗn
hợp racemic, do vậy cần tiến hành tách để thu lấy đồng phân L có hoạt tính sinh
học.
Sơ đồ các giai đoạn tổng hợp như sau:
CH2 CH NH CH2 CH COOH
NaOH (CH3CO)2O
OC CO NH2
N NaOH
HO H HO
OCH3 OCH3 10
9
CH2 CH COOH CH2 CH COOH
H+
NH NH 1
H3CCO COCH3 H3CCO COCH3
O OCH3 O OCH3
(S)
11 (R,S) 12
H+ O
H CH2 CH COOH
CH2 C
(CH3CO)2O NH
N O
+
H H3CCO COCH3
H3CCO
CH3 O OCH3
O OCH3
(R,S) 13 (R)
14
Thủy phân 17 trong dung dịch acid HBr 48% ở 1180C trong 5 giờ thu được sản
phẩm acid 2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic (1) [13].
H3CO H3CO
H3CO HO
O
H3CO CH2 CH CNH2 HO CH2 CH COOH
NH2 NH2
1
17
Nhận xét:
Phương pháp của C. Vicenzo và cộng sự có nhiều hạn chế do sử dụng nhiều
hóa chất và dung môi. Quá trình tổng hợp tiến hành phức tạp và hiệu suất không
cao, thời gian tổng hợp kéo dài nên khó áp dụng vào quy mô công nghiệp.
e) Phương pháp của William S. Knowles và cộng sự (1975)
Nguyên liệu ban đầu là vanillin (18) được phản ứng với acetylglycin (19) thu
được sản phẩm acid 2-acetamido-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylic (20).
Thêm xúc tác để phản ứng hydro hóa nguyên liệu 20 xảy ra thu được hợp chất N-
acety1-3-(4 -hydroxy-3-methoxypheny1)-alanin, với 80% hợp chất có cấu hình L và
20% hợp chất có cấu hình D. Methanol được tách ra và acid HCl đặc được thêm vào
để kết tinh hợp chất 21. Hồi lưu hỗn hợp gồm nguyên liệu 21 và dung dịch trong 3
giờ. Sau khi hoàn thành phản ứng dung dịch phản ứng được làm lạnh đến 25-300C,
thêm nước và trung hòa tới pH = 3 bằng NaOH 2N. L-dopa (1) kết tinh và thu hồi
bằng cách lọc và rửa với nước lạnh [18,19].
Quy trình tổng hợp L-dopa được tiến hành như sơ đồ sau:
13
R = HO
H3CO HO
COOH
HO CH2 CH COOH *
R H2C CH
NH2 NHCOCH3
1
21 L
Nhận xét:
Phương pháp trải qua ít giai đoạn nhưng xúc tác dùng trong phản ứng hydro
hóa đắt tiền và khó kiếm.
f) Phương pháp của M. Lewandowski
Phương pháp tổng hợp sử dụng nguyên liệu là L-tyrosin (2). Quá trình tổng
hợp trải qua 3 giai đoạn chính. Quá trình tổng hợp như sau: Phản ứng nitro hóa L-
tyrosin (2) với tác nhân HNO3/H2SO4 thu được hợp chất L-3-nitro tyrosin (22). Tiếp
theo là phản ứng hydro hóa hợp chất 22 với tác nhân kim loại trong dung dịch acid
thu được hợp chất L-3-amino tyrosin (23). Tiến hành phản ứng tạo hợp chất diazo
từ nguyên liệu 23 với tác nhân NaNO2/HCl rồi thủy phân trong môi trường nước thu
được sản phẩm L-dopa (1) [29].
HO CH2 CH COOH
HO CH2 CH COOH
NH2
NH2
HO 1
H2N 23
14
Nhận xét:
Phương pháp cũng đi từ nguyên liệu ban đầu là L-tyrosin. Quá trình tổng hợp
trải qua ít giai đoạn nhưng hiệu suất các giai đoạn chưa cao. Đồng thời phản ứng
hydro hóa tiến hành phức tạp nên quy trình còn nhiều hạn chế.
1.2.4.3. Các phương pháp chiết xuất
Don V. Wysong và cộng sự đã tiến hành chiết xuất L-dopa từ hai nguồn
nguyên liệu: đậu mèo rừng đất, móc mèo đất.
