การสกัด

1.สกัดด้วยน้าร้อน
การกลั่นด้วยน้าร้อน (Water distillation & Hydro-distillation) เป็นวิธีที่ง่ายที่สุดของการกลั่นน้ามัน
หอมระเหย การกลั่นโดยวิธีนี พืนที่กลั่นต้องจุ่มในน้าเดือดทังหมด อาจพบพืชบางชนิดเบา หรือให้ท่อไอน้าผ่านการ
กลั่น น้ามันหอมระเหยนีใช้กับของที่ติดกันง่ายๆ เช่น ใบไม้บางๆ กลีบดอกไม้อ่อนๆ
ข้อควรระวัง ในการกลั่นโดยวิธีนีคือ พืชจะได้รับความร้อนไม่ส ม่้าเสมอ ตรงกลางมักจะได้ความร้ อน
มากกว่าด้านข้าง จะมีปั ญหาในการไหม้ของตัว อย่าง กลิ่ นไหม้จะปนมากับน้ามันหอมระเหยและมีส ารไม่พึง
ประสงค์ติดมาในน้ามันหอมระเหยได้ วิธีแก้ไข คือ ใช้ไอน้า หรืออาจใช้ closed steam coil จุ่มในหม้อต้ม แต่การ
ใช้ steam coil นีไม่เหมาะกับดอกไม้บางชนิด เพราะเมื่อกลีบดอกไม้ถูก steam coil จะหดกลายเป็น glutinous
mass จึงต้องใช้วิธีใส่ลงไปในน้า กลีบดอกไม้จะสามารถหมุ นเวียนไปอย่างอิสระในการกลั่น เปลือกไม้ก็เช่นกัน ถ้า
ใช้วิธีกลั่นด้วยน้า น้าจะซึมเข้าไปและน้ากลิ่นออกมา หรือกลิ่นจะแพร่กระจายออกจากเปลือกไม้ได้ง่ายขึน ดังนัน
การเลือกใช้วิธีการกลั่นจึงขึนกับชนิดของพืชที่น้ามากลั่นด้วย
https://www.sentangsedtee.com/farming-trendy/article_97896

2.ใช้ Methanol extract

ยกตัวอย่างการเตรียมสารสกัดจากเห็ดหลินจือในตัวท้าละลายเมทานอลและน้า
น้าตัวอย่างเห็ดหลินจือแห้ง จากร้านจ้าหน่ายหน่ายสินค้าในโครงการพิเศษ ตังอยู่ที่กรุงเทพ จ้านวน 420
กรัม อบแห้งที่อุณหภูมิ 40-50 °C และ น้ามาบดละเอียด แบ่งตัวอย่างที่บดละเอียดเป็น 2 ส่วน ส่วนแรกน้าไปสกัด
ด้วยตัวท้าละลายที่เป็น 100% เมทานอล (AR grade, Merck, Germany) ปริมาตร 2 ลิตร โดยแช่เห็ดหลินจือใน
เมทานอล ประมาณ 1 สัปดาห์
ในขณะส่วนที่สองสกัดด้วยน้า ด้วยการต้มในน้าเดือดที่มีปริมาตร 2 ลิตร เช่นเดียวกันประมาณ 1 ชั่วโมง
จากนั นน้ าเห็ ดหลิ น จื อจากการเตรี ย มทั งสองวิ ธี มาแยกกากและตะกอน ด้ว ยผ้ าขาวบางและกระดาษกรอง
(Millipore, USA) ตามล้าดับ น้าสารละลายไประเหยแห้งด้วย rotary evaporator (Buchii, Switzerland) และ
freeze dryer (Labconco, USA) จนแห้งสนิท เก็บสารสกัดในที่มืด อุณหภูมิ 4 °C เพื่อน้าไปทดสอบคุณสมบั ติ
ทางชีวภาพต่อไป
file:///C:/Users/User/Downloads/thaijtox,+%7B$userGroup%7D,+73-86%20(2).pdf
การทดสอบในส่วนของ Antioxidant
1.ทดสอบ phenolic content
สารประกอบฟีนอลิก (phenolic compounds) หรือสารประกอบฟีนอล เป็นสารที่พบตามธรรมชาติใน
พืชหลายชนิด เช่น ผักผลไม้ เครื่องเทศ สมุนไพร ถั่วเมล็ดแห้ง เมล็ดธัญพืช ซึ่งถูกสร้างขึนเพื่อประโยชน์ในการ
เจริ ญเติบ โต สารประกอบฟีน อลมีโ ภชนเภสั ช ซึ่งสรรพคุณที่ดีต่อสุ ขภาพคือ มีส มบัติเป็นสารต้านอนุมูลิ สระ
(antioxidant) สามารถละลายได้ในน้า
การหาปริ ม าณสารประกอบฟี น อลทั งหมด (total phenolic content) โดยวิ ธี Folin-Ciocalteu’s
metho
น้าสารสกัดหยาบที่มีความเข้มข้น 25, 50 และ 100 mg.ml-1 ปริมาตร 200 µl ใส่ลงในหลอด ทดลอง
เติม 1.0 ml ของ 10 % Folin-Ciocateu’s regent จากนันใส่ 1.0 ml ของ 7 % Na2CO3 ปรับปริมาตรด้วยน้า
กลั่นให้มีปริมาตร 5 ml เขย่าให้เข้ากัน ทิงไว้ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จนปฏิกิริยาเกิดสมบูรณ์
น้าไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 765 nm ด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ ท้าซา้ ทังหมด 3 ครัง น้าไปเปรียบเทียบกับ
กรดแกลิกมาตรฐาน
file:///C:/Users/User/Downloads/tujo,+Journal+manager,+2.%E0%B8%9A%E0%B8%97%E0%B8%84%E
0%B8%A7%E0%B8%B2%E0%B8%A1_%E0%B8%AD.%E0%B8%94%E0%B8%A3.%E0%B8%98%E0%B8%B2%E0%
B8%A3%E0%B8%97%E0%B8%B4%E0%B8%9E%E0%B8%A2%E0%B9%8C%20(1).pdf

