TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG


TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Trichoderma Hazianum VÀ ỨNG DỤNG CHẾ
PHẨM TRONG NÔNG NGHIỆP
 TÓM TẮT

Ngày nay, việc sử dụng phân bón vi sinh trong nông nghiệp đang được ứng dụng
rộng rãi do những vấn đề nguy hại từ phân hóa học gây nên. Vì thế, các nghiên cứu tạo
ra các chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp cũng đang được tiến hành ngày
càng nhiều. Và nói đến việc phòng trừ sâu bệnh hại trên cây trồng thì Trichoderma là
loài nấm đang được quan tâm nhiều hiện nay do Trichoderma là một loài nấm đối
kháng, nó có khả năng đối kháng mạnh với nhiều loài vi nấm gây hại trên cây trồng.
Không chỉ vậy loài nấm này còn có khả năng hỗ trợ, cải thiện sự sinh trưởng của cây.

Trước thực trạng trên, dưới sự hướng dẫn của Ths. Ngô Minh Nhã, sinh viên
Phạm Như Ngọc đã thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma
Hazianum và ứng dụng chế phẩm trong nông nghiệp”. Đề tài được thực hiện tại Phòng
Thí Nghiệm Vi Sinh, Trường CĐ Kinh tế - Công nghệ TP. HCM từ ngày 4/10/2009
đến ngày 4/01/2010. Mục tiêu của đề tài là tạo môi trường tối ưu nuôi cấy
Trichoderma Hazianum và làm rõ khả năng phòng nấm bệnh trên rau của Trichoderma
Hazianum.

Hai phương pháp chính để thực hiện đề tài là:

- Tối ưu hóa môi trường bán rắn nuôi cấy Trichoderma Hazianum

- Khảo sát tác dụng phòng bệnh trên rau cải bẹ xanh của Trichderma Hazianum

Những kết quả đạt được:

- Xác định được thành phần môi trường tối ưu trong nuôi cấy sản xuất chế phẩm
Trichoderma Hazianum

- Xác định rõ khả năng phòng bệnh trên cây cải bẹ xanh của Trichodderma
Hazianum.

ii
 MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i

TÓM TẮT ............................................................................................................................ ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................... viii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................................... ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ....................................................................................................... ix
Chương 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích và mục tiêu của đề tài: ................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:........................................................................................ 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3
2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma .................................................................... 3
2.1.1. Vị trí phân loại: ................................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 3
2.1.3. Cấu tạo tế bào, sự sinh trưởng và hình thành bào tử của Trichoderma: ..................... 5
2.1.4. Đặc điểm sinh thái, sinh hóa ................................................................................ 7
2.2. Ứng dụng của chế phẩm sinh học Trichoderma........................................................... 8
2.2.1.Ứng dụng chế phẩm sinh học phục vụ cây trồng ................................................... 8
2.2.2. Ứng dụng chế phẩm sinh học trong cải tạo đất và xử lý phế thải .......................... 9
2.2.3. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen ........................................................... 10
2.2.4. Ứng dụng làm chất kiểm soát sinh học .............................................................. 10
2.2.5. Ứng dụng trong lương thực và ngành dệt ........................................................... 11
2.3. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma ......................................................... 11
2.3.1. Tương tác với nấm bệnh .................................................................................... 11
2.3.2. Tương tác với cây trồng .................................................................................... 15
2.4. Trichoderma Harzianum........................................................................................... 20
2.4.1. Phân loại ........................................................................................................... 20
2.4.2. Đặc điểm ........................................................................................................... 20
2.4.3. Các ứng dụng .................................................................................................... 21

iii
 2.5. Nấm Fusarium:......................................................................................................... 22
2.5.1. Phân loại ........................................................................................................... 22
2.5.2. Đặc điểm ........................................................................................................... 22
2.6. Nấm Sclerotium Rolfsii ............................................................................................. 24
2.6.1. Phân loại ........................................................................................................... 24
2.6.2. Đặc điểm: .......................................................................................................... 25
2.7. Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về ứng dụng vi nấm Trichoderma ................ 27
2.7.1. Các nghiên cứu trong nước: ............................................................................... 27
2.7.2. Các nghiên cứu ngoài nước: .............................................................................. 27
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 29
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện: ............................................................................... 29
3.2. Vật liệu thí nghiệm: .................................................................................................. 29
3.2.1. Hóa chất và thiết bị sử dụng: ............................................................................. 29
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu: .......................................................................................... 29
3.3. Bố trí thí nghiệm: ...................................................................................................... 30
3.4. Phương pháp nghiên cứu: ......................................................................................... 30
3.4.1. Phương pháp nuôi cấy chủng Trichoderma Harzianum: .................................... 30
3.4.2. Quan sát đại thể nấm Trichoderma Harzianum .................................................. 33
3.4.3. Quan sát vi thể Trichoderma Harzianum ........................................................... 34
3.4.4. Thử nghiệm khả năng đối kháng của Trichoderma Hazianum với nấm bệnh ..... 34
3.4.5. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma hazianum.................................... 35
3.4.6. Phương pháp xác định số tế bào vi sinh vật: ...................................................... 38
3.4.7. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm: ........................................................................ 41
3.4.8. Khảo sát khả năng phòng bệnh trên cây trồng bởi chế phẩm Trichoderma
Harzianum .................................................................................................................. 41
3.5. Xử lý số liệu kết quả: ................................................................................................ 43
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 44
4.1. Quan sát đại thể Trichoderma Hazianum : ................................................................ 44
4.2. Quan sát vi thể T. Hazianum: .................................................................................... 46
4.3. Thử tính đối kháng của T.Hazianum với nấm bệnh: .................................................. 48
4.4. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma Hazianum: ................................. 49
4.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chitin đến tốc độ sinh trưởng của
Trichoderma Harzianum trong môi trường nuôi cấy bán rắn ....................................... 50

iv
 4.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma
Harzianum trong môi trường nuôi cấy bán rắn ............................................................ 50
4.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng cám đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma
Harzianum trong môi trường nuôi cấy bán rắn ............................................................ 51
4.4.4. Khảo sát môi trường tối ưu của T. Hazianum bằng thực nghiệm ........................ 52
4.5. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm ................................................................................. 55
4.6. Khảo sát khả năng chống bệnh trên cải bẹ xanh gây ra bởi 2 loài nấm bệnh S. Rolfsii
và Fusarium .................................................................................................................... 55
4.6.1. Cải trồng chuẩn bị thí nghiệm:........................................................................... 55
4.6.2. Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của T. Hazianum: ............................................... 57
4.7. Tính giá thành sản phẩm: .......................................................................................... 64
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 65
5.1. Kết luận: ................................................................................................................... 65
5.2. Đề nghị: .................................................................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 67
PHỤ LỤC

v
 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

T. Hazianum: Trichoderma Hazianum

T.Viride: Trichoderma Viride
T. Reesei: Trichoderma Reesei
T. Longibrachiatum: Trichoderma Longibrachiatum
T. Koningii: Trichoderma Koningii
T. Hamatum: Trichoderma Hamatum
S. Rolfsii: Sclerotium Rolfsii

T. Virens: Trichoderma Virens

T. Polysporum: Trichoderma Polysporum

T. Pseudokoningii: Trichoderma Pseudokoningi

T. Citrinoviride: Trichoderma Citrinoviride

R. Solani: Rhizoctonia Solani

F. Solani: Fusarium Solani

F. Oxysporum: Fusarium Oxysporum

F. Chlamydosporum: Fusarium Chlamydosporum

PGA: Potato glucose agar

PDA: Potato dextro agar

vi
 DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 2.1. Tác dụng và hiệu quả đề kháng cho cây trồng do loài Trichoderma mang lại ....... 18
Bảng 3.1. Thành phần dinh dưỡng của cám gạo ................................................................... 32
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến tốc độ sinh trưởng
của Trichoderma Hazianum ................................................................................................. 36
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tốc độ sinh trưởng của
Trichoderma Hazianum ....................................................................................................... 37
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng cám đến tốc độ sinh trưởng của
Trichoderma Hazianum ....................................................................................................... 38
Bảng 4.1. Mức biến thiên hàm lượng của các thành phần môi trường ................................... 53
Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm .............................................. 53
Bảng 4.3. Chi phí trong 1 lít môi trường nhấn giống Trichoderma Hazianum ....................... 64
Bảng 4.4. Chi phí trong 1 kg môi trường lên men bán rắn .................................................... 64