L-dopa thu được từ bột xay thô mịn của đậu mèo rừng đất (Vicia faba) bằng
cách chiết xuất với acid sulfuric loãng. Protein trong đó phải được kết tủa bằng
dung dịch chì acetat. Sau khi lọc bỏ protein kết tủa, phần dịch lọc được kiềm hoá
nhẹ để kết tủa muối chì của L-dopa. L-dopa sau đó thu được bằng cách phân hủy
muối chì với hydro sulfid.
Với nguyên liệu là móc mèo đất , các tác giả đã thực hiện chiết xuất với dung
dịch acid acetic 1% ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 20 giờ, khuấy trong 4
giờ đầu. Dịch được gạn và chất đậu nhão được lọc chân không qua lưới lọc, xử lý
bằng acid trong một phễu Buchner. Dịch được gạn chắt được kết hợp với phần lọc
được và cô đặc trong chân không và môi trường khí nitơ. Sau khi xử lý với cacbon
hoạt tính, chất cô đặc sau đó được lọc qua lưới lọc, xử lý bằng acid. Sau khi cô đặc
phần lọc, chất rắn bắt đầu kết tinh. Dịch lọc được làm lạnh ở 50C trong vài giờ, lọc
thu được L-dopa. Acid formic, acid cloroacetic và acid propionic được thay thế thay
acid acetic có kết quả tương đương [26].
15
- Xác định độ tinh khiết của các chất trung gian và sản phẩm
- Khẳng định cấu trúc phân tử của các chất trung gian và sản phẩm cuối cùng
của quy trình tổng hợp.
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Thực hiện các phản ứng hoá học để tổng hợp L-dopa
Phương pháp tổng hợp được lựa chọn dựa trên cơ sở: nguyên liệu sẵn có,
điều kiện phản ứng phù hợp với các điều kiện thí nghiệm hiện có tại Việt Nam và
có thể triển khai sản xuất trên quy mô công nghiệp, nhằm đáp ứng nhu cầu về
nguyên liệu để bào chế thuốc hiện nay.
Nguyên liệu L-tyrosin: L-tyrosin được chiết tách ra từ dịch thuỷ phân các
nguồn keratin khác nhau (sừng, lông, tóc, móng…) trong môi trường acid. L-tyrosin
là phụ phẩm của quy trình chiết tách L-cystin làm nguyên liệu bán tổng hợp N-
acetyl-L-cystein trong đề tài cấp Nhà nước đã được nghiệm thu thành công của Bộ
môn Công nghiệp Dược. Nguồn nguyên liệu này sẵn có, có khả năng đáp ứng đủ
cho nhu cầu sản xuất ở quy mô công nghiệp [4,8,10,11].
2.3.2. Sử dụng các phương pháp vật lý, hoá lý để chiết tách và tinh chế các sản
phẩm tạo thành.
- Các phương pháp chiết tách
- Phương pháp kết tinh
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng:
+ Pha tĩnh: Silicagel GF254
+ Pha động: n-Butanol: Acid acetic băng: Nước = 9: 2: 2,5
+ Thuốc thử hiện màu: dung dịch ninhydrin/aceton, nồng độ 1%.
2.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc
Các chất tổn g hợp được xác định cấu trúc bằng các lo ại phổ sau : phổ hồng
ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
- Phổ hồng ngoại (IR): phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer với kĩ
thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Các mẫu rắn được phân tán
19
trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực
cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm .
- Phổ khối lượng (MS): phổ khối lượng các chất được ghi bằng máy Agilent
6310 Ion Trap của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam; trên máy đo phổ khối lượng LC-MSD-
Trap-SL và máy đo phổ khối lượng p hân giải cao FT -ICR-MS-Varian
910MS tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) được ghi trên máy Bruker AV -500
tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
20
2
6
Hình 3.1: SKLM của phản ứng tổng hợp (2S)- methyl 2-amino-3-(4-
hydroxyphenyl)propanoat (6)
21
Kết quả cho thấy sản phẩm tạo thành cho một vết tròn màu cam có Rf6=0,45
so với nguyên liệu có Rf2= 0,73. Như vậy có thể kết luận sơ bộ sản phẩm thu được
đã loại bỏ hoàn toàn nguyên liệu và không có tạp.
Quy trình tổng hợp được mô tả ở Hình 3.2
1. L-tyrosin Khuấy
2. Methanol
Làm lạnh
Hợp chất 6
COOCH3 COOCH3
2 (CH3CO)2O
NH2 pyridin NHCOCH3
HO H3CCO
6 7
O
Theo dõi tiến trình phản ứng chúng tôi nhận thấy phản ứng kết thúc ở 4h. Như
vậy: chọn thời gian phản ứng tốt nhất là 4h.
