Dolaylı Gen Aktarımı

Agrobacterium Aracılığıyla Gen Transferi

Bitkilerde dolaylı transformasyon, Agrobacterium
tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes gibi plazmid
bulunduran bakteriler aracılığıyla yapılan yöntemdir.
Agrobacterium, toprakta yaşayan gram-negatif bir
bakteridir. Bitkilerde tümör ve saçak kök oluşumuna neden
olmaktadır.
Agrobacterium enfeksiyonu sonucunda T-DNA
bölgesi bitki hücrelerine aktarılmakta ve kromozomlarla
stabil olarak bütünleşmektedirler.
 Agrobacterium Aracılığıyla Gen Transferi
Agrobacterium hücresinde bulunan Ti plazmidi
ve gen aktarımında gerekli olan öğeler vardır. Bunlar
T-DNA bölgesi

Virülens bölgesi

Kromozomal genler
 1. T-DNA bölgesi
T-DNA bölgesi, bakteriden bitki hücresine
aktarılarak bitkinin genomuyla birleşen küçük bir DNA
parçasıdır.
Fitohormon ve opin sentezleyen enzimleri
kodlayan genleri içerirler. Bu genler bitkiye
aktarıldığında bitkide tümör oluştururlar (onkogenler).
Opin türlerine bağlı olarak oktopin ve napolin tipi
vardır.
Agrobacterium’ da T-DNA bölgesi
Oktopin ve napolin tipi plazmitlerin T-DNA
bölgleri, sağ ve soldan 24 bp uzunluğundaki düzensiz
nükletid dizileri ile sınırlandırılmıştır.
 T-DNA bölgesinde tümör oluşturan genlerin kesici
enzimler yardımıyla T-DNA bölgesinden çıkarılması bitki
hücresine gen aktarımını engellememektedir.
T-DNA’ nın sağ sınırın nükleotidleri gen
aktarımında gerekli iken sol sınır nükleotidleri dizisindeki
eksilmede bitki hücresine gen aktarımını
engellememektedir.
 2. Virülens (vir) bölgesi
Bu bölge, T-DNA aktarımında gerekli olan
ürünlerin önemli bir kısmını sağlamaktadır.
Vir bölgesinde, T-DNA aktarımında mutlaka gerekli
olan ve gerekli olmayan operonlar vardır.
 VirA geni, yaralı bitkilerin salgıladığı fenolik
bileşikleri tanır ve onlarla bağlantı kurar.
VirG geni, kendi ve diğer vir genleri için
transkripsiyon işlemcisi görevini yapar.
VirD, T-DNA iplikçiğinin rejenerasyonunu sağlar.
VirC, T-DNA’ nı sınırlardan kesilmesinde görev alır.
VirB ve VirE operonları, T-DNA’ nın bitki hücresine
hareketinde görev alır.
VirH ve VirF operonları T-DNA transferinde gerkli
değildir.
 3. Kromozomal genler
Bakterinin kendi kromozomu üzerinde dört adet
lokus bulunmaktadır. Bunlar;
chvA, chvB, pscA ve attR
- Bakterinin bitki hücrelerine tutunmasını
- Yaralanmış bitki dokularında bakterinin çoğalmasını
- Ti plazmidi üzerinde bulunan vir genlerinin
düzenlenmesinde etkilidir.
 Kromozomu üzerinde bulunan chvA, chvB, pscA ve
attR lokuslar.
 T-DNA Aktarımının Moleküler Mekanizması
T-DNA’ nın bitki hücrelerine aktarımı 4 ana aşmada
gerçekleşmektedir.
1) Agrobacterium bitkiye tutunur ve koloni
oluşturur
2) Vir genleri uyarılır
3) T-DNA transferi
4) T-DNA’ nın bitki genomuna entegrasyonu
1) Agrobacterium bitkiye tutunması ve koloni oluşturması
Agrobacterium’ un bitki hücrelerine tutunması ve
koloni oluşturması tümör oluşumu için gerekli olan ilk
aşamadır.
Agrobacterium hücrelerinin yüzeylerindeki
polisakkaritlerin bitki hücrelerine tutunmada önemli rolleri
vardır.
attR lokusu bakterinin bitki hücresine tutunmasını
için gerekli olan genleri taşır.
1) Agrobacterium bitkiye tutunması ve koloni oluşturması
Bakteri hücre duvarına tutunduktan sonra bakteri
tarafından selüloz lifleri sentezlenmekte ve böylece bitki
hücre duvarında çok sayıda bakteri yığılması
gözlenmektedir.