vii
 DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma.................................................. 4
Hình 2.2. Trichoderma Hazianum T-22 phát triển trên môi trường PDA (vùng màu xanh
chứa bào tử) ........................................................................................................................... 4
Hình 2.3. Môi trường nuôi cấy Trichoderma hóa vàng .......................................................... 5
Hình 2.4. Trichoderma ký sinh trên Pythium gây bệnh trên rễ cây họ đậu (Trichoderma
nhuộm màu vàng, Pythium nhuộm màu lục)......................................................................... 12
Hình 2.5. Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh trên khuẩn ty nấm bệnh ..................................... 13
Hình 2.6. Sự gia tăng phát triển hệ rễ với thể cạnh tranh T-22 ở vùng rễ............................... 16
Hình 2.7. Sự gia tăng sản lượng trên cây ớt với hạt giống được xử lí với T-22...................... 17
Hình 2.8. Khuẩn ty Trichoderma Hazianum ......................................................................... 20
Hình 2.9. A. Khuẩn lạc Fusarium; B. Sợi nấm Fusarium dưới kính hiển vi; C. Hiện tượng thối
rễ do Fusarium gây ra ......................................................................................................... 24
Hình 2.10. S. rolfsii phát triển trên môi trường thạch đĩa (A); Triệu chứng mục rửa thân do
nấm kí sinh (B); Nấm gây bệnh trên cây thuốc lá (C); trên Thơm (D)................................... 26
Hình 3.1. Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân ................................................... 39
Hình 3.2: Buồng đếm hồng cầu ............................................................................................ 39
Hình 4.1. Khuẩn lạc T. Hazianum sau 1 ngày nuôi cấy ......................................................... 44
Hình 4.2. Khuẩn lạc T. Hazianum sau 2 ngày nuôi cấy ......................................................... 45
Hình 4.3. Khuẩn lạc T. Hazianum sau 3 ngày nuôi cấy ......................................................... 45
Hình 4.4. Khuẩn lạc T. Hazianum sau 7 ngày nuôi cấy ........................................................ 46
Hình 4.5 . Hệ sợi nấm và bào tử của T. Hazianum dưới kính hiển vi..................................... 47
Hình 4.6. Sợi nấm có vách ngăn ........................................................................................... 47
Hình 4.7. Thể bình của T. Hazianum dưới kính hiển vi......................................................... 47
Hình 4.8. Mức độ đối kháng của T. Hazianum và Fusarium (+++) ....................................... 48
Hình 4.9. Mức độ đối kháng của T. Hazianum và S. rolfsii (++++)....................................... 49
Hình 4.10. Hình bào tử Trichoderma Hazianum trên ô vuông lớn của buồng đếm hồng cầu
dưới kính hiển vi .................................................................................................................. 49
Hình 4.11. Cải bẹ xanh sau 15 ngày gieo .............................................................................. 56
Hình 4.12. Cải bẹ xanh sau 25 ngày gieo .............................................................................. 56
Hình 4.13. Cải bẹ xanh sau 35 ngày gieo .............................................................................. 57
Hình 4.14. Triệu chứng bệnh do nấm S. Rolfsii gây ra .......................................................... 60
Hình 4. 15. Bệnh do Fusarium gây ra trên lá ........................................................................ 61
Hình 4.16. So sánh rễ của cây trên nghiệm thức có nấm bệnh S. Rolfsii và nghiệm thức có T.
Hazianum ............................................................................................................................ 62
Hình 4.17. So sánh rễ của cây trên nghiệm thức có nấm bệnh Fusarium và nghiệm thức có T.
Hazianum ............................................................................................................................ 62

viii
 DANH MỤC SƠ ĐỒ
Trang

Sơ đồ 3.1. Khảo sát khả năng phòng bệnh trên cây trồng bởi chế phẩm Trichoderma
Harzianum ........................................................................................................................... 42

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng chitin đến tốc độ sinh trưởng của T. Hazianum....... 50
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến tốc độ sinh trưởng của T. Hazianum ......... 51
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng cám đến tốc độ sinh trưởng của T. Hazianum ......... 52
Biểu đồ 4.4. Khảo sát môi trường tối ưu nuôi cấy T. Hazianum bằng thực nghiệm ............... 54
Biểu đồ 4.5. Tỷ lệ lá bệnh trên các nghiệm thức sau những thời gian khảo sát ...................... 58
Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ cây bệnh trên các nghiệm thức sau những thời gian khảo sát ................... 58
Biểu đồ 4.7. Khối lượng rễ cây ở các nghiệm thức ............................................................... 63

ix
 Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Ngộ độc thực phẩm là một trong những vấn đề cấp thiết đang được quan tâm
hiện nay. Trong đó việc ngộ độc từ rau quả xanh cũng chiếm một tỷ lệ khá lớn. Nguồn
gốc của các vụ ngộ độc này là do việc dùng nhiều các hợp chất hóa học để bón tưới
cho cây với mục đích tăng năng suất cũng như phòng trừ vi nấm hay sâu bệnh hại.
Những hóa chất này vốn rất độc hại và nguy hiểm, chúng làm ô nhiễm môi trường, gây
ung thư và nhiều bệnh khác cho con người.
Trước hiện trạng này, việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ sâu
bệnh là điều hết sức cần thiết và cấp bách. Ngày nay việc sử dụng phương pháp sinh
học trong phòng trừ sâu bệnh và vi nấm đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và
nghiên cứu. Các tác nhân đáng chú ý là một số loại nấm kí sinh có khả năng đối kháng
với một số vi nấm gây hại cho cây trồng, đối kháng với nấm bệnh nhưng không gây
ảnh hưởng tới các cây trồng. Phương pháp này vừa giúp tiêu diệt hữu hiệu các vi nấm
gây bệnh, vừa hiệu quả trong vấn đề bảo vệ môi trường. Một trong số các loài nấm
kháng vi nấm gây bệnh đang được chú ý là Trichoderma. Nó có khả năng đối kháng
mạnh với các loại nấm bệnh như: Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium...gây bệnh trên
cây lúa, bắp, tiêu...
Trichoderma là vi nấm hoại sinh có khả năng sản sinh ra các loại enzym ngoại
bào rất hiệu quả. Các chế phẩm enzym từ loài nấm này ( enzym chitinase, enzym beta
- glucannase, enzym protease) được sử dụng trực tiếp hoặc phối hợp với các thuốc diệt
nấm để bảo vệ trái cây tránh bị thối rửa và cải thiện hiệu quả sử dụng thuốc diệt nấm.
Chính vì thế, nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm Trichoderma trong nông
nghiệp nên chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma
Harzianum và ứng dụng chế phẩm trong nông nghiệp”.

1
1.2. Mục đích và mục tiêu của đề tài:
1.2.1. Mục đích:
+ Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma harzianum
+ Khảo sát khả năng phòng nấm gây bệnh của chế phẩm Trichoderma
Harzianum trên rau cải bẹ xanh
1.2.2. Mục tiêu:
+ Xác định thành phần môi trường tối ưu nuôi cấy chủng Trichoderma
Harzianum
+ Xác định khả năng phòng bệnh của chế phẩm Trichoderma Harzianum
trên cây rau cải bẹ xanh.
1.3. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Tạo tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng rộng rãi chế phẩm từ nấm
Trichoderma trong sản xuất rau quả sạch an toàn.

2
 Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma

2.1.1. Vị trí phân loại:
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong công
tác phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho phân loại vẫn còn chưa được biết
đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về đặc
trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính.
Năm 1801, Persoon ex Gray đã phân loại Trichoderma như sau: [22]
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Euascomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Ainsworth và Sussman lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ
Moniliales, họ Moniliaceae [7].
Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc
họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; Các loài Trichoderma được phân thành 5
nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và
Hypocreanum. Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium và Hypocreanum có giai
đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea, nhóm
Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập, nhóm Saturnisporum
không tìm thấy hình thức teleomorph. [10]
Ngoài ra, theo tài liệu thống kê, có 6 chủng Trichoderma phổ biến: T.
Hazianum, T.Viride, T. Reesei, T. Longibrachiatum, T. Koningii và T. Hamatum.
2.1.2. Đặc điểm hình thái [1], [4], [6]
Trichoderma là loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn
ty, phát triển tốt trên đất và các tàn dư thực vật.

3
 Khuẩn ty của nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, phía cuối
nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không vách ngăn, không
màu, liên kết thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, elip hoặc
hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 1 – 1,1 m) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài rộng là
hơn 1,4 m), đa số bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 m. Đặc điểm nổi bậc
của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như T.
Virens), màu vàng hay xanh xám. Trên môi trường PGA, khuẩn lạc ban đầu có màu
trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Và một số
loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm môi trường hóa vàng.

Hình 2.1. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma

Hình 2.2. Trichoderma Hazianum T-22 phát triển trên môi trường PDA (vùng
màu xanh chứa bào tử)
4
 Hình 2.3. Môi trường nuôi cấy Trichoderma hóa vàng

Có một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Nó là một nhóm
sợi nấm bện vào nhau. Một số loài khác cuống bào tử lại mọc lên từ những cụm hay
những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. Koningii), có
kích thước từ 1 – 7 m, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc,
những nốt sần này dễ dàng được tách khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như
chồi mầm.
2.1.3. Cấu tạo tế bào, sự sinh trưởng và hình thành bào tử của Trichoderma: [1]
2.1.3.1. Cấu tạo tế bào:
Trichoderma, cũng như các loại nấm mốc khác, có thành tế bào cấu tạo chủ
yếu là chitin (là polymer của n – acetylglucosamine) và chitosan (chitin bị deacetyl
hóa) và các thành phần khác gồm  - glucan,  - glucan, mannoprotein (Siu – Wai
Chui và David Moore, 2001), chất màu, lipid (8 – 33%). Màng tế bào dầy khoảng
7m, thành phần chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%). Nhân phân hóa, thường
hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 – 3 m. Ty thể hình elip, luôn di động
để tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào (Lâm Thanh Hiền, 1999).

5
 2.1.3.2. Sự sinh trưởng:
Trichoderma là nấm hoại sinh nên có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp
cacbon và nitrogen. Nguồn cacbon và năng lượng Trichoderma sử dụng được là
monosaccharides và disaccharides, cùng với hỗn hợp polysagarides, puriness,
pyrinidines, acideamin, tanmins và caechins và caechins cô đọng, aldehydes và acid
hữu cơ. Đặc biệt acid béo (E.B.nelson, G.E.Harman), methanol methylamine, formate
và NH3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi trồng Trichoderma.
Ngoài ra, muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp như vitamin cũng có ảnh hưởng lớn
đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma. Nhưng muối sodium chloride sẽ làm giảm
sự sinh trưởng và phát triển của một số loài Trichoderma. Do đó trong môi trường
nuôi trồng không được có mặt của muối này.
Nồng độ CO2 trong môi trường nuôi trồng cũng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của nấm đối kháng trong đất. Tuy nhiên ảnh hưởng của CO2 đến khả năng sinh
trưởng và sản xuất của Trichoderma phụ thuộc vào nồng độ pH của môi trường đất.
Khi tăng nồng độ CO2 từ 2 - 10% thì tốc độ mọc của Trichoderma giảm trong môi
trường acid và tăng trong môi trường kiềm, và khi độ pH đạt đến 10% thì nồng độ CO2
không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma. Như vậy CO2 có ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng của Trichoderma tại độ pH có giá trị cao. Tuy nhiên ở nồng
độ cao, CO2 sẽ ức chế mạnh sự phát triển của Trichoderma trong môi trường kiềm.
Điều này có thể giải thích vì sao Trichoderma chỉ phát triển trong môi trường đất
phèn, ẩm ướt, ít hiện diện trên đất kiềm. [19]

2.1.3.3. Sự hình thành bào tử trên môi trường:

Phần lớn các loài Trichoderma có cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều
kiện môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn, hay bào tử có thể
xuất hiện trong điện sáng. Môi trường agar trong thời gian khoảng 20 – 30 giây với
cường độ chiếu sáng 85 lux thì làm tăng hiệu quả tạo bào tử. Thể bào tử phialoconidio
cảm ứng với ánh sáng nhất sẽ xuất hiện nhiều dưới ánh sáng ban ngày trong khoảng 3
phút hoặc gần tia cực tím (bước sóng 366nm) trong khoảng 10 – 30 giây. Các tác giả
đã công bố Trichoderma không hình thành bào tử dưới bước sóng 254nm hoặc trên
1.100nm và hình thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng 380nm đến 440 nm. Các bào tử
cảm quang hạn chế phát triển dưới ảnh hưởng của hóa chất. Các hỗn hợp như

6
azaguanine, 5 – fluorouracil, actiomycin D, cyloheximide, phenethyl alcohol và
ethidium bromide ngăn cản sự hình thành các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc đặc
biệt của cơ thể rất quan trọng trong hình thái học làm tăng tiềm năng trong phòng trừ
sinh học. T. Hazianum, T. Hamatum, T. Viride, T. Virens ở trong cả môi trường lỏng
và rắn có acid thích hợp cho bào tử nảy mầm hơn là trong môi trường trung tính.

