BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA LIPID MÁU CỦA

CHẾ PHẨM TỪ BỘT SẤY PHUN ĐÀI HOA CỦA

CÂY BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, 2022

1
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA LIPID MÁU CỦA

CHẾ PHẨM TỪ BỘT SẤY PHUN ĐÀI HOA

CỦA CÂY BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae)

TRÊN CHUỘT NHẮT

NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 62720405

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. NGUYỄN PHƯƠNG DUNG

TP. HỒ CHÍ MINH, 2022

 LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các
kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách
quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào.

Tác giả luận án

 MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT ................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH.............................................................................. vi
MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ............................................................................3
1.1. Rối loạn lipid máu .........................................................................3
1.2. Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae) ...........................36
1.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của thuốc lên chuyển hóa lipid...44
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................51
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................51
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................53
2.4. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu ...........................................70
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ..............................................................................71
3.1. Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ
đài hoa của cây Bụp giấm ..............................................................................71
3.2. Xác định quy trình bào chế, tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của
cốm Bụp giấm từ Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm .......................................74
3.3. Tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển hóa
lipid ................................................................................................................90
3.4. Tác dụng điều hòa lipid máu và tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ
của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng .........................................................96
3.5. Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên
chuột nhắt .....................................................................................................106
CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN ........................................................................114
4.1. Liều có tác dụng của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm ...........114
4.2. Cốm Bụp giấm ...........................................................................116
4.3. Tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển hóa
lipid ..............................................................................................................121
 4.4. Tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu và dự phòng gan nhiễm mỡ
không do rượu của cốm Bụp giấm ...............................................................127
4.5. Độc tính của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt .............................132
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................135
Kết luận .............................................................................................135
Kiến nghị...........................................................................................137
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
 i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
ALP Alkaline phosphatase Alkaline phosphatase
ALT Alanine transaminase Alanine transaminase
AMPK 5’adenosine Adenosin 5 monophosphat
monophosphate-activated kích hoạt bởi protein kinase
protein kinase
AST Aspartate transaminase Aspartate transaminase
BG Hibiscus Bụp giấm
BSP Spray drying powder Bột sấy phun
BTMXV Atherosclerotic Bệnh tim mạch xơ vữa
cardiovascular disease
CVD Cardiovascular disease Bệnh tim mạch
CE Cholesterol ester Cholesterol ester
DĐVN Vietnamese Pharmacopoeia Dược điển Việt Nam
GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate Enzym Glyceraldehyd 3-
dehydrogenase phosphat dehydrogenase
HDL High density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao
HMGCR HMG coenzym reductase HMG coenzym reductase
IDL Intermediate density Lipoprotein tỷ trọng trung
lipoprotein gian
LD50 Lethal dose 50 Liều làm chết 50% động vật
thử nghiệm
LDL Low density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp
LDLR Low density lipoprotein Thụ thể LDL
receptor
LPL Lipoprotein lipase Lipoprotein lipase
 ii

