Sự Phiên Mã Và Mã Di Truyền

SỰ PHIÊN MÃ VÀ
MÃ DI TRUYỀN
Bộ môn Vi sinh - Ký sinh
Môn học: Sinh học phân tử
Mục tiêu
• Trình bày được quá trình phiên mã ở nhân nguyên thủy và

nhân thật
• Trình bày được quá trình phiên mã ngược và ý nghĩa
• Trình bày được các yếu tố điều hòa phiên mã
• Phân biệt được các loại ARN polymerase
• Nêu được bản chất của mã di truyền

Mở đầu
Học thuyết trung tâm

http://faculty.ksu.edu.sa
Nguyên tắc chung
ADN
mARN
Sơ đồ quá trình phiên mã
http://www.biology.arizona.edu
Nguyên tắc chung
Video 1: mRNA Synthesis (Transcription)

Nguyên tắc chung
ARN polymerase phụ thuộc ADN bám vào ADN

• Gây đứt liên kết hydro giữa các cặp base bổ
sung của chuỗi xoắn kép ADN  tách hai mạch
đơn ADN
• Di chuyển theo hướng 3’ - 5’ trên ADN  ARN
được tổng hợp theo hướng 5’ – 3’
Chỉ một trong hai mạch của phân tử ADN dùng làm
khuôn tổng hợp ARN  phiên mã bất đối xứng
Nguyên tắc chung
Nguyên tắc của quá trình phiên mã:
- Cần cung cấp các ribonucleotid triphosphat : ATP, GTP,

CTP và UTP
- ARN polymerase là một holoenzym  cần co-factor:

Mg2+ hoặc Mn2+
Quá trình phiên mã
Phiên mã gồm các bước chính:

• Khởi đầu
• Kéo dài
• Kết thúc
→ Sản phẩm là các phân tử ARN nguyên thủy
→ Biến đổi thành các ARN trưởng thành
Quá trình phiên mã
Video 2: Stages of Transcription

Quá trình phiên mã – Giai đoạn khởi đầu
• ARN polymerase cùng với yếu tố sigma gắn với

trình tự promoter trên ADN
• Bong bóng phiên mã hình thành
en.wikibooks.org
Quá trình phiên mã – Giai đoạn kéo dài
• ARN polymerase cùng với bong bóng phiên mã
chuyển động dọc theo sợi ADN khuôn mẫu theo
hướng 3’-5’  gắn kết các nucleotid triphosphat
• Khi phức hợp ADN-ARN đạt chiều dài 12 base  đầu

5’ của ARN tách khỏi mạch ADN bổ sung  2 mạch
kép ADN ban đầu phục hồi
en.wikibooks.org
Quá trình phiên mã – Giai đoạn kết thúc
• ARN polymerase gặp điểm kết thúc
→ Chấm dứt nối dài mạch ARN
→ ARN polymerase và chuỗi ARN hoàn chỉnh tách
khỏi sợi ADN
en.wikibooks.org
Phiên mã ở nhân nguyên thủy
Đặc điểm:
• Chỉ một loại ARN polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp
tất cả các loại ARN
• mARN thường chứa thông tin nhiều gen nối tiếp nhau
(polycistron mARN)
• Quá trình tổng hợp ARN chỉ bắt đầu từ dấu xuất phát
(TAC)
• Phiên mã tiến hành khi ARN polymerase bám vào vùng
khởi động
• Quá trình tổng hợp ARN thường kết thúc khi đọc qua dấu
kết thúc
• Quá trình phiên mã và dịch mã xảy ra đồng thời
ARN polymerase của E. coli
- Là phức hợp protein chứa 5 tiểu đơn vị thuộc 4 loại (α,
β, β’, σ)
- Mr ~ 450.000
- Tiểu đơn vị σ có thể tách ra thuận nghịch từ

holoenzym
α 2 β β’ σ α 2 β β’ + σ
Holoenzym Core enzym

ARN polymerase của E. coli
Tiểu đơn vị Chức năng
β và β’ Chịu trách nhiệm xúc tác
α Liên quan đến lắp ghép enzym
σ Liên quan đến tính đặc hiệu của promoter
Vị trí gắn của ARN polymerase trên ADN

http://bioweb.wku.edu
Promoter
- Ký hiệu: base đầu tiên phiên mã thành mARN: ký
hiệu +1  các base ngược chiều phiên mã: ký hiệu “-”
- Promoter gồn hai trình tự:
1. TATAAT: hộp TATA hay hộp Pribnow

• Thường tận cùng là base T
• Cách điểm xuất phát 6-8 base
• Base trung tâm ở vị trí -10
Promoter
2. TTGACA:
• Base trung tâm ở vị trí -35
• Tham gia gắn khởi đầu ARN polymerase
 Không phải promoter nào cũng có cùng hai trình tự

trên  có thể thay đổi một vài nucleotid
 Chức năng của promoter được xác định nhờ đột biến
điểm
Hai trình tự này chịu trách nhiệm cho phép gắn ARN
polymerase vào vùng khởi động phiên mã
ARN ở E. coli
- Có đời sống bán hủy ngắn (một vài phút)
- Bị thoái hóa do hệ thống enzym endonuclease và

exonuclease
 Hầu hết tại bất cứ thời điểm nào, mARN trong tế bào
chất đều là chuỗi mới sinh
- ARN gắn với phức hợp “ADN khuôn – ARN

polymerase”
- Ribosom gắn vào vị trí gắn ribosom ở phía đầu 5’ của

mARN  thực hiện quá trình dịch mã
ARN ở E. coli
Ở tế bào nhân nguyên thủy, quá trình phiên mã và dịch

mã thực hiện gần như song song nhau
http://www.google.com.vn
Kết thúc quá trình tổng hợp chuỗi ARN
- Quá trình tổng hợp ARN kết thúc khi gặp một trình tự
đặc hiệu trên ADN
- Ở E. coli, có hai cơ chế kết thúc:

1 Kết thúc độc lập với yếu tố Rho
2 Kết thúc lệ thuộc yếu tố Rho

Kết thúc độc lập với yếu tố Rho:
• Hiện diện trình tự ~ 30-40 bp giàu GC trên ADN
và có thêm 5-6 adenin
 ARN phiên mã từ trình tự này có thể hình thành
một nút vòng hay cấu trúc kẹp tóc do hình thành
liên kết hydro nội phân tử giữa các base bổ sung
• Cặp base bổ sung A – U ít bền vững  ARN tách
khỏi ADN
• Phóng thích sợi ADN kép hình thành trong bong
bóng phiên mã và phần lõi của ARN polymerase –
có ái lực thấp với ADN kép
Cấu trúc bậc hai của ARN từ trp operon của E. coli
Kết thúc phụ thuộc yếu tố Rho
Rho gắn vào phía đầu 5’ của ARN, trên đoạn có chiều dài khoảng 70-
80 nucleotid và giàu trình tự C - nghèo G
Rho di chuyển dọc theo ARN theo chiều 5’-3’, hướng tới bong bóng
phiên mã
Khi ARN polymerase di chuyển chậm, Rho sẽ bắt kịp và kết thúc quá
trình phiên mã tại dấu kết thúc
Rho có hoạt tính ATPase, giải phóng ARN và ARN polymerase khỏi
sợi ADN
Kết thúc phụ thuộc yếu tố Rho
https://o.quizlet.com
Sự phiên mã ở nhân thật
Đặc điểm:
• Các ARN polymerase khác nhau chịu trách nhiệm
tổng hợp các ARN khác nhau
• Bản phiên mã đầu tiên gọi là pre-mARN
• Quá trình phiên mã và dịch mã KHÔNG xảy ra
đồng thời
• mARN chứa thông tin một gen (monocistron mARN)
Sự phiên mã ở nhân thật
Đặc điểm:
- Các ARN polymerase khác nhau chịu trách nhiệm tổng
hợp các ARN khác nhau
ARN
polymerase I rARN
ARN
ARN
polymerase II mARN
polymerase
ARN ARN nhỏ,

polymerase III tARN, ARN 5S
ARN polymerase của tế bào nhân thật
Loại Vị trí Bản sao Độ nhạy α-

amanitin
Polymerase I Nhân Pre-rARN Không nhạy cảm
Polymerase II Dịch nhân Pre-mARN Rất nhạy cảm
Polymerase III Dịch nhân 5S rARN, tARN và Nhạy cảm trung

các ARN nhỏ khác bình
Phiên mã do ARN polymerase I
- Do nhu cầu rARN cao của tế bào  các gen ARN
ribosom được sao chép nhiều nhất
- Trình tự các gen ARN ribosom có tính bảo tồn cao ở
các chủng sinh vật  có các trình tự chuyên biệt phía
trước các điểm phiên mã ở từng loài
- Các gen không nằm rải rác mà xếp thành nhóm
- Bản phiên mã đầu tiên là pre-rARN 45S ( tiếp theo
là quá trình cắt nối tạo 28S, 18S và 5.8S)
- ARN polymerase I gồm 13 tiểu đơn vị
- Promoter:
• Promoter chính: gồm ~ 75 bp, nằm giữa vị trí -45
và +20, quanh điểm khởi đầu phiên mã
• Yếu tố kiểm soát UPE (Upstream Promoter
Element), ở vị trí -180  -107: thúc đẩy phiên mã
• Promoter chính và UPE giàu trình tự GC nhưng
có 1 trình tự giàu AT xung quanh vị trí khởi đầu
phiên mã
- Hai yếu tố khác cần thiết cho quá trình phiên mã:
• UBF (Upstream Binding Factor):
o Là chuỗi polypeptid đơn, gắn với UPE và
promoter chính
o Vai trò: nhận diện trình tự giàu GC
• SL1:
o Gồm 4 protein, trong đó có TATA-box binding
protein (TBP)
o Vai trò: gắn với UBF1
- Khi UBF và SL1 tạo thành phức hợp, RNAP I gắn vào
promoter lõi  bắt đầu phiên mã

http://www.mun.ca/biochem/courses
Phiên mã do ARN polymerase II
- Các gen được phiên mã bởi ARN polymerase II tạo ra
mARN
- Các gen do RNAP phiên mã có trình tự duy nhất hoặc
với số ít bản sao (trừ gen mã hóa cho protein histon)
 mã hóa cho 1 loại protein
- Các protein tham gia vào các quá trình phiên mã, gắn
chóp, gắn đuôi, cắt nối và vận chuyển ARN ra tế bào
chất tương tác với nhau  thúc đẩy hiệu quả các quá
trình
 Đóng vai trò quan trọng nhất trong 3 loại ARN
polymerase
- Promoter: có cấu trúc khác nhau tùy thuộc vào sự kết
hợp các yếu tố phiên mã
Một số thành phần cơ bản của promoter:
• Hộp TATA:
o Nằm cách ~ 25 bp ngược chiều với điểm bắt
đầu phiên mã
o Trình tự chung TATAAAT
o Vai trò: lựa chọn vị trí bắt đầu phiên mã
• Yếu tố khởi đầu: quyết định vị trí bắt đầu phiên mã
• Hộp GC:
o Trình tự chung GGGCCGGG
o Nằm cách ~ 40-100 bp ngược chiều với điểm
bắt đầu phiên mã
o Yếu tố phiên mã Sp1 gắn vào hộp GC
http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org
• Hộp CAAT:
o Trình tự chung GGCAATCT
o Nằm cách ~ 40-100 bp ngược chiều với điểm
bắt đầu phiên mã
o Yếu tố phiên mã CTF hay NF1 gắn vào hộp
CAAT
- RNAP II không thể hoạt động độc lập  cần thêm các
yếu tố phiên mã TF (Transcription Factor)
• Ít nhất 6 yếu tố phiên mã đã được xác định (TFIIA,
B, D, E, F, H)
• Giúp RNAP gắn chính xác vào điểm khởi đầu phiên
mã
Quá trình phiên mã gồm các bước chính sau:
1. TFIID nhận diện và gắn với hộp TATA
TFIID có TATA-box binding protein (TBP) và ~ 10 yếu tố TBP
associated factors (TAFs)
 TFIID có vai trò hướng ARN polymerase tới promoter
2. TFIIA gắn và bền vững với TFIID
3. Sắp xếp các yếu tố điều hòa và yếu tố phiên mã
• TFIIB
o 1 chuỗi polypeptid đơn
o Gắn với cả 2 phía của hộp TATA (ngược chiều và cùng chiều)
o Tạo thành phức hợp với RNAPII
• TFIIE
o Gồm hai tiểu đơn vị
o Kết hợp với TFIIH  tạo thành phức hợp khởi đầu quá
trình giải phóng promoter và giai đoạn kéo dài
• TFIIF
o Gồn hai tiểu đơn vị RAP30 và RAP74
o RAP74 có hoạt tính helicase (phá vỡ liên kết hydro)  tách

sợi đôi ADN tại vị trí promoter  bộc lộ sợi ADN khuôn
• TFIIH
o Gồn chín tiểu đơn vị
o Có hoạt tính kinase  thực hiện quá trình
phosphoryl hóa, giải phóng promoter
Trình tự sắp xếp của các yếu tố phiên mã có thể:
TFIID  TFIIA  TFIIB  (TFIIF + RNAP II)  TFIIE  TFIIH
4. Gắn kết các yếu tố điều hòa  tạo thành phức hợp
tiền khởi đầu
Phiên mã do ARN polymerase III
chịu trách nhiệm phiên mã rARN 5S, tARN và một số
- RNAPIII
ARN nhỏ của nhân và tế bào chất
- Các gen do RNAPIII phiên mã thường chứa <300 nucleotid.
• Gen 5S rARN không có intron
• Gen tARN có nhiều intron nhỏ
RNAPIII:
• Là enzym lớn nhất trong 3 loại RNAP
• Mr ~ 700 kD
• Gồm 17 tiểu đơn vị

- Promoter:
• Điểm khác biệt, một số promoter có thể nằm trong
gen được phiên mã (VD: promoter của gen 5S
rARN, tARN)
Ở noãn bào Xenopus laevis:
• Gen 5S rARN có chiều dài 120 bp
• Trình tự +41  +87 có khả năng điều khiển
phiên mã  được xem như là promoter
• Promoter của gen snARN nằm phía trước điểm
khởi đầu phiên mã
- Các yếu tố phiên mã bổ sung khác
• TFIIIA
o Chỉ cần thiết cho phiên mã gen 5S rARN
o Gồm một chuỗi polypeptid đơn
o Gắn với ADN theo mô hình ngón tay kẽm

- Các yếu tố phiên mã bổ sung khác
• TFIIIB
o Gồm ba tiểu đơn vị
o Một tiểu đơn vị là TBP (TATA-box binding

protein)
• TFIIIC
o Gồm sáu tiểu đơn vị
o Cần thiết cho tất cả các promoter

- TFIIIA gắn vào vị trí trong vùng promoter
- TFIIIC liên kết tạo phức hợp bền vững. TFIIIC bao phủ
toàn bộ gen
- TFIIIB gắn vào vị trí xung quanh điểm khởi đầu phiên
mã
- Cuối cùng, RNAPIII gắn và thực hiện phiên mã

Phiên mã do RNAPIII
Các yếu tố phiên mã
Video 3: Transcription Factors

Phiên mã ở tế bào nhân nguyên thủy vs
tế bào nhân thật
Video 4: Processing of Gene Information:

Prokaryotes vs Eukaryotes
Phiên mã ngược ở retrovirus
- Retrovirus là các virus mà vật liệu di truyền là ARN
• Sự tổng hợp ADN từ khuôn mẫu ARN được xúc tác bởi enzym
phiên mã ngược reversve transcriptase
• Khác với ARN polymerase, enzym phiên mã ngược cần dùng

mồi
• Mồi là tARN của tế bào chủ, bắt cặp vào đầu 3’ của virus
• Sản phẩm đầu tiên là chuỗi kép lai ARN-ADN
• ARN virus trong chuỗi kép bị hủy bởi RNAse H
•Mạch ADN vừa tổng hợp trong chuỗi lai ARN-ADN được dùng
làm khuôn mẫu để tổng hợp chuỗi kép ADN
• Chuỗi kép ADN tích hợp vào ADN tế bào chủ

Mã di truyền
1961, F. Crick chứng minh “codon gồm 3 nucleotid

kế tiếp nhau”  có 64 tổ hợp
Mã di truyền
- Trong 64 codon:
• Có 3 codon không mã hóa cho acid amin  codon vô nghĩa, đóng vai trò
codon kết thúc: UAA, UAG và UGA
• Có nhiều codon mã hóa cho 1 acid amin (codon đồng nghĩa)  tính thoái
hóa của mã di truyền
Codon đồng nghĩa có 2 nucleotid đầu giống nhau và khác nhu ở nucleotid
thứ 3
• Chỉ methionin và tryptophan có 1 codon mã hóa
•Một codon chỉ mã hóa cho một acid amin, ngoại trừ GUG vừa mã hóa cho
valin và acid amin mở đầu N-formylmethionin
- Trừ một số ngoại lệ, mã di truyền có tính phổ biến cho tất cả sinh vật
Mã di truyền
CÁC LOẠI ARN
MỤC TIÊU
1. Mô tả cấu trúc các loại ARN
2. Trình bày vai trò của các ARN
3. Mô tả cách thức biến đổi ARN

Khái niệm
http://faculty.ksu.edu.sa
Cấu trúc ARN
• Mạch đơn
polynucleotide
• Đường Ribose (5C)
• Base nitơ:A,G,C,U
ARN và chức năng
Lấy thông tin di truyền từ ADN để tổng hợp protein
ARN Chức năng
mARN (messenger Chứa trình tự nucleotid từ

ARN) ADN để mã hóa protein
tARN Vận chuyển acid amin đến
(transfer ARN) ribosom
rARN Là thành phần cấu tạo của
(ribosome ARN) ribosom
Các tiền ARN và ARN khác
hnARN
Pre- Pre-
tARN rARN
ARN
khác
scARN snARN
• hn: Heterogeneous nuclear RNA

• sn: Small nuclear RNA
• sc: Small cytoplasmic RNA
Các loại ARN
ARN toàn phần
ARN mã hóa ARN không mã hóa
hnARN Pre-rARN Pre-tARN sn-ARN sno-ARN sc-ARN tm-ARN

và ARN
khác
Tất cả tế bào
Tế bào nhân thật
mARN rARN tARN
Tế bào nhân nguyên thủy
Vai trò rARN
rARN là thành phần cấu tạo của ribosom
Ribosom
Hệ số lắng S
(Svedberg)
Ribosom Ribosom Ribosom

Tb nhân nguyên thủy Tb nhân thật Ty thể động vật có vú
70S 80S 50S

Cấu tạo ribosom của prokaryot
Cấu tạo ribosom của eukaryot
Các tiểu đơn vị ribosom
Được tổng hợp trong nhân
Di chuyển ra tế bào chất

qua lỗ nhân
Hai tiểu đơn vị liên kết

nhau tại tế bào chất
Protein ñöôïc toång hôïp trong teá baøo chaát

Vai trò của ribosom
Ribosom
Tiểu đơn vị lớn Tiểu đơn vị nhỏ
Xác định acid amin cần tổng

Chịu trách nhiệm hình thành hợp, kiểm soát quá trình
liên kết peptid tương tác giữa mARN và anti-
codon của tARN
Cấu trúc rARN
Cấu trúc bậc 1 Cấu trúc bậc 2
https://www3.nd.edu
Cấu trúc rARN
• Cấu trúc bậc 1
o Methyl hóa nucleotid, biến đổi bản sao sơ cấp
rARN
• Cấu trúc bậc 2
o Lắp ráp ribosom
Methyl hóa rARN
Nhaân
nguyeân thuûy
OH
Nhaân thaät
Pre-rARN
Quaù trình toång hôïp

ribosom ôû teá baøo HeLa
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/
Pre-rARN ở tế bào nhân nguyên thủy
http://www.bx.psu.edu
http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/RNAProcessingCh12.htm
Quaù trình caét noái pre-rARN ôû E. coli
- RNase III cắt 16S rARN vaø 23S rARN

- RNase E vaø M5 caét 5S rARN
- RNase P vaø F caét tARN
tARN
https://upload.wikimedia.org
Đặc điểm chung của tARN
• Chieàu daøi 73-93 nucleotid