2.1.4. Đặc điểm sinh thái, sinh hóa: [6], [12], [13], [16], [22]
Trichoderma spp. là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng,
đầm muối và đất sa mạc. Hầu hết chúng là các vi sinh vật hoại sinh nhưng chúng cũng
có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống
và không sống nội kí sinh với thực vật. Chúng có thể tồn tại trong tất cả các miền khí
hậu từ miền cực Bắc tới những vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới. Tuy nhiên có
một sự tương quan giữa sự phân bố các loài và các điều kiện môi trường.
T. Polysporum và T. Viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi T. Hazianum
có ở các vùng khí hậu nóng. Điều này tương quan với nhu cầu nhiệt độ tối đa cho từng
loài.
Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm
ướt và những khu rừng khác nhau. Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về độ
ẩm cũng khác nhau. T. Hazianum và T. Pseudokoningii có thể chịu điều kiện độ ẩm
cao hơn so với những loài khác.
Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có pH từ 2.5 – 9.5, phát
triển tốt nhất ở pH 4.5 – 6.5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 –
300C, một vài dòng phát triển tốt ở 35 0C và một số ít phát triển ở 400C (Gary J.
Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào
tử của Trichoderma khác nhau khi ở nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo ra những
khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường. Và ở 37 0C
không tạo bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.
Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat,
amino acid đến amonia.
Trichoderma có thể được phát hiện trong đất nhờ mùi hương của chúng, hương
dừa (6 – pentyl -  - pyrone dễ bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng
của Trichoderma.

7
 Với các phương pháp pha loãng, người ta ước tính Trichoderma có thể đạt đến
3% tổng số vi nấm hiện diện trong các loại đất rừng và 1.5% số lượng nấm trong đất
đồng cỏ.
Tuner và cộng sự (1997) chỉ ra rằng T. Longibachiatum và T. citrinoviride có
nhiều sự trùng nhau về khu vực phân bố địa lý. Sự phân bố rộng khắp này có lẽ là do
sự phát tán hiệu quả (nhờ gió và côn trùng) hoặc biểu hiện một quá trình tiến hóa sớm.
2.2. Ứng dụng của chế phẩm sinh học Trichoderma
2.2.1.Ứng dụng chế phẩm sinh học phục vụ cây trồng: [6]
Phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh được sự trợ giúp của vi sinh vật
chuyên biệt có khả năng thúc đẩy quá trình chuyển hóa các phế thải hữu cơ thành phân
bón.
Thông thường trong các nhóm vi sinh vật chuyển hóa cellulose và ligno
cellulose là các loài Aspergillus Niger, T. Reesei, Aspergilus sp., Pennicilium sp.,
Paeceilomyces sp. … Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng
dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học ở Việt Nam. Phân hữu
cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là loại phân có tác dụng tốt
trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá, chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm
Phytophtora Palmirova gây ra. Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm
do một số nấm bệnh gây ra: Furasium Solari, Pythium sp., S. rolfssi…
Nhóm phân hữu cơ sinh học bổ sung sinh vật trợ giúp làm giàu dinh dưỡng
thường được chế biến bằng cách đưa thêm một số vi sinh vật có tên khác vào ví dụ
như nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do như Azotobacter, vi khuẩn hoặc nấm sợi phân
giải photphat khó tan như Bacillus polymixa…
Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng bằng
sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho
thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng
sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả
năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết
chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium
oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng
phân huỷ cellulose, phân giải phân lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã
trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình
8
phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng
kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty
Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh), phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được
nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau ứng dụng hiệu quả.

2.2.2. Ứng dụng chế phẩm sinh học trong cải tạo đất và xử lý phế thải: [6]
Trong các chế phẩm cải tạo đất, nhóm vi sinh vật cũng được ứng dụng cải tạo
đất bị ô nhiễm do kim loại nặng và các thuốc hóa học bảo vệ thực vật hữu cơ. Các vi
sinh vật này sống ở vùng rễ cây có sinh sản ra acid hữu cơ và tạo phức với kim loại
nặng hoặc kim loại độc hại với cây trồng (nhôm, sắt…). Một số vi sinh vật có khả
năng phân hủy các hợp chất hóa học có nguồn gốc hữu cơ. Ngoài ra các vi sinh vật có
khả năng phân giải hoặc chuyển hóa các chất gây ô nhiễm trong đất, qua đó tạo lại cho
đất sức sống mới. Bên cạnh đó chúng còn có thể phân hủy các chất phế thải hữu cơ,
cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, đồng thời giúp cây tăng khả năng kháng bệnh do
các tác nhân trong đất gây ra.
Các vi sinh vật thường được sử dụng trong cải tạo đất thoái hóa, đất có vấn đề
do ô nhiễm được ứng dụng nhiều như nấm rễ nội cộng sinh (VAM – Vacular
Abuscular Mycorhiza) và vi khuẩn Pseudomonas.
Xử lý các phế phẩm nông nghiệp: Chế phẩm sinh học nấm đối kháng
Trichoderma ngoài tác dụng sản xuất phân bón hữu cơ sinh học hay sử dụng như một
loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) thì còn có tác dụng để xử lý phân chuồng, phân gia
súc, vỏ café, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất hiệu quả. Chế phẩm sinh
học BIMA (có chứa Trichoderma) của Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí
Minh, đang được nông dân ở Tp. Hồ Chí Minh và khu vực Đồng Bằng Sông Cửu
Long, Đông Nam Bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón lót cho cây trồng.
Việc sử dụng chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ loại phân chuồng nhanh gấp 2 – 3
lần so với phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối
của phân chuồng. Người nông dân lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng
được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng nấm đối
kháng Trichoderma có chứa trong phân.

9
 2.2.3. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen: [6], [7]
Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hóa
các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có
nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong
chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được
thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển.
2.2.4. Ứng dụng làm chất kiểm soát sinh học: [6]
Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được
đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật. Các chế phẩm nấm Trichoderma
được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình
thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc phối trộn vào phân hữu cơ để bón
cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của
cây. Nấm đối kháng Trichoderma có khả năng tiêu diệt và khống chế được các loại
nấm bệnh hại cây trồng như: R. Solani, Fusarium, Phytophtora sp., gây bệnh thối rễ,
chết yểu, héo rũ. Khả năng này là do Trichoderma tiết ra một loại enzym làm tan vách
tế bào của các loài nấm khác, sau đó nó tấn công vào bên trong nấm gây hại và tiêu
diệt chúng.
Chế phẩm sinh học này tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển
sống trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng
phân giải tốt các chất xơ, chitin, ligin, trong phế thải hữu cơ thành các chất dinh
dưỡng, tạo điều kiện cho cây hấp thụ dễ dàng. Sử dụng chế phẩm kết hợp với phân
hữu cơ có tác dụng cải tạo làm cho đất xốp hơn và làm tăng hàm lượng chất mùn và
mật độ côn trùng có ích, giữ được độ phì của đất.
Tóm lại tiềm năng sử dụng chế phẩm sinh học trong canh tác cây trồng rất lớn,
là một hướng đi đúng đắn, hướng tới một nền nông nghiệp hữu cơ sinh thái bền vững
và thân thiện với môi trường.
Tuy nhiên, trên thực tế việc sử dụng chế phẩm sinh học ở Việt Nam còn rất hạn
chế, đặc biệt là nhóm chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng. Vì vậy nhà
nước và ngành nông nghiệp phải có chính sách khuyến khích hỗ trợ các doanh nghiệp
đầu tư vào sản xuất, kinh doanh trong lĩnh vực này. Ngoài ra, cần có sự đầu tư chuyển
giao kỹ thuật, tuyên truyền, hướng dẫn để người nông dân ủng hộ và ứng dụng rộng rãi
các chế phẩm sinh học trong sản xuất nông nghiệp. Như vậy mới giúp cho nông dân có
10
thể nâng cao chất lượng, giảm giá thành sản phẩm, tăng thu nhập cho nông dân trong
nền kinh tế hội nhập và cải thiện chất lượng môi trường.
2.2.5. Ứng dụng trong lương thực và ngành dệt: [7], [23]
Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzyme ngoại bào rất có hiệu
quả. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzyme khác
phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong
thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự. Ví dụ, cellulase của nấm được
dùng trong dệt vải quần jean, làm vải mềm hơn hoặc trong việc wash làm bạc vải
quần. Các enzyme cũng được dùng trong thức ăn gia cầm để tăng tiêu hóa của
hemicelluloses từ lúa mạch hoặc các loại cây trồng khác.