LRP LDL receptor related protein Protein liên quan thụ thể
lipoprotein tỷ trọng thấp
LXR Liver X receptor Thụ thể X của gan
NAFLD Non-alcoholic fatty liver Bệnh gan nhiễm mỡ không
disease do rượu
NASH Non-alcoholic Viêm gan nhiễm mỡ không
steatohepatitis do rượu
NHANES National health and nutrition Khảo sát nghiên cứu về sức
examination survey khỏe và dinh dưỡng quốc gia
PCSK9 Proprotein converse Proprotein converse
subtilisin/kexin 9 subtilisin/kexin 9
PL Appendix Phụ lục
PP Phospholipid Phospholipid
RLLM Dyslipidemia Rối loạn lipid máu
SREBP Sterol regulatory element – Yếu tố gắn protein điều hòa
binding protein sterol
TG Triglyceride Triglycerid
THA Hypertension Tăng huyết áp
VLDL Very lowdensity lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng rất thấp
 iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm của các thuốc statin .......................................................20
Bảng 1.2. Phân loại các thuốc statin ..............................................................20
Bảng 1.3. Một số dược liệu được sử dụng dự phòng và điều trị rối loạn lipid
máu .................................................................................................................29
Bảng 1.4. Một số bài thuốc (công thức phối hợp) được sử dụng dự phòng và
điều trị rối loạn lipid máu ..............................................................................31
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu đánh giá tác động của thuốc lên quá trình chuyển
hóa lipid mức độ phân tử và tế bào ................................................................45
Bảng 1.6. Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng chế độ ăn .....................47
Bảng 1.7. Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339) ....48
Bảng 2.1. Các công thức bào chế được khảo sát ...........................................56
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu thử nghiệm trong theo dõi độ ổn định .......................61
Bảng 2.3. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc ..........................61
Bảng 2.4. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường .......................................61
Bảng 2.5. Trình tự các nucleotid của các mồi (primer) .................................63
Bảng 3.1. Nồng độ lipid máu của các lô thử nghiệm tại thời điểm ban đầu ........71
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát các công thức phối hợp bào chế cốm Bụp giấm ......75
Bảng 3.3. Độ ẩm của cốm Bụp giấm .............................................................77
Bảng 3.4. Độ đồng đều khối lượng của cốm Bụp giấm.................................77
Bảng 3.5. Độ tan của chế phẩm cốm Bụp giấm.............................................78
Bảng 3.6. Phản ứng thay đổi màu trong các môi trường của anthocyanin ....79
Bảng 3.7. Hàm lượng hoạt chất trong 3 lô cốm Bụp giấm ............................82
Bảng 3.8. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh delphinidin-3-O-sambubiosid
trong 6 lần tiêm mẫu liên tiếp ........................................................................82
Bảng 3.9. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh cyanidin-3-O-sambubiosid trong
6 lần tiêm mẫu liên tiếp..................................................................................83
 iv

Bảng 3.10. Kết quả diện tích đỉnh theo nồng độ delphinidin-3-O-sambubiosid
và cyanidin-3-O-sambubiosid ........................................................................84
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ lặp lại quy trình định lượng delphinidin-3-O-
sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm ....................85
Bảng 3.12. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng delphinidin-3-O-
sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm ..................86
Bảng 3.13. Kết quả theo dõi độ ổn định của cốm Bụp giấm ở điều kiện lão hóa
cấp tốc ............................................................................................................87
Bảng 3.14. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm ban đầu ............87
Bảng 3.15. Kết quả theo dõi độ ổn định của cốm Bụp giấm ở điều kiện bảo dài
hạn ..................................................................................................................88
Bảng 3.16. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm sau 6 tháng ......89
Bảng 3.17. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm sau 12 tháng.......89
Bảng 3.18. Phần trăm gây độc của các mẫu trên dòng tế bào ung thư gan Hep
G2 ở các nồng độ khác nhau được xác định bằng phương pháp SRB ...........90
Bảng 3.19. Sự thay đổi biểu hiện các gene của các mẫu ...............................94
Bảng 3.20. Nồng độ lipid máu của các lô thử nghiệm tại thời điểm ban đầu .......96
Bảng 3.21. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm tại thời điểm ban
đầu ..................................................................................................................99
Bảng 3.22. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm sau 8 tuần gây
bệnh bằng dung dịch giàu lipid ......................................................................99
Bảng 3.23. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm tại thời điểm ban
đầu ................................................................................................................102
Bảng 3.24. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cốm Bụp giấm ...............106
Bảng 3.25. Kết quả theo dõi cân nặng của các lô trong thử nghiệm độc tính
bán trường diễn ............................................................................................107
Bảng 3.26. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 6 tuần của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn .................................................................110
 v