• Caáu truùc hình laù cheû ba
• Ñaàu 3’ keát thuùc baèng trình töï CCA - gaén keát aa
– Ở E. coli, CCA phiên mã từ base bổ sung có trong
ADN nhiễm sắc thể
– Ở tế bào nhân thật, CCA được thêm vào sau khi
phiên mã
Cấu trúc của tARN
http://www3.interscience.wiley.com:8100/
Cấu trúc tARN
1. Đầu tận cùng 5’ phosphate
2. Nhánh gắn acid amin: gồm 7 cặp base
– Các nucleotid đầu tận cùng 3’ có –OH tự do để gắn aa
– Các cặp base có thể không theo trình tự bổ sung
3. Đuôi CCA: trình tự CCA tại 3’ giúp enzym nhận biết tARN
khi dịch mã
4. Vòng D: gồm 4 cặp base, chứa dihydrouridine
5. Vòng đối mã: gồm 5 cặp base đối mã. Mỗi tARN mang
một bộ ba đối mã đặc hiệu của 1 hay nhiều codon mã
hóa cho 1 aa
6. Vòng T: gồm 5 cặp base, chứa trình tự T
7. Các base biến đổi: khác với A, U, G, C
Cấu trúc tARN
Các ribonucleotid bị biến đổi ở tARN

tARN gắn acid amin
Là quá trình gồm 02 giai đoạn:

• Giai đoạn 1:
Acid amin + ATP  Aminoacyl-AMP + PPi
• Giai đoạn 2:
Aminoacyl-AMP + tARN  Aminoacyl-tARN + AMP
http://www.rpi.edu/
• Enzym aminoacyl tARN synthetase xúc tác
giai đoạn aminoacyl hóa:
- Mỗi enzym nhận diện 1 acid amin đặc hiệu và
tARN vận chuyển acid amin đó
- Enzym thường nhận diện tARN tại 2 vị trí:

cuống D và vòng đối mã
Video 1: Aminoacyl tRNA Synthetase

Cấu trúc không gian tARN
http://www.bio.miami.edu
Biến đổi tARN
Một số đặc điểm của quá trình biến đổi pre-tARN
• Intron không có trình tự nhận diện vị trí cắt
• Cần cung cấp GTP, ATP
• Vòng 2’3’-P được tạo thành ở exon 5’
• Cấu trúc bậc 2 của tARN ảnh hưởng đến quá trình
cắt nối
Biến đổi tARN
Cấu trúc mARN
Gồm 3 phần
1. Đoạn 5’ không mã hóa
2. Vùng mã hóa
3. Đoạn 3’ không mã hóa
• Đoạn không mã hóa 5’UTR và 3’UTR (untranslated
region)
o Làm gia tăng hay giảm độ ổn định của ARN
o Giúp ARN tồn tại lâu hơn trong tế bào chất
mARN ở nhân thật
Ở nhân thật, sau khi mARN được tổng hợp, trước khi
được dịch mã, phải trải qua 2 giai đoạn “hậu phiên
mã”:
1. Giai đoạn mũ hóa (capping): Gắn dạng đặc hiệu guanin
triphosphat methylat vào đầu 5’
2. Gắn đuôi polyA (50-150 adenin) vào đầu 3’
mARN ở nhân thật
Giai đoạn mũ hoá: xảy ra theo 1 trong 3 cách:
• Cap 0: methyl gắn vào vị trí G7 do enzym
guanin-7-methyl transferase xúc tác. Phản ứng
này xảy ra ở tất cả mARN nhân thật.
• Cap 1: methyl gắn vào vị trí 2’-OH đường ribose
của nucleotid đầu tiên. Phản ứng do enzym 2’-O-
methyl transferase xúc tác, xảy ra ở hầu hết
mARN nhân thật.
• Cap 2: phản ứng methyl hoá tương tự xảy ra ở
nucleotid thứ 2 với tỉ lệ 10-15%
Giai đoạn mũ hóa mARN nhân thật
Giai đoạn gắn đuôi polyA ở mARN nhân thật
Giai đoạn gắn đuôi polyA vào đầu 3’

• Đuôi polyA gắn vào pre-mARN có trình tự nhận
diện AAUAAA
• Do enzym polyA polymerase xúc tác
o Giúp mARN rời khỏi nhân
o Xác định số lần mARN được dịch mã
o Bảo vệ ARN
o Gắn với ribosom
Giai đoạn gắn đuôi polyA ở mARN nhân thật
http://www.web-books.com
Tóm tắt quá trình xử lý mARN
http://www.schenectady.k12.ny.us
Sn ARN, Sc ARN
Sn ARN, Sc ARN
Sn ARN + protein ñaëc hieäu snRNP
Sc ARN + protein ñaëc hieäu scRNP
Vai troø snRNPø: bieán pre-ARN ARN
U1-U2
hnARN mARN
snRNP
Pre-rARN U3 rARN
Vai troø scRNP: nhaän dieän tín hieäu xuaát

Quá trình cắt nối ARN
Nguyên tắc GU-AG
• GU luôn tận cùng đầu 5’ của intron

→ Vị trí cho
• AG luôn tận cùng đầu 3’ của intron
→ Vị trí nhận
Bất kỳ vị trí cho nào cũng có thể gắn với vị trí nhận
Phản ứng cắt nối
Là 02 phản ứng chuyển vị ester hóa
• Phản ứng chuyển vị ester hoá I: nhóm -OH ưa
nhân gắn vào vị trí 5’P của intron.
• Phản ứng chuyển vị ester hoá II: nhóm 3’-OH
ưa nhân của exon gắn vào vị trí 3’P của intron
• Nối các exon, loại bỏ intron
Cơ chế cắt nối ARN
Tự cắt nối
• ARN đóng vai trò enzym – ribozym
• Xảy ra ở:
o Nhóm intron 1
o Nhóm intron 2
Tự cắt nối
http://oregonstate.edu
Cơ chế cắt nối ARN
Cắt nối ở tARN
Cắt nối nhờ spliceosome
• Spliceosome là phức hợp chứa khoảng
40 protein qui định cắt nối và các snARN.
Các phức hợp ribonucleoprotein này được
gọi là snRNP hay snurp.
• Các snRNP gồm có U1, U2, U5 và U4/U6
chứa snARN U1, U2, U4, U5, U6. Chúng
nhận diện các trình tự exon – intron để loại
bỏ intron và nối các exon. Quá trình này
thường xảy ra ở ARN nhân của tế bào
nhân thật bậc cao.
Video 2: How Spliceosomes Process RNA

Phản ứng cắt nối
Gồm 3 giai đoạn chính
• Giai đoạn 1: vị trí cho bị cắt, đầu 5’ gắn vào vị trí
nhánh của intron bằng liên kết 5’-2’ phosphodiester
tạo sợi đôi tạm thời
• Giai đoạn 2: vị trí nhận bị cắt, các exon được nối
lại, intron bị loại
• Giai đoạn 3: sợi đôi bị bẻ nhánh và thoái hóa
Cắt nối chéo
• Phản ứng cắt nối trên một ARN
–Cis-splicing
• Phản ứng cắt nối giữa các ARN
–Trans-splicing
Cis và trans splicing
Đầu tiên, vị trí nhánh A ở sợi lên tại vùng giàu pyrimidin liên kết với vùng 3’ của ARN dẫn, giải
phóng”tiểu exon”. Sau đó, đầu 3’ của tiểu exon tự do liên kết với đầu 5’ của exon mã hoá, cắt bỏ
đoạn nhánh chứa vùng 3’ của ARN dẫn và vùng 5’ mã hoá của bản sao nguyên thủy. Các bước
này tương ứng với phản ứng chuyển vị ester hoá I, II trong cắt nối pre-mARN ở tế bào nhân
thật bậc cao www.jci.org
Các ARN khác
Antisense ARN
Vai trò antisense ARN
Các ARN khác
miARN (microARN)
– Sợi đơn ARN, 20-25 nucleotid
– Được tổng hợp từ ADN
– Ở vị trí 3’UTR mARN
– Không dịch mã protein
Điều hòa hoạt động gen
siARN ( small interfering ARN)

– ARN, 20-25 nucleotid
– Điều hoà biểu hiện gen
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP VÀ
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG
SINH HỌC PHÂN TỬ
Bộ môn Vi sinh – Ký sinh
1
Tạo dòng gen
Đoạn gen
đích Vector mang
gen đích Nuôi cấy
Tạo dòng
Nghiên cứu Chiết tách

chức năng
Dòng tế bào
mang gen đích
Đưa trở lại Thực hiện

tế bào biến đổi
2
Đặc điểm một số chủng xuất phát từ E. coli K12
• JM109:
– Dùng để nhân bản các vector của phage M13,
– Có thể dùng với plasmid pUC, là các plasmid sử
dụng kỹ thuật bổ sung alpha để chọn lọc dòng tái tổ
hợp.
– Chủng này bị mất gen β-galactosidase trên nhiễm
sắc thể, nhưng có mang gen cho đoạn omega của
β-galactosidase trên plasmiad F’, cho phép nó bị
nhiễm bởi các phage dạng sợi như M13. Nếu mất Nguồn: Wikipedia
plasmid F’ sẽ làm mất khả năng này, do đó phải

duy trì chủng này trên môi trường tối thiểu.
– Có đột biến trên gen recA, làm cho nó mất khả
năng tái tổ hợp tương đồng.
– Chủng này được ưa dùng hơn JM103 nếu tái tổ
hợp là các đoạn chèn thay đổi. Tuy nhiên, hiệu suất
thu ADN của M13 của nó thấp hơn JM103. 3
• DH5-α
– Có đặc tính bổ sung alpha.
– Chủng này mang gen recA1 đột biến.
– Ngoài ra, nó còn mang đột biến deoR làm dễ dàng cho việc thu nhận
các mảnh ADN lớn.
• DH5-αF’:
– Rất tốt cho việc nhân bản vector M13 mp.
– Cho phép tạo ra ADN sợi đơn từ plasmid có origin f1 (như vector
M13) khi bị nhiễm đồng thời một phage trợ giúp (helper phage).
– Khác với JM103, F’ episome, cần để nhân bản phage sợi đơn, ổn
định, không cần sử dụng môi trường tối thiểu để duy trì nó.
4
• XL1-Blue:
– Rất tốt để nhân bản các thư viện cADN hay genome cũng như các
phage như M13.
– Mang các đột biến làm bất hoạt hầu hết các RE của E. coli, do đó
ngăn việc cắt các ADN có mang C hoặc A được metyl hóa, hay gặp
trong các cADN hay ADN chân hạch.
– Mang đột biến hsdR, ngăn sự cắt ADN đã tạo dòng bởi EcoK.
– Mang recA, F’ và kỹ thuật bổ sung alpha.
– Mang gen kháng tetracyclin nên không dùng để chọn lọc dòng sau
biến nạp.
5
Vai trò của vector tạo dòng trong SHPT
• Vector tạo dòng là vật liệu di truyền trung gian để chuyển gen giữa các
tế bào do chúng có khả năng được sao chép và phân phối vào các tế
bào mới trong quá trình phân bào, nhờ đó gen đang nghiên cứu cũng
được sao chép và hiện diện ở tất cả các tế bào xuất phát từ tế bào
nhận gen ban đầu.
6
Yêu cầu của vector tạo dòng
• Có thể được sao chép bởi tế bào nhận nó.
• Có trình tự nhận diện của enzym giới hạn để cắt và đưa gen ngoại lai
vào.
• Mang một hay nhiều yếu tố chọn lọc nào đó để phân biệt hoặc chọn
lọc tế bào nhận được vector với tế bào không nhận được.
7
Đặc điểm và yêu cầu của vector plasmid
• Plasmid là một phân tử ADN sợi đôi, dạng vòng kín, nhỏ có thể nhân
bản độc lập với nhiễm sắc thể trong tế bào.
• Yêu cầu
– Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp, thường là một hay
nhiều gen kháng kháng sinh.
– Có điểm khởi đầu sao chép (Ori) cho phép nhân bản plasmid trong
tế bào chất không phụ thuộc NST.
– Các plasmid được sử dụng hiện nay thường có điểm Ori có thể
kiểm soát được, ví dụ cho phép khuếch đại plasmid khi có mặt chất
ức chế tổng hợp protein (như chloramphenicol). Điều này giúp tăng
số bản sao của plasmid trong tế bào chủ và cho hiệu suất cao khi
chiết tách plasmid với độ tinh khiết khá tốt. Trình tự của Ori cũng
quyết định số bản sao của plasmid trong một tế bào.
– Có vùng tạo dòng (Multiple Cloning Site - MCS): là một trình tự
ADN ngắn, mang nhiều trình tự nhận diện duy nhất của các RE
khác nhau nằm liên tiếp (polylinker), cho phép cắt để mở vòng
plasmid và nối đoạn gen mong muốn vào.
8
Đặc điểm và yêu cầu của vector plasmid
• Ngoài ra, một số plasmid có thể mang yếu tố đánh dấu chèn để
nhận biết plasmid sau khi đưa vào tế bào đã được nối với gen ngoại
lai trong vùng tạo dòng hay chưa.
• Plasmid được đưa vào tế bào chủ bằng cách biến nạp
(transformation) hay thẩm điện (electroporation).
Video 1: Construction of a plasmid vector 9

Ví dụ một số plasmid
• pUC
– Là một dãy các plasmid có mang một
số đặc tính của vector M13 và pBR,
làm thuận lợi hơn cho thao tác. Kích
thước nhỏ (2,7 kb).
– Có gen kháng ampicillin, điểm Ori
của pBR322 và một phần gen lacZ
của E. coli. MCS (tương tự M13)
nằm trong đoạn lacZ nên có thể dùng
kỹ thuật bổ sung alpha để làm yếu tố
đánh dấu chèn.
– Cho số bản sao cao, và có thể được Nguồn: openclipart.org
khuếch đại bằng chloramphenicol.
10
• pBR322
– Plasmid dài 4363 bp (base pair - cặp
base), dùng để tạo dòng nhanh và
đơn giản các đoạn ADN.
– Có gen kháng tetracycline và
ampicillin.
– Hiệu suất tạo dòng thấp hơn các
vector sau này.
Nguồn: openclipart.org
11
• pGEM và pBluescript II
– Mang nhiều yếu tố thuận tiện cho
thao tác. Kích thước khá nhỏ (2,9
kb), cho số bản sao cao trong tế bào
E. coli thích hợp (SURE).
– MCS nằm giữa 2 promoter T7 và T3
cho phép phiên mã từ trình tự được
chèn vào.
Nguồn: openclipart.org
12
Đặc điểm của vector phage lambda
• Phage tiêu giải, nghĩa là sau khi xâm nhập tế bào
chủ, phage sẽ nhân bản ADN của mình và tạo các
virion, ly giải tế bào chủ rồi phóng thích phage.
• Nếu tế bào chủ được nuôi cấy trong môi trường bán
lỏng, pha nhiễm vào và nhân lên sẽ làm tế bào bị ly
giải tạo ra vùng ly giải (plaque) xung quanh vị trí của
phage ban đầu, khi đó muốn thu hoạch phage
người ta sẽ hút phần môi trường tại plaque.
Nguồn: wikibooks.org
13
Đặc điểm của vector phage lambda
• Vector:
– Cắt bỏ một phần bộ gen của phage không liên quan đến quá trình
tiêu giải và thay thế bằng đoạn ADN cần tạo dòng.
– Kích thước sau tái tổ hợp phải lớn hơn 78% (38 kb) và nhỏ hơn
102% (51 kb) so với dạng hoang dại (50 kb) thì mới đóng gói dễ
dàng thành phage được.
– Phải chú ý đến kích thước đoạn gen muốn chèn, nếu đoạn gen
mong muốn không đủ kích thước thì người ta sẽ nối thêm ADN
độn khác để đủ kích thước có thể đóng gói được.
• Ưu điểm trong xây dựng các thư viện tái tổ hợp.
– Đóng gói in vitro. Điều này rất có ý nghĩa vì khi đó chỉ cần một
lượng ít vector và ADN cần chèn. Đóng gói in vitro là cách đơn
giản nhất để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào E. coli chủ.
– Thư viện phage có thể dễ dàng phát hiện với mẫu dò, khuếch đại
và bảo quản trong một thời gian dài.
14
Nguyên tắc hoạt động của vector cosmid
• Đặc điểm cosmid
– Cosmid là một dạng lai giữa phage và
plasmid
– Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori của
plasmid,
– Vị trí tạo dòng
– Các trình tự của phage lambda mã hóa
cho vị trí cos.
Nguồn: Biology 335 - Molecular Genetics
15
Nguyên tắc hoạt động của vector cosmid
• Hoạt động:
– Cắt vector bằng RE tại vị trí tạo dòng và
trộn với đoạn gen muốn chèn (có chiều
dài từ 35 - 45 kb),
– Vector và đoạn chèn sẽ được nối lại
bằng ligase, tạo thành một sợi ADN
thẳng với đoạn chèn bị kẹp giữa 2 phần
của vector và tận cùng với các vị trí cos Nguồn: Biology 335 - Molecular Genetics
ở 2 đầu.
– Đóng gói in vitro nhờ nhận diện 2 vị trí
cos: Sợi ADN này khi ủ với các protein
vỏ sẽ tạo thành phage và được gây
nhiễm vào E. coli.
– Sau khi vào tế bào chủ, ADN tái tổ hợp
sẽ tạo thành vòng nhờ vị trí cos và hoạt
động như một plasmid.
16
Các ưu điểm của cosmid
• Tạo dòng các đoạn gen có kích
thước lớn đến 50 kb.
• Có thể đóng gói in vitro và đưa
gen vào tế bào bằng cách gây
nhiễm, do đó đơn giản, hiệu quả
và tiết kiệm ADN
• Trong tế bào hoạt động như
plasmid: dễ thao tác, duy trì
Nguồn: web-books.com
17
Cấu tạo và chức năng của RE (enzyme giới hạn)
• Cấu tạo
Enzym cắt hạn chế (restriction enzym - RE) là các endonuclease có
khả năng cắt ADN tại hay gần một trình tự nhận diện đặc hiệu.
• Chức năng
Cắt và thoái hóa các ADN ngoại lai (ví dụ ADN phage) giúp cho bộ
gen của vi khuẩn được ổn định.
• Danh pháp
– Dùng ba ký tự Latin (in nghiêng) trên cơ sở tên chi và loài (đôi khi
sử dụng thêm ký tự thứ tư để chỉ chủng (strain) hoặc plasmid)
– Một số La mã để chỉ thứ tự phát hiện ra enzym.
• Ví dụ: BamHI: là RE của Bacillus amyloliquefaciens chủng H, được
phát hiện đầu tiên.
18
Phân loại RE
• Phân loại RE: có 3 loại
– Loại I và III mang một phức hệ gồm cả 2 hoạt tính cắt giới hạn và
methyl hóa, loại này cần ATP để có năng lượng và nó cắt ADN tại
vị trí khá xa điểm nhận diện. Hai loại này ít được dùng trong các
thực hành sinh học phân tử.
– Loại II chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt
động và cắt ADN tại hoặc rất gần vị trí nhận diện. Loại II được sử
dụng nhiều trong thực tiễn sinh học phân tử và hiện người ta đã
biết khoảng 1000 RE loại này và có vài trăm loại đã được thương
mại hóa.
Video 2: Restriction Endonucleases 19

Vị trí nhận diện cắt của RE
• Vị trí nhận diện của đa số RE loại II thường chứa 4 - 6
nucleotid theo kiểu palindrome.
• Có 4 kiểu sắp xếp của trình tự nhận diện :
– palindrome (ví dụ BamHI, EcoRI);
– palindrome bị ngắt (HinfI, XmnI);
– trình tự bị thoái biến, thường có phần còn lại của palindrome
(EcoRII, HincII);
– không phải palindrome (MboII).
20
Vị trí nhận diện cắt của RE
• RE chỉ cắt ADN sợi đôi và tạo ra 2 đầu tận 5’ phosphate và 3’
hydroxyl. Đầu cắt có thể tà (tù) hoặc so le (còn gọi là đầu dính)
(Hình 9.2).
• Nếu trình tự nhận diện có phần nào tính đối xứng thì điểm cắt
thường nằm giữa nó và ở vị trí giống nhau cho mỗi sợi. Ngược lại
thì vị trí cắt cách khoảng so với nó.
-AATCAGCTGTTA- -TAAGGATCCAAA-
-TTAGTCGACAAT- -ATTCCTAGGTTT-
Cắt với HaeIII Cắt với BamHI
-AATCAG CTGTTA- -TAAG GATCCAAA-