Kromozomal chvA, chvB ve pscA lokusları, vir
genlerinin şeker sentezlemesinde ve bundan dolayı da
bakterinin tutunmasında rol oynamaktadır.
2) Virülens genlerin uyarılması
Bakteri bitki hücresine tutunduktan sonra,
yaralanmış bitki hücresinden salgılanan fenolik bileşikler,
Agrobacterium tarafından algılanmasıyla T-DNA aktarımı
başlatılır.
Bu fenolikler bakterideki vir genlerini uyarır.
Fenolik bileşikler bitki türleri ve dokuları arasında
farklılık göstermektedir. Bu durum T-DNA transferini
etkilemektedir.
2) Virülens genlerin uyarılması
Yaralanmış hücre tarafından salgılanan sinyal
proteinlerini (fenolik bileşikleri) VirA proteini yakalar.
VirA kendi fosfatını VirG proteinine aktarır ve daha
sonra diğer vir genlerin ifadelerinin düzenlenmesinde
transkripsiyonl faktör olarak görev yapar.
VirG proteini tarafından uyarılan vir genlerine ait
proteinlerin önemli bir kısmı Ti plazmidinden bitki
hücresine T-DNA aktarımında doğrudan görev almaktadır.
3) T-DNA Transferi
Vir genlerinin uyarılması sonucunda T-DNA’ nın alt
sarmalına homolog, tek sarmal bir DNA molekülü üretilir.
VirD proteinleri T-DNA sınır bölgelerindeki
nükleotidleri tanır ve bu noktalarda çentik oluşturur
(Endonükleaz etkisi).
VirD proteini, alt sarmalı sağ sınır bölgesinden
kestikten sonra bu sarmalın 5’ ucunda bağlı kalarak
ekzonükleolitik degredasyonu engellemektedir.
3) T-DNA Transferi
VirE proteini tek iplikçiği kaplayarak nükleaz
enziminin olumsuz etkisinden korur. Ayrıca T-iplikçiğini
sararak, kompleksin çapını 2 nm’ ye kadar düşürür ve
hücre zarı açıklıklarında geçişini kolaylaştırır.
VirB proteini bakteri ve bitki hücre zarından T-
Kompleksinin geçebileceği büyüklükte açıklık oluşturur.
Agrobacterium’ dan bitki hücresine T-DNA Transferi
4) T-DNA’ nın bitki genomuna entegrasyonu
Bitki hücresi içerisinde tek sarmal T-DNA
kompleksinin çekirdek zarını geçerek kromozomlara
yönelmesinde en önemli görevi VirD ve VirE proteinleri
üstlenmektedir.
T-DNA’ nın kromozomlarla birleşme mekanizması
tam olarak bilinmemekle birlikte, ortamdaki enzimlerin bu
olayda önemli rol oynadıklarına ilişkin bulgular vardır.
4) T-DNA’ nın bitki genomuna entegrasyonu
VirD’ nin bağlı olduğu T-iplikçiği ve bitki DNA’
sında mikro-homolog bölgeler açılmakta ve T-DNA’ nın
bu bölgeleri ile bitki DNA’ sında bulunan bölgeler
arasında temas kurulmakta.
T-iplikçiği bitkinin alt sarmal DNA’ sı ile
birleşmektedir.
Tek iplikli T-DNA, çift iplikli hale getirilir
Ti Plazmitlerin Bitkilere Gen Aktarımında Kullanımı
Onkogenik Ti plazmidleri ile T-DNA aktarımı
yapılan bitki hücrelerinde kontrolsüz fitohormon üretimi
meydana geldiğinden, tümör dokularından normal
transgenik bitkilerin elde edilmesi oldukça güç olmaktadır.
T-DNA bölgesinde bulunan ve opin sentezini
sağlayan genler ile tümör oluşumuna neden olan onc
genlerinin T-DNA aktarımında işlevleri bulunmamaktadır.
Bu genler kesici enzimler ile kesilerek yerine
yabancı genler klonlanabilir.
Ti Plazmitlerin Bitkilere Gen Aktarımında Kullanımı
Non-onkojenik plazmitler aracılığıyla T-DNA
aktarımı yapılmış bitki hücreleri, normal hücreler gibi
davranmaktadır. Yani transgenik bitkileri normallerinden
ayırmak imkansız olmaktadır.
Gen aktarılmış bitkilerin seçimi için seçici işaret
(markör) genleri geliştirilmiştir.
Örneğin herbisitlere, antibiyotiklere dayanıklılık
geni.