Bảng 3.27. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 12 tuần của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn .................................................................110
Bảng 3.28. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 6 tuần của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn .................................................................111
Bảng 3.29. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 12 tuần của các lô chuột trong
thử nghiệm độc tính bán trường diễn ...........................................................112
 vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Con đường chuyển hóa lipid ............................................................6
Hình 1.2. Sự điều hòa con đường mevanonate của SREBP-2 .......................12
Hình 1.3. Chuyển hóa lipid ở gan ..................................................................13
Hình 1.4. Cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae) ................................... 37
Hình 1. 5. Vị trí cây Bụp giấm trong bảng phân loại hệ thống thực vật........37
Hình 2.1. Đài hoa Bụp giấm ..........................................................................51
Hình 2.2. Hướng dẫn dự đoán tuổi thọ của thuốc theo ASEAN (2013) ........60
Hình 3.1. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý tại thời điểm ban đầu và sau 48
giờ tiêm tyloxapol ..........................................................................................72
Hình 3.2. Nồng độ lipid máu của các lô sau khi tiêm tyloxapol 48 giờ ........73
Hình 3.4. Quy trình bào chế cốm Bụp giấm, lô nghiên cứu ..........................76
Hình 3.4. Cốm Bụp giấm ...............................................................................77
Hình 3.5. Phản ứng thay đổi màu trong các môi trường của cốm Bụp giấm.....79
Hình 3.6. Sắc ký đồ của cốm BG và đài hoa Bụp giấm ở UV 365 nm và dưới
ánh sáng thường. ............................................................................................81
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC đánh giá tính đặc hiệu của quy trình định lượng
delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid .........................83
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa nồng độ và cường độ hấp
thu ......................................................................................................... 84
Hình 3.9. Kết quả điên di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi ở các nhiệt độ 54
o
C, 57 oC, 60 oC và 63 oC bằng RT-PCR. ......................................................91
Hình 3.10. Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi ở các nhiệt độ 54
o
C, 57 oC, 60 oC và 63 oC bằng RT-PCR (HMGCoA và AMPK). ................92
Hình 3.11. Kết quả khảo sát đường cong nóng chảy của các gen LDLR,
SREBP2, HMGCoA, AMPK .........................................................................93
Hình 3.12. Số lần làm tăng, giảm biểu hiện gen của các mẫu thử nghiệm ........95
 vii

Hình 3.13. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý không được điều trị tại thời điểm
ban đầu và sau 48 giờ tiêm tyloxapol ............................................................97
Hình 3.14. Nồng độ lipid máu so với ban đầu của các lô sau 48 giờ tiêm
tyloxapol ........................................................................................................98
Hình 3.15. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý, không được điều trị (mg/dl) ....100
Hình 3.16. Mức độ thay đổi nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm
sau 1 tuần điều trị so với thời điểm sau khi gây bệnh 8 tuần.......................100
Hình 3.17. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm sau 6 tuần ......102
Hình 3.18. Chỉ số lipid máu của các lô chuột trong thử nghiệm sau 4 tuần ......103
Hình 3.19. Chỉ số sinh hóa máu của các lô chuột trong thử nghiệm sau 4
tuần ...................................................................................................... 104
Hình 3.20. Trọng lượng các lô chuột trong 4 tuần thử nghiệm ...................104
Hình 3.21. Hình ảnh vi thể gan bình thường và viêm gan mạn tính mức độ nhẹ
có kèm thoái hóa mỡ ....................................................................................105
Hình 3.22. Lượng nước uống của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán
trường diễn ...................................................................................................109
Hình 3.23. Lượng thức ăn của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán
trường diễn ...................................................................................................109
Hình 3.24. Hình ảnh vi thể gan, thận của các lô trong thử nghiệm độc tính bán
trường diễn ...................................................................................................112
Hình 3.25. Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn .................................................................113
 1