-TTAGTC GACAAT- -ATTCCTAG GTTT-
Đầu tà (tù) Đầu so le (dính)
21
Đặc điểm RE loại II và các kiểu cắt của nó
• Chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt động và cắt
ADN tại hoặc rất gần vị trí nhận diện
• Trình tự nhận diện cắt gồm 4-8 nucleotid, thường có kiểu palindrome,
VD: GAATTC
• Kiểu cắt
– Đầu tù: cắt hai mạch tại cùng một điểm
– Đầu so le/dính: cắt mỗi mạch tại một điểm khác nhau
• Ứng dụng
– Cắt ADN trong kỹ thuật tái tổ hợp di truyền
– Phân tích đa hình cắt giới hạn  định danh, phân biệt
22
Phân loại polymerase
• Phân loại dựa trên sản phẩm và khuôn mẫu:
– ADN polymerase phụ thuộc ADN: enzym sao chép
– ARN polymerase phụ thuộc ADN: enzym phiên mã
– DNA Polymerase phụ thuộc ARN: reverse transcriptase
– Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu: primase
23
Các đặc tính chung của polymerase
• Là enzym tổng hợp acid nucleic từ các đơn vị nucleotid
• Đặc tính chung:
– Hoạt tính tổng hợp 5’- 3’: Hoạt tính kéo dài. Dùng dNTP để gắn
thêm 1 deoxynucleotid-5’-monophosphate vào đầu 3’ hydroxyl của
mồi và phóng thích pyrophosphate. Tùy theo enzym, phản ứng cần
có khuôn mẫu ADN, ARN, hay không.
– Hoạt tính exonuclease 3'- 5': chức năng “sửa lỗi”. Khả năng này đối
với mạch đơn mạnh hơn. Trên mạch kép nếu có đủ dNTP, hoạt tính
tổng hợp mạnh hơn. Hoạt tính này cũng mạnh lên khi tăng nhiệt độ.
– Hoạt tính exonuclease 5’- 3’: phân hủy đoạn mồi hay khuôn mẫu.
24
Các đặc tính chung của polymerase
• Đặc tính chung (tt)
– Hoạt tính ribonuclease H: Chỉ có ở một số polymerase, nó phân
hủy đặc hiệu ARN khi có sự hiện diện của phức lai ARN/ADN.
– Dịch chuyển sợi: Một số polymerase có khả năng chuyển sợi cũ
từ vai trò khuôn mẫu thành sợi mới đang được tổng hợp. Nếu
không có hoạt tính exonuclease 5’- 3’, sự dịch chuyển sợi sẽ tạo
ra sự tổng hợp chồng chéo trên cùng một khuôn mẫu. ADN sau
khi tách ra sẽ bị phân hủy bởi exonuclease 3'- 5'.
– Khả năng xử lý: Là giá trị chỉ khả năng của 1 phân tử
polymerase có thể tiếp tục tổng hợp trên sợi khuôn trước khi tách
ra và có thể bị thay thế bởi một polymerase khác.
– Tần suất lỗi: Khi sử dụng in vitro tần suất này thường cao hơn in
vivo và phụ thuộc vào điều kiện tiến hành. Bên cạnh đó nó cũng
tùy vào khả năng “sửa lỗi” và xử lý của polymerase.
25
Các hoạt tính của polymerase
ARN RNase H
ADN
Khía (nick)
A T C A G T C C A T C A
26
T A G T C A G G T A G T
Đặc điểm và ứng dụng của ADN polymerase I
• Là ADN polymerase phụ thuộc ADN
• Được phân lập từ E. coli, nhưng ngày nay đã được sản xuất từ chủng
vi khuẩn có khả năng siêu tổng hợp enzym này.
• Mục đích sử dụng:
– Chuyển khía (nick translation): ứng dụng trong đánh dấu acid nucleic
– Tổng hợp sợi thứ 2 của cADN
• Đặc tính
– Hoạt tính tổng hợp 5’- 3’: dùng đoạn mồi ADN hay ARN. Hoạt động
tốt trên khuôn mẫu ADN. Khả năng xử lý thấp và cần tối thiểu 1 mM
dNTP.
– Exonuclease 3'- 5': yếu hơn polymerase của T4 và T7.
– Exonuclease 5’- 3’
27
Đoạn Klenow
• Thu được nhờ tác động của enzym thủy phân protein trên polymerase I
của E. coli hoặc nhờ siêu tổng hợp ở dòng tái tổ hợp gen qui định
polymerase đã được biến đổi. Đoạn Klenow không có hoạt tính
exonuclease 5’- 3’. Gần đây với công nghệ di truyền đã tạo được dòng
sản xuất đoạn Klenow không có hoạt tính exonuclease (exo- Klenow
enzym; Stratagene).
• Sử dụng
– Làm tà đầu 3’bị hụt (đầu dính)
– Loại bỏ đầu 3’ nhô ra.
– Đánh dấu đầu 3’ của ADN sợi đôi, đặc biệt đối với đầu 3’ bị hụt.
– Tổng hợp sợi thứ 2 của cADN, có ưu điểm hơn polymerase I vì
không có hoạt tính exonuclease 5’- 3’.
– Đánh dấu bằng kỹ thuật mồi ngẫu nhiên.
– Giải trình tự ADN bằng phương pháp dideoxy.
– Tổng hợp ADN từ ADN sợi đơn với mồi đặc hiệu. 28
Ligase - ứng dụng
• Là enzym xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiester giữa 3’-OH và
5’-P của hai sợi acid nucleic
• ADN ligase hoạt động trên ADN sợi đôi. ARN ligase hoạt động trên
ARN hoặc ADN sợi đơn
• ADN ligase của E. coli cần NAD để có năng lượng và có thể dùng sửa
chữa chổ bị cắt khía hay nối các đầu dính
• ADN ligase của T4 cần ATP để hoạt động và có thể dùng để sửa chổ
cắt khía, nối đầu dính và cả đầu tù
• ARN ligase của T4 có thể xúc tác nối ARN  đánh dấu đầu 3’ của
ARN / sản xuất đoạn dò
29
Phản ứng nối của ligase
A T C A G T C C A T C A
T A G T C A G G T A G T
30
Chiết tách vật liệu di truyền
• Nguyên tắc chung: 3 bước
– Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học
– Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform
– Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối
• Các trường hợp cụ thể:
– Plasmid: mục tiêu loại NST bằng sự khác nhau về cấu dạng - kích thước
– ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid
– Tế bào Thực vật: phá tế bào bằng cách nghiền
– Tế bào Động vật: phá tế bào bằng enzym - chất tẩy
– ARN: bất hoạt RNase, tủa bằng LiCl 8M, loại ADN bằng DNase
– Tủa lượng ADN nhỏ: độn bằng tARN
– Tủa bằng isopropanol, tert-butanol,…
• Các kỹ thuật khác
– Loại carbohydrat, lipid bằng CTAB
– Thu hồi ADN bằng sắc ký hấp phụ
31
Phương pháp chiết tách plasmid
• Yêu cầu không lẫn ADN nhiễm sắc thể.

• Dựa trên một vài khác biệt về vật lý giữa ADN plasmid và
ADN nhiễm sắc thể, mà chủ yếu là về kích thước và cấu dạng
(conformation).
32
Phương pháp chiết tách plasmid
• Tách dựa trên kích thước
– Phá vỡ tế bào trong điều kiện được kiểm soát chặt chẽ và êm
dịu,
– ADN nhiễm sắc thể không bị đứt đoạn nên có kích thước rất lớn
và thường gắn với màng tế bào → loại bỏ bằng cách ly tâm.
• Tách dựa trên cấu dạng - phương pháp thủy giải kiềm
– Tế bào bị phá vỡ với tác nhân tẩy ion hóa như SDS, khi đó các
ADN lớn như nhiễm sắc thể bị đứt đoạn.
– pH dung dịch được nâng lên 12 - 12,5 bằng NaOH làm cho các
ADN thẳng bị tách thành sợi đơn,
– ADN plasmid ở dạng supercoil (siêu xoắn) nên không bị tác động.
– Khi thêm acid để làm hạ pH, ADN sợi đơn lại tái hợp, nhưng vì
sợi quá dài nên kết hợp không chính xác tạo nên bó rối dày đặc,
không tan và có thể dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm.
– Phương pháp này còn thuận lợi hơn vì trong điều kiện ly giải như
vậy, hầu hết protein và ARN cũng trở thành không tan và bị loại
bỏ. 33
Tinh chế acid nucleic
• Ly tâm phân đoạn: dung dịch acid nucleic được siêu ly tâm trong
thang tỷ trọng đường saccarose hay CsCl2 khi đó các phân tử khác
nhau sẽ tách theo tỷ trọng (tỷ lệ với kích thước phân tử). Cách này
được áp dụng khi lượng acid nucleic cần tinh chế lớn.
• Điện di gel và sắc ký lọc gel: tách acid nucleic theo kích thước phân
tử ở qui mô nhỏ (điện di) hay lớn (lọc gel). Điện di với gel
polyacrylamid (PAGE) có thể tinh chế các acid nucleic với khác biệt 1
nucleotid.
• HPLC: được áp dụng chủ yếu đối với các oligonucleotid do độ phân
giải lên đến 1 nucleotid.
• Sắc ký hấp phụ: ARNm thường tận cùng bằng polyA, do đó được
hấp phụ bằng resin có gắn oligo dT hay dU.
34
Định tính - định lượng acid nucleic
• Quang phổ kế: OD260nm

– Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh của base purin và pirimidin ở
bước 260 nm
– 1 đơn vị OD260nm tương đương nồng độ:
• 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi
• 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn
• 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base)
– Kiểm tra độ tinh khiết bằng tỷ lệ OD260/230 hoặc OD260/280 và OD320nm
• Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện trong gel
– Định tính theo kích thước khi so với chuẩn
– Định lượng bằng so sánh với chuẩn
35
Điện di gel
36
Nguồn: theblaze.com
Lai acid nucleic (lai phân tử)
• Hai phân tử acid nucleic sợi đơn trong điều kiện thích hợp có thể bắt
cặp bổ sung với nhau bằng các liên kết hydro để tạo thành phân tử
sợi đôi, quá trình này gọi là lai hóa acid nucleic (hybridization).
• Phân tử sợi đôi thu được gọi là phân tử lai (hybrid) hay duplex.
• Quá trình ngược lại khi duplex tách ra thành các sợi đơn được gọi là
sự biến tính (denaturation).
• Phản ứng lai được xem là đặc hiệu khi sự bắt cặp bổ sung hoàn toàn
của một phân tử với phân tử còn lại diễn ra trên một vùng liên tục giữa
hai mạch, ngược lại khi có các điểm không bắt cặp tồn tại giữa phân
tử lai hoặc một phân tử chỉ bắt cặp một phần với phân tử kia thì sự lai
hóa được xem là không đặc hiệu hay không hoàn toàn.
G-T-A-G-T-C-C Lai hóa G-T-A-G-T-C-C

+
T-C-A-G-G-T Biến tính T-C-A-G-G-T
37
Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng
• Do bản chất của phản ứng lai là sự hình thành các liên kết hydro nên
cân bằng phản ứng, độ đặc hiệu và độ bền của duplex phụ thuộc vào
các yếu tố sau:
– Nhiệt độ: là yếu tố quyết định độ bền của liên kết hydro
– Độ dài các các trình tự lai: độ dài càng lớn duplex càng bền và thời gian phản ứng
càng lâu.
– Tỷ lệ GC trong duplex: tỷ lệ GC càng cao duplex càng bền
– Nồng độ ion: ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydro
– Nồng độ các phân tử và thời gian phản ứng
• Nhiệt độ chảy (melting temperature, Tm): là nhiệt độ ở đó có 50% số
duplex được hình thành. Nhiệt độ này phụ thuộc chiều dài và tỷ lệ GC
của duplex, ngoài ra nồng độ ion cũng có ảnh hưởng lớn, do đó cách
tính Tm khá phức tạp. Phản ứng lai sẽ diễn ra ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm
của duplex, ngược lại ở nhiệt độ lớn hơn Tm, sự biến tính của duplex
sẽ chiếm ưu thế.
– Tm = 4(GC) + 2(AT)
38
Các kỹ thuật lai acid nucleic và ứng dụng
• Trong ứng dụng, phản ứng lai diễn ra giữa một phân tử đích (phân
tử cần được phát hiện) và một đoạn dò (probe).
• Đoạn dò là phân tử oligonucleotid được đánh dấu bằng phóng xạ,
huỳnh quang, enzym hay các kỹ thuật đánh dấu khác
• Kỹ thuật
– Lai trên màng rắn: kỹ thuật blot, trong đó màng nitrocellulose thường được sử
dụng. Các biến thể của lai trên màng:
• Southern blot
• Northern blot
• Dot blot
– Lai tại chỗ
– Lai trong dung dịch: Kỹ thuật này chủ yếu áp dụng trong chẩn đoán phát hiện
dựa trên acid nucleic.
• Trong sinh học phân tử, kỹ thuật lai được ứng dụng để phát hiện sự
tồn tại của acid nucleic đích, nghiên cứu sự biểu hiện gen. Trong y
học nó được ứng dụng trong chẩn đoán phát hiện bệnh dựa trên
acid nucleic và nghiên cứu bệnh học.
39
Phân biệt Southern blot, Northern blot và dot blot
• Southern blot: lai được thực hiện với ADN sau khi đã được điện di
trong gel rồi được chuyển và cố định trên màng.
• Northern blot: lai được thực hiện với ARN sau khi đã được điện di
trong gel rồi được chuyển và cố định trên màng.
• Dot blot: lai được thực hiện với hỗn hợp acid nucleic đích được chấm
trực tiếp lên màng.
Nguồn: genhunter.com
40
Southern blot
Video 3: Southern Blot 41

Nguyên tắc Kỹ thuật PCR: sao chép ADN in vitro
• Khuôn ADN sợi đơn được gắn mồi nhờ lai hóa đặc hiệu
• Trong điều kiện có sẵn nucleotid, ADN polymerase sẽ kéo dài mồi
theo nguyên tắc bổ sung với khuôn ADN sợi đơn nếu đầu 3’-OH của
mồi còn trống tạo thành sản phẩm sợi đôi
• Phản ứng được quay vòng nhờ mồi thừa và sử dụng nhiệt độ cao để
tái tạo khuôn ADN sợi đơn từ sản phẩm sợi đôi
5’-P 3’-OH
3’-HO 5’-P
nucleotid
Polymerase
5’-P 3’-OH
3’-OH 5’-P
42
PCR
ADN đích
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
Video 4: Polymerase Chain Reaction
ADN đích biến tính
5’ 3’
3’ 3’
Gắn mồi
3’ 3’
Đoạn Đoạn
đích Kéo dài đích
q u a y q u a y
ạ ạ
Biến tính
l i l i
Gắn mồi
Kéo dài
Biến tính và gắn mồi
Kéo dài 43
Tiếp tục biến tính, gắn mồi và kéo dài trong 20-40 chu kỳ
PCR - Các yếu tố kỹ thuật
• Chương trình PCR
– Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút
– Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần
• Biến tính: 94-95oC trong 30 giây đến vài phút
• Gắn mồi: 40-70oC (< Tm của mồi) trong 30 - 60 giây
• Kéo dài: được thực hiện ở nhiệt độ gần với nhiệt độ tối thích của
enzym (thường là 65-74oC đối với enzym polymerase chịu nhiệt),
thời gian tùy theo độ dài khuôn (thường 1 phút cho mỗi kb)
– Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài
44
PCR - Các yếu tố kỹ thuật
• Thành phần phản ứng: 20-100 µl
– Khuôn mẫu: 1 pg - 1 μg, nồng độ cao sẽ ức chế phản ứng.
– Mồi: 0,1 - 1 μM, nồng độ quá cao sẽ dẫn đến bắt cặp sai và làm
giảm tính đặc hiệu.
– Đệm: cung cấp pH thích hợp cho phản ứng và có nồng độ Mg2+
thay đổi (cần tối ưu hóa), thường trong khoảng 0,5-5 mM.
– Hỗn hợp các dNTP: A, T, G và C, nồng độ 200-250 μM
– ADN polymerase chịu nhiệt: 0,5 - 2,5 đơn vị cho mỗi phản ứng
– Nước vừa đủ.
45
Ứng dụng PCR
• Tạo đoạn ADN mong muốn
• Giải trình tự
• Gây đột biến
• Chẩn đoán, Phát hiện và định danh sinh vật
• Xác định quan hệ di truyền
• Nhận dạng tội phạm,…
46
Tạo dòng gen
• Tạo ra dòng tế bào mới mang đoạn gen cần nghiên cứu
• Mục đích:
– Cô lập đoạn gen cần nghiên cứu ra khỏi tập hợp gen chung để có
thể nghiên cứu chức năng và thực hiện các thao tác biến đổi
– Sản xuất lượng lớn gen đích
Đoạn gen
đích Vector mang
gen đích Nuôi cấy
Tạo dòng
Nghiên cứu Chiết tách

chức năng
Dòng tế bào
mang gen đích
Đưa trở lại Thực hiện

tế bào biến đổi 47
Tại sao cần tạo dòng gen
• Để cô lập đoạn gen ở dạng tinh khiết, với số lượng lớn và nghiên cứu
cấu trúc, chức năng của nó ta cần đưa đoạn gen đó vào một tế bào
chủ sao cho nó có thể nhân bản được - nghĩa là tạo dòng gen.
• Bằng kỹ thuật tạo dòng gen, hiện nay người ta đã xây dựng các thư
viện hay ngân hàng gen của nhiều loại sinh vật - với thành tựu nổi bật
nhất là giải mã bộ gen người trong dự án Giải mã Bộ gen người
(Human Genome Project) - trong đó mỗi gen nằm trong một dòng tế
bào chủ.
48
Các bước tạo dòng gen
• Bốn bước cơ bản:
– Tạo đoạn ADN,
– Nối đoạn ADN cần tạo dòng vào vector
để tạo phân tử tái tổ hợp,
– Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ
– Chọn lọc dòng tái tổ hợp.
Video 5: Steps in Cloning a Gene 49