Khảo sát nhiệt độ tiến hành phản ứng
Tiến hành phản ứng với các thông số sau:
- Nhiệt độ phản ứng khảo sát là: 15, 20, 25, 30, 35 (0C).
- Tỷ lệ mol Ac2O: sản phẩm ester = 2,5
- Thời gian: 4h.
Quá trình phản ứng tương tự như trên, khối lượng L-tyrosin methyl ester = 1g.
Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất phản
ứng acyl hóa
KL sản phấm Hiệu suất Nhiệt độ nóng
STT Nhiệt độ phản ứng (0C)
(g) phản ứng (%) chảy (0C)
1 15 0,97 67,80 105-107
2 20 1,01 70,59 105-107
3 25 1,08 75,48 105-107
4 30 1,02 71,29 105-107
5 35 0,98 68,49 105-107
Nhận xét: Từ kết quả thu được như trong Bảng 3.1 ta thấy khi tăng nhiệt độ phản
ứng từ 150C lên 350C thì hiệu suất tăng từ 67,80% lên 75,48% ở 250C và giảm
xuống 68,49% ở 350C. Như vậy nhiệt độ phản ứng khoảng 250C sẽ cho hiệu suất
lớn nhất là 75,48%.
Khảo sát tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng
Tiến hành phản ứng với các thông số sau:
- Nhiệt độ phản ứng khảo sát là: 250C.
- Thời gian: 4h.
- Tỷ lệ mol Ac2O: sản phẩm ester = 2,00; 2,25; 2,50; 2,75.
Quá trình phản ứng tương tự như trên, khối lượng L-tyrosin methyl ester = 1g.
24
Nhận xét: Từ kết quả thu được như trong Bảng 3.2 ta thấy khi tỷ lệ mol anhydrid
acetic: L-tyrosin methyl ester tăng từ 2,0 lên 2,25 thì hiệu suất phản ứng tăng từ
69,89% lên 76,88% và giảm xuống 71,99% ở tỷ lệ 2,75/1. Tỷ lệ mol anydrid acetic:
L-tyrosin methyl ester = 2,25 thì hiệu suất phản ứng là lớn nhất 76,88%.
Như vậy, qua kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp từ,
các thông số cho quy trình phản ứng tốt nhất được trình bày ở Bảng 3.3:
Bảng 3.3: Các thông số tốt nhất cho quy trình phản ứng tổng hợp
Tỷ lệ mol Ac2O Nhiệt độ Thời gian phản
Hiệu suất phản ứng
và ester phản ứng ứng
2,25 250C 4h 76,88%
Cho vào bình cầu 1 cổ khô, dung tích 250ml: 3g (10,75 mmol) nguyên liệu 7
và 36ml nitrobenzen. Khuấy cho tan hết, thêm vào bình 3,6g (26,96 mmol) AlCl3
khan, hỗn hợp được đun hồi lưu trong khoảng 4h ở nhiệt độ 1250C-1300C. Trong
quá trình đun có kiểm tra sản phẩm tạo thành bằng sắc ký lớp mỏng. Sau đó, làm
lạnh bình phản ứng, thêm 60ml nước lạnh và 5,5ml acid HCl đặc, khuấy trong vòng
20 phút.
Chiết 2 lần bằng ethylacetat: lần 1 với 100ml ethylacetat, lần 2 với 50ml
ethylacetat. Thu lấy dịch chiết pha hữu cơ. Gộp dịch chiết và tiếp tục chiết bằng
NaOH 2N, lần 1 với 15ml, lần 2 với 5ml. Thu lấy dịch chiết pha nước. Loại
nitrobenzen thừa bằng ether dầu hỏa. Dịch chiết được làm lạnh về 50C và sau đó
điều chỉnh về pH =1 bằng acid HCl đặc thu được tủa. Sấy khô tủa thu được hợp
chất 4. Nhiệt độ nóng chảy t0nc= 146-1480C.
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng
Kết quả sắc ký lớp mỏng được mô tả ở Hình 3.3
1. Nước đá
Acid hóa pH=1
2. Acid HCl đặc
Lọc
Sấy
Hợp chất 4
1. Nguyên liệu 4
Khuấy 22h-24h
2. Dd H2O2 7,1%
ở nhiệt độ 250C
3. Dd NaOH 2N
Hợp chất 1
Hình 3.6: SKLM của phản ứng tổng hợp L-dopa (1)
Kết quả cho thấy sản phẩm tạo thành cho một vết tròn màu vàng có Rf1= 0,45.