MỞ ĐẦU
Các bệnh lý do oxy hóa đang có xu hướng gia tăng trong xã hội phát
triển. Trong số đó, rối loạn chuyển hóa lipid máu, nguyên nhân của các bệnh
xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành, viêm tụy, gan nhiễm mỡ, … có tỷ lệ ngày
càng cao [43], [90]. Hiện nay, việc điều trị rối loạn lipid máu chủ yếu sử dụng
những nhóm thuốc hóa dược như statin, fibrat, ezetimib hay thuốc ức chế
PCSK9. Tuy nhiên, những nhóm thuốc này có nhược điểm là có thể gây ra tổn
thương gan, viêm gan, viêm cơ hoặc những tác dụng có hại trên đường tiêu
hóa; rất ít các thuốc điều trị rối loạn lipid sử dụng được trên bệnh nhân bị tổn
thương chức năng gan [28], [79]. Vì vậy, việc tìm kiếm các liệu pháp, thuốc
mới có hiệu quả và an toàn trong điều trị rối loạn chuyển hóa lipid, đồng thời
có tác dụng bảo vệ gan đang là một vấn đề cấp thiết.
Trong nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên vô cùng phong phú của thế giới
nói chung và Việt Nam nói riêng, có rất nhiều cây thuốc, vị thuốc có khả năng
làm giảm lipid máu đã được chứng minh qua các nghiên cứu và thực tế sử
dụng [6]. Đặc biệt, trong số đó có Bụp giấm (Hibiscus sabdarifa L.,
Malvaceae), một loài cây nhiệt đới có khả năng thích nghi với nhiều loại đất
khác nhau và đã được trồng thành công ở Bình Thuận, Việt Nam với quy mô
rộng và đạt tiêu chuẩn VietGAP (Thực hành sản xuất nông nghiệp tốt). Bụp
giấm chứa anthocyanin có tác dụng chống oxy hóa rất tốt, ngoài ra còn có
alkaloid, chất đường, chất khoáng, acid hữu cơ,... Bộ phận thường sử dụng
nhất là đài hoa do có chứa anthocyanin với hàm lượng có thể lên tới 1,5 g/kg
đài hoa khô, với delphinidin và cyanidin là hai anthocyanin chính chiếm
khoảng 71% và 29% [34]. Cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều công
trình nghiên cứu liên quan đến Bụp giấm như: Tác dụng giảm lipid máu của
các polyphenol thông qua sự ức chế quá trình tạo mỡ và thúc đẩy sự thanh thải
lipid ở gan, giảm độc tính của acetaminophen trên gan, hạ huyết áp, ... [45],
[62], [101]. Bên cạnh đó, theo các nghiên cứu tiền đề, bột sấy phun từ đài hoa
 2

Bụp giấm có tác dụng trên chuột nhắt gây rối loạn lipid máu nội sinh và ngoại
sinh, có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột nhắt gây tổn thương tế bào
gan bằng ethanol hoặc acetaminophen. Tuy nhiên, tác dụng này không tỷ lệ
thuận với liều sử dụng, do đó, cần phải có những nghiên cứu nhằm xác định
liều cũng như đánh giá độc tính của đài hoa Bụp giấm khi sử dụng thời gian
dài nhằm đưa ra những khuyến cáo (nếu có) khi sử dụng trên lâm sàng [9],
[10], [11]. Ngoài ra, bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm có nhược điểm là khá
bất tiện khi sử dụng vì có vị chua, dễ hút ẩm, khó bảo quản. Do đó, trong
nghiên cứu này, chúng tôi cũng đề ra mục tiêu nghiên cứu bào chế một dạng
chế phẩm thuận tiện để sử dụng xuất phát từ nguồn nguyên liệu bột sấy phun
đài hoa của cây Bụp giấm. Việc nghiên cứu phát triển một chế phẩm từ bột
sấy phun đài hoa của cây Bụp giấm mang đến triển vọng cao trong điều trị
bệnh lý rối loạn lipid máu và các bệnh lý liên quan mà không làm tổn thương
chức năng gan.
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Mục tiêu chung: Nghiên cứu tác dụng điều hòa lipid máu của chế phẩm
từ đài hoa của cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae).
Mục tiêu cụ thể:
1. Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ đài
hoa của cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae).
2. Xây dựng quy trình bào chế và tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ ổn định
của cốm Bụp giấm.
3. Khảo sát tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển
hóa lipid: LDLR, SREBP-2, HMGCoA Reductase, AMPK.
4. Đánh giá tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu và tác dụng dự phòng
gan nhiễm mỡ của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng.
5. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột
nhắt trắng.
 3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. Rối loạn lipid máu
1.1.1. Đặc điểm dịch tễ và nguyên nhân

Theo thống kê, ước tính có khoảng 92,1 triệu người trưởng thành ở Mỹ
mắc ít nhất một bệnh lý về tim mạch – CVD (Cardiovascular diseases). Dự
đoán đến năm 2030, sẽ có 43,9% dân số trưởng thành ở Mỹ mắc bệnh tim
mạch. Trên toàn thế giới, 80% trường hợp tử vong do bệnh lý tim mạch diễn
ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, tỷ lệ này gần như bằng nhau ở
nam và nữ [26]. Đối với các cá nhân có nguy cơ bệnh lý tim mạch từ trung
bình đến cao hoặc những bệnh nhân đang bị các bệnh lý về tim mạch, ngoài
việc kiểm soát lối sống (chế độ ăn, hoạt động thể lực, hút thuốc lá), cần làm
giảm các yếu tố nguy cơ như tình trạng rối loạn lipid máu, tăng huyết áp [28].