Cách tạo đoạn gen mong muốn để tạo dòng
• Kỹ thuật PCR
– Nếu cấu trúc đoạn gen đã được biết
– Thông thường đoạn ADN thu được bằng PCR có các đầu bị so le
(lệch) không xác định về trình tự.
– Làm tà đầu sản phẩm PCR, gắn linker hoặc adaptor
– Thiết kế mồi có chứa trình tự nhận diện cắt của RE
• Dùng RE
– Cắt phân tử ADN lớn (vd: ADN nhiễm sắc thể) thành các đoạn nhỏ
bằng RE. Điều này thường được sử dụng khi xây dựng các thư viện
gen (genomic library).
– Sử dụng 2 loại RE khác nhau để các đoạn tạo ra có kích thước vừa
phải cho việc tạo dòng. Đồng thời với việc cắt bằng 2 RE khác nhau
ta có thể phân tích các đoạn thu được và lập bản đồ các vị trí cắt của
bộ gen.
– RE được chọn để cắt cần lưu ý vị trí cắt sẽ tạo ra đầu tù (blunt end)
hay đầu dính (sticky end)
50
Phản ứng nối ADN
• Dùng liagse của T4 (được tinh chế từ E. coli bị nhiễm phage T4).
• Ủ vector đã duỗi thẳng và đoạn ADN với ligase trong điều kiện thích
hợp, phản ứng diễn ra tạo liên kết phosphodiester và nối các ADN lại.
• Trong trường hợp tạo dòng, ADN tái tổ hợp phải được nối hoàn chỉnh
với các yếu tố của vector để sẵn sàng được đưa vào và hoạt động
trong tế bào.
51
Các giải pháp hỗ trợ việc nối ADN đầu tù
• Linker (đoạn nối)
– Oligonucleotid sợi đôi tổng hợp ngắn có đầu tà và chứa trình tự cắt (đầu
dính) của một RE.
– Ligase sẽ nối linker với đoạn ADN có đầu tù,
– Sau đó dùng RE cắt linker để tạo ra đầu dính.
• Adaptor
– Nhược điểm linker → Adaptor - đây là một oligonucleotid sợi đôi tổng
hợp có sẵn một đầu dính
– Ligase sẽ nối adaptor với đoạn ADN có đầu tù và tạo thành đoạn mới có
đầu dính.
– Phía 5’ của đầu dính trên adaptor bị thay nhóm phosphate bằng nhóm
hydroxyl để tránh các adpator tự nối với nhau. Do đó sau khi nối adpator
xong ta phải dùng polynucleotid kinase để trả lại nhóm phosphate.
• Tạo đuôi homopolymer
– Sử dụng enzym doxynucleotidyl transferase để thêm một loạt các
nucleotid (cùng loại) vào đầu 3’-OH của sợi ADN tạo thành đuôi
homopolymer.
– Trên vector đã duỗi thẳng cũng thực hiện như vậy nhưng với nucleotid
bổ sung với các nucleotid trên sợi ADN. Kết quả cũng sẽ tạo ra 2 đầu
dính dễ dàng nối với nhau bằng ligase. 52
Các giải pháp hỗ trợ việc nối ADN đầu tù
Cắt
Linker
Adaptor
Homopolymer TTTTTT
AAAAAA
Trên đoạn chèn Trên vector
53
Nguyên tắc các phương pháp đưa gen vào tế bào
• Biến nạp: dựa vào khả năng đánh bắt ADN của một số vi khuẩn
• Thẩm điện: dùng điện thế cao làm thủng màng tế bào để ADN lọt qua
• Tải nạp: sử dụng thực khuẩn để gây nhiễm tế bào đích
• Chuyển nhiễm: dựa trên khả năng đắt bắt phức của ADN với một số
chất trong chuyển nhiễm, áp dụng chủ yếu cho tế bào động vật
• Đạn sinh học: gắn ADN vào hạt mang và bắn xuyên qua màng tế
bào.
54
Biến nạp để đưa gen vào tế bào
• Chuẩn bị tế bào khả nạp:
– Xử lý với CaCl2 (thường sử dụng nồng độ 50 - 100 mM). Tại thời
điểm sau khi xử lý, ADN chỉ dính ở mặt ngoài tế bào chứ chưa vào
trong.
– Tế bào khả nạp phải được bảo quản lạnh và khi sử dụng để ở nhiệt
độ thấp (4oC).
• Đưa ADN vào tế bào chất:
– Gây sốc tế bào để việc đánh bắt ADN diễn ra.
– Sốc nhiệt: môi trường tế bào được nâng nhiệt độ lên 42oC trong thời
gian ngắn (khoảng 2 phút) rồi làm lạnh nhanh.
55
Phương pháp chuyển nhiễm để đưa gen vào tế bào
• Chuyển nhiễm nhờ phosphate calci:
– Đây là một phương pháp tương đối đơn giản để đưa plasmid tái tổ
hợp vào tế bào động vật có vú. Bằng phương pháp này có thể đưa
cùng lúc 2 plasmid (co-transfection) vào tế bào.
– ADN được trộn trong kết tủa của phosphate calci và được tế bào
đánh bắt bằng cơ chế không rõ. Khi thực hiện phương pháp này
cần lưu ý độc tính với tế bào của kết tủa.
– Có thể sử dụng sốc glycerol (15%) để gia tăng khả năng đánh bắt
ADN nếu tế bào chịu đựng được.
• Chuyển nhiễm qua trong gian DEAE dextran:
– Phương pháp này thích hợp cho việc tạo dòng không bền
(transient transfection) hơn. Tế bào được treo trong
Dietylaminoetyl (DEAE) dextran (phân tử lượng 500.000).
– Thời gian được xác định thực nghiệm tùy theo loại tế bào và có
ảnh hưởng lớn đến hiệu quả.
56
Phương pháp chuyển nhiễm để đưa gen vào tế bào
• Qua trung gian liposom:
– Phương pháp này nhanh, đơn giản và hiệu quả, có thể chuyển
đồng thời 2 plasmid vào tế bào với tần suất cao.
– Liposom được điều chế từ các chất béo cation như: N-(1-[2,3-
dioleyloxy]propyl-N,N,N-trimetylamonium cholrid (DOTMA) và
dioleoyl phosphotidyl etanolamin (DOPE) (tỷ lệ 1:1).
– Các lipid này được cho tiếp xúc với ADN để tạo thành một phức
hợp có thể được đánh bắt bởi tế bào.
– Cần lưu ý ADN dùng cho phương pháp này phải thật tinh khiết thì
hiệu quả mới cao. Và phải sử dụng vật chứa bằng polystyren
thay vì polypropylen do liposom sẽ tạo phức không ổn định với
chất sau.
• Sử dụng Lipofectamine:
– Tác nhân này là một dạng cationic lipid được điều chế thích hợp,
được sử dụng nhiều trong thời gian gần đây vì cho hiệu quả
chuyển nhiễm cao với nhiều loại tế bào và cách sử dụng rất đơn
giản, chỉ cần trộn với ADN để tạo phức và cho vào môi trường
nuôi cấy tế bào.
– Tác nhân này đặc biệt hiệu quả khi cần chuyển nhiễm ARNi vào 57
tế bào
Kỹ thuật bổ sung alpha
• Dựa trên sự hiện diện của hoạt tính β-galactosidase
(chịu trách nhiệm thủy phân lactose thành
galactose). Enzym này là một tetramer, trong đó mỗi
monomer có 2 mảnh (alpha và omega).
• Bộ gen của tế bào chủ bị đột biến mất hoặc bất hoạt
phần mã hóa cho mảnh alpha, do đó chỉ sản xuất
được mảnh omega của enzym, không đủ để có hoạt
tính (kiểu hình lac-, không thủy phân được lactose).
• Trong khi đó, vector lại mang trình tự mã hóa cho Nguồn: Wikipedia
đoạn alpha và vị trí chèn gen ngoại lai sẽ nằm trong

trình tự này.
• Do đó nếu tế bào nhận vector mang chưa tái tổ hợp
thì sẽ được bổ sung mảnh alpha và có kiểu hình
lac+, ngược lại nếu vector bị tái tổ hợp với gen lạ
trong trình tự mã hóa mảnh alpha thì mảnh alpha sẽ
bị bất hoạt và tế bào sẽ có kiểu hình lac-. 58
Các phương pháp chọn lọc dòng tái tổ hợp
• Chọn lọc trực tiếp
Đây là cách tốt nhất nhưng khó thực hiện trên thực tế. Trong phương
pháp này, đoạn chèn sẽ mang đến cho tế bào nhận được nó các đặc
điểm kiểu hình mà các dòng khác không có và ta dễ dàng nhận ra
khi phân lập. Ví dụ đoạn chèn mang gen mã hóa sắc tố hay enzym.
• Lai khóm (colony hybridization)
Áp dụng cho trường hợp đoạn chèn đã biết trình tự. Các khóm sau
khi phân lập được in dấu lên màng nitrocellulose hay nylon, tế bào
trên màng bị phá huỷ để bộ lộ vật liệu di truyền. Màng lọc lúc này
được cho lai với đoạn dò được đánh dấu tương ứng của đoạn chèn.
Nếu khóm nào mang đoạn chèn sẽ có tín hiệu, từ vị trí tín hiệu trên
màng lọc suy ra khóm tương ứng trên hộp thạch ban đầu.
59
Phương pháp giải trình tự Sanger
• Phương pháp enzym/dideoxy: dựa vào sự ngừng
tổng hợp ADN khi gặp phải dideoxy nucleotid
(Frederick Sanger)
• Qui trình:
– Thực hiện 4 phản ứng PCR riêng biệt với 1 mồi:
1.A: có dNTP + ddATP
2.T: có dNTP + ddTTP
3.G: có dNTP + ddGTP
4.C: có dNTP + ddCTP
– Mỗi ống sản phẩm được nạp vào một giếng điện di
– Kết quả điện di được đọc  trình tự
Video 6: Sanger Sequencing
60
Đọc kết quả Phương pháp Sanger
Trình tự cần giải:
5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’
5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’
Sản phẩm của các phản ứng:
Phản ứng với ddC (G): số nu Phản ứng với ddG (C): số nu
ddG ddA ddT ddC
5’-C 1 5’-CCG 3
5’-CCGG 4
3’
5’-CC 2
5’-CCGGC 5 5’-CCGGCG 6
5’-CCGGCGC 7 5’-CCGGCGCAG 9
5’-CCGGCGCAGAAG 12
5’-CCGGCGCAGAAGC 13
5’-CCGGCGCAGAAGCG 14
5’-CCGGCGCAGAAGCGGC 16 5’-CCGGCGCAGAAGCGG 15
5’-CCGGCGCAGAAGCGGCATC 19
Phản ứng với ddA (T): số nu
Phản ứng với ddT (A): số nu 5’-CCGGCGCA 8
5’-CCGGCGCAGAAGCGGCAT 18 5’-CCGGCGCAGA 10
5’-CCGGCGCAGAA 11
5’-CCGGCGCAGAAGCGGCA 17
Kết quả điện di các phản ứng:
Số nu G A T C
19
3’
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
5’
4
3
2
61 5’
1
Kỹ thuật tự động mới nhất (Harold Swerdlow)
• Các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau
• Thực hiện một phản ứng PCR duy nhất với sự hiện diện của các dNTP
và ddNTP
• Sử dụng điện di mao quản để tách sản phẩm
• Đọc kết quả bằng đầu dò laser
62
Nguồn: Wikipedia
Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert
• Phương pháp hóa học: dựa vào sự thủy giải đặc trưng của
ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert)
• Qui trình:
– Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự
– Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu
– Thực hiện 4 (hoặc 5) ống phản ứng riêng biệt:
1. G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa
2. AG: + formic acid  Adenin và Guanine bị methyl hóa
3. TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin và Cytosin
4. C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin
– Xử lý 4 ống trên với piperidine 1M/90oC để cắt ADN ở liên kết
phosphat kế nucleotid bị biến đổi
5. A>C: NaOH 1,2N/90oC cắt ADN ở Adenin > Cytosin
– Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di
– Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự 63
Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert
Trình tự cần giải:
5’-?TTGACTTAGCCN-3’
Sản phẩm cắt sau khi xử lý:
Phản ứng G số nu Phản ứng AG số nu
32 32
P-TTG 3 P-TTG 3
32 32
P-TTGACTTAG 9 P-TTGA 4
32
Phản ứng TC số nu
P-TTGACTTA 8
32
P-TTGACTTAG 9
32
P-T 1
32
P-TT 2 Phản ứng C số nu
32
P-TTGAC 5 32
P-TTGAC 5
32
P-TTGACT 6 32
P-TTGACTTAGC 10
32
P-TTGACTT 7 32
P-TTGACTTAGCC 11
32
P-TTGACTTAGC 10
32
P-TTGACTTAGCC 11
Kết quả tự xạ ký và đọc trình tự:

G A/G T/C C
64
CHIẾT TÁCH ADN PLASMID pBLUESCRIPT
TỪ VI KHUẨN E. COLI
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MẪU NHỎ
BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH

MÔN HỌC: THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ
NGUYÊN TẮC
• Phương pháp mẫu nhỏ áp dụng để chiết ADN plasmid từ
thể tích dịch nuôi cấy 1-2 ml
• Kích thước của ADN plasmid nhỏ hơn nhiều so với ADN bộ
gen
–Dưới tác động của SDS-kiềm thì các ADN bị biến tính và duỗi thẳng
–Khi thêm KOAc thì ADN plasmid hồi phục được cấu dạng nhưng ADN
nhiễm sắc thể thì không
NGUYÊN VẬT LIỆU
• Vi khuẩn E. coli mang plasmid pBluescript kháng ampicillin

• Môi trường nuôi cấy: Môi trường LB lỏng (Luria Bertani
Broth) chứa ampicillin 50 µg/ml
• Hóa chất:
– Dung dịch đệm GTE (Lysis solution I)
– Dung dịch SDS- Kiềm: SDS 1% - NaOH 0,2 M (Lysis solution II). Pha dùng
trong ngày
– Dung dịch KOAc 5 M, pH 4,8 (Lysis solution III)
• Ethanol tuyệt đối, Ethanol 70%
• RNAase 10 mg/ml
• Đệm TE0,1
THIẾT BỊ
Eppendorf Máy nuôi cấy lắc Máy Vortex Máy ly tâm mini
Micropipette 10 – 100 µl
Micropipette 100 – 1000 µl
NHẤP VÀO TỪNG THIẾT BỊ ĐỂ XEM HƯỚNG DẪN

CHUẨN BỊ VI KHUẨN
• Chuẩn bị 1 ống 5 ml MT LB lỏng chứa ampicillin 50 µg/ml

• Cấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ E. coli mang plasmid pBluescript
vào ống môi trường trên, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC.
LY TÂM THU TẾ BÀO
- Ly tâm huyền trọc vi khuẩn E.coli thu được sau khi nuôi cấy qua đêm
- Hút bỏ phần nước nổi ở trên để thu tế bào.
PHÂN TÁN CẮN VÀO ĐỆM GTE
- Phân tán cắn vi khuẩn vào đệm GTE (Lysis solution 1)

- Vortex mạnh và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
PHÁ VỠ TẾ BÀO - BIẾN TÍNH ADN VÀ CÁC TẠP
- Thêm dung dịch SDS kiềm (Lysis solution 2)

- Trộn nhẹ bằng cách úp ngửa Eppendorf nhiều lần
- Ủ trong đá
TRUNG HÒA pH VÀ KHÔI PHỤC PLASMID
- Thêm dung dịch KOAc 5 M (Lysis solution III)

- Trộn nhẹ nhàng bằng cách úp ngửa
- Ủ trong đá
LY TÂM LOẠI BỎ TẠP – THU DỊCH CHỨA PLASMID
- Ly tâm để lắng các mảnh vỡ của vi khuẩn.

- Chuyển phần nước nổi sang một Eppendorf mới, cẩn thận không làm
tróc cắn.
TINH CHẾ ADN PLASMID
- Thêm ethanol 70%, trộn đều bằng cách úp ngửa

- Ly tâm, hút bỏ ethanol, thu cắn plasmid
TINH CHẾ ADN PLASMID – LOẠI TẠP CATION
- Thêm ethanol 70%, vortex

- Ly tâm, hút bỏ ethanol, thu cắn plasmid
- Để khô cắn trong không khí
HÒA TAN ADN PLASMID
- Hòa tan cắn ADN plasmid bằng đệm TE (có thể có RNAse)
- Vortex nhẹ, bảo quản ở -20oC
- Xác định kích thước ADN plasmid cách điện di sử dụng marker phù
hợp
THÀNH PHẦN CÁC HÓA CHẤT SỬ DỤNG
• Dung dịch đệm GTE: Glucose – Tris – EDTA

Tris base 3g
Glucose 9g
EDTA 3,72 g
Hòa tan trong 800 ml dH2O điều chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl. Thêm
nước đến 1000 ml, chia thành các phần nhỏ (100 ml) và hấp hoặc
lọc tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
• Dung dịch SDS- Kiềm
SDS 1% - NaOH 0,2 M. Pha ngay trước khi dùng từ SDS 10% (kl/tt)
và NaOH 1M: trong 5 ml dH2O thêm 2 ml NaOH 1 M rồi thêm 1 ml
SDS 10% trộn đều, thêm nước vừa đủ 10 ml.
• Dung dịch KOAc 5 M, pH 4,8
Lấy 29,5 ml acid acetic băng, thêm KOH đậm đặc để chỉnh pH đến
4,8. Thêm nước vừa đủ 100 ml. Không hấp tiệt trùng. Bảo quản ở
nhiệt độ phòng
• RNAase 10 mg/ml
Hòa tan 10 mg/ml RNAse trong TE hoặc GTE, đun sôi 10 phút để
phá hủy DNAse. Chia thành các phần nhỏ và bảo quản ở -20oC.
Lượng sử dụng để chiết tách ADN là 50 µl RNAse/ml GTE
• Đệm TE0,1
10 mM Tris-Cl, pH 7,4 và 0,1 mM EDTA. Phối hợp 0,5 ml Tri-Cl 2 M,
pH 7,4 và 20 µl EDTA 0,5 M, pH 8, thêm 99,48 ml nước. Tiệt trùng
bằng lò hấp, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

NGUYÊN TẮC
• ADN tích điện tích âm, khi được đặt trong dòng điện một chiều sẽ di
chuyển từ cực âm sang cực dương.
• Nếu ADN được đặt vào một mạng lưới gel (như gel agarose), tốc độ
di chuyển về cực dương của ADN sẽ phụ thuộc vào kích thước và
cấu dạng của đoạn ADN đó.
• Các đoạn ADN kích thước và cấu dạng khác nhau sẽ được phân
tách ra khỏi nhau sau một thời gian di chuyển.
• Để phát hiện ADN, người ta dùng thuốc nhuộm phát huỳnh quang
dưới tia UV là EtBr hoặc Safeview™. Các thuốc nhuộm này chèn vào
chuỗi ADN một cách không thuận nghịch, do đó cần lưu ý cẩn thận
khi thao tác vì dễ gây ung thư.
• Cần lựa chọn thông số: nồng độ gel agarose, hiệu điện thế, thời gian
chạy… thích hợp để phân tách các đoạn ADN một cách hiệu quả.
NGUYÊN VẬT LIỆU
• Các mẫu ADN cần phân tích
• Thang ADN chuẩn thích hợp
• Đệm tải 6X
• Đệm TAE 50X
• Nước cất
• Agarose tinh khiết
• Thuốc nhuộm EtBr hoặc Safeview™
THIẾT BỊ
UV BOX
Micropipet
Găng tay Hệ thống điện di
NHẤP VÀO CÁC THIẾT BỊ ĐỂ XEM HƯỚNG DẪN

CHUẨN BỊ DUNG DỊCH ĐỆM TAE 1X
- Pha dung dịch đệm TAE 1X từ dung dịch đệm TAE 50X
CHUẨN BỊ AGAROSE
- Cân 2g agarose (để chuẩn bị gel agarose 2%)

- Phân tán vào 100 ml đệm TAE 1X ở bước trước
- Đun nóng cho agarose tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 50oC
- Thêm thuốc nhuộm 0,5 µl EtBr hoặc Safe view, lắc đều tránh bọt
LẮP KHUÔN – ĐỔ GEL
- Lắp khuôn gel

- Đổ gel agarose còn nóng ở trên vào khuôn gel
- Đặt lược, để cho thạch nguội và đông đặc hoàn toàn
- Gỡ lược nhẹ nhàng, nhấc gel ra khỏi khuôn.
- Đặt vào bể điện di sao cho các giếng nằm về phía cực âm.
- Thêm đệm TAE 1X cho ngập mặt gel.
CHUẨN BỊ ĐỆM TẢI
- Chuẩn bị một miếng parafilm

- Hút sẵn 6 mẫu đệm tải 6X, mỗi mẫu 4 µl lên trên miếng parafilm.
NẠP THANG ADN CHUẨN (MAKER/LADDER)
- Hút 20 µl marker thích hợp

- Trộn đều với một mẫu đệm tải trên giấy parafilm bằng cách
dùng pipet hút lên- nhả xuống nhẹ nhàng
- Nạp hỗn hợp này vào một giếng trên gel
NẠP MẪU ADN
- Hút 20 µl mẫu ADN cần phân tích, trộn đều với đệm tải ở trên
bằng pipet
- Nạp mẫu vào giếng nhẹ nhàng, tránh để mẫu trào ra ngoài
- Lần lượt nạp hết các mẫu ADN vào các giếng
CHẠY ĐIỆN DI
- Đậy nắp bảo vệ, kết nối điện cực của bể điện di với nguồn phát sao
cho đúng chiều
- Bật nguồn, đặt hiệu điện thế 100 V, lúc này bạn sẽ thấy bọt khí nổi
lên nhiều ở cực âm (cực dương ít)
- Khi thấy thuốc nhuộm đi hơn 3/4 chiều dài gel, ngắt điện, lấy gel ra
ĐỌC KẾT QUẢ
- Mở UV box ra, đặt bản gel vào, đậy nắp.