2.ทดสอบ DPPH
DPPH assay เป็ น วิธีการวิเคราะห์ ความสามารถในการเป็นสารต้านออกซิเดชัน (antioxidant) ซึ่งใช้
reagent คือ 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl เป็นวิธีที่สะดวก รวดเร็ว ง่ายต่อการวิเคราะห์ ให้ความถูกต้องและ
แม่นย้าสูง
หลักการ
DPPH เป็น stable radical ในตัวท้าละลายเมทานอล (methanol) สารละลายนีมีสีม่วง ซึ่งดูดกลืนแสง
ได้ดีที่ความยาวคลื่น 515-517 นาโนเมตร (nm)
การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ
วิธี DPPH free radical scavenging ใช้วิธีของ Gülcin et al. (2003) ความสามารถในการจับกับสารอนู
มูลอิสระท้าได้โดยการผสมสารตัวอย่าง 0.5 มิลลิลิตร กับสารละลาย 1.5 มิลลิลิตร ของDPPH ใน ethanol (0.1
มิลลิโมลาร์) ส่วนตัวอย่างควบคุมจะประกอบด้วยเมธานอล 0.5 มิลลิลิตร กับสารละลาย 1.5 มิลลิลิตร ของ DPPH
น้าตัวอย่างมาเขย่าแล้วตังทิงไว้เป็นเวลา 30 นาที วัดค่าดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตร การค้านวณค่าการยับยัง
สารอนุมูลอิสระ ดังนี
เปอร์เซ็นต์การยับยัง = [(ค่าดูดกลืนแสงของตัวอย่างควบคุม - ค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างทดลอง)/ค่า
ดูดกลืนแสงของตัวอย่างควบคุม] x 100
ค่าการยับยังที่ 50 เปอร์เซ็นต์ ค้านวณจากการสร้างกราฟระหว่างค่าเปอร์เซ็นต์การยับยังกับความเข้มข้น
ของสารสกัด
file:///C:/Users/User/Downloads/930_CUnit3%20%E0%B8%95%E0%B8%A3%E0%B8%87.pdf

3.ทดสอบ FRAP
FRAP assay ห รื อ Ferric reducing antioxidant power เ ป็ น อี ก วิ ธี หนึ่ ง ที่ ใ ช้ ใ น ก าร ตร ว จสอบ
ความสามารถในการต้าน ออกซิเดชัน โดยอาศัยปฏิกิริยารีดอกซ์และติดตามการเปลี่ยนแปลงสีของสารประกอบ
เชิงซ้อน คือเมื่อสารประกอบเชิงซ้อน ferric tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ) ได้รับอิเล็ กตรอน จากสารต้าน
ออกซิเดชัน แล้วจะ เปลี่ยนไปอยู่ในรูปสารประกอบเชิงซ้อน ferrous tripyridyltriazine (Fe2+-TPTZ) ที่มีสีม่วง
น้าเงิน
วิธี Ferric reducing antioxidant power (FRAP)
การทดสอบฤทธิ์ ต้ า นอนุ มู ล อิ ส ระด้ ว ยวิ ธี Ferric reducing antioxidant power ใช้ วิ ธี ข อง Li et al.
(2006) การเตรี ย มสารละลาย FRAP ประกอบด้ว ย 10 มิล ลิ โ มลาร์ของสารละลาย TPTZ ใน 40 มิล ลิ โ มลาร์
hydrochloric acid 20 (มิลลิลิตร), 20 มิลลิโมลาร์ ferric (III) chloride (20 มิลลิลิตร) และอะซิเตทบัฟเฟอร์ (5
มิลลิลิตร, 300 มิลลิโมลาร์, ph 3.6) โดยต้องเตรียมใหม่ทุกครัง ในการทดลองน้าตัวอย่าง 0.1 มิลลิลิตร ผสมกับ
FRAP Reagan ( 1.5 มิลลิลิตร ) และ 1.4 มิลลิลิตร ของอะซิเตทบัฟเฟอร์ ( 300 มิลลิโมลาร์ , PH 3.6 จากนันทิง
ไว้ ที่ อุ ณ หภู มิ ป กติ 30 นาที และน้ า ไปวั ด ค่ า การดู ด กลื น แสงที่ 593 นาโนเมตร โดยใช้ gallic acid เป็ น สาร
มาตรฐาน FRAP value ค้านวนออกมาในหน่วยมิลลิกรัมสมมูลกรดแกลลิกต่อกรัมสารสกัด

file:///C:/Users/User/Downloads/930_CUnit3%20%E0%B8%95%E0%B8%A3%E0%B8%87.pdf
อุปกรณ์
1. เครื่องชั่ง
2. สเปกโตรโฟโตมิเตอร์
3. เครื่องแก๊สโครมาโทกราฟี-แมสสเปกโทรเมทรี
4. หม้อต้ม
5. ตู้อบลมร้อน
6. กรวยกรอง
7. กระดาษกรอง
8. ขวดวัดปริมาตร
9. ขวดเก็บตัวอย่าง
10. บีกเกอร์
11. กระบอกตวง
12. ขวดรูปชมพู่
13. หลอดทดลอง
14. คิวเวตแก้ว
15. โกร่งบดยา
16. ผ้าขาวบาง
17. หลอดหยด