2.3. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma

2.3.1. Tương tác với nấm bệnh: [14]
Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác được phân loại
như sau: tiết ra các chất kháng nấm bệnh, kí sinh trên cơ thể của nấm bệnh, cạnh tranh
dinh dưỡng với nấm bệnh. Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối
kháng thực tế có thể là một trong những loại cơ chế này. Ví dụ, sự kiểm soát Botrytis
trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự kí sinh trên
hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh. Cả cơ chế tạo ra chất kháng
nấm và cơ chế kí sinh có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, sự sản xuất ra
chất độc có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường tăng trưởng. Các kết
quả nghiên cứu gần đây cho thấy các chất kháng sinh và các enzym thủy phân không
chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng kí sinh.
Gần đây có giả thiết cho rằng tác nhân kiểm soát sinh học T. Harzianum T39
làm giảm lượng enzim phân hủy pectin do B. Cinerea tạo ra do đó làm giảm sự gây
bệnh.

11
 2.3.1.1. Cơ chế tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis):
Các chủng Trichoderma sản xuất đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp dễ
bay hơi và không bay hơi, một vài chất loại này ức chế vi sinh vật khác mà không có
sự tương tác vật lý. Chất ức chế được coi là chất kháng sinh. Chất có mùi dừa 6 – n –
pentyl – 2H – pyran – 2 – one (PPT) được tìm thấy ở một số chủng Trichoderma phân
lập được. Các chủng Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi
trường cũng tác động vào sự sản xuất cả về chất lượng và số lượng. Hơn nữa các
kháng sinh đặc hiệu tác động vào các tác nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau.
2.3.1.2. Cơ chế ký sinh (mycoparasitism):
Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn:
(a) Sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa, nó ký sinh phân nhánh hướng về
những nấm đã được định trước, trong giai đoạn này tác nhân kích thích hóa học từ nấm
đích hấp dẫn nấm đối kháng.
(b) Sự nhận dạng đặc hiệu, vật kí sinh và vật đối kháng được Trichoderma nhận
dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa học, có lẽ trung gian
bởi lectin trên bề mặt tế bào của các tác nhân gây bệnh và nấm đối kháng.
(c) Sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma xung quanh vật chủ
(d) Sự bài tiết các enzym phân giải tế bào thực vật. Hệ enzym phân giải vách tế
bào bao gồm chitinase, glucanase và protease. Những enzym này có khả năng bào mòn
thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ. Đây là khả
năng tấn công trực tiếp của Trichoderma.

Hình 2.4. Trichoderma ký sinh trên Pythium gây bệnh trên rễ cây họ đậu
(Trichoderma nhuộm màu vàng, Pythium nhuộm màu lục)
12
 Hình 2.5. Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh trên khuẩn ty nấm bệnh
Rhizoctnia solani
2.3.1.3. Cơ chế cạnh tranh (competition):
Cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh (competition for nutrient)
Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đưa ra khái niệm cạnh tranh
khai thác và cạnh tranh cản trở vào tương tác giữa quần thể nấm. Sự canh tranh cản trở
liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật khác
tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tương tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác
loài.
Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn lợi
nhưng khác nhau về hiệu quả và tốc độ khai thác. Trong trường hợp nguồn lợi là dinh
dưỡng được xem như là cạnh tranh dinh dưỡng.
Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh (competition for necrotic tissue)
Botrytis và Sclerotina spp. là mầm bệnh cơ hội tấn công vào mô thực vật lão
hóa hoặc mô chết và coi đó như nguồn dinh dưỡng, từ đây tiếp tục tấn công vào những
mô khỏe mạnh. Khi đã xử lý Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm sự hình
thành khuẩn lạc của Botrytis và Slcerotina trên những loại rau, trái cây khác nhau như
dâu, dưa chuột…

13
 Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt (competition for plant exudates)
Bệnh chết nhát (Damping-off) gây bởi Pythium ultimum ở một số loại ngũ
cốc và rau quả được xuất phát bởi sự đáp ứng nhanh chóng của mầm bệnh đối với
dịch rỉ từ hạt. Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống trong
vòng vài giờ khi Pythium đã tràn lan trong đất. xử lí hạt giống với Trichoderma làm
giảm sức nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tượng này được cho là sự cạnh tranh
chất kích thích nảy mầm.
Sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng được xem như cơ chế hữu hiệu nhất sử dụng
bởi T. Hazianum T-35 trong sự kiểm soát Fusarium oxyporum trong vùng rễ cây bông
vải và dưa hấu.
Sự cạnh tranh trên vị trí vết thương (competition for wound sites)
Một trong những thí nghiệm thành công đầu tiên của sự kiểm soát sinh học
trên vết thương do cắt xén là sử dụng T. viride, áp dụng trong phun xịt hoặc dùng kéo
lớn cắt, để kiểm soát mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostereum purpureum). Thể
Trichoderma đưa vào được chứng minh có khả năng mọc khuẩn lạc trên cây vừa bị
cắt và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ (Amillaria luteobubalina).
Sự thối thân thường theo cùng sự xâm nhiễm Botrytis vào vết thương bị cắt
trên cây cà chua trong nhà kính, căn bệnh này rất khó kiểm soát bởi những biện pháp
canh tác. Thể Trichoderma được chứng minh có khả năng kiểm soát sự thối thân khi
tiêm chủng trước hay cùng lúc với Botrytis, nhưng không có hiệu quả kiểm soát nếu
được tiêm sau, như vậy có thể cho rằng sự cạnh tranh mọc khuẩn lạc trên vết thương là
yếu tố xác định sự giảm bệnh.
Trong một nghiên cứu sự xâm nhiễm của Pythium vào rễ dưa chuột đã chỉ
ra rằng mặc dù không có sự hình thành khuẩn lạc của chủng T. Hazianum trên toàn bộ
rễ nhưng vẫn có sự hình thành khuẩn lạc tại vết thương. Sự cạnh tranh dinh dưỡng từ
dịch rỉ vết thương của thể cạnh tranh rõ ràng là nguyên nhân làm giảm sự xâm nhiễm
của Pythium.

14
 2.3.2. Tương tác với cây trồng: [15]
2.3.2.1. Hiệu quả của sự hình thành khuẩn lạc ở rễ đến cơ chế trao đổi chất
ở lá:
Một vài nghiên cứu cho thấy sự mọc khuẩn lạc ở rễ do các chủng
Trichoderma dẫn đến sự tăng cường hoạt tính của các enzym có liên quan đến tính
chống chịu của thực vật, bao gồm các peroxidase, chitinase,  - 1,3 – glucanase và
lipoxygenase. Trong cây dưa chuột, sự thêm vào Trichoderma Asperellum T-203 đã
dẫn đến sự gia tăng sản lượng xuất phenylalanine amonia lyase nhất thời trong cả rễ và
chồi cây, nhưng trong vòng 2 ngày, tác động này sẽ giảm xuống ở mức cơ bản ở cả hai
cơ quan trên. Sự thay đổi trong cơ chế trao đổi chất của thực vật có thể dẫn đến sự tích
tụ các hợp chất kháng sinh. Trichoderma không chỉ tạo ra chất kháng sinh một cách
trực tiếp mà còn kích hoạt mạnh mẽ vào cây trồng để cây trồng tự sản xuất các hợp
chất kháng sinh. Sự hình thành khuẩn lạc trên rễ bởi những loại nấm này gây biến đổi
đáng kể đến bộ máy trao đổi chất của cây trồng.
Những kết quả trên cho phép chúng ta tạo một mô hình cơ chế Trichoderma
spp. kiểm soát và làm giảm bệnh cây trồng. Nhiều loài như T. Virens, T. Asperellum,
T. Atroviride và T. Hazianum gây sự thay đổi cơ chế trao đổi chất trên cây trồng làm
tăng cường khả năng kháng lại phổ rộng các tác nhân gây bệnh là các loài vi sinh vật.
Hơn thế, đáp ứng này còn hiệu quả trên nhiều loại cây trồng. Khi bào tử hoặc cơ quan
nhân giống khác được thêm vào đất và tiến đến tiếp xúc với rễ thì chúng nảy mầm và
tăng trưởng trên bề mặt rễ, và tối thiểu một ít nhiễm vào phía ngoài tế bào rễ. Chúng
sản xuất tối thiểu 3 loại chất mà tạo ra đáp ứng bảo vệ của cây trồng, đáp ứng này ngăn
chặn sự xâm nhiễm nhiều hơn nữa của mầm bệnh. Những thể tạo ra sự đáp ứng bao
gồm các peptide, protein và hợp chất trogn lượng phân tử nhỏ. Trong một vài trường
hợp, sự kháng chỉ mang tính cục bộ như trong trường hợp của T.Virens trên cây bông
vải, còn trên hầu hết hệ thống cây trồng Trichoderma khác thì tính kháng mang tính
toàn bộ.
2.3.2.2. Cải thiện sự tăng trưởng của rễ:
Trong các nghiên cứu lý thuyết và ứng dụng thương mại, các chủng
Trichoderma đều tăng cường sự phát triển của rễ trên ngô và nhiều loại cây trồng
khác. Tác động này kéo dài trong cả cuộc đời của cây lâu năm và có thể được tạo nên
bằng thêm vào một lượng nhỏ vi nấm (nhỏ hơn 1g . ha-1) được áp dụng như một biện
15
pháp xử lý hạt giống. Ví dụ cây ngô được trồng trên cánh đồng với những hạt giống
được xử lý và không được xử lý với Trichoderma. Sau một vài tháng, khi cây trồng đã
cao trên 2m các mương được đào thành các hàng và tần số mặt tiếp xúc của rễ trên khu
vực các luống cày được xác định. Sự hiện diện của khuẩn lạc Trichoderma đã làm cho
mặt tiếp xúc của rễ sâu hơn. Điều này dẫn đến tăng cường khả năng chịu hạn và có lẽ
chống lại những loại đất cứng. Sự tăng trưởng của các cây này có thể được tăng cường
bởi sự hiện diện của vi sinh vật có ích trên rễ khác.
Trong hầu hết các trường hợp đã đề cập ở trên thì không thể tách rời các tác
động trực tiếp đến sự tăng trưởng cây trồng khỏi sự kiểm soát các mầm bệnh hoặc cá
vi sinh vật có hại khác ảnh hưởng xấu đến sự tăng trưởng của rễ. Sự gia tăng đồng thời
cả sự phát triển của rễ và sự tăng trưởng cây trồng có lẽ gây bởi sự kiểm soát sinh học
và các tác động liên hệ đến rễ do hệ vi sinh vật, và cũng gây bởi sự cải tiến trực tiếp
trên trong sự tăng trưởng cây trồng. Hệ vi sinh vật có hại cho rễ làm giảm sự tăng
trưởng trong sự thiếu vắng hoàn toàn bệnh cây. Một vi sinh vật có hại sản xuất cyanid
– có lẽ tồn lưu trong nơi ở của chúng trong cuộc cạnh tranh. Trichoderma spp. kháng
lai cyanid và tạo ra hai loại enzym khác nhau có khả năng phân hủy chúng trong vùng
rễ. Do đó Trichoderma có thể tăng cường trực tiếp cho sự tăng trưởng của rễ, kiểm
soát vi sinh vật có hại không phải là mầm bệnh, tiêu diệt các chất chuyển hóa độc hại
được tạo ra bởi vi sinh vật có hại và trực tiếp kiểm soát mầm bệnh ở rễ. Sự gia tăng
tăng trưởng rễ do những nấm này cùng với sự tăng cường đồng thời tăng trưởng cây và
sự đề kháng stress được thực hiện bởi một vài con đường khác nhau, có thể mỗi đáp
ứng bao gồm nhiều cơ chế mà đã được miêu tả ở sự kiểm soát sinh học trên rễ và lá.