Theo số liệu của NHANES (Khảo Sát Nghiên Cứu về Sức Khỏe và
Dinh Dưỡng Quốc Gia Hoa Kỳ) từ 2007 đến 2010, tỷ lệ mắc bệnh rối loạn
lipid máu ở người trưởng thành có béo phì là 49,7%, thừa cân là 44,2% và cân
nặng bình thường là 28,6%, tỷ lệ mắc chung của rối loạn lipid ở thanh thiếu
niên từ 12 đến 19 tuổi là 20,3%. Khoảng 17% người lớn có HDL thấp trong
giai đoạn 2011-2012. Ngoài ra, khoảng 24,2% người trưởng thành có mức
triglycerid cao (≥ 150 mg/dL) theo báo cáo của NHANES 2011 đến 2014 [26].

Rối loạn lipid máu có thể được định nghĩa như sự tăng bất thường
cholesterol toàn phần và LDL và/hoặc triglycerid trong máu và/hoặc sự giảm
HDL. Rối loạn lipid máu có thể do di truyền (nguyên phát) hoặc do hậu quả
của những bệnh khác (đái tháo đường, suy giáp, …), do chế độ ăn, do thuốc
(thứ phát). Tăng lipid máu là do tăng nồng độ lipoprotein huyết tương. Một
hoặc nhiều nhóm lipoprotein có thể tích lũy trong máu do tăng sản xuất, tăng
bài tiết vào tuần hoàn hoặc giảm độ thanh thải, giảm loại bỏ lipoprotein khỏi
lưu thông. Trong một số trường hợp, cả hai quá trình cùng tồn tại [67].
 4

1.1.2. Chuyển hóa lipid

Lipid là các phân tử kỵ nước không hòa tan hoặc hòa tan rất ít trong
nước. Lipid trong cơ thể được phân bố trong 2 khu vực lớn là trong tế bào và
trong huyết tương. Lipid trong huyết tương không lưu thông dưới dạng tự do,
muốn chuyên chở, chúng phải kết hợp với các thành phần khác và được
chuyên chở dưới hình thức các tiểu phân lipoprotein [1], [67]. Lipoprotein là
các phức hợp đại phân tử được tạo thành từ hàng trăm phân tử lipid và protein.
Chúng có hình cầu, phần lõi gồm triglycerid và cholesteryl ester, bao quanh
là một lớp đơn gồm các phospholipid, một ít cholesterol tự do và các phân tử
protein (apoprotein). Chính các phân tử protein này đóng vai trò quan trọng
trong việc điều hòa chuyên chở lipid và chuyển hóa lipoprotein. Lipoprotein
được chia làm 5 lớp tùy vào tỷ trọng là: (1) Chylomicron, (2) VLDL: Very
Low Density Lipoprotein, (3) IDL: Intermediate Density Lipoprotein, (4)
LDL: Low Density Lipoprotein, (5) HDL: High Density Lipoprotein [1].

Triglycerid trong thức ăn được men lipase tụy thủy phân thành acid béo
và monoglycerid. Tại niêm mạc ruột non, các chất này được hấp thu trong các
thể micelle. Trong tế bào niêm mạc ruột, tại bộ máy Golgi, triglycerid được
tái tạo và cùng cholesteryl ester hình thành phần lõi của chylomicron. Sau đó,
phospholipid, cholesterol tự do, apo B48, apo AI, apo AII, apo AIV tạo lớp
phủ bề mặt thành tiểu phân chylomicron. Chylomicron đi vào mạch bạch huyết
và vận chuyển vào hệ tuần hoàn. Trong huyết tương, HDL chuyển apo C, apo
E cho chylomicron. Khi chylomicron gắn với LPL, apo CII trên bề mặt
chylomicron hoạt hóa LPL, LPL hoạt hóa sẽ thủy phân triglycerid thành acid
béo và monotriglycerid. Acid béo được vận chuyển vào tế bào mỡ, tế bào cơ
để dự trữ dưới dạng triglycerid hoặc sử dụng làm nguồn năng lượng. Cơ chế
dự trữ triglycerid ở tế bào mỡ này rất quan trọng vì tế bào mỡ không có khả
năng tân tạo mỡ từ glucid như ở gan. Một số ít cholesterol ester từ HDL đến
chylomicron nhờ men CETP. Chylomicron mất dần triglycerid trở thành
 5