- Bật nguồn phát UV ở bước sóng 254 nm
- Các băng ADN sẽ phát huỳnh quang màu cam (với thuốc nhuộm
EtBr)
- So sánh vị trí băng của marker với mẫu để xác định kích thước
ADN tương đối
• Đệm TAE 50X

Tris Base 242 g, acid acetic băng 55,1 ml; Na2EDTA 37,2 g; nước
cất vđ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
• Đệm tải 6X
Chứa dH2O 10 ml, bromophenol blue 25 mg, glycerol 3 ml.
ĐỘT BIẾN GEN
Mục tiêu
• Trình bày được nguyên nhân và hậu quả của đột biến
• Nêu được cách tế bào sửa chữa ADN hư hỏng để tránh

đột biến.
• Nhận diện được một số bệnh di truyền ở người do đột

biến gây ra.
• Mô tả được các phương pháp chọn lọc đột biến ở vi sinh

vật
Khái niệm
• Đột biến là các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột
• Đột biến gen là sự thay đổi trong trình tự nucleotid
trên gen → tạo ra protein đột biến với trình tự acid
amin thay đổi hay tác động đến quá trình điều khiển
sự tổng hợp của các sản phẩm gen
Khái niệm
• Đột biến xảy ra ở tế bào không sinh sản: đột biến
sinh dưỡng  thay đổi có tính cục bộ  không di
truyền (VD: u sắc tố ngoài da)
• Đột biến xảy ra trong giao tử: đột biến dòng mầm 
di truyền
• Đa số đột biến là gen lặn  không phát hiện được

nếu hợp tử không có 2 bản allel đột biến
Khái niệm - Tần số đột biến
Tần số đột biến được đánh giá trên:
• Một lần sao chép
• Một lần phân bào
• Một giao tử
• Một tế bào trong một thế hệ

Sinh vật Tần số đột biến/ cặp base/ 1 thế hệ
Eukaryote 10-4 – 10-6
Vi khuẩn 10-8
Virus (ADN) 10-6 – 10-8
Virus (ARN) 10-3 – 10-5
Trên cùng 1 sinh vật, đột biến:
• Ở các gen khác nhau  tần số đột biến khác nhau
• Ở cùng 1 gen  tần số đột biến ổn định

Tỉ lệ đột biến của các gen khác nhau do:

• Kích thước đích: gen có vùng mã hóa protein rất lớn
→ có nhiều base có thể bị thay đổi hoặc làm mất
chức năng của gen
• Điểm nóng:
o Một số gen nằm trong vùng nhiễm sắc thể nhạy
cảm hơn với sự phá hủy/ thay đổi di truyền
o Gen chứa các trình tự dễ bị thay đổi (trình tự CpG)
bởi các đột biến tự phát hơn
Các loại đột biến
• Đột biến điểm

– Thay thế cặp nucleotid
– Đột biến lệch khung
• Đột biến đa điểm

Video 1: Mutation by Base Substitution

Đột biến điểm
Thay thế cặp nucleotid – Chuyển vị
Base pyrimidin
Thymin Cytosin
Base purin
Adenin Guanin
Đột biến đảo chuyển
Base Base Thymin Cytosin

pyrimidin purin
Adenin Guanin
Đột biến điểm:
• Có thể gây ra bởi acid nitrơ hay các đồng đẳng

base như 5-bromo-2-deoxyuridin (BrdU)
• Có khuynh hướng là đột biến lùi (hồi biến): chuyển

lại dạng nguyên thủy
Đột biến tại cùng 1 điểm có 1/3 cơ hội quay lại

chuỗi ban đầu
Đột biến thay thế cặp nucleotid – Phân loại
Đột biến lặn Đột biến lệch Đột biến vô

nghĩa nghĩa
Mã hóa cho Mã hóa cho Mã hóa cho

cùng acid amin acid amin khác codon kết thúc
Không ảnh Có thể làm Có thể làm cụt

hưởng đến protein không protein
protein cuối có chức năng
Đột biến thay thế cặp nucleotid
UAC
Tyrosin
CAC UAU
UAG
Histidin Tyrosin
Protein Protein Protein bình

lạ không được thường
tổng hợp
Đột biến điểm – Đột biến lệch khung
Đột biến lệch khung do: chèn hoặc mất một nucloetid
trong vùng mã hóa của gen
Chứa codon kết

Làm thay đổi khung đọc thúc  dừng tổng
hợp protein
Thay đổi tất cả acid amin
phía sau điểm đột biến
Tạo protein không chức năng

Đột biến đa điểm
• Là những thay đổi tác động đến 2 – hàng ngàn base
• Gây hậu quả xóa bỏ 1 phần của trình tự mã hóa 

thay đổi hoàn toàn protein tạo ra
• Không có tính hồi biến  đột biến ổn định
• Sự chèn đa điểm có thể do transposon hay lỗi khi sao

chép các yếu tố lặp lại
Đột biến đa điểm
Transposon:
• Có thể dài tới vài ngàn base
• Làm ngưng quá trình sao mã và dịch mã
• Có 2 loại:
• Transposon: có thể di chuyển trực tiếp từ vị trí này

sang vị trí khác trong bộ gen
• Retrotransposon: được phiên mã thành ARN,  ADN

nhờ reverse transcriptase,  chèn vào bộ gen
Đột biến đa điểm -Transposon
http://www.chrisdellavedova.com/
Đột biến đa điểm - Retrotransposon
http://www.bio.miami.edu
Nguyên nhân đột biến
Có hai nguyên nhân gây đột biến:

• Đột biến tự nhiên: xảy ra tự phát
• Đột biến cảm ứng: gây bởi các tác nhân đột biến
Đột biến tự nhiên
Đột biến tự phát ở mức phân tử, gồm:
• Hỗ biến
• Khử amin
• Chuyển vị - đảo chuyển
• Đột biến lệch khung
• Oxy hóa phá hủy

Đột biến tự nhiên – Hỗ biến
Keto C=O  Enol C-OH
Amin NH2  Imin =NH
www.bio.miami.edu
Đột biến tự nhiên – Khử amin
http://bio3400.nicerweb.com /
Đột biến tự nhiên – Khử amin
Trong ADN:
• Khử amin: cytosin  uracil: loại bỏ uracil
• Khử amin: 5-methylcytosin  thymin: không được

điều chỉnh
Vùng CpG (-C-phosphat-G-): 70-80% cytosin bị methyl

hóa  5-methylcytosin  CpG là điểm nóng của đột
biến
Đột biến tự nhiên – Lệch khung
Đột biến lệch khung:
• Do chèn hoặc mất nucleotid trên 1 sợi
• Do lỗi của ADN polymerase khi sao chép các đoạn

lặp lại của 1 nucleotid
Đột biến tự nhiên – Oxy hóa phá hủy
Oxy hóa phá hủy:
• Do các gốc oxy tăng trong tế bào (do chuyển hóa

oxy hóa)
• VD: 8-hydroxy guanin bắt cặp sai với A, tạo đảo

chuyển G-C thành T-A
8-hydroxy guanin
Đột biến cảm ứng
Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự
nhiên gọi là các tác nhân gây đột biến
• Các tác nhân có thể tự nhiên hay nhân tạo
o Tác nhân vật lý: phóng xạ, tia X, tia UV,…
o Tác nhân hóa học: các đồng đẳng của base nitơ,
acid nitrơ HNO2, các chất alkyl hóa mạnh
• Làm thay đổi cấu trúc hay trình tự ADN

Đột biến cảm ứng – Tác nhân hóa học
Tác nhân gây đột biến hóa học có thể chia làm 4 nhóm:
1. Base đồng đẳng
2. Chất hóa hóa học làm thay đổi cấu trúc và đặc tính bắt
cặp của các base
• Các chất khử amin
• Các chất alkyl hóa
3. Nhóm chèn vào ADN: tác nhân làm lệch khung
4. Các tác nhân làm thay đổi cấu trúc ADN

Tác nhân hóa học gây đột biến – Base đồng đẳng
Base đồng đẳng có cấu trúc hóa học giống các purin và
pyrimidin  gắn vào ADN tại vị trí của các base bình
thường khi sao chép ADN
Bromouracil (BU):
• Là hợp chất nhân tạo
• Giống thymin  bắt cặp với adenin
• Có khả năng hỗ biến thành dạng enol  bắt cặp với

guanin
http://thuviensinhhoc.com
http://www.mun.ca/biochem/
Aminopurin
• Là đồng đẳng của adenin  bắt cặp với thymin

hoặc cytosin (rất hiếm)
• Gây chuyển vị A-T  G-C hoặc G-C  A-T
Các đồng đẳng base gây chuyển vị như hỗ biến tự phát

Các chất hóa học thay đổi cấu trúc và đặc tính
bắt cặp của base – Các chất khử amin
Acid nitrơ HNO2: tạo ra do sự phân giải các nitrit (chất

bảo quản) trong thực phẩm, gây:
cytosin  uracil
me-cytosin  thymin
adenin  hypoxanthin khử amin  bắt cặp

với cytosin  gây chuyển vị
Các chất hóa học thay đổi cấu trúc và đặc tính
bắt cặp của base – Các chất alkyl hóa
Các chất alkyl hóa thêm các nhóm methyl hay ethyl
• Thêm nhóm methyl hay ethyl vào guanin  base

tương tự adenin  bắt cặp bổ sung sai
• Mất guanin đã bị alkyl hóa (mất purin)  tạo lỗ hổng

trên ADN  làm đứt mạch
• Liên kết chéo giữa các mạch của 1 hay các ADN khác
nhau  mất nucleotid
Tác nhân hóa học gây đột biến – Chèn vào ADN
Các tác nhân chèn vào ADN (làm lệch khung)

• VD: Proflavin, Cam acridin, Ethidium bromide
• Đều là các phân tử đa vòng phẳng tương tác và
chèn vào các base của ADN
 “dãn” sợi đôi ADN và ADN polymerase bị “đánh
lừa” chèn base vào đối diện nhiều hơn bình
thường
 làm lệch khung ADN tạo thành
Tác nhân hóa học gây đột biến – Thay đổi cấu
trúc ADN
Các tác nhân thay đổi cấu trúc ADN:
• Các phân tử lớn gắn vào base trong ADN và làm
chúng trở thành không mã hóa.
VD: N-acetoxy-2-acetylaminofluorene (NAAAF)
• Các tác nhân gây liên kết chéo trong và giữa các sợi.
VD: các psoralen có trong một số rau và dùng trong điều
trị một số bệnh da.
• Các chất hóa học gây đứt sợi ADN. VD: các peroxid
• Các hydrocarbon đa vòng. VD: các benzypyrene có
trong xăng
Tác nhân bức xạ gây đột biến
Tác dụng gây đột biến của bức xạ có 2 đặc điểm:

• Không có ngưỡng tác dụng  không có liều lượng
vô hại
• Số lượng đột biến tỉ lệ thuận với liều lượng phóng
xạ, không phụ thuộc vào cường độ và thời gian chiếu
xạ
Tác nhân bức xạ – Tác dụng sinh học
• Bức xạ ion hóa sản sinh các gốc tự do của nước (gốc
hydroxyl) → gây hư hỏng tế bào và sinh vật
• Các gốc tự do có các điện tử không bắt cặp và rất hoạt động
về mặt hóa học → tương tác với ADN, protein, lipid trong
màng tế bào,…
• Tia X gây hư hỏng ADN và protein, làm hỏng cơ quan, ngăn
phân chia tế bào, làm chết tế bào
• Các loại tế bào phân chia nhanh bị ảnh hưởng bởi bức xạ ion
hóa nhiều nhất
• Độ nghiêm trọng của tác động tùy thuộc liều đã nhận
Tác nhân bức xạ – Tia cực tím UV
Bức xạ UV:
• Ít năng lượng  không ion hóa
• Ưu tiên hấp phụ bởi các base của ADN và các acid
amin thơm của protein  ảnh hưởng sinh học và di
truyền
• Bị các chất hữu cơ có mạch vòng (VD: purin,
pyrimidin) hấp thu trực tiếp
Bức xạ UV
UV-B, UV-C
Tạo liên kết đồng hóa trị giữa các

pyrimidin cạnh nhau trên 1 sợi
Tạo các dimer pyrimidin
Ngăn chặn sự phiên mã và sao chép

ADN
Gây chết nếu không sửa chữa

http://www.web-books.com/
Các cơ chế chống lại đột biến
Cơ chế “sửa chữa” đột biến thuộc ba loại:

• Đảo nghịch sai hỏng: là cơ chế đơn giản nhất, enzym
hoạt động phục hồi cấu trúc bình thường
• Loại bỏ sai hỏng: cắt bỏ và thay thế base hoặc phần
nucleotid sai hỏng hoặc không thích hợp
• Dung nạp sai hỏng: không sửa chữa thật sự, sao
chép sai hỏng và tiếp tục sống
ADN là đại phân tử duy nhất được tế bào sửa chữa

hư hỏng
Đảo nghịch sai hỏng – Cơ chế
Đảo nghịch sai hỏng theo 03 cơ chế:

• Quang phục hồi
• Mất nhóm alkyl
• Nối chỗ đứt của sợi đơn
Đảo nghịch sai hỏng
• Nối các chỗ đứt của sợi đơn: nhờ enzym ADN ligase
• Quang phục hồi: enzym photolyase cắt các liên kết
đồng hóa trị của dimer pyrimidin khi có ánh sáng
http://www.mun.ca/biology/
Đảo nghịch sai hỏng
• Làm mất nhóm alkyl: nhờ

enzym O6-methylguanin-
ADN methyltranferase
(MTase)
– Chuyển nhóm alkyl từ nguyên
tử oxy trên ADN sang gốc
cystein trên enzym  enzym
mất hoạt tính
– Phản ứng không thuận nghịch
Loại bỏ hư hỏng – Cơ chế
Loại bỏ hư hỏng theo 03 cơ chế:

• Cắt base nhờ glycosylase
• Sửa chữa lệch đôi
• Cắt nucleotid
Loại bỏ hư hỏng – Cắt base nhờ glycosylase
Enzym N-glycosylase
Nhận biết base biến đổi
Thủy giải liên kết N-glycosilic
Tạo vị trí AP
AP endonuclease cắt bỏ vị trí AP
ADN polymerase lấp đầy khoảng

http://asajj.roswellpark.org/ trống
Sửa chữa lệch đôi
• Quá trình này xảy ra sau sao chép

ADN như là “đánh vần kiểm tra” cuối
cùng sự chính xác của sao chép
• Sửa chữa này được tiến hành bởi
một nhóm các protein có thể quét
ADN và tìm các base bắt cặp không
chính xác → Nucleotid không chính
xác sẽ được loại bỏ và ADN
polymerase sẽ hoạt động lần thứ hai
để có trình tự đúng
http://www.neb.com
Sửa chữa lệch đôi
Video 2: Proofreading Function of DNA Polymerase

Loại bỏ hư hỏng – Cắt nucleotid NER
• Cắt sợi ADN chứa sai

hỏng bởi endonuclease ở
phía sai hỏng
• Loại bỏ đoạn ngắn chứa
vùng sai hỏng bởi
exonuclease
• Khoảng trống tạo thành
được lấp vào bởi ADN
polymerase
NER: Nucleotide Excision Repair

Loại bỏ hư hỏng – Cắt nucleotid NER
Video 3: Thymine Dimers: Formation and Repair

Dung nạp ADN sai hỏng
• Là loại sửa chữa bằng phản
ứng liên kết đầu không tương
đồng để sửa các đầu ADN bị
đứt
• Protein Ku70, Ku80 và các
protein kinase phụ thuộc ADN
cần cho liên kết đầu không
tương đồng
NHEJ: Non Homologous End Joining http://atlasgeneticsoncology.org

Dung nạp ADN sai hỏng – Sửa chữa bằng đột biến
Một cách khác để ADN polymerase bị ngăn tại dimer là thay đổi
tính đặc hiệu của nó, nhờ đó có thể chèn bất cứ nucleotid đối
diện dimer nào và tiếp tục sao chép (cách “đột biến hoặc là
chết”)
Sửa sai nhờ hệ thống SOS
• Khi ADN bị tổn thương ngừng sao chép, thì phản ứng SOS hồi
phục sao chép và chuyển sai hỏng thành sửa sai trong khi
nhân đôi
• Ở E.coli, sự phá hủy ADN làm mở ra khoảng 20 gen của hệ
thống SOS, được kiểm soát âm bởi chất kìm hãm lexA
• Khi có nhiều sai hỏng cấp cứu, lexA bị kích thích, thay đổi cấu
hình, tự cắt và mất hoạt tính kìm hãm
→ các gen SOS được mở ra
• Nếu sửa sai không kịp, tế bào phải chấp nhận hoặc bị đột biến
hoặc bị chết
Sửa sai nhờ hệ thống SOS
https://upload.wikimedia.org
Các tính trạng đột biến và protein đột biến
Đột biến sinh dưỡng ở vi sinh vật
• Vi sinh vật hoang dại: thể nguyên dưỡng  có thể
tổng hợp tất cả thành phần tế bào từ các nguyên liệu
đơn giản
• Vi sinh vật đột biến: thể khuyết dưỡng  không còn
khả năng phát triển trên môi trường đơn giản  phải
thêm acid amin, vitamin hoặc nguyên tố vi lượng
Đột biến và bệnh ở người
Hàng ngàn bệnh có thể di truyền do đột biến gen –
liên quan đến enzym bị bất hoạt hay protein bị thay
đổi chức năng
Một số bệnh di truyền ở người
Hoaït tính sinh hoùa
Loaïi roái Trieäu chöùng Taàn soá / 1000
Teân bò aûnh höôûng hay
loaïn ñieån hình ngöôøi
khieám khuyeát
Maùu Hoàng caàu löôõi lieàm Hoàng caàu Hemoglobin coù xu 10 - 20 (Afro-
bieán daïng, höôùng ngöng keát vaø Caribbeans)
hình löôõi lieàm keát tuûa
Beänh thieáu maùu Thieáu maùu Thieáu moät trong 10-20
Ñia Trung Haûi naëng, laùch lôùn caùc chuoãi (daân Ñiaï Trung
polypeptide cuûa Haûi)
hemoglobin ngöôøi
tröôûng thaønh
Thieáu maùu huyeát Thoaùi hoùa teá Coù nhieàu daïng taát 0,05 Pyruvate
giaûi hoàng caàu bia baøo hoàng caû ñeàu maát 1 kinase
caàu, vaøng da, enzym trong nhaùnh
laùch lôùn chuyeån hoùa HMP
Beänh öa chaûy Maùu khoâng Yeáu toá VIII trong 0,1 (nam)
maùu A ñoâng ñöôïc huyeát töông
Đột biến gen và ung thư
Cơ chế phân tử
Biến đổi di truyền trên ADN
Ảnh tiến trình tăng sinh bình

thường của tế bào
Nguyên nhân gây ung thư

Các nhóm gen liên quan đến ung thư
Liên quan đến sự tăng sinh của tế bào, có 2 con đường

dẫn tới ung thư:
• Tăng hoạt gen kích thích  hiệu quả trội:
o Allel bị biến đổi là gen ung thư (oncogen)
o Allel bình thường là gen tiền ung thư (proto-
oncogen)
• Bất hoạt gen kìm hãm  hiệu quả lặn
• Gen kìm hãm là gen ức chế khối u
Biến đổi gen tiền ung thư thành gen ung thư
Có 3 cách chủ yếu:

• Mất đoạn hoặc đột biến điểm trong trình tự mã hóa
• Khuếch đại gen
• Cấu trúc nhiễm sắc thể
Các gen có thể bị biến đổi do đột biến điểm, mất đoạn,
chuyển đoạn nhiễm sắc thể hay xen đoạn trình tự gen
của retrovirus
Gen ung thư do retrovirus tải nạp
Retrovirus
Sao chép ngược
Tích hợp ADN vào nhiễm

sắc thể tế bào chủ
Mang gen ung thư cạnh

gen tiền ung thư của tế
bào chủ
Gen ung thư do retrovirus tải nạp
Hoï Chöùc naêng cuûa Nguoàn goác
U do virus gaây ra
oncogen proto-oncogen virus
abl Protein kinase (tyrosine) Chuoät, meøo Pre- B- celleukemia
erb-B Protein kinase (tyrosine): Gaø Erythroleukemia

thuï theå cuûa yeáu toá taêng Fibrosarcoma
tröôûng thöôïng bì EGF
(epidermal growth factor)
sis Nhaân toá taêng tröôûng baét Khæ Sarcoma,

nguoàn töø maïch maùu Myelocytoma
Carcinoma
src Protein kinase Gaø Sarcoma
Abl = Baïch huyeát Abelson Erl = Erythroblastose (taêng nguyeân hoàng caàu)
Sis = Simian sarcoma virus Src = Sarcoma
Các hệ thống chọn lọc đột biến ở sinh vật
Dùng môi trường chọn lọc chứa các tác nhân làm đa số tế bào chết, chỉ
có tế bào đột biến phát triển được
Kieåu gen Ñoät bieán coù Ñoät bieán Ñoät bieán