Hình 2.6. Sự gia tăng phát triển hệ rễ với thể cạnh tranh T-22 ở vùng rễ
Ghi chú: Without T-22: không được xử lí với T-22
With T-22: đã xử lí với T-22

16
 Hình 2.7. Sự gia tăng sản lượng trên cây ớt với hạt giống được xử lí với T-22
2.3.2.3. Tương tác tăng cường sử dụng chất dinh dưỡng:
Trichoderma spp. gia tăng sự sử dụng và tập trung các chất dinh dưỡng (Cu,
P, Fe, Mn, Na) trong rễ trong môi trường ngập nước. Sự gia tăng khả năng sử dụng
này cho biết sự cải tiến các cơ chế sử dụng chất dinh dưỡng của cây trồng. Hơn nữa có
thể gia tăng trạng thái cân bằng dinh dưỡng khi thêm nguồn nitơ trong phân bón. Điều
này cho thấy Trichoderma gia tăng hiệu quả sử dụng nguồn nitơ trong phân bón trên
cây ngô, và khả năng này có thể làm giảm sự ô nhiễm nitrat trong đất và bề mặt nước.
Các phân tích đã cho thấy Trichoderma gây ra sự gia tăng sử dụng các yếu tố bao gồm
As, Co, Cd, Ni, Va, Mg, Mn, Cu, Bo, Zn, Al, Na.
Tóm lại chủng Trichoderma có thể hòa tan nhiều loại dinh dưỡng cho cây
trồng khác nhau chẳng hạn như phosphate khó tan, Fe3+, Cu2+, Mn4+, Zn, có thể
không dùng được cho cây trồng từ một số loại đất.

17
Bảng 2.1. Tác dụng và hiệu quả đề kháng cho cây trồng do loài Trichoderma
mang lại [15]
T.virens G-6,
T.harzianum T.harzianum T.Asperellum T.harzianum
Chủng G-6-5 và
T-39 T-39 T-203 NF-9
G-11
Cà chua, hồ
tiêu, thuốc
Cây trồng Bông vải Cây đậu Dưa chuột Lúa
lá, rau diếp,
đậu
Magnaporthe
Colletotrichum Pseudomonas grisea ;
Tác nhân Rhizoctonia Botrytis
lindemuthianum ; syringae pv. Xanthomonas
gây bệnh solani cinerea
Botrytis cinerea lachrymans oryzae
pv.oryzae
Bảo vệ tất cả
Bảo vệ lá khi
các bộ phận
T-203 đã xuất
của cây Bảo vệ lá khi Bảo vệ lá khi
Bảo vệ lá khi T-39 hiện duy nhất
trồng, tạo ra T-39 đã xuất NF-9 đã xuất
Tác dụng đã xuất hiện duy ở rễ, sự sản
chất độc hiện duy hiện duy nhất
nhất ở rễ xuất các hợp
terpenoid nhất ở rễ ở rễ
chất kháng
phytoalexins
nấm trên lá
cho nấm

Thời gian
sau khi sử 4 ngày 10 ngày 7 ngày 5 ngày 14 ngày
dụng

Giảm 78%
bệnh, có khả Lên tới 80%
năng tạo ra Giảm 42% trong sự giảm bệnh
Giảm 25-
phytoalexins vùng thương tổn trên lá, giảm
100% hội Giảm 34-50%
Hiệu quả cần thiết cho và giảm số lượng 100 lần mức
chứng mốc bệnh
hoạt động sự lan tỏa các độ tế bào vi
xám
kiểm soát vùng thương tổn khuẩn gây
sinh học tối bệnh cho lá
đa

18
 T.harzianum
T-22 ; T.harzianum T.harzianum Trichoderma
Chủng T.harzianum
T.atroviride T-22 T-22 GT3-2
P1
Cây trồng Đậu Cà chua Ngô Dưa chuột Hồ tiêu

Botrytis cinera
và C.orbiculare,
Tác nhân Alternaria Colletotrichum Phytophthora
Xanthomonas P.syringae
gây bệnh solani graminicola capsici
campestris pv. pv.lachrymans
phaseoli
Bảo vệ thân khi
Bảo vệ lá khi Bảo vệ lá khi
các chủng
T-22 hoặc P1 các chủng
Bảo vệ lá khi Trichoderma đã
đã xuất hiện Bảo vệ lá khi Trichoderma
các chủng xuất hiện duy
duy nhất ở rễ, T-22 đã xuất đã xuất hiện
Tác dụng Trichoderma nhất ở rễ, tăng
sự sản xuất các hiện duy nhất duy nhất ở rễ,
đã xuất hiện cường sự sản
hợp chất ở rễ tạo ra sự hóa
duy nhất ở rễ xuất
kháng nấm gỗ và sự sinh
phytoalexins
trên lá ra superoxid
capsidiol

Thời gian
sau khi sử 7-10 ngày 3 tháng 14 ngày 1 ngày 9 ngày
dụng

Giảm 69% hội

chứng mốc Giảm 44%
xám (Botrytis kích thước Bảo vệ 59%
cinerea) với thương tổn khỏi bệnh gây
Giảm tới 80%
T22 ; mức độ trên lá bị bởi
hội chứng thối Giảm gần 40%
Hiệu quả kiểm soát thấp thương và C.orbiculare
sớm từ sự xâm chiều dài thương
hơn với P1. không gây và 52% khỏi
nhiễm tự nhiên
Giảm 54% hội bệnh trên lá bệnh gây bởi
chứng bệnh không bị P.syringae
gây ra do vi thương
khuẩn.

19
2.4. Trichoderma Harzianum:
2.4.1. Phân loại: [19]
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Loài: Trichoderma Harzianum

2.4.2. Đặc điểm: [4]

Giai đoạn đầu phát triển T. Harzianum ra tơ màu trắng, sau đó chuyển dần sang
xanh đến ngày thứ 8, tơ chuyển sang xanh lá cây đậm hoàn toàn. Mặt trái khuẩn lạc
không màu. Bào tử trần có hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn. Bào tử áo
ở giữa sợi nấm hoặc ở đỉnh các nhánh, hình cầu, nhẵn. Đường kính 6 – 12m. Giá bào
tử trần ngăn vách, phân nhánh 2,3 lần; đường kính 4 - 5m; dài 250m. Thể bình 3 - 4
x 5 - 7m, thường thành cụm 2 – 5 cái ở đỉnh tận cùng, cũng đơn độc ở dọc các nhánh.
Thể bình ở giữa dài tới 17m và có đường kính ở giữa nhỏ hơn 2 – 3m ở phần rộng
nhất.

Hình 2.8. Khuẩn ty Trichoderma Hazianum

20
 2.4.3. Các ứng dụng: [1]
Chế phẩm gồm Trichoderma Harzianum và Trichoderma Virens là thành phần
chính chống lại sự thối rửa của táo sau thu hoạch. Trichoderma Harzianum còn được
kết hợp với Trichoderma Polysporum trong việc sản xuất Binabt được dùng chữa trị
các vết thương bị nhiễm trùng ở cây trồng.
Trichoderma Harzianum AG2 được dung hợp với tế bào trần để phòng các
bệnh cây trồng.
Một nghiên cứu gần đây cho biết nếu cây ngô có Trichoderma Harzianum T –
22 kí sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có Trichoderma
Harzianum T – 22.
Nhiều công trình khoa học đã chứng minh rằng Trichoderma Harzianum và
Trichoderma Koningii kích thích sự nảy mầm và tăng trưởng của cây. Đối với các hoa
được trồng trong nhà kính thì Trichoderma Harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách
rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa.
Một số chủng Trichoderma Harzianum còn có thể xâm nhập vào mô tế bào cây,
làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng.
Trichoderma Harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng
trên ciliatin, glycophosphat và amino methylphosphoric acid (3 – methoxyphenyl).
Trichoderma Harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường Đại học Califonia) có
thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachchlorophenol. Nấm
này phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quá
trình sinh sống của nó.
Trichoderma Harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong
đất trong 24h, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong
đất và trong đầm lầy.