chylomicron tàn dư. Nhờ có apo E trên bề mặt, các tàn dư này được thụ thể
tàn dư (LDL receptor related protein: LRP) ở gan bắt giữ. Tế bào gan dị hóa
chylomicron tàn dư thành triglycerid dự trữ, cholesteryl ester, còn apo B48
được phân cách thành acid amin. Như vậy, triglycerid trong thức ăn đã được
đưa đến mô mỡ và cơ dưới dạng acid béo, còn cholesterol được đưa đến gan
để tạo acid mật [1], [67], [91].

Triglycerid và cholesterol (do gan sản xuất hoặc gan đã lấy từ

chylomicron tàn dư) được bao bọc bởi phospholipid, cholesterol tự do và apo
B100 để tạo thành VLDL. Ở người bình thường, kích thước VLDL phụ thuộc
vào lượng triglycerid ở tế bào gan. Khác với chylomicron, phần lớn
cholesterol trong lõi của VLDL là cholesterol tự do. Vì tốc độ sản xuất ra B100
tương đối ít thay đổi nên số lượng VLDL lưu hành trong máu cũng ít thay đổi,
do đó, khi ăn nhiều mỡ hoặc gan sản xuất nhiều triglycerid thì chỉ có kích
thước VLDL thay đổi mà thôi [1]. Sau khi VLDL vào máu, nó được HDL
chuyển giao một số apo E và apo C. Khi VLDL gắn với LPL, apo CII trên bề
mặt của VLDL hoạt hóa LPL, sau đó LPL thủy phân triglycerid của VLDL
thành glycerol và acid béo. VLDL trở thành IDL (VLDL tàn dư). Một phần
nhỏ IDL bị gan bắt giữ bởi LDLR (nhờ apo B100 và apoE) hoặc thụ thể tàn
dư (nhờ apoE). Phần lớn IDL bị lấy bớt triglycerid và apoprotein trở thành
LDL. Thường thì những IDL có nguồn gốc từ VLDL lớn đều bị gan bắt giữ
chứ không chuyển thành LDL. Chỉ có những IDL bắt nguồn từ VLDL kích
thước nhỏ mới chuyển hóa tiếp thành LDL nhờ apo E và HTGL [1], [67]. LDL
chỉ có một apoprotein duy nhất đó là apo B100, do đó, LDL chủ yếu được
thanh lọc qua con đường LDL receptor (khoảng 75% LDL). LDL receptor là
một glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 160 kDa, có trên bề mặt của
hầu hết các tế bào trong cơ thể. Số lượng LDL receptor ở tế bào gan nhiều
nhất trong cơ thể (2/3 số lượng LDL được thanh lọc ở gan) và số lượng này
tùy thuộc vào số lượng LDL lưu hành trong máu, nếu LDL cao thì số lượng
 6

receptor tăng và ngược lại, đây chính là cơ chế điều hòa sự ổn định của
cholesterol [1], [67], [91].

Triglycerid, cholesterol LPL

từ thức ăn

Golgi
Micelle HDL CII PP

Apo E, Apo C VLDL

TG
CETP Choles
TD
Choles TD B100

B100
PP MTP
Apo E, Apo C, CE
IDL
B48 Apo E
Apo B48
Choles TD LDLR Apo E,
TG Apo E
(VLDHTGL
Chylomicron CE
AIV LRP TG, Choles
Chylomi L
cron
Apo A
CII Tàn dư tàn
LDL
AI B100 d
AII LP
L LDL-R (gan, thận,tế bào khác) → aa,
cholesterol

Triglycerid -> Acid béo,

monotriglycerid
Tế bào mỡ,
cơ (dự trữ,
năng lượng)
NỘI SINH
NGOẠI SINH

Hình 1.1. Con đường chuyển hóa lipid

PP: Phospholipid, TG: Triglycerid, CE: Cholesterol ester, LPL:

lipoprotein lipase, LRP: LDL receptor related protein, LDLR: LDL receptor,
MTP: Microsomal triglycerid transfer protein, CETP: Cholesterol ester
transfer protein, VLDL: Very low density lipoprotein, LDL: Low density
lipoprotein, IDL: Intermediate density lipoprotein, HDL: High density
lipoprotein.