ñieàu kieän khuyeát döôõng ñeà khaùng
Khoâng
Nhieät ñoä Nhieät ñoä Khoâng Coù boå Coù taùc
coù taùc
thöôøng cao boå sung sung nhaân
nhaân
Kieåu
Bình Bình Taêng Taêng Taêng
hoang Khoâng
thöôøng thöôøng tröôûng tröôûng tröôûng
daïi
Bình Taêng Taêng Taêng

Ñoät bieán Ñoät bieán Khoâng
thöôøng tröôûng tröôûng tröôûng
Các hệ thống chọn lọc đột biến ở sinh vật
• Phương pháp đề kháng

• Phương pháp làm giàu chậm
• Phương pháp làm giàu hạn chế
• Phương pháp làm giàu nhờ penicillin
• Phương pháp lọc
• Phương pháp in
Phương pháp chọn lọc đột biến
Phương pháp đề kháng

Tác nhân: thuốc hoặc phage
 Đột biến mọc trên môi trường có thuốc hay phage
Phương pháp làm giàu chậm
Traûi vi khuaån treân beà maët moâi tröôøng thaïch toái thieåu

uû ñeå moïc thaønh caùc khoùm rôøi

Phuû lôùp moûng moâi tröôøng töông töï

uû ñeå caùc khoùm bình thöôøng moïc leân

phuû lôùp moâi tröôøng dinh döôõng coù boå sung

uû, chaát boå sung khueách taùn
Caùc ñoät bieán khuyeát döôõng seõ moïc, khoùm nhoû hôn
Phương pháp làm giàu hạn chế

• Đơn giản hơn phương pháp làm giàu chậm
• Cấy vi khuẩn trên môi trường tối thiểu có 1 ít chất bổ
sung  đột biến khuyết dưỡng mọc đến khi hết chất
bổ sung thì ngừng  khuẩn lạc nhỏ
• Vi khuẩn bình thường tạo khuẩn lạc to
Phương pháp làm giàu nhờ penicillin

• Penicillin diệt khuẩn dạng phân chia
• Cấy vi khuẩn trên môi trường tối thiểu có penicillin
 các vi khuẩn bình thường đang tăng trưởng bị diệt
• Vi khuẩn đột biến không tăng trưởng  còn sống 
nuôi cấy trên môi trường không có penicillin
Phương pháp lọc

• Chọn lọc đột biến khuyết dưỡng ở nấm sợi
• Dung dịch bào tử nuôi trong môi trường thiếu chất
bổ sung  dạng bình thường mọc thành sợi
• Lọc qua sợi thủy tinh  dạng đột biến đi qua sợi lọc
 nuôi cấy trên môi trường có chất bổ sung
Phương pháp in
• Cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng để mọc
rời từng khuẩn lạc
• In đúng vị trí khuẩn lạc trên môi trường tối thiểu
bằng miếng nhung  vi khuẩn đột biến không mọc
được
• Căn cứ vị trí khuẩn lạc không mọc trên bản sao, tách
đột biến khuyết dưỡng
PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN
(POLYMERASE CHAIN REACTION – PCR)

NGUYÊN TẮC
• Bản chất là quá trình sao chép ADN in vitro
• Khuôn ADN sợi đơn được gắn mồi nhờ lai hóa đặc hiệu
• Trong điều kiện có sẵn nucleotid, ADN polymerase sẽ kéo
dài mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn ADN sợi đơn
nếu đầu 3’-OH của mồi còn trống tạo thành sản phẩm sợi
đôi
• Phản ứng được quay vòng nhờ mồi thừa và sử dụng
nhiệt độ cao để tái tạo khuôn ADN sợi đơn từ sản phẩm
sợi đôi
NGUYÊN TẮC
THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR
Thể tích của phản ứng từ 20 – 100 µl gồm
• ADN khuôn mẫu
ADN chứa đoạn ADN cần khuếch đại. Nồng độ thường dùng: 1 ng ADN plasmid
hay 10 ng ADN nhiễm sắc thể hay 2 µl huyền dịch của 1 khuẩn lạc/ 20 µl LB
• Mồi xuôi P1 và mồi ngược P2
Mồi có bản chất là các đoạn oligonucleotide có trình tự bổ sung với 2 đầu của
đoạn ADN cần khuếch đại, nồng độ sử dụng 0,5 mM mỗi loại
• dNTPs
dATP, dCTP, dGTP, dTTP là thành phần cấu tạo ADN, nồng độ 0,25 nM/loại.
• Dung dịch đệm phản ứng PCR
Tạo điều kiện pH ổn định cho phản ứng diễn ra. Thường được cung cấp ở dạng
dung dịch mẹ 10 X.
• ADN Polymerase
Enzym tổng hợp đoạn ADN bổ sung sau khi gắn lên mồi. Tùy vào loại ADN
polymerase có thể phải cung cấp thêm MgCl2 với nồng độ khác nhau tùy trường
hợp cụ thể.
• Nước cất vừa đủ
CHƯƠNG TRÌNH PCR
• Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút
• Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần
–Biến tính: 94-95oC trong 30 giây đến vài phút
–Gắn mồi: 40-70oC (< Tm của mồi) trong 30 - 60 giây
–Kéo dài: được thực hiện ở nhiệt độ gần với nhiệt độ tối
thích của enzym (thường là 65-74oC đối với enzym
polymerase chịu nhiệt), thời gian tùy theo độ dài khuôn
(thường 1 phút cho mỗi kb)
• Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài
MÁY LUÂN NHIỆT
Máy luân nhiệt giúp điều chỉnh chính xác nhiệt độ của ống phản
ứng PCR và duy trì nhiệt độ đó trong các khoảng thời gian xác
định
Nắp – Lid
nơi truyền nhiệt
Block –
Nơi đặt ống
phản ứng PCR
Màn hình
Phím số
Start/Stop
Các phím
Option Delete điều hướng
MÁY LUÂN NHIỆT
Màn hình hiển thị khi thiết kế chương trình nhiệt
Tên chương trình

nhiệt đang thao tác
Bước nhiệt
Nhiệt độ cài đặt Thời gian kéo dài

của bước nhiệt của bước nhiệt
MÁY LUÂN NHIỆT
Màn hình hiển thị khi máy luân nhiệt đang vận hành
Nhiệt độ cài đặt Thời gian kéo dài

của bước nhiệt của bước nhiệt
Bước/chu kỳ
Thời gian còn
lại của bước
nhiệt (đếm lùi)
Nhiệt độ danh nghĩa/
nhiệt độ thực
Chu kỳ đang
Nhiệt độ của nắp vận hành
ỐNG PCR
Phản ứng PCR vận hành dựa trên sự tăng giảm nhiệt độ lặp lại theo
thời gian, do đó ống đựng phản ứng cần phải có thành mỏng để truyền
nhiệt tốt và làm bằng vật liệu bền với nhiệt. Ống PCR có 2 loại với
dung tích 0,2 ml hoặc 0,5 ml
THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR
Nhấn vào để xem clip. Thực hiện theo hướng dẫn

trong clip để biết các bước thực hiện phản ứng PCR
SAO CHÉP ADN

1
Mục tiêu
• Trình bày được quá trình sao chép ADN vi

khuẩn và ADN tế bào nhân thật
• Tóm tắt được cách thức sao chép của acid

nucleic virus
• Mô tả được quá trình sửa chữa ADN
2
Nội dung
• Các khái niệm
• Sự sao chép của ADN
 Thí nghiệm của Meselson và Stahl
 Các yếu tố cần thiết cho sự sao chép ADN
 Sao chép ADN prokaryote (E. coli)
 Sao chép ADN eukaryote
 Sao chép ADN virus
• Sửa sai khi sao chép và khi không sao chép
 Sửa sai khi sao chép
 Sửa sai khi không sao chép
3
Học thuyết trung tâm
(Central Dogma)
4
Cấu trúc xoắn kép của ADN
Gồm:
 2 chuỗi đường-
phosphat ở mặt
ngoài
 Các base nitơ ở
bên trong nối
với nhau bằng
các liên kết
hydro
5
• Các base nitơ trên hai

mạch đơn ADN bắt cặp
với nhau bằng liên kết
hydro theo nguyên tắc
bổ sung:
A=T
G≡C
6
Video 1: DNA Structure
7
Cơ chế sao chép bán bảo thủ của ADN
• Nuôi vi khuẩn vài thế hệ trong môi

trường N15  tất cả ADN của vi
khuẩn đều là loại nặng.
• Chuyển vi khuẩn vào môi trường
chứa N14 là nguồn cung cấp nitơ
duy nhất, đến khi khối lượng ADN
tăng lên gấp đôi
• Chiết ADN và ly tâm trên thang
nồng độ CsCl
Video 2: Meselson và Stahl Experiment
8
Thí nghiệm của Meselson và
Stahl
2010 Pearson Education.Inc

Cơ chế sao chép bán bảo thủ
của ADN
• Phân tử ADN được

tổng hợp gồm một
mạch mới và một
mạch cũ
10
Images.suit101.com
Các yếu tố cần thiết cho quá trình
sao chép ADN
Quá trình sao chép ADN cần:
• ADN khuôn mẫu
• 4 loại desoxyribonucleotid triphosphat: dA,
dT, dC, dG
• ADN polymerase
• Ion Mg2+
Phương trình kéo dài chuỗi ADN:
d(NMP)n + dNTP d(NMP)n+1 + PPi
11
ADN Polymerase
Các loại ADN polymerase:

• Tế bào nhân nguyên thủy: 5 loại I, II, III, IV, V
• Tế bào nhân thật: 5 loại α, β, γ, δ, ε
12
Các ADN polymerase từ E. coli và retrovirus
E. coli
Polymerase Virus
I II III IV V
Trọng lượng 109 000 120 000 180 000 160 000
phân tử (Mr)
Cấu trúc, đơn vị một một α 140 000 α 65 000
nhỏ, Mr ε 25 000 β 95 000
θ 10 000
Polymer hóa 5’→ + + + + + +

3’
Hoạt tính
exonuclease
5’ → 3’ + - - -
3’ → 5’ + + + -
13
Vai trò của các ADN polymerase
• ADN polymerase I chịu trách nhiệm sữa chữa ADN hư

hỏng và có vai trò phụ trong sao chép
• ADN polymerase II cần thiết cho sự tái khởi động chạc

ba sao chép khi ADN tổn thương
• ADN polymerase III, còn gọi là replicase, là enzym sao

chép chính
• ADN polymerase IV và V cho phép quá trình sao chép

bỏ qua những tổn thương trong ADN
14
Các ADN polymerase của nhân thật
Polymerase α β γ δ ε
Mr 350 000 39 000 200 000 250 000 350 000
Đơn vị nhỏ 4 1 2 4 4
Vị trí Nhân Nhân Ty thể Nhân Nhân
Hoạt tính Khởi đầu Sửa chữa Sao chép Sao chép Sao chép
polymer hóa sao chép ADN ty thể ADN nhiễm ADN nhiễm
5’→3’ ADN nhiễm sắc thể sắc thể
sắc thể
15
Sao chép ADN ở E. coli
Sao chép ADN ở E. coli gồm các bước:
• Khởi đầu
• Tháo xoắn
• Tổng hợp mồi
• Kéo dài
• Kết thúc
16
Bước khởi đầu
• ADN của nhân nguyên thủy có dạng vòng, xoắn kép
• Vị trí Origin (OriC), 254 bp, điểm bắt đầu sự tổng hợp ADN
của nhiễm sắc thể, do protein B nhận biết → tạo bong
bóng sao chép khi khởi đầu
• Các nút sao chép = các chạc ba sao chép
Chạc ba sao chép
Hướng Hướng
Chạc ba sao 17
chép
Bước tháo xoắn
• Protein khởi đầu tách hai sợi ADN tại vị trí khởi đầu
• Enzym helicase:
– Gắn vào vị trí khởi đầu
– Bẻ gãy liên kết hydro giữa các base của hai mạch
nucleotid
– Bám vào sợi muộn của mỗi chạc ba sao chép
– Di chuyển theo hướng 5’ – 3’ của sợi muộn
• Enzym ADN gyrase – topoisomerase: kiểm soát tình trạng
siêu xoắn của ADN
18
Vai trò của Topoisomerase
• Là enzym điều hòa trạng thái xoắn của ADN

• Topoisomerase I gắn với ADN, cắt một sợi, cho phép
ADN xoắn kép quay quanh một điểm làm mất đi sự
xoắn.
• Topoisomerase II còn gọi là gyrase tạo ra các dạng siêu
xoắn âm (phải sang trái). Topoisomerase II làm mất đi
vòng catena, cắt một sợi ADN kép và để phân tử ADN
sợi kép còn lại đi xuyên qua điểm cắt, sau đó sợi kép
ban đầu được nối lại. 19
20
• Sự tháo xoắn ADN gây ra hiện tượng siêu xoắn

o Siêu xoắn âm: mở vặn
o Siêu xoắn dương: vặn xoắn thêm
21
Bước tổng hợp mồi
• Đoạn mồi ARN
o Đoạn ARN ngắn, đầu 3' - OH tự do, bổ sung được với ADN khuôn
o Luôn cần cho sự tổng hợp ADN bởi ADN polymerase
o Do primase tổng hợp
• N-protein nhận diện trình tự đặc hiệu trên chuỗi ADN đơn
 Primase + vài chuỗi polypeptid  primosome chức năng ~
5 - 10 base đặc hiệu
• ADN polymerase I loại bỏ mồi ARN khỏi chuỗi ADN 
khoảng trống được lắp đầy các bằng các dNTP thích hợp
• ADN ligase nối lại thành sợi ADN liên tục
22
Tổng hợp mồi ARN 23

Bước kéo dài
• Xảy ra sau khi:
– ADN tháo xoắn
– Mồi ARN gắn vào
• Enzym ADN polymerase kéo dài chuỗi polynucleotid bằng
hoạt tính polymer hóa:
– Thêm nucleotid mới vào đầu tận cùng 3’ của phân tử
ADN đang tổng hợp
24
Chạc ba sao chép 25

Bước kết thúc
• Xảy ra sau khi:
– Hai chạc ba sao chép gặp nhau
– Gặp trình tự kết thúc đặc hiệu
• Protein kết thúc Tus gắn với trình tự kết thúc → ngăn
chặn sự di chuyển của helicase → kết thúc sao chép
ADN
26
Cấu trúc theta
• Sao chép từ 1 vị trí Origin trên
ADN vòng, tiến hành theo cả hai
chiều thuận và nghịch
 cấu trúc theta
• Cứ mỗi 10 base được sao chép thì
hai sợi ADN gốc phải vặn xoắn 1
vòng  sợi đơn ADN
• Hai phân tử ADN mạch kép lồng
vào nhau và được tách bởi
Topoisomerase II (Gyrase)
27
Các protein sao chép quan trọng của E. coli
Protein Chức năng
Protein B Nhận biết điểm Ori
N-protein Cho phép primase hoạt động
Primase Tổng hợp mồi ARN
Rep protein Tháo xoắn sợi dẫn
Helicase Tháo xoắn sợi chậm
SSB-protein Ổn định sợi ADN đơn
ADN polymerase III Tổng hợp ADN
ADN topoisomerase I Cắt khía một sợi đơn ADN
ADN topoisomerase II (gyrase) Cắt khía cả hai sợi đơn ADN
ADN ligase Nối các đầu của polynucleotid đã hình thành
28
Sao chép ADN ở nhân thật
 Cơ chế sao chép: tương tự như ở nhân nguyên thủy
KHÁC
 ADN đóng cuộn trong nhiều nhiễm sắc thể và dài hơn
 Tốc độ di chuyển ADN polymerase ở nhân thật chậm hơn rất nhiều
(~ 50 nucleotid/giây).
 Có nhiều replicon
 ≥ 2000 chạc ba sao chép
 Các đoạn Okazaki nhỏ hơn, ~ 40 - 300 base
 Tốc độ sao chép ADN ở nhân thật nhanh hơn rất nhiều so với
E. coli
29
Quá trình sao chép ADN ở nhân thật
So sánh quá trình sao chép ADN ở

tế bào nhân nguyên thủy và nhân thật
Đặc điểm Nhân nguyên thủy Nhân thật
Tốc độ di chuyển 800 nucleotid/s 50 nucleotid/s
của ADN
polymerase
Số replicon 1 Nhiều
Kích thước đoạn 1000 – 2000 40 – 300
Okazaki nucleotid nucleotid
Tốc độ sao chép Chậm Nhanh
30
Mô hình sao chép ở nhân thật
• Pol δ → tổng hợp sợ dẫn 5’
• Pol α → tổng hợp sợi muộn 3’ ADN primase

Polymerase - 
• Sợi muộn được thắt nút 3’
xung quanh pol α → enzym
di chuyển theo hướng chạc 5’
ba sao chép, giống sao chép
5’ Helicase
ở nhân nguyên thủy
PCNA
3’
Polymerase - 
PCNA = proliferating cell nuclear antigen
kháng nguyên tăng sinh nhân tế bào
31
32
Replicon ở tế bào nhân thật
33
Sao chép ADN ty thể và lạp thể
• Ty thể có ADN polymerase γ

• Sự sao chép tạo nên cấu trúc D
– Sao chép 01 sợi của ADN gốc,
khi tiến hành được một nửa thì
sợi kia bắt đầu
– Kết quả là tạo ra sự lồng ghép
của 02 vòng ADN và
topoisomerase II sẽ tách đôi hai
vòng kép này
34
Sao chép ADN virus
• Bộ gen là
– ADN dạng vòng đôi  sao chép bình thường
– ADN dạng thẳng
sao chép đặc biệt
– AND sợi đơn hay ARN
35
Sao chép ADN virus
• Bộ gen dạng thẳng
– Bộ gen bị ngắn hơn sau mỗi lần sao chép
– Không được tổng hợp chính xác
5’ 3’
3’ 5’
 Chiến lược tránh