21
2.5. Nấm Fusarium:
2.5.1. Phân loại: [29]
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Fusarium
Fusarium có hơn 20 loài. Và ba loài Fusarium phổ biến thường gặp nhất là: F.
Solani, F. Oxysporum, F. Chlamydosporum. [30]

2.5.2. Đặc điểm: [26], [30]

Fusarium phát triển nhanh trên môi trường Sabouraud dextro agar ở 250C.
Khuẩn lạc là những sợi tơ mịn như bông, bằng phẳng, mọc lan rộng. Mặt trước khuẩn
lạc thường có màu trắng, kem, nâu vàng, vàng, đỏ hoặc tím… Mặt sau khuẩn lạc có
thể không màu, vàng nâu, đỏ hay tím sẫm…Hạch nấm, hệ các sợi nấm không hoạt
động trong suốt thời gian dài với điều kiện bất lợi, có thể được nhìn thấy bằng mắt
thường và nó có màu xanh đậm
Fusarium là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký sinh
trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây chủ.
Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá
trình chuyển vận nước làm héo cây, Fusarium cũng sản xuất một số chất độc tiết vào
mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây héo rũ, nhiều loài thực vật bị Fusarium tấn công.
Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu
nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ.
Một số loài Fusarium gây bệnh héo lá: F. udum (trên đậu săn Cajanus cajan),
F.oxysporum bv. licopersici (trên cà chua Lycospersicon esculentum), F. lini (trên cây
lanh Linum usitatissimum), F. solani (trên khoai tây Solanum tuberosum) và F.
orthaceras (trên đậu mơ-đậu Thổ Nhĩ Kỳ)...
Hầu hết các loài Fusarium phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số
sinh sống trong đất ở khí hậu lạnh. [30]
Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử đính
lớn (Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và bào tử vách dày (hậu bào tử -

22
Chlamydospores). Bào tử đính lớn dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ
cuống bào tử, đầu và cuối bào tử lớn thuôn nhọn. Một vài loài bào tử lớn tách rời và
không gắn trên cuống bào tử, những tế bào sinh bào tử lớn gọi là thể bình (phialide).
Tiểu bào tử đính thường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng
được sinh ra từ một thể bình hay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân
nhánh. Tiểu bào tử đính thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu bào tử đính của
Fusarium rất giống bào tử của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường Fusarium
được xếp vào nấm Cephalosporium.
Bào tử vách dầy hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa
các sợi nấm giả. Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc
các ống mầm nếu bào tử gặp điều kiện thuận lợi. Hậu bào tử hay bào tử vách dầy rất
bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài. [26]

23
 A B

C
Hình 2.9. A. Khuẩn lạc Fusarium [28]
B. Sợi nấm Fusarium dưới kính hiển vi [28]
C. Hiện tượng thối rễ do Fusarium gây ra [27]

2.6. Nấm Sclerotium Rolfsii: [6]

2.6.1. Phân loại:
Nấm S. rolfsii là nấm gây bệnh hại cây trồng được phát hiện năm 1892 bởi Peter
Henry Rolfs, được phân loại như sau:
Giới: Fungi
Ngành: Basidiomycota
Lớp: Basidiomycetes

24
 Bộ: Agaricales
Họ: Typhulaceae
Giống: Sclerotium

2.6.2. Đặc điểm:

Sợi nấm đa bào, không màu, phân nhánh nhiều. Vách ngăn của sợi nấm có mấu
lồi, ôm lấy hai ngăn của sợi nấm. Tản nấm màu trắng xốp, đâm tia phát triển thuận lợi
và tương đối nhanh trên bề mặt mô bệnh và các loại môi trường nhân tạo như PGA,
PDA,… Tản nấm phát triển không làm biến đổi màu môi trường nuôi cấy. Ở nhiệt độ
thấp, tản nấm phát triển chậm và thưa hơn, còn ở nhiệt độ thích hợp 25 – 300C tản nấm
phát triển nhanh, dày trắng xốp, sau cấy 3 – 5 ngày thì hạch nấm được hình thành
nhiều (hạch non và hạch già).
Hạch nấm ban đầu khi hình thành có màu trắng, về sau chuyển màu vàng, và
khi già sẽ có màu nâu đen như màu hạt chè. Hạch nấm có dạng hình tròn, nhỏ như hạt
cải, kích thước biến động tùy theo các nấm phân lập trên cây kí chủ.
Nấm S. Rolfsii chủ yếu gây bệnh thối gốc, héo rũ gốc mốc màu trắng trên một
số cây trồng. Nguồn bệnh của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật, cây
kí chủ và trong các vật liệu giống nhiễm bệnh dưới dạng sợi nấm, hạch nấm. Bệnh gây
nên hiện tượng héo rũ, chết cây và ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây và
đến năng suất. Biểu hiện của bệnh là các sợi nấm màu trắng và các hạch nấm nhỏ màu
nâu tròn dạng hạt cải được hình thành trên bế mặt gốc thân bị bệnh. Các sợi nấm trắng
phát triển mạnh khi bệnh lây từ cây bệnh sang cây khỏe. Phổ kí chủ rộng bao gồm cà
chua, ớt, bầu bí, đậu, cà rốt … Bệnh phát triển trong điều kiện thời tiết ấm, mưa hoặc
ẩm.

25
 A B

C D

Hình 2.10. S. rolfsii phát triển trên môi trường thạch đĩa (A); Triệu chứng mục rửa thân
do nấm kí sinh (B); Nấm gây bệnh trên cây thuốc lá (C); trên Thơm (D)

26
2.7. Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về ứng dụng vi nấm Trichoderma [6]
2.7.1. Các nghiên cứu trong nước:
Trichoderma còn được sử dụng để phân giải rác sinh hoạt và các phế thải nông
nghiệp nhờ khả năng tiết ra cellulase, enzym này bền nhiệt hơn vi khuẩn (Nguyễn
Xuân Thành, 2003). Viện năng lượng Nguyên tử Việt Nam, Hoàng Hưng Tiến (2005),
đang tiến hành nghiên cứu “Gây tạo và chọn lọc đột biến Trichoderma chống chịu
thuốc trừ nấm hóa học tồn lưu trong đất canh tác bằng tia cực tím”.
Lê Đình Đôn và cộng sự (2006) đã đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm bệnh hại
cây trồng trong điều kiện đồng ruộng của T. Virens, T. Hazianum và T. Asperellum
(có nguồn gốc trong nước). Thiết lập hoàn chỉnh qui trình công nghệ sản xuất chế
phẩm sinh học của 3 loại nấm này và đã đăng ký thương mại ba chế phẩm
“Trichoderma cho cây sầu riêng”, “Trichoderma cho cây rau xanh”, và “BIO – TRI”
với bản quyền thuộc trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, góp phần tạo sản
phẩm nông nghiệp an toàn trong sử dụng.
Cùng với chức năng nghiên cứu, chuyển giao công nghệ và sản xuất các chế
phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, năm 2007, Trung tâm Công nghệ sinh học
TP.HCM đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học BIMA có chứa vi
nấm Trichoderma, Trichoderma là loại nấm đối kháng có tác dụng cao trong việc thúc
đẩy quá trình phân hủy chất hữu cơ và có nhiều tác dụng, được dùng cho các loại cây
trồng. Chống được các loại nấm bệnh cây trồng gây bệnh thối rễ, chết yểu, xì mủ,…
do các nấm bệnh (R.Solani, Fusarium Solani, Phytophthora, S. rolfsii,…) gây nên tạo
điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm sống trong đất phát triển. Sinh tổng hợp các
enzym cellulase, chitinase, protease, pectinase, amylase có khả năng phân giải tốt các
chất xơ, chitin, lignin, pectin trong phế thải hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng, tạo
điều kiện cho cây hấp thu dễ dàng.

2.7.2. Các nghiên cứu ngoài nước:

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzym như chitinase,
cellulase, đây là 2 loại enzym chính phân giải thành màng tế bào, phá hủy khuẩn ty
của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm
tăng tỷ lệ nảy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được biết (Gary J.
Samuels, 2004).

27
 Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng đột
biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác
động của điểu kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng
trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế sẽ tạo ra
những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là
những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như việc tạo chế phẩm sinh học
kiểm soát nấm bệnh thực vật (Gary E.Harman, 2000).
T. Hazianum có khả năng phân hủy các hợp chất gây ô nhiễm trong đất rừng.
Sự tồn tại của các hợp chất chlorouaiacol, hợp chất AOX (các hợp chất halogen thấm
nước) trong chất thải của các nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney, vùng Đông Nam
nước Úc và các sản phẩm phân giải của T. Hazianum đã được nhà khoa học Van
Leeuwen cùng các cộng sự nghiên cứu ( Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998).
Chất tẩy trắng chlor của các nhà máy sử dụng sulfit hóa bột giấy được tháo ra
hồ một cách gián đoạn đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophenol trong nước và cặn
bẩn. Hợp chất chlorophenol có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các chất tự do
2,4,6 – trichlorophenol; 4,5 – dichlorophenol và cả AOX trong môi trường chứa muối
khoáng. Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do
trong môi trường khoáng mặn (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998).
Sự cần thiết của việc tái tạo nguồn năng lượng được chú trọng trong việc tái tạo
nguồn polysaccharide cellulose, là cơ chất có thể thủy phân bằng ezym để sản xuất
đường. T. Reesei QM9414, một vi sinh vật có thể tổng hợp cellulase, là đối tượng đột
biến bằng cách sử dụng kết hợp ánh sáng tia UV và sodium nitrite (45 phút, 0.5mg/l).
Chủng đột biến có khả năng kháng lại mạnh hơn đối với các chất ức chế bởi đường. sự
gia tăng khả năng sinh tổng hợp cellulase tăng lên 1.5 – 1.75 lần và khả năng thủy
phân tăng lên 1.2 lần (N.J. Gadgil và ctv, 1995).

28
 Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện:

Thời gian:
Tháng 10 năm 2009, đến tháng 1 năm 2010
Địa điểm:
Phòng thí nghiệm vi sinh – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường CĐ Kinh tế -
Công nghệ TP. HCM
Địa chỉ: 547/M8 Thành Thái, Phường 14, Quận 10, Tp. HCM

3.2. Vật liệu thí nghiệm:

3.2.1. Hóa chất và thiết bị sử dụng:
Hóa chất:
- MgSO4. 7H2O
- KH2PO4
- Glucose
- Agar
Thiết bị:
- Cân điện tử loại 2 số lẻ.
- Nồi hấp khử trùng autoclave, hiệu HYRAYAMA
- Máy microwave, loại LG microwave OVEN
- Tủ sấy
- Tủ cấy vi sinh
- Tủ hút
- Máy đo pH
- Buồng đếm hồng cầu
- Kính hiển vi

3.2.2. Vật liệu nghiên cứu:

+ Giống: rau cải bẹ xanh, loại cải bẹ xanh cao cây .