Chuyển hóa lipid ở gan

Cholesterol ở gan có từ 2 nguồn: (1) nguồn thứ nhất là tổng hợp từ

acetyl coA, trong quá trình này có vai trò rất quan trọng của HMG CoA
 7

reductase, (2) nguồn thứ hai là từ LDL ở trong huyết tương, với vai trò của
LDL receptor [44].

Quá trình sinh tổng hợp cholesterol ở gan từ acetyl CoA: Cholesterol
được tổng hợp chủ yếu từ acetyl CoA theo đường HMG-CoA reductase ở
nhiều tế bào/mô. Khoảng 20 - 25% lượng cholesterol tổng hợp mỗi ngày
(~1 g/ngày) xảy ra ở gan, các vị trí khác có tỉ lệ tổng hợp cao gồm ruột, tuyến
thượng thận và cơ quan sinh sản. Quá trình tổng hợp cholesterol gồm 25 bước,
chia làm 4 giai đoạn: (1) tổng hợp acid mevalonic từ acid acetic dưới dạng
acetylCoA, (2) biến đổi acid mevalonic thành isopren hoạt hóa, (3) biến đổi 6
đơn vị isopren hoạt hóa thành squalen, (4) biến đổi squalen thành nhân steroid
có 4 vờng. Tổng hợp cholesterol bắt đầu bằng phản ứng tổng hợp mevalonate
từ acetyl-CoA trong bào tương: (1) phản ứng tổng hợp 2 phân tử acety-CoA
thành phân tử acetoacetyl-CoA, (2) phản ứng tạo HMG-CoA, (3) phản ứng
khử với vai trò của HMG-CoA reductase tổng hợp mevalonate [78].

Trong quá trình vận chuyển lipid máu nội sinh, khi LDL gắn vào LDL
receptor ở gan, cả 2 được đưa vào nội bào, sau đó, LDL được đưa đến
lysosome còn LDLR quay trở lại bề mặt tế bào để tái sử dụng. Tại lysosom,
thành phần protein của LDL là apo B100 bị thoái hóa thành acid amin hay
oligopeptid; cholesterol ester bị thủy phân thành cholesterol tự do và được
dùng để tổng hợp màng tế bào, hormon, acid mật, nếu dư thì cholesterol tự do
lại được ester hóa để dự trữ dưới dạng những giọt nhỏ. Khi đó, những LDLR
bị thoái hóa để tránh trường hợp quá tải cholesterol cho tế bào. Thời gian bán
hủy của nó khá dài (2-3 ngày) [1], [67]. Như vậy, sự điều hòa thuận nghịch
LDLR có vai trò rất quan trọng trong việc duy trì nồng độ cholesterol trong tế
bào gan. Tuy nhiên, cholesterol được giữ trên màng tế bào còn việc tổng hợp
LDLR diễn ra ở nhân. Như vậy, tồn tại một cơ chế để các thông tin được vận
chuyển đến nhân và điều hòa quá trình phiên mã gen. Vào năm 1993,
Yokoyama và các cộng sự đã tìm thấy được yếu tố điều hòa phiên mã rất quan
 8

trọng là Sterol Regulatory Element-binding Protein (SREBP) [80]. Các

SREBP được tổng hợp như là protein trong màng tế bào của lưới nội chất. Sau
khi dịch mã trên ribosom liên kết màng, nó gắn vào Scap là một protein
polytopic của màng lưới nội chất. Tại đây, diễn ra quá trình thay đổi về cấu
trúc của Scap để đưa SREBP đến bộ máy Golgi, nơi SREBP được xử lý tuần
tự bởi 2 protease là Site-1 Protease (S1P) và Site-2 Protease (S2P). Kết quả
của quá trình này là sự phóng thích phân đoạn hoạt tính phiên mã vào nhân để
hoạt hóa quá trình phiên mã gen LDLR. Scap là một cảm biến sterol, nằm ở
trên màng lưới nội chất nhạy cảm với nồng độ cholesterol trên màng. Khi
cholesterol của lưới nội chất tăng vượt ngưỡng 5% tổng lượng lipid,
cholesterol sẽ gắn với luminal Loop 1 của Scap. Ở