3’
Hủy mồi 3’ phage λ vòng hóa bộ gen

5’
5’ 3’ 5’ 3’ phage T7 thành lập các phức nối
3’ 5’ 3’ 5’
Hủy mồi
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 36
Sao chép ADN virus
• Sự sao chép theo kiểu lăn vòng
– Trên ADN vòng, tạo ra sản phẩm ADN dạng thẳng
– Nếu cứ tiếp tục  sợi ADN phức chứa nhiều bản sao liên tiếp
của phân tử ADN vòng
 Nhiều bản sao của bộ gen được tạo ra
Phage λ tạo ra nhiều bản sao nối tiếp
Phage M13 chỉ tạo 1 bản sao
5’
3’
37
Sao chép ở phage Lambda
• Đặc điểm
– Bộ gen là ADN sợi đôi thẳng, tận cùng của bộ gen là một
đoạn sợi đơn gọi là đầu dính 12 nu  2 đầu có thể gắn bổ
sung với nhau (vị trí cos)
– Trong E. coli, nst của phage Lambda vòng hóa nhờ vị trí cos
và sao chép theo chu trình tiêu giải tiềm ẩn
• Giai đoạn sớm
– Theo mô hình theta, ori nằm trên gen O tạo DnaA (yếu tố
khởi đầu sao chép) tách 2 sợi ADN
– Gen P có DnaC (yếu tố nạp helicase) giúp DnaB (helicase)
gắn vào ADN và sao chép
– Kéo dài khoảng 5 - 15 phút 38
Sao chép ADN virus
• Giai đoạn muộn
– Sao chép lăn vòng → ADN kép dài chứa nhiều bản
sao liên tiếp cách nhau bằng cos
– Enzyme Terminase nhận diện vị trí cos và cắt tạo các
bản sao đơn của bộ gen phage với vị trí cos 2 đầu
– In vivo, có sự tham gia của protein capsid, đóng gói
ADN tạo phage hoàn chỉnh
39
Sao chép của phage M13
• Đặc điểm
– Bộ gen là một phân tử ADN sợi đơn vòng
– Lệ thuộc hoàn toàn vào bộ máy của tế bào chủ do
không ADN polymerase
– Một phần của bộ gen có dạng kẹp tóc sợi đôi → ~
promoter cho ARN polymerase của tế bào chủ, để
phiên mã một đoạn mồi ARN ngắn, mất cấu trúc kẹp
tóc
– Theo kiểu ăn vòng: do gp2 endonuclease cắt khía
ADN của thể sao chép tại vị trí đặc hiệu
40
Sao chép ADN ở phage M13
41
Sao chép của phage T7
• Đặc điểm
– Bộ gen là dsADN thẳng, dài 39.937 bp
– Sự sao chép bắt đầu tại một điểm cách đầu tận bên
trái khoảng 5900 bp và diễn ra theo cả hai hướng
– Có 160 bp ở đầu bên trái giống hệt 160 bp cuối cùng
bên phải → Gọi là các phần thừa ở đầu
– Sau vòng sao chép đầu tiên hai phân tử con thu
được có một đầu dính với trình tự của phần thừa
42
Sao chép của phage T75’ 3’
3’ 5’
Sao chép
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
Xử lý
Nối lại
5’ 3’
3’ 5’
Cắt ra
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
43 5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
Cơ chế sửa sai trong sao chép
• Tính chính xác cao trong sao chép ADN nhờ các cơ
chế:
– Hướng sao chép luôn là 5’ -3’ → việc sửa sai chính
xác
– Ở tế bào nhân nguyên thủy: ADN polymerase I và III:
o Có hoạt tính polymer hóa
o Hoạt tính exonuclease 5’ – 3’ và 3’ – 5’
→ nếu gắn nucleotid sai → ADN polymerase lùi
lại, cắt bỏ theo hướng 3’ – 5’
– Ở tế bào nhân thật, ADN polymerase δ và ε có hoạt
tính exonuclease
44
Cơ chế sửa sai khi không sao chép
Gắn vào trình Tổng hợp lại

Enzyme Cắt đoạn sai
tự sai đoạn sai
• 20 enzym dò tìm base bị biến đổi hóa học

• 5 enzym đặc hiệu liên kết cộng hóa trị sai giữa
base với các chất hóa học khác; giữa các base
trên một mạch
• Một số enzym khác phát hiện sự bắt cặp sai
 Có khoảng 50 enzym tham gia sửa sai 45
Cơ chế sửa sai khi không sao chép
Video 3: Direct Repair

46
SINH TỔNG HỢP PROTEIN
Bộ môn Vi sinh – Ký sinh

ARN vận chuyển và các enzym tổng hợp (tARN-
aminoacyl synthetase).
tARN
 Các ARN vận chuyển có 1 anticodon tương ứng với acid
amin mà nó vận chuyển
 Mỗi tARN đặc hiệu cho một loại acid amin riêng biệt.
 Có thể có vài tARN giải mã cho cùng một acid amin. Các loại
tARN chuyên chở cùng một acid amin thì được gọi là tARN đồng
nhận
 Có vài bộ ba trong mã di truyền cùng giải mã cho một loại
acid amin, ngoại trừ methionin và tryptophan. Những bộ ba đồng
loại (synonym) này được gọi là codon chéo, đây là điểm khác
nhau quan trọng nhất giữa loài này và loài khác.
ARN vận chuyển và các enzym tổng hợp
(tARN-aminoacyl synthetase).
 Số lượng các tARN biến động theo loài : nhân nguyên thủy 30-40,
nhân thật 50.
 Các tARN phải được nhận biết chuyên biệt đồng thời bởi mARN và
bởi enzyme gắn acid amin vào tARN tương ứng (enzyme tARN-
aminoacyl synthetase). Điều này giúp giải quyết trở ngại không gian
trong quá trình dịch mã.
 Kích thước của codon lớn hơn so với acid amin, nên nếu một acid
amin nhận biết và gắn trực tiếp lên một codon trên mARN thì nó sẽ
cách với acid amin tương ứng với codon kế cận để hình thành liên
kết peptid.
ARN vận chuyển và các enzym tổng hợp
(tARN-aminoacyl synthetase).
tARN-aminoacyl synthetase
 Chỉ có một loại aminoacyl-tARN synthetase cho một loại acid
amin.
 Có 20 loại acid amin khác nhau cấu trúc nên bản dịch, nên cần
phải có tới 20 loại aminoacyl-tARN synthetase khác nhau.
 Sự nhận diện chính xác tARN của synthetase thông qua việc
nhận diện anticodon. Enzyme aminoacyl-tARN synthetase phải
phù hợp và chọn đúng tARN : tARN chỉ đúng cho một synthetase
thì được gọi là tARN duy nhất (cognate tARN).
Amynoaxyl hóa
Hai bước aminoacyl hóa

1. Hình thành aminoacyl-adenylate hoạt hóa
 Acid amin phản ứng với ATP có enzyme xúc tác để tạo thành
aminoacyl adenylate hoạt hóa.
 Pyrophosphat tạo ra bị thủy giải thành 2 phân tử phosphat vô cơ.
Phản ứng này tạo ra một năng lượng thủy giải tự do tương đối cao,
đẩy phản ứng theo chiều tạo aminoacyl-AMP trung gian
Amynoaxyl hóa
H 2O
ATP + Acid amin Aminoacyl -AMP + PPi 2Pi
Aminoacyl
synthetase O O
tARN
Acid amin A denosi ne O P O C CH(R)NH +
O
ATP PP
(Acid amin hoaït hoaù)
H 2O
2Pi
Amynoaxyl hóa
2. Hình thành aminoacyl-tARN
Aminoacyl-AMP được chuyển tới phân tử tARN tương ứng bằng
synthetase :
AMINO ACYL - + tARN AMINOACYL – t ARN

AMP
+ AMP
Aminoacyl hóa
tARN-aminoacyl synthetase
Video 1: Aminoacyl tRNA Synthetase

Amynoaxyl hóa
Trong quá trình dịch mã, ribosom không có khả năng xác định tARN
có gắn đúng với acid amin tương ứng hay không, nó chỉ đơn thuần
đảm bảo sự ăn khớp giữa codon trên mARN và anticodon trên
tARN, nếu khớp thì acid amin trên tARN dù đúng hay sai đều được
nối vào chuỗi polypeptid.
Bước aminoacyl hóa phải chính xác: nếu một tARN chấp nhận một
acid amin sai dẫn đến việc gắn acid amin không đúng vào protein và
sẽ không có “bước đọc sửa sai” theo sau bước aminoacyl hóa.
Amynoaxyl hóa
 Bước đọc sửa sai chỉ được thực hiện ở giai đoạn aminoacyl
hóa bởi chính enzym aminoacyl-tARN synthetase.
 Quá trình aminoacyl hóa cùng lúc thực hiện 2 chức năng:
– Cung cấp sự liên hệ duy nhất của mã di truyền (dựa vào acid
nucleic) và cấu trúc protein (với các acid amin).
– Hoạt hóa acid amin trước khi kết nối vào protein. Liên kết ester
aminoacyl giữa acid amin và tARN dự trữ một năng lượng tự do
tương đối cao, năng lượng này rất cần thiết cho việc hình thành
liên kết peptid trong quá trình dịch mã.
Sự dị biệt codon
 Hầu hết các loài đều có 20 loại Aminoacyl-tARN synthetase tương
ứng với 20 loại acid amin. Đó là Alanyl-tARN synthetase, Arginyl-
tARN synthetase,Asparaginyl-tARN synthetase, ….
 Một số vi khuẩn (ví dụ Helicobacter pylori) không có Glutaminyl-
tARN synthetase để aminoacyl hóa tARNGln.
 Trong trường hợp này, Glutamat-tARN synthetase được dùng để
aminoacyl hóa tARNGln với Glutamate và sau đó một enzym khác
sẽ chuyển glutamat trên glutamat- tARNGln thành Glutamin. Điều
này cho thấy Aminoacyl-tARN synthetase không bao giờ gắn 2
acid amin khác nhau lên cùng một loại tARN.
 Có vài loại tARN khác nhau cho mỗi một loại acid amin (để giải mã
các codon khác nhau tương ứng với acid amin đó), nhưng chỉ có
một aminoacyl-tARN synthetase cho mỗi loại acid amin. Enzym
aminoacyl-tARN synthetase phải phù hợp và chọn đúng tARN: các
tARN được nhận diện bởi một synthetase thì được gọi là tARN
cùng họ (cognate tARN), các loại tARN liên quan đến cùng một
acid amin thì được gọi là tARN đồng nhận (isoaccepting tARN).
 Một số loài có số tARN nhiều hơn số codon (ví dụ E. coli có 86
tARN), nghĩa là có nhiều tARN cùng giải mã cho một codon.
 Có hơn một codon trong mã di truyền cho từng loại acid amin,
ngoại trừ methionin và tryptophan.
 Những codon đồng nghĩa (synonym) này thường liên quan đến
các tARN khác nhau.
 Các tARN lại có trình tự đối mã (anticodon) khác nhau.
 Thí dụ, trong trường hợp của serin, mặc dù có tới 6 codon
(UCU, UCC, UCG, UCA, AGU, AGC) đều có ý nghĩa như nhau,
nhưng không phải tất cả đều được sử dụng thường xuyên như
nhau.
 Đối với một loài chỉ có một vài codon cho một acid amin được
sử dụng và có một vài phân tử tARN cho mỗi codon trong tế bào.
Hiện tượng này được gọi là sự dị biệt codon và đây là điểm khác
nhau quan trọng giữa loài này và loài khác.
Các tARN và Codon khởi đầu
 Trình tự mã của phân tử mARN được khởi đầu với bộ ba AUG, rất
hiếm các bộ ba khác (AUU, UUG)
 Chỉ có một codon mã hóa cho Met, nhưng trong tế bào chất lại
hiện diện 2 loại tARN có khả năng mang Met đến kết hợp với
codon đó :
 (1) tARNmMet kết hợp với codon AUG nằm giữa phân tử mARN, có
nhiệm vụ gắn Met vào chuỗi polypeptid đang hình thành.
 (2) tARNiMet kết hợp với codon AUG khởi động, gắn Met mở đầu
vào chuỗi polypeptid.
 Ơ vi khuẩn, tARNiMet khởi đầu không chỉ vận chuyển methionin mà
còn vận chuyển formyl-methionin : tARN này được gọi là tARNfMet
(viết tắt là fMet) .
O
O
C NH CH C tARN f
H
CH2
Nhoùm formyl CH2

Nhoùm methionyl
S
CH3
 Sự tổng hợp tất cả protein ở vi khuẩn đều bắt đầu bằng formyl-
methionin. Nhóm formyl, cũng như nhóm methionyl, thường bị
loại bỏ sau khi tổng hợp xong phân tử protein. Ví dụ, ở E. coli,
chỉ có 45% các protein hoàn chỉnh bắt đầu bằng methionin.
 Ở tế bào nhân thật, các tARN chuyên biệt cho các bộ ba AUG
khởi đầu và AUG bên trong mARN, những tARNMet mở đầu chỉ
vận chuyển methionin khởi đầu được gọi là tARNiMet và
tARNmMet cho các bộ ba AUG bên trong
Các bộ ba khởi đầu và tARN khởi đầu
Vi khuẩn Nhân thật
Bộ ba khởi đầu AUG (GUG) AUG

tARN khởi đầu tARNfMet tARNIMet
tARN mang a.a Formyl- Methionin
methionin
Giai đoạn khởi đầu
Giai đoạn khởi đầu, có sự tham gia của :
 2 tiểu đơn vị của ribosome,
 Một phần tử mARN (được sắp thẳng hàng với ribosome)
 tARN khởi đầu mang methionin hoặc formyl-methionin ở nhân
nguyên thủy.
 Các nhân tố khởi đầu (initiation factors) như IF1, IF2, IF3 ở vi
khuẩn và 10 nhân tố eIF (nhân thật F) như eIF1, eIF2, eIF3, eIF-4A,
eIF-4B… ở nhân thật
Chuỗi peptid mới sinh
Protein hoàn
chỉnh
40S
5' 3'
S S
Giai đoạn T T Giai đoạn
Giai đoạn O
khởi đầu A kết thúc
R
kéo dài P
T Tiểu đơn vị
nhỏ
40S
60S Tiểu đơn vị
40S lớn
60S
CHU TRÌNH RIBOSOME NHÂN THẬT

Các yếu tố khởi đầu của tế bào nhân nguyên thủy và
nhân thật và chức năng
Yếu tố Yếu tố ở Chức năng

ở vi nhân thật
khuẩn
IF-1 eIF-1 Vai trò chưa rõ
IF-2 Gắn Met-tARN (hoặc fMet-tARN) vào ribosome thành phức hợp
eIF-2
với GTP
IF-3
eIF-3 Ngăn cản sự kết nối của các tiểu đơn vị ribosome
eIF-4A
Nhóm yếu tố liên quan đáp ứng cho việc gắn chóp 5’vào đầu
eIF-4B mARN và tháo xoắn cấu trúc bậc 2 tạo điều kiện cho ribosome
đậu vào bộ ba khởi đầu
eIF-4E
eIF-4F
Giải phóng eIF-2 và eIF-3 khỏi ribosome và giúp cho bán đơn vị
eIF-5
60S kết nối
eIF-6 Tham gia vào việc tách ribosome thành các bán đơn vị
Yếu tố biến đổi nucleotid Guanin : tái sinh eIF-2 bởi sự biến
GEF đổi trung gian GDP thành GTP trong quá trình tương tự để tái
sinh EF-Tu bởi EF-Ts
Khởi đầu chuỗi peptid ở vi khuẩn
 Có sự tương tác trực tiếp giữa mARN và rARN của tiểu đơn vị
30S dẫn đến việc gắn mARN vào ribosome
 Nhận diện được bộ ba khởi đầu : Các mARN vi khuẩn có chứa
một trình tự dẫn ở đầu 5’ ngắn: bao gồm trình tự polypurin ngắn
bổ sung với một trình tự giàu pyrimidin ở tận cùng 3’ của rARN
16S.
 Trình tự Shine-Dalgarno.
 Việc ghép đôi base giữa các trình tự này có thể là cơ chế làm cho
ribosome của vi khuẩn hướng tới đúng bộ ba khởi đầu của mARN.
Ngày nay, người ta gọi trình tự ngắn này là trình tự Shine-
Dalgarno.
Đặc điểm sự khởi đầu chuỗi peptid ở vi khuẩn
 Nhận diện trình tự Shine-Dalgarno, nằm gần điểm xuất phát của
trình tự mã hóa mARN.
 Sự khởi đầu khơng phải nằm gần với điểm khởi đầu 5’ của
mARN.Sự phiên dịch có thể bắt đầu ở bất kỳ điểm nào trên phân tử
mARN, chứng tỏ trước bộ ba khởi đầu đã có một trình tự Shine-
Dalgarno.
 Các mARN nhân nguyên thủy có chứa tới vài vùng mã hóa,
(polycistronic mARN). VD: mARN chứa operon mã hóa cho 3 loại
protein khác nhau.
 Các phân tử tARN luôn luôn gắn với ribosome như những phức
base có chứa GTP và yếu tố protein.
 mARN và phức hợp tARN gắn trước tiên vào tiểu đơn vị 30S, cả 2
bước này đều xảy ra trước khi 50S gắn vào để tạo ra phức hợp 70S
cho việc nối dài.
Khởi đầu dịch mã ở tế bào nhân nguyên thủy bắt đầu với tiểu đơn vị
30S và được xúc tác bởi các yếu tố khởi đầu IF1, IF2 và IF3.
 IF1 ngăn không cho aminoacyl-tARN gắn vào vị trí sẽ trở thành vị
trí A của ribosom hoàn chỉnh.
 IF2 là một GTPase (protein gắn và thủy phân GTP). IF2 tương tác
với 3 thành phần của bộ máy khởi đầu là tiểu đơn vị 30S, IF1 và
fMet-tRNAfMet,do đó giúp fMet-tRNAfMet gắn vào tiểu đơn vị 30S
tại vị trí P và ngăn các aminoacyl-tARN khác gắn vào.
 IF3 gắn vào tiểu đơn vị 30S và ngăn nó tái hợp với tiểu đơn vị 50S
hay gắn với aminoacyl-tARN khác. Cần lưu ý là sự khởi đầu dịch
mã cần tiểu đơn vị 30S tự do, do đó IF3 sẽ gắn với tiểu đơn vị 30S
khi kết thúc quá trình dịch mã để giúp tách ribosom thành các tiểu
đơn vị riêng biệt.
Tiến trình khởi đầu gồm các bước:
1. IF3 gắn vào tiểu đơn vị nhỏ tại vị trí E.
2. IF1 gắn vào tiểu đơn vị nhỏ tại vị trí A. IF2 (có hoạt tính
GTPase) gắn vào IF1 và chồm qua vị trí P để có thể tiếp xúc với
tARNfMet.
3. Tiểu đơn vị nhỏ của ribosom gắn mARN nhờ bắt cặp base giữa
vị trí gắn ribosom (rbs) trên mARN với rARN 16S sao cho codon
khởi đầu nằm tại vị trí P. tARNfMet gắn vào tiểu đơn vị nhỏ tại vị trí
P nhờ sự trợ giúp của IF2. Sự gắn của cả hai ARN (mARN và
tARNfMet) vào ribosom có thể xảy ra theo thứ tự bất kỳ và độc lập
với nhau.
4. Khi codon khởi đầu bắt cặp đúng với anticodon trên tARNfMet,
tiểu đơn vị nhỏ thay đổi cấu hình làm cho IF3 không gắn được và bị
phóng thích. Khi không có IF3, tiểu đơn vị lớn mới gắn vào tiểu đơn
vị nhỏ.
5. Sự gắn tiểu đơn vị lớn kích hoạt GTPase (trên IF2-GTP) thủy giải
GTP thành GDP. IF2-GDP có ái lực yếu với ribosom và tARNfMet dẫn
đến phóng thích IF2-GDP và IF1 khỏi ribosom và giải phóng vị trí A
để tiếp nhận các tARN đã hoạt hóa khác cho giai đoạn nối dài.
Đặc điểm khởi đầu chuỗi peptid ở nhân thật
 Trình tự dẫn mARN nhân thật không được xem như trình tự
Shine-Dalgarno ở nhân nguyên thủy.
 Đầu tận cùng 3’ của rARN 18S (tương đương với rARN 16S ở vi
khuẩn) không có trình tự CCUCC.
 Bộ ba AUG có thể chỉ là bộ ba mã hóa bình thường nhưng cũng
có thể là bộ ba khởi đầu.
 mARN ở nhân thật là monocistronic, chúng chỉ chứa một trình tự
mã hóa và khởi đầu, thường xảy ra ở bộ ba khởi đầu AUG trong
mARN.
 Ở nhân thật Met-tARNiMet phải được gắn kết trước vào tiểu đơn
vị 40S. Điều đó cho thấy rằng đối mã (CAU) trên tARN-khởi đầu đã
nhận ra AUG trong khi 40S đang quét trên mARN.
 Marilyn Kozak đã đề xuất mô hình “quét” để nhận diện codon
khởi đầu ở tế bào nhân thật. Trước tiên tiểu đơn vị nhỏ 40S của
ribosom gắn vào đầu tận cùng 5’ của mARN, sau đó di chuyển
dọc theo mARN tới khi gặp codon khởi đầu AUG.
 Năng lượng cho sự di chuyển lấy từ sự thủy phân ATP và sự
tương tác khởi đầu với mARN có thể liên quan tới cấu trúc chóp
5’ (CAP). Codon AUG có thể chỉ là codon mã hóa bình thường
nhưng cũng có thể là codon khởi đầu, nếu nó được định vị trong
một “ngữ cảnh” đúng. Ngữ cảnh biết tới nhiều nhất do Kozak
phát hiện, do đó còn được gọi là trình tự Kozak.
Ngữ cảnh nhận diện codon khởi đầu
30
 Tiểu đơn vị 40S sẽ bỏ qua codon AUG bình thường cho đến khi
định vị tại codon AUG khởi đầu nằm trong ngữ cảnh tốt. 95% các
trường hợp khởi đầu ở tế bào nhân thật xảy ra tại codon khởi đầu
AUG, hầu như không dùng tới GUG.
 Khởi đầu dịch mã ở tế bào nhân thật phức tạp hơn rất nhiều so với
tế bào nhân nguyên thủy và có hơn 30 peptid tham gia.
1. Chuẩn bị tiểu đơn vị 40S:
a. eIF1A và eIF3 gắn vào tiểu đơn vị nhỏ tại vị trí A và E.
b. eIF1A giúp eIF5B-GTP gắn vào tiểu đơn vị nhỏ.
c. eIF5B-GTP giúp phức eIF2-GTP gắn với tRNAiMet, eIF5B-GTP và
eIF2-GTP định vị tRNAiMet vào vị trí P.
2. Chuẩn bị mARN
a. eIF4E gắn vào chóp 5’ của mARN, giúp eIF4A và eIF4G gắn vào
mARN, 3 protein này tạo thành eIF4F hoàn chỉnh.
b. eIF4B được gắn tiếp vào và hoạt hóa hoạt tính helicase trên
eIF4F để loại bỏ cấu trúc bậc 2 ở đầu 5’ của mARN
Video 2: Translation Initiation