Như vậy có thể kết luận sơ bộ sản phẩm thu được đã loại bỏ hoàn toàn nguyên liệu
và không có tạp.
3.2. Xác định các thông số vật lý và cấu trúc các chất trung gian và sản phẩm tạo
thành
3.2.1. Xác định nhiệt độ nóng chảy
Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất tổng hợp được bằng máy đo
nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ), thu được kết quả như sau:
Bảng 3.4: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy các chất trung gian và sản phẩm L-dopa
Tính chất Nhiệt độ
STT Các hợp chất
cảm quan nóng chảy
(2S)-methyl 2-amino-3-(4-
1 Tinh thể trắng 134-1360C
hydroxyphenyl)propanoat (6)
30
(2S)-2-acetamido-3-(4-
2 Tinh thể trắng 105-1070C
acetoxyphenyl)propanoat (7).
β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L- Tinh thể vàng
3 146-1480C
alanin (4) nhạt
Nhận xét: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy phù hợp với kết quả trong các tài liệu đã
công bố [16,21,23,24,27,28].
3.2.2. Kết quả phân tích phổ
3.2.2.1. Kết quả phân tích phổ IR
Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR
Phụ Đỉnh hấp thụ
Chất Công thức cấu tạo Nhóm chức
lục (cm-1)
3208 -NH2
O
2996 -C-H thơm
1 6
OCH3 2833 H3C-O-C- ester
NH2
HO 1731 -C=O ester
3256 -NH amid
O 1745 -C=O ester
2 7 OCH3 1633 -C=O amid
NHCOCH3
H3CCO
1558 -C=C- thơm
O
3372 -NH3+
O 3076 -O-H phenol
HO
4 1 OH 1730 -C=O acid
NH2
HO 1570 -C=C- thơm
1254 -C-O- acid
Nhận xét:
Phổ hồng ngoại của các chất được trình bày ở Bảng 3.5, kết quả đã cho những
dải hấp thụ đặc trưng của các chất được phân tích:
- Hợp chất 6 đã thấy xuất hiện nhóm -C=O ester có đỉnh hấp thụ 1731 cm-1.
Chứng tỏ phản ứng ester hoá đã xảy ra.
- Hợp chất 7 đã thấy xuất hiện nhóm -C=O ester có đỉnh hấp thụ 1745 cm-1 và
nhóm -C=O amid có đỉnh hấp thụ 1633 cm-1 chứng tỏ đã xảy ra phản ứng O-
acyl hoá và N-acyl hoá.
- Hợp chất 4 đã thấy xuất hiện nhóm -C=O acid có đỉnh hấp thụ 1726 cm-1 và
-C=O amid có đỉnh hấp thụ 1641 cm-1 chứng tỏ phân tử đã có nhóm acid
carboxylic và nhóm amid.
- Hợp chất 1 đã thấy xuất hiện nhóm –O-H phenol có đỉnh hấp thụ 3076 cm-1,
nhóm -C=O acid có đỉnh hấp thụ 1730 cm-1 chứng tỏ đã xả ra phản ứng oxy
hoá nhóm ceton tạo -O-H phenol.
3.2.2.2. Kết quả phân tích phổ MS
Kết quả phổ MS được trình bày tại Bảng 3.6
Kết quả phân tích phổ MS trong Bảng 3.6 đã cho thấy phổ khối lượng của
từng chất đều cho pic phân tử có số khối đúng bằng khối lượng phân tử dự kiến của
chất cần phân tích. Đặc biệt Phụ lục 7: phổ MS của L-dopa đã cho mảnh có m/z
phù hợp với khối lượng của L -dopa và kết quả dự đoán công thức phân tử
C9H12NO4 đúng với công thức phân tử của sản phẩm L-dopa (1).
3.2.2.3. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR
Phổ 1H-NMR của các sản phẩm được đo trên máy Bruker AV500, Viện Hóa
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR
Phụ lục Chất phân tích Kết quả phân tích
1, 78 (3H, s, -NH-CO-CH3)
2,62 (3H, s, -CO-CH3)
O O
2' 3,0 (2H, m, C3H)
H3CC 3' 1' 3 2 1
OH 4,5 (1H, m, -CH-COOH)
8 6' NHCOCH3
HO 4'
5' 6,87 (1H, s, C2’-H)
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR được trình bày trong Bảng 3.7, kết quả cho
thấy:
- Phổ 1H-NMR của hợp chất 4, 1 xuất hiện các pic với số lượng proton phù
hợp.
- Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 xuất hiện các pic 1,78 ppm của nhóm methyl
trong -NH-CO-CH3, 2,62 ppm của nhóm methyl trong -CO-CH3, 4,5 ppm
của nhóm –CH- trong -CH-COOH, 11,89 của nhóm –OH phenol, chứng tỏ
hợp chất này đã có thêm nhóm –OH, -CO-CH3 gắn với nhân thơm trong phân
tử và gốc acid carboxylic.
3.3. Bàn luận
3.3.1. Với phản ứng acyl hóa
- Phản ứng acyl hoá từ 6 đến 7:
• Thời gian phản ứng: như kết quả đã khảo sát, thời gian tốt nhất cho phản ứng
là 4h. Khi tăng thời gian phản ứng thì hiệu suất phản ứng cũng không tăng
thêm nữa.
• Nhiệt độ phản ứng: từ kết quả thu được như trong Bảng 3.1 ta thấy khi tăng
nhiệt độ phản ứng từ 150C lên 350C thì hiệu suất tăng từ 67,80% lên 75,48%
ở 250C và giảm xuống 68,49% ở 350C. Như vậy nhiệt độ phản ứng khoảng
250C sẽ cho hiệu suất lớn nhất là 75,48%. Nguyên nhân : ở nhiệt độ thấp
hơn như 0-50C chỉ xảy ra phản ứng N-acyl hóa do khả năng phản ứng acyl
của nhóm –OH phenol yếu hơn ở nhiệt độ thấp . Khi nâng dần nhiệt độ thì
khả năng phản ứng acyl của nhóm –OH phenol cũng tăng lên và xảy ra đồng
thời phản ứng O-acyl hóa và N-acyl hóa [5].
• Tỷ lệ mol : từ kết quả thu được như trong Bảng 3.2 ta thấy khi tỷ lệ mol
anhydrid acetic : L-tyrosin methyl ester tăng từ 2,0 lên 2,25 thì hiệu suất
phản ứng tăng từ 69,89% lên 76,88% và giảm xuống 71,99% ở tỷ lệ 2,75/1.
Tỷ lệ mol anydrid acetic : L-tyrosin methyl ester = 2,25 thì hiệu suất phản
ứng là lớn nhất 76,88%. Nguyên nhân có thể là do : phản ứng diacyl nên tỷ
lệ mol tối thiểu là 2/1, khi tăng tỷ lệ mol lên 2,25/1 thì hiệu suất tăng lên
34
nhưng nếu tăng thêm nữa thì có thể xảy ra phản ứng triacyl tạo sản phẩm
phụ làm giảm hiệu suất.
- Phản ứng cần thực hiện trong môi trường khan nước, do tác nhân Ac2O dễ bị
phân hủy trong môi trường nước nên hóa chất và thiết bị cần được làm khô
trước khi tiến hành phản ứng.
3.3.2. Với phản ứng chuyển vị Fries
Phản ứng chuyển vị từ 7 đến 4:
AlCl3 là một acid Lewis có vai trò xúc tác cho phản ứng. Một trong những điều
kiện để acid Lewis phát huy tác dụng là phản ứng phải thực hiện dưới điều kiện
khan nước. Sự hiện diện của một lượng nhỏ nước làm ngưng phản ứng do acid
Lewis sẽ tác dụng ngay lập tức với nước và bị phân hủy. Vì vậy, phản ứng cần được
thực hiện trong môi trường khan nước, dung môi sử dụng là nitrobenzen, xúc tác
AlCl3 khan, hóa chất và thiết bị cần được làm khô trước khi phản ứng [9].
3.3.3. Với phản ứng oxy hóa và phản ứng thủy phân
Phản ứng oxy hóa từ 4 đến 8: cần chú ý loại hoàn toàn H2O2 bằng SO2.
Phản ứng thủy phân từ 8 đến 1: khi sử dụng tác nhân là acid HBr 48% thì phản
ứng xảy ra mãnh liệt, gây ra khó khăn khi tinh chế sản phẩm. Vì vậy chúng tôi đã
tiến hành thay thế acid HBr bằng hỗn hợp acid với tỷ lệ thể tích acid HCl đặc : Acid
acetic băng = 1 : 2. Kết quả: phản ứng tốt và hiệu suất cao, sản phẩm dễ tinh chế.
35
OCH3
NH2
HO
OCH3
NHCOCH3
H3CCO
O
OCH3
NHCOCH3
H3CCO
O
M = 279
M=265
[2M-H]
NH 2
N
HO
M=197
NH2
HO