29
 + Loại nấm bệnh xử lý: Sclerotium Rolfsii và Fusarium, do Phòng thí nghiệm
Vi sinh Trường CĐ Kinh tế - Công Nghệ TP. HCM cung cấp.
+ Chủng Trichoderma Harzianum, do Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường CĐ
Kinh tế - Công nghệ TP. HCM cung cấp.
+ Môi trường nuôi cấy Trichoderma Harzianum và vi nấm gây bệnh
+ Môi trường bán rắn nhân giống Trichoderma Harzianum
3.3. Bố trí thí nghiệm:
Nuôi cấy chủng Trichoderma Harzianum trên môi trường bán rắn có bổ sung
chitin.
Nuôi cấy, nhân giống vi nấm gây bệnh Sclerotium Rolfsii và Fusarium
Quan sát đại thể, vi thể Trichoderma Harzianum
Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy Trichoderma Harzianum
Khảo sát khả năng phòng chống nấm bệnh của chế phẩm Trichoderma
Harzianum trên cây rau cải bẹ xanh.
3.4. Phương pháp nghiên cứu:
3.4.1. Phương pháp nuôi cấy chủng Trichoderma Harzianum:
3.4.1.1.Vật liệu, dụng cụ:
- Ống nghiệm
- Đĩa petri
- Khay nhựa
- Que cấy
- Đèn cồn
- Môi trường PGA có bổ sung khoáng:
- Môi trường bán rắn
3.4.1.2. Phương pháp thực hiện:
 Pha môi trường PGA: [3]
- Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ
trong 1 lít nước cất trong 30 phút. Lọc qua vải thưa, giữ lại phần lỏng, đó là
chất chiết khoai tây.
- Trộn với các thành phần khác như Glucose (20g), MgSO4..7H2O (12,8g), agar
(20g) rồi đun sôi để hòa tan.
- Hấp tiệt trùng trong 15 phút ở 1210C.
30
- Cho từng thể tích 20 – 25 ml vào các đĩa petri vô khuẩn 15 x 100 mm. pH cuối
= 5,6  0,2. Lưu ý, nắp petri chỉ được mở một phần khi rót môi trường vào đĩa.
Sau khi rót môi trường thì đậy nắp lại, xoay đĩa theo đường tròn, tới, lui một
cách nhẹ nhàng để tránh môi trường dấy lên thành và nắp đĩa. Để yên cho môi
trường nguội và đặc lại.
- Đối với ống nghiệm, phân phối môi trường vào ống nghiệm có nút bông ngay
sau khi vô khuẩn môi trường. Thể tích môi trường được phân phối vào ống
nghiệm tùy thuộc vào chiều dài của thạch nghiêng, thường thì cho vào ống
nghiệm một lượng môi trường bằng 1/3 thể tích ống nghiệm để làm thạch
nghiêng.
 Cấy chuyền và giữ giống:
- Từ ống giống gốc, tiến hành cấy chuyền trên môi trường PGA có bổ sung
khoáng, cấy sang 5 ống nghiệm. Trong đó, bảo quản 2 ống giống trong tủ lạnh
để giữ giống.
- 3 ống còn lại, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Tiếp tục cấy chuyền sang những
ống nghiệm khác, 3 ống cấy vào 9 ống, ủ trong 5 ngày nhiệt độ phòng.
 Nhân giống cấp 1:
 Pha môi trường nhân giống (PG):
- Thực hiện tương tự cách pha môi trường PGA. Tuy nhiên ta không bổ sung
agar và sau khi hòa đều các thành phần môi trường ta phân ra các erlen 250ml (
mỗi erlen từ 150 – 200ml môi trường).
- Đóng nút bông lại, gói giấy báo và hấp tiệt trùng.
 Tiến hành nhân giống:
- Dùng pipet hút nước cất vô trùng cho vào các ống giống.
- Lấy que cấy mài nhẹ trên bề mặt thạch trong ống nghiệm để tách bào tử và hòa
đều chúng với nước cất tạo thành huyền phù.
- Cho toàn bộ huyền phù vào trong bình erlen.
- Đậy nút bông, gói báo và tiến hành nuôi cấy lắc trong 7 ngày.
- Các thao tác được thực hiện trong tủ hút, có đèn cồn.

31
  Nhân giống cấp 2, phương pháp nhân giống Trichoderma Harzianum
trên môi trường bán rắn
 Thành phần và tính chất của môi trường bán rắn [4]
 Vỏ café: Hàm lượng đường 14,4%, trong đó lượng đường khử chiếm 12,4%
cùng với hàm lượng protein 10,1% và 18 loại acid amin là nguyên liệu tốt đề có
thể lên men. Hàm lượng hữu cơ trong đó củng rất cao. Hàm lượng cellulose
trong vỏ café là 63,2% và lignin là 17,7% - hai thành phần nếu được phân hủy
sẽ tạo mùn. Ngoài ra còn có hàm lượng protein 11,2% cùng các loại khoáng vi
lượng cao.
 Cám gạo: cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn. Cám gạo chiếm khoảng 10
– 12% khối lượng lúa chưa xay xát. Nó là hỗn hợp của lớp vỏ ngoài của hạt gạo
và lớp aloron. Những thành phần được thu hồi khi xay xát và chế biến gạo được
gọi chung là cám.
Bảng 3.1. Thành phần dinh dưỡng của cám gạo
Thành phần Khối lượng /100g
Calori 316KJ
Tổng số lipid 21g
Chất béo bão hòa 4g
Chất xơ tiêu hóa được 21g
Cacbonhydrat 28g
Đường 0.9g
Protein 13.3g
Vitamin E 4.9mg
Vitamin B6 4.1mg
Canxi 57mg
 Trấu: là nguồn nguyên liệu thay thế cung cấp nhiệt trong sản xuất với giá rất rẻ,
dễ kiếm, tạo độ tơi xốp cho môi trường sản xuất. Chất hữu cơ chủ yếu chứa
trong trấu là cellulose, lignin và Hemi – cellulose (90%), ngoài ra có thêm
thành phần khác như hợp chất nito và vô cơ. Lignin chiếm khoảng 25 – 30% và
cellulose chiếm khoảng 35 – 40%.

32
  Khoáng: MgSO4, KH2PO4 đây là những loại khoáng thiết yếu cho việc phát triển
của tế bào nấm cũng như giúp cho việc giữ độ pH thích hợp cho nấm phát triển.
những loại khoáng này rât cần thiết cho sự phát triển.
 Chitin: cơ chất cảm ứng T. Hazianum sản xuất chitinase, một enzym có vai trò
quan trọng trong phá hủy vách tế bào vi sinh vật.
 Trộn môi trường:
- Tiến hành cân các thành phần môi trường theo tỷ lệ
Cám gạo 30%
Trấu 20%
KH2PO4 1%
MgSO4 1%
Chitin 2%
Vỏ cafe 20%
- Bổ sung nước cất vô trùng đã được chuẩn độ về pH thích hợp (pH=6). Bổ sung
nước để đạt độ ẩm 45 – 50%.
- Phân đều vào các khay nhựa thành lớp khoảng 2 – 3cm. Các khay được mang đi
hấp tiệt trùng ở 1210C, 20 phút rồi lấy ra, để nguội.
- Dùng micropipet hút 2 ml dịch từ bình erlen cho vào môi trường nhân giống đã
nguội, trộn đều và nuôi ủ nhiệt độ phòng trong 5 – 7 ngày.
3.4.2. Quan sát đại thể nấm Trichoderma Harzianum:[1], [5]
3.4.2.1. Vật liệu, dụng cụ:
- Môi trường PGA có bổ sung khoáng
- Đĩa petri
- Que cấy móc
3.4.2.2. Phương pháp thực hiện
Tiến hành nuôi cấy chủng nấm trong đĩa petri chứa môi trường PGA đã
được chuẩn bị sẵn. Dùng que cấy móc cấy 1 điểm ở trung tâm đĩa. Gói và ủ đĩa ở nhiệt
độ phòng. Theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm, sau 2 – 4 ngày, quan sát
khuẩn lạc và màu sắc trước và sau khi có bào tử.

33
 3.4.3. Quan sát vi thể Trichoderma Harzianum: [6]
3.4.3.1 Vật liệu, dụng cụ:
- Đĩa petri
- Lam
- Bông thấm nước
- Que cấy móc
3.4.3.2. Phương pháp tiến hành:
- Đặt miếng bông thấm nước vào đĩa petri, sau đó là phiến kính.
- Đậy nấp đĩa petri, gói giấy và mang đĩa đi hấp khử trùng.
- Sau khi hấp, tiến hành đổ môi trường PGA bổ sung khoáng trên phiến kính. Đổ
sao cho thạch chảy dài một nửa bên của phiến kính.
- Khi thạch đặt lại, thêm 1 ít nước cất vô trùng vào miếng bông thấm để giữ độ
ẩm
- Dùng que cấy móc cấy 1 ít tơ nấm hay bào tử, cấy từ 1 – 2 điểm trên thạch của
phiến kính trong buồng ẩm.
- Gói hộp lại, ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày.
3.4.4. Thử nghiệm khả năng đối kháng của Trichoderma Hazianum với nấm
bệnh: [1]
3.4.4.1. Vật liệu, dụng cụ:
- Môi trường PGA có bổ sung nước chiết giá đỗ
- Đĩa petri
- Que cấy móc
- Bông thấm nước
3.4.4.2. Nguyên tắc:
Trong quần thể vi sinh vật, các loài vật có tác động qua lại, loài này có khả
năng kiểm soát và điểu hòa số lượng của loài khác qua cơ chế đối kháng hay cạnh
tranh.
3.4.4.3. Phương pháp thực hiện:
- Rót môi trường PGA đã hấp khử trùng vào đĩa petri và kiểm tra sự nhiễm tạp
sau 24h ở nhiệt độ phòng.