Các bước chuẩn bị khởi đầu ở tế bào nhân thật
Định vị codon khởi đầu và hoàn tất khởi đầu ở tế bào nhân thật
Khởi đầu chuỗi peptid ở nhân thật
Vai trò của các yếu tố khởi đầu
 Ở E. coli chỉ có 3 yếu tố khởi đầu, ở nhân thật có 10 yếu tố thể
hiện qua các cách gắn mARN và xác định bộ ba khởi đầu.
 eIF-3 (giống IF-3) cản trở các bán đơn vị ribosome kết nối.
 eIF-2 (giống IF-2) làm trung gian gắn kết tARN-khởi đầu với tiểu
đơn vị nhỏ thành phức hợp với GTP.
Vai trò của các yếu tố khởi đầu
 eIF-6 tương tác với bán đơn vị lớn 60S và tách đôi được 2 bán đơn
vị của ribosome.
 eIF-5 giúp đơn vị 60S kết nối và giải phóng các yếu tố khởi đầu
khác. Nhiều yếu tố khởi đầu liên quan tới sự gắn kết mARN như eIF-
4A, eIF-4B, eIF-4E, eIF-4F.
Các yếu tố này thường là những protein gắn chóp (Cap-binding
proteins) do chúng gắn vào chóp 5’: chúng gắn vào các hợp phần
của chóp (như f-methyl GTP)
 eIF-4F là một phức hợp protein chứa các thành phần tương tự eIF-
4E và eIF-4A, vì cùng là protein có phân tử lượng Mr 220 000. Người
ta cho rằng eIF-4F thông qua eIF-4E gắn trực tiếp vào chóp trước và
sau đó eIF-4A và eIF-4B mới gắn vào.
Khởi đầu chuỗi peptid ở nhân thật
Video 3: Translation Initiation in Eukaryotes

Nối dài
 Quá trình phiên dịch trên mARN được nối dài theo hướng 5’  3’,
chuỗi polypeptid được bắt đầu tổng hợp ở đầu tận cùng –N. Quá
trình này giống nhau ở tế bào nhân nguyên thủy và nhân thật
 Sự nối dài có nhiều chu kỳ
 Sự nối dài cần đến các yếu tố nối dài (elongation factors = EF). Ở vi
khuẩn, các yếu tố này là EF-Tu, EF-Ts và EF-G
 Trên ribosome có 2 vị trí A và P. Vị trí A là vị trí aminocyl (hoặc
Acceptor), và vị trí P là vị trí Peptidyl, nối giữa phức hợp peptidyl-
tARN.
Các yếu tố nối dài
Nối dài
Nối dài
Tiến trình nối dài gồm các chu kỳ 3 bước, sau mỗi chu kỳ 1 acid amin
mới được thêm vào mạch polypeptid, tiến trình nối dài ở nhân nguyên
thủy như sau:
1. Aminoacyl-tRNA có đối mã đúng được mang vào vị trí A nhờ yếu

tố EFTu- GTP; khi vào đúng vị trí, hoạt tính GTPase của EF-Tu-GTP
được kích hoạt bởi tiểu đơn vị lớn dẫn đến thủy phân GTP thành GDP
và phóng thích aminoacyl-tRNA. Sự kích hoạt GTPase chỉ xảy ra nếu
tRNA vào đúng vị trí A và có anticodon đúng với mã trên mARN.
2. Liên kết peptid được hình thành giữa aminoacyl-tRNA ở vị trí A

với peptidyl-tRNA ở vị trí P nhờ enzym peptidyl transferase (do rARN
23S đảm nhiệm) và do đó chuyển polypeptid đang tổng hợp từ tRNA ở
vị trí P sang aminoacyl-tRNA ở vị trí A.
Nối dài
3. Peptidyl-tRNA mới hình thành ở vị trí A được chuyển vị sang
vị trí P nhờ hoạt động của yếu tố kéo dài EF-G-GTP sử dụng năng
lượng thủy phân GTP thành GDP để giải phóng vị trí A cho 1 chu
kỳ mới. Sự chuyển vị có 3 hiện tượng xảy ra đồng thời:
- tARN vận chuyển ở vị trí P được đẩy sang vị trí E và thoát ra
ngoài.
- Peptidyl-tARN di chuyển từ vị trí A sang vị trí P
- Ribosom tiến thêm một codon trên mARN, do đó, codon tiếp
theo được đưa vào gióng hàng với vị trí A.
Nối dài
 Bất kỳ aminoacyl-tARN (ngoại trừ tARN-khởi đầu) đều vào vị trí A,
chúng lưu lại đây nếu anticodon khớp mã với codon tại A.
 Aminoacyl-tARN chính xác được lựa chọn và chọn được đúng
acid amin cho sự hình thành chuỗi polypeptid mới sinh.
 Việc gắn này là gắn phức hợp giữa EF-Tu hoặc EF-1 với GTP
giống như tARN-khởi đầu gắn kết trong suốt giai đoạn khởi đầu.
3'
5' 3' CUCAGGUUU
CUCAGGUUU mARN
mARN
P A P A
Böôùc peptidyl
Ar g transferase
Leu Leu
Ar g
[E F-Tu-GTP-Ar g-t ARN ] Pept ide
Pept ide
I II
Ar g- t ARNAr g
Taùi hoài
E F- Tu-GDP] +Pi
3' Chuyeån vò CUCAGGUUUU

CUC AGG UUU mARN
A P A
P
E F-G E F-G Ar g
Ar g + + Leu
Leu GDP GTP
+ Pept ide
Pept ide Pi
+ QUÁ TRÌNH NỐI DÀI
IV t ARNLeu III
Cấu trúc vòng của mARN khi dịch mã ở nhân thật
Nối dài
 Quá trình thủy phân GTP giải phóng GDP và Pi.
 GDP được phóng thích khỏi ribosome sẽ gắn kết với nhân tố nối
dài tạo phức hợp [EF-Tu-GDP] hoặc [EF-1-GDP].
 Để nhân tố nối dài lại có thể tham gia vào quá trình gắn kết
aminoacyl-tARN tiếp theo vào ribosome thì GDP phải được thay
thế bởi GTP.
 Ở vi khuẩn, nhân tố EF-Ts đóng vai trò trung gian cho việc
chuyển đổi GDP/GTP, tương tự các nhân tố của protein-G liên
quan tới sự tải nạp tín hiệu hormon.
Nối dài
 Giữa acid amin sau cùng của chuỗi mới sinh với acid amin
trên tARN ở vị trí A, hình thành liên kết peptid. Phản ứng này
được xúc tác bởi enzyme peptidyl-transferase. Kết quả là tARN ở
vị trí P lúc bấy giờ không còn mang acid amin hoặc là tách khỏi
chuỗi polypeptid.
Nối dài
Bước chuyển vị (translocation step) cuối cùng của giai đoạn nối
dài cần một yếu tố nối dài khác là EF-G hoặc EF-2 và GTP. GTP
thủy phân thành GDP và Pi. Sự chuyển vị có 3 hiện tượng xảy ra
đồng thời :
 tARN vận chuyển xong được tách khỏi vị trí P
 Peptidyl-tARN di chuyển từ vị trí A sang vị trí P
 Ribosome chuyển dịch theo từng bộ ba trên mARN, do đó, bộ ba tiếp
theo được đưa vào gióng hàng với vị trí A.
Nối dài
 Quá trình chuyển vị nối dài sẽ được lặp lại cho đến khi có một
bộ ba kết thúc xuất hiện ở vị trí A.
 Vai trò của GTP trong quá trình nối dài chưa rõ ràng. Sự thủy
phân GTP cung cấp năng lượng cho việc tạo nên liên kết peptid
và cho bước chuyển vị, nhưng nó có thể liên quan một cách
không ổn định đến mức độ chính xác của sự chuyển vị.
Nối dài
Sự tái hồi EF-Tu bởi EF-Ts và đồng phân của protein-G:
 EF-Tu được giải phóng khỏi ribosome sau mỗi chu kỳ nối dài
thành phức hợp với GDP(bất hoạt), nghĩa là phức hợp này
không thể gắn kết aminoacyl-tARN.
 Để cho EF-Tu tham gia vào vòng nối dài tiếp theo GDPcần phải
được biến đổi thành GDP tạo phức hợp có hoạt tính [EF-Tu-
GTP]. sự biến đổi nucleotid guanin cần có một nhân tố protein
khác, đó là EF-Ts.
Nối dài
Video 4: Translation Elongation

Kết thúc
 Chu trình dịch mã chấm dứt khi khi một trong các codon kết
thúc : UAA, UAG, UGA
 Ở bước kết thúc, các mã kết thúc không có anticodon.
 Các yếu tố kết thúc RF làm kết thúc quá trình dịch mã.
 Yếu tố kết thúc RF nhận diện stop codon và kích hoạt sự kết
thúc dịch mã, phóng thích chuỗi polypeptid.
Yếu tố kết thúc
Có 2 loại yếu tố kết thúc (RF - Release Factor):
Loại I: nhận diện stop codon và thủy phân chuỗi polypeptid
khỏi tARN ở vị trí P. Phản ứng này được xúc tác bởi enzym
peptidyl transferase của ribosom và đòi hỏi GTP.
 Tế bào nhân thật: chỉ có 1 yếu tố eRF1 nhận diện cả 3
codon kết thúc
 Tế bào nhân nguyên thủy: 2 yếu tố
– RF1 nhận diện UAG
– RF2 nhận diện UGA
– UAA được nhận diện bởi cả RF1 và RF2
Yếu tố kết thúc
Loại II (RF3 và eRF3): kích hoạt sự tách yếu tố loại I ra khỏi
ribosom nhờ năng lượng thủy giải GTP.

 Sau khi kết thúc ribosom vẫn gắn mARN và 2 tARN tại vị trí P và E.
 Yếu tố tái sử dụng ribosom (RRF - Ribosome Recycling Factor)
giúp thu hồi bộ máy dịch mã cho chu kỳ mới. Ở Prokaryot:

– RRF gắn vào vị trí A, giả làm tARN, nó kéo EF-G vào ribosom và
đẩy các tARN ra khỏi ribosom theo cách tương tự ở quá trình nối
dài.
– Khi tARN bị loại ra, RFF và EF-G phóng thích khỏi ribosom cùng
với mARN.
Kết thúc dịch mã
Video 5: Translation Termination

Độ chính xác của quá trình dịch mã
Sai sót trong quá trình dịch mã sẽ tạo ra một protein bất hoạt, hoặc
là một protein điều hòa và xúc tác không phù hợp làm thay đổi sinh
lý của tế bào bình thường. Các sai sót đó là :
 Aminoacyl hóa tARN
Một tARN có thể nhận thêm một acid amin không đúng hoặc
enzyme aminoacyl-tARN synthetase dùng tARN có anticodon không
chuyên biệt cho các acid amin được gắn vào nó. Có một số acid
amin có cấu trúc tương tự với acid amin cần được đưa vào, cho
nên các enzyme aminoacyl-tARN synthetase cũng phải có cách
thức chọn đúng
 Enzyme isoleucyl-tARN synthetase :
– Phải phân biệt giữa isoleucin và các acid amin thơm nhỏ hơn như
Valin,
– Phải phân biệt giữa isoleucin với các acid amin trơ nước, cồng kềnh
hơn như leucin, phenylalanin.
 Cơ chế điều chỉnh xảy ra như sau :
Enzyme isoleucyl-tARN synthetase có 2 vị trí tác động, một vị trí xúc tác
thành lập aminoacyl-tARN (A) và vị trí thứ 2 (H), ở sát ngay vị trí thứ
nhất, thủy phân aminoacyl-tARN để cho ra acid amin tự do và tARN.
SƠ ĐỒ BƯỚC SỬA SAI AMINOACYL HÓA tARN CỦA ENZYME

SYNTHETASE.
a) Các acid amin lớn hơn isoleucin không vào được vị trí A (như
phenylalanin). Kết quả : phản ứng không xảy ra
A
H
Gộp 2 slide tiếp theo

vào cùng slide này.
Đua 3 hình chung một
hang ngang cho dẽ
theo dõi
A = VỊ TRÍ ACYL HÓA (ACYLATION); H = VỊ TRÍ THỦY PHÂN (HYDROLYTIC).

Val + tARN
Val - tARN
A
H
Val + tARN
b) Các acid amin nhỏ hơn isoleucin (như valin) vào vị trí A và tạo
aminoacyl-tARN, nhưng cũng đi vào được vị trí H nên bị thủy phân
thành 2 phần tARN và acid amin. Kết quả : phản ứng không xảy ra
IIe + tARN
IIe - tARN
c) Chỉ có isoleucin gắn vào vị trí A tạo isoleucyl-tARN nhưng không thể
gắn vào vị trí H và do đó không bị thủy phân. Kết quả : Acyl hóa chính
xác isoleucin
Nguyên nhân kết thúc sớm, kết thúc muộn
 Các sai sót của giai đoạn kết thúc có thể xảy ra do kết thúc sớm
hoặc kết thúc muộn do đọc quá:
 Sự đọc quá do lỗi của bộ máy dịch mã, không nhận ra bộ ba
dừng: acid amin được đưa vào và phiên dịch liên tục qua cả vùng
không mã hóa 3’mARN.
 Sự đọc quá cũng có thể do một đột biến ở bộ ba đối mã
(anticodon) nào đó làm cho bộ ba đối mã này giải mã được bộ ba
dừng (stop codon).
 Sai sót ở tỉ lệ 1/3000 gốc acid amin được kết hợp:
– Nếu một phân tử protein có 300 gốc acid amin thì chỉ 1 phân tử
protein trong 10 phân tử có chứa 1 lỗi
– Thường những lỗi này sẽ được định vị mà không quan trọng
đối với cấu trúc hoặc chức năng của protein.
Một số lớn các chất được biết ức chế một hoặc nhiều bước trong
quá trình sinh tổng hợp protein
 Những chất ức chế chọn lọc sự tổng hợp protein vi khuẩn mà
không ảnh hưởng tới sinh tổng hợp protein tế bào nhân thật.
 Có triển vọng sử dụng như những kháng sinh loại trừ sự nhiễm
khuẩn mà không ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa protein
của tế bào chủ
Các yếu tố ức chế quá trình dịch mã
Các chất ức chế dịch mã
Chất ức chế Chọn lọc trên Tác động ở giai đoạn
Chloramphenicol Nhân nguyên Nối dài : ức chế peptidyl transferase

thủy
Cycloheximide Nhân thật Nối dài : chưa rõ cơ chế
Erythromycin Nhân nguyên Nối dài : ức chế sự chuyển peptid hóa
thủy
Acid fusidic Cả 2 giới (nhân Nối dài :ức chế sự phóng thích của EF-G (hoặc
nguyên thủy và EF-2) : phức hợp GDP
nhân thật)
Kanamycin Cả 2 giới Nối dài : gây đọc sai
Neomycin Cả 2 giới Khởi đầu và nối dài: mARN đọc nhầm
Furomycin Cả 2 giới Nối dài : gây kết thúc sớm
Sparsomycin Cả 2 giới Nối dài : ức chế peptidyl transferase
Spectinomycin Nhân nguyên Nối dài : ức chế chuyển peptid hóa
thủy
Streptomycin Nhân nguyên Nối dài : gắn vào 30S và ảnh hưởng tới tương tác
thủy codon – anticodon gây ra sự đọc nhầm của mARN
Tetracyclin Nhân nguyên Nối dài : phong bế việc gắn aminoacyl-tARN vào
thủy vị trí A

Sự Phiên Mã Và Mã Di Truyền

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Sự Phiên Mã Và Mã Di Truyền

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

SỰ PHIÊN MÃ VÀ

• Trình bày được quá trình phiên mã ở nhân nguyên thủy và

• Trình bày được quá trình phiên mã ngược và ý nghĩa

• Trình bày được các yếu tố điều hòa phiên mã

• Phân biệt được các loại ARN polymerase

• Nêu được bản chất của mã di truyền

Học thuyết trung tâm

Sơ đồ quá trình phiên mã

Video 1: mRNA Synthesis (Transcription)

ARN polymerase phụ thuộc ADN bám vào ADN

- Cần cung cấp các ribonucleotid triphosphat : ATP, GTP,

- ARN polymerase là một holoenzym  cần co-factor:

Phiên mã gồm các bước chính:

Video 2: Stages of Transcription

• ARN polymerase cùng với yếu tố sigma gắn với

• Khi phức hợp ADN-ARN đạt chiều dài 12 base  đầu

- Tiểu đơn vị σ có thể tách ra thuận nghịch từ

Holoenzym Core enzym

Vị trí gắn của ARN polymerase trên ADN

- Promoter gồn hai trình tự:

1. TATAAT: hộp TATA hay hộp Pribnow

 Không phải promoter nào cũng có cùng hai trình tự

- Bị thoái hóa do hệ thống enzym endonuclease và

- ARN gắn với phức hợp “ADN khuôn – ARN

- Ribosom gắn vào vị trí gắn ribosom ở phía đầu 5’ của

Ở tế bào nhân nguyên thủy, quá trình phiên mã và dịch

- Ở E. coli, có hai cơ chế kết thúc:

2 Kết thúc lệ thuộc yếu tố Rho

ARN ARN nhỏ,

Loại Vị trí Bản sao Độ nhạy α-

Polymerase II Dịch nhân Pre-mARN Rất nhạy cảm

Polymerase III Dịch nhân 5S rARN, tARN và Nhạy cảm trung

Phiên mã do ARN polymerase I

3. Sắp xếp các yếu tố điều hòa và yếu tố phiên mã

o Gồm hai tiểu đơn vị

o Gồn hai tiểu đơn vị RAP30 và RAP74

o RAP74 có hoạt tính helicase (phá vỡ liên kết hydro)  tách

- Các gen do RNAPIII phiên mã thường chứa <300 nucleotid.

• Gen 5S rARN không có intron

• Gen tARN có nhiều intron nhỏ

• Là enzym lớn nhất trong 3 loại RNAP

• Gồm 17 tiểu đơn vị

o Chỉ cần thiết cho phiên mã gen 5S rARN

o Gồm một chuỗi polypeptid đơn

o Gắn với ADN theo mô hình ngón tay kẽm

o Gồm ba tiểu đơn vị

o Một tiểu đơn vị là TBP (TATA-box binding

o Gồm sáu tiểu đơn vị

o Cần thiết cho tất cả các promoter

- TFIIIA gắn vào vị trí trong vùng promoter

- Cuối cùng, RNAPIII gắn và thực hiện phiên mã

Video 3: Transcription Factors

Video 4: Processing of Gene Information:

• Khác với ARN polymerase, enzym phiên mã ngược cần dùng

• Sản phẩm đầu tiên là chuỗi kép lai ARN-ADN

• ARN virus trong chuỗi kép bị hủy bởi RNAse H

• Chuỗi kép ADN tích hợp vào ADN tế bào chủ

1961, F. Crick chứng minh “codon gồm 3 nucleotid

• Chỉ methionin và tryptophan có 1 codon mã hóa

1. Mô tả cấu trúc các loại ARN

2. Trình bày vai trò của các ARN

3. Mô tả cách thức biến đổi ARN

Lấy thông tin di truyền từ ADN để tổng hợp protein

ARN Chức năng