TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ

DOĞRUDAN GEN AKTARIMI

 Gen Aktarımının Prensipleri
Genetik transformasyon aşaması;

i. Yabancı nükleik asit molekülünün hücreye girişi

ii. Genoma bağlanması

iii. Genin anlatımının yapılması

iv. Yavru döllere aktarımı

 Aktarılacak DNA parçası;

i. Aktarılmak istenen genin promotor geni,

ii. Sadece gen aktarımı yapılan hücre ve dokuların

seçimi için seçici (markör) geni,

iii. Aktarılan genin bitkide ifade edilip edilmediği

anlamak için raportör genden oluşur.
 Gen Aktarım Sistemleri
Bitkilere gen aktarımında kullanılan teknikler, hücre
duvarından, plazma ve nükleus zarında geçebilecek ve
hücreye zarar vermeyecek şekilde geliştirilmiştir.

A. Dolaylı gen aktarımı (A. tumefaciens ve A. rhizogens)

B. Doğrudan gen aktarımı

 Gen Aktarım Sistemleri
A. Dolaylı gen aktarımı (A. tumefaciens ve A. rhizogens)

Gen aktarımı iki çenekli bitki türüne başarıyla

yapılabilmektedir.

Tek çenekli bitki türünde çoğunlukla etkin değildir.

 Gen Aktarım Sistemleri
B. Doğrudan gen aktarımı – Kullanılan yöntemler

a. Mikro-enjeksiyon

b. Biyolistik (Partikül tabancası)

c. Protoplastlara gen aktarımı

i. Kimyasal yöntem

ii. Elektroporasyon
 Doğrudan Gen Aktarımı
a. Mikroenjeksiyon

Doğrudan gen aktarımı yöntemleri arasında en kesin

biçimde hücrenin istenilen bölmesine DNA’nın enjekte
edilmesini sağlayan mikro-enjeksiyon, kapiller mikropipetler
yardımıyla ve mikroskop altında gerçekleştirilir. Mikro-
enjeksiyonla protoplastlara, izole edilmiş hücrelere, kallus,
meristemler, zigotik ve mikrospor türevli proembriyolar gibi
çok hücreli dokulara DNA aktarımı mümkündür.
a. Mikroenjeksiyon

Alıcı hücreler veya dokular sodyum alginat, agaroz

veya poli-L-lisin ile ya da kapiler sistem kullanılarak
sabitlenir.DNA mikromanipülatör sistemine bağlı kapiler
bir mikropipet aracılığı ile doğrudan hücrenin çekirdeğine
aktarılır.
a. Mikroenjeksiyon yönteminin avantajları

✦ Aktarılan DNA’nın miktarı optimize edilebilir.

✦ Ġstenilen hücreye DNA aktarılabilir.
✦ Ġstenilen hücre kısmına DNA aktarımı görsel olarak kontrol
edilebilir.
✦ Mikrosporlar ya da birkaç hücreli proembriyolar gibi küçük
boyutlu hedef dokular kullanılabilir.
✦ Zigotik embriyo kültürü ve mikro-enjeksiyon yöntemleri
birlikte kullanılarak her bitki türüne gen aktarımı yapabilmek
mümkün olabilir.
a. Mikroenjeksiyon yöntemi
b. Biyolistik (partikül bombardımanı)

Bu yöntemin esası, yüksek derecede hızlandırılmış mikro-

taşıyıcı adı verilen 1-2 µm çapındaki metal (çoğunlukla
altın ya da tungsten) partiküller aracılığıyla, bir ateşleme
mekanizmasından yararlanılarak DNA’nın hedef dokulara
aktarılmasıdır
b. Biyolistik (partikül bombardımanı)

Mikro-taşıyıcılar makro-taşıyıcı olarak adlandırılan

plastik bir silindir üzerinden hedef dokulara doğru bir
helyum gazı basıncı ile hızlandırılır. Ateşleme gerek
mikro-taşıyıcıların sürtünmesinden doğan sürüklenmeyi,
gerekse yüksek basınçlı gaz şokundan doğabilecek hücre
parçalanmasını ve sesi engellemek için vakum altında
yapılır.
Biyolistik: Gen aktarım frekansını etkileyen faktörler

1. Partikül hızlandırmada kullanılan helyum gazının basıncı:

Gaz hızlandırma tüpündeki helyum basıncı, mikro-
partiküllerin hızının belirlenmesinde etkilidir. Partikülü
hızlandırmak amacıyla, kullanılan dokunun özelliğine bağlı
olarak 450 ile 2200 psi basınç uygulanır. Ancak, çoğu hücre
tipi için optimal basınç 1000 psi olarak belirlenmiştir. Bu
değerden daha yüksek basınçlarda hücrelerde yaralanma
düzeyi artar ve gen aktarım frekansı düşer.
Biyolistik: Gen aktarım frekansını etkileyen faktörler

2. Mikro-taşıyıcının boyutu, tipi ve sayısı: Tungsten partiküllerin

ortalama çapları µm olup, optimum boyut hedef hücrelerin çapı ile
ilişkilidir. Ancak 1.0 µm çaplı partiküllerin, başarılı geçici ve stabil
transformasyonlar için uygun olduğu saptanmıştır. Tungsten
partiküllerinin kullanımının dezavantajları; düzensiz şekil ve
boyutta olmaları, belli hücre tipleri için toksik etki göstermeleri ve
DNA çökelmesi ile sonuçlanabilecek yüzey oksidasyonuna neden
olmalarıdır. Uniform boyutta olan (1-3 µm) altın partikülleri ise
tungstenden daha pahalı olmalarına karşın daha az toksik etkiye
sahiplerdir.
Biyolistik: Gen aktarım frekansını etkileyen faktörler

3. Makro-taşıyıcı ile hedef doku arasındaki uzaklık:

Maksimum etkinlikte transformasyon elde etmek için
makro-taşıyıcı ile hedef doku arasındaki uzaklık (uçuş
mesafesi) önemli bir parametredir. Her hücre tipi için bu
mesafenin deneme yoluyla belirlenmesi gerekmekle
birlikte, pek çok örnekte 10 mm’ lik uçuş mesafesi
kullanılarak yüksek transformasyon frekansı elde
edilmiştir.
Biyolistik: Gen aktarım frekansını etkileyen faktörler

4. DNA’nın mikro-taşıyıcı partiküllere yapışması için

kullanılan spermidin ve CaCl2’ün konsantrasyonu.
Biyolistik: Başlıca üstünlükleri
1. Kullanım kolaylığı,

2. Her ateşlemede mikro-taşıyıcıların birden fazla hücreye

ulaşabilmesi,

3. Mikro-taşıyıcılara bağlı genlerin biyolojik aktivitelerinin

bozulmaması,

4. Polen, hücre kültürleri, bitki organları, meristemler, kallus,

olgunlaşmamış embriyo, olgun embriyo parçaları, yaprak
parçaları, mikrosporlar gibi çeşitli hedef dokulara
uygulanabilmesi,

5. Mikro-taşıyıcıların derin hücre katmanlarına ulaşabilmesidir.

Biyolistik cihazı
Biyolistik cihazı
c. Kimyasal yöntem:
PEG aracılığıyla transformasyon;
d. Elektroporasyon yöntemi
d. Elektroporasyon yöntemi
Gen aktarımında yaygın olarak kullanılan yöntemlerin
karşılaştırılması
Gen aktarımında yaygın olarak kullanılan yöntemlerin
karşılaştırılması