34
 - Kẻ 1 đường thẳng ở giữa, phần đáy đĩa petri và đánh 2 dấu đối xứng nhau qua
đường thẳng vừa kẻ đảm bảo cho khoảng cách từ đường thẳng tới 2 điểm là
bằng nhau.
- Lần lượt cấy các giống Trichoderma Hazianum và nấm bệnh lên 2 điểm vừa kẻ.
- Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của 2 loài nấm.
- Thực hiện lặp lại trên 3 đĩa.
 Cơ sở đánh giá tính đối kháng của chủng Trichoderma hazianum
sau 8 ngày nuôi cấy:
- Phần nấm Trichoderma phát triển bao phủ phần nấm gây hại.
- Phần nấm gây hại bị bào mòn dần ở mép khuẩn lạc.
- Phần nấm Trichoderma phát triển và khống chế làm cho phần nấm gây hại không
phát triển được.
Ghi nhận kết quả đối kháng theo qui ước:
+ : Nấm Trichoderma hazianum đối kháng yếu với nấm gây bệnh. Hiệu quả
ức chế từ 40 – 60%
++ : Nấm Trichoderma hazianum đối kháng trung bình với nấm gây bệnh.
Hiệu quả ức chế từ 60 – 80%
+++ : Nấm Trichoderma hazianum đối kháng mạnh đối với nấm gây bệnh.
Hiệu quả ức chế từ 80 – 90%
++++ : Nấm Trichoderma hazianum tiêu diệt hoàn toàn nấm gây bệnh. Hiệu
quả ức chế từ >90%
- : Nấm Trichoderma hazianum không đối kháng với nấm gây bệnh. Nấm
bệnh gần như phát triển bình thường và tấn công sang phần của Trichoderma
hazianum
3.4.5. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma hazianum
3.4.5.1. Vật liệu, dụng cụ:
- Khay nhựa
- Erlen 500ml
- Môi trường bán rắn.

35
 3.4.5.2. Phương pháp thực hiện:
 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến tốc độ sinh trưởng của
Trichoderma Hazianum
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần.
Chuẩn bị môi trường và cấy giống tương tự như cách nhân giống cấp 2. Từ ống
giống gốc nhân lên 10 ống nghiệm, rồi từ 10 ống nghiệm sẽ hòa mỗi ống vào 1 khay
Sau khi cấy giống, ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi và so sánh tốc độ sinh trưởng
của nấm ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp đếm mật độ tế bào.

Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến
tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Hazianum

Nghiệm Cám gạo Trấu KH2PO4 MgSO4 Chitin Vỏ café

thức (g) (g) (g) (g) (g) (g)

NT1 30 _ 1 1 2 20

NT2 30 10 1 1 2 20

NT3 30 20 1 1 2 20
NT4 30 30 1 1 2 20
NT5 30 40 1 1 2 20
Thành phần môi trường được xét trên khối lượng môi trường tổng là 100g
 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tốc độ sinh trưởng của
Trichoderma Hazianum
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần.
Chuẩn bị môi trường và cấy giống tương tự như cách nhân giống cấp 2. Từ ống
giống gốc nhân lên 18 ống nghiệm, rồi từ 18 ống nghiệm sẽ hòa mỗi ống vào 1 Erlen
500ml.
Sau khi cấy giống, ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi và so sánh tốc độ sinh trưởng
của nấm ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp đếm mật độ tế bào.

36
 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tốc
độ sinh trưởng của Trichoderma Hazianum

Nghiệm Cám gạo Trấu KH2PO4 MgSO4 Chitin Vỏ café

thức (g) (g) (g) (g) (g) (g)
NT1 30 20 1 1 _ 20
NT2 30 20 1 1 1 20
NT3 30 20 1 1 2 20
NT4 30 20 1 1 3 20
NT5 30 20 1 1 4 20
NT6 30 20 1 1 5 20
NT7 30 20 1 1 6 20
NT8 30 20 1 1 7 20
NT9 30 20 1 1 8 20

Thành phần môi trường được xét trên khối lượng môi trường tổng là 100g
 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng cám đến tốc độ sinh trưởng của
Trichoderma Hazianum
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần.
Chuẩn bị môi trường và cấy giống tương tự như cách nhân giống cấp 2. Từ ống
giống gốc nhân lên 12 ống nghiệm, rồi từ 12 ống nghiệm sẽ hòa mỗi ống vào 1 Erlen
500ml.
Sau khi cấy giống, ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi và so sánh tốc độ sinh trưởng
của nấm ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp đếm mật độ tế bào.

37
 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng cám đến tốc độ
sinh trưởng của Trichoderma Hazianum

Cám gạo Trấu KH2PO4 MgSO4 Chitin Vỏ café

(g) (g) (g) (g) (g) (g)

NT1 0 20 1 1 2 20
NT2 10 20 1 1 2 20
NT3 20 20 1 1 2 20
NT4 30 20 1 1 2 20
NT5 40 20 1 1 2 20
NT6 50 20 1 1 2 20
Thành phần môi trường được xét trên khối lượng môi trường tổng là 100g
 Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy T. Hazianum bằng phương
pháp thực nghiệm
Nhằm xác định điền kiện tối ưu để thu được sinh khối cực đại. Tiến hành tối ưu
hóa thành phần môi trường nuôi cấy nấm theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm và
tiến hành như sau:
Xét k=3, nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm (cám, trấu, chitin) và
mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần
Ta tieán haønh thí nghieäm ôû n = 2 möùc giaù trò cuûa caùc nhaân toá.

Vaäy soá thí nghieäm caàn thöïc hieän laø:

(thí nghieäm)
Hàm mục tiêu Y là mật độ tế bào T. Hazianum
3.4.6. Phương pháp xác định số tế bào vi sinh vật:
3.4.6.1. Pha loãng mẫu:
- Chuẩn bị bình erlen 250ml chứa 90ml nước cất.
- Cân 1g môi trường nuôi cấy Trichoderma Hazianum cho vào bình erlen, sau đó
thêm nước cất để điều chỉnh thể tích mẫu về 100ml.
- Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếng hành pha loãng mẫu.
- Hút 1ml dịch pha với 9ml nước cất ta được dung dịch pha loãng 10 lần. Tiếp
tục hút 1ml dịch của nồng độ trước hòa với 9ml nước cất ta lại được dung dịch
sau có độ pha loãng 10 lần. Cứ tương tự như thế ta được một loạt các dung dịch
có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10 -4, …
38
 Hình 3.1. Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân
- Tùy theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít.
- Sau khi có độ pha loãng thích hợp tiến hành xác định số lượng tế bào
Trichoderma Hazianum.
3.4.6.2. Xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu: [3], [5]
 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:
Buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, có một vùng đĩa đếm nằm giữa
phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm 2 và được
chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm 2 và 400 ô nhỏ, mỗi ô diện
tích 1/400 mm2. Tải bản FULL (92 trang): https://bit.ly/3j2BHBT
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

(a) (b)

Hình 3.2: Buồng đếm hồng cầu

(a) Nhìn nghiêng và nhìn từ trên xuống
(b) Ô trung tâm (khoanh tròn) được quan sát với độ phóng đại 100 lần

39
  Cách tiến hành:
1- Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên bề mặt buồng đếm kề với
cạnh của lá kính nhờ một pipet Pasteur. Dịch huyền phù sẽ di vào buồng đếm
nhờ cơ chế mao dẫn. buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không
gian nẳm giữa lá kính và buồng đếm được điền bởi dịch huyền phù tế bào, các
rãnh xung quanh không bị dính ướt.
2- Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi
đó dịch nằm trong khoan có độ dày khoảng 0.1 mm.
3- Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi.
4- Điểu chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ rảng cả tế bào lẫn các
đường kẻ. Tùy thuộc vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế
bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong ô đại diện.
5- Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 – 5 phút; phải đếm tế bào nằm
trên các đường kẻ nhưng không được lặp lại khi chuyển qua đếm tế bào trên ô
kế cận. Tải bản FULL (92 trang): https://bit.ly/3j2BHBT
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net
 Cách tính:
Số tế bào trong 1g mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức:
Số tế bào/ml = [(a/b) x 400/0.1] x 103 x 10n
Trong đó:
a - số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ);
b - số ô nhỏ trong 5 ô lớn (16 x 5 = 80 ô nhỏ);
400 - tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm;
0.1 – thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm;
103 : chuyển từ mm3 sang ml (1000 mm 3 = 1ml)
10n : độ pha loãng của mẫu

40
3.4.7. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm:
 Nguyên tắc
Sấy là quá trình sử dụng nhiệt để làm khô sản phẩm, tùy từng loại sản phẩm mà
điều chỉnh nhiệt độ và thời gian phù hợp để thu được sản phẩm khô như mong muốn.
 Chỉ tiêu thu nhận
Sản phẩm Trichoderma Hazianum, sản phẩm dạng bột min.
 Phương pháp tiến hành
Qua quá trình khảo sát môi trường tối ưu cho sự phát triển của Trichoderma
Hazianum, chọn ra môi trường tối ưu nhất, các thành phần trấu, cám, chitin thích hợp
nhất để tiến hành sản xuất chế phẩm Trichoderma Hazianum bằng phương pháp sấy
khô.
3.4.8. Khảo sát khả năng phòng bệnh trên cây trồng bởi chế phẩm Trichoderma
Harzianum
Thí nghiệm khảo sát khả năng phòng nấm bệnh của chế phẩm Trichoderma
harzianum trên cây rau cải bẹ xanh được bố trí theo cách hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần
o NT1: Chỉ dùng chế phẩm Trichoderma Harzianum.
o NT2: Không dùng chế phẩm Trichoderma Harzianum, chỉ xử lý nấm
bệnh A (Fusarium)
o NT3: Không dùng chế phẩm Trichoderma Harzianum, chỉ xử lý nấm
bệnh B (S. Rolfsii)
o NT4: Dùng chế phẩm Trichoderma Harzianum và xử lý nấm bệnh A.
o NT5: Dùng chế phẩm Trichoderma Harzianum và xử lý nấm bệnh B.
o NT6: Xử lý cả 2 loại nấm bệnh A, B và dùng chế phẩm Trichoderma
Harzianum.

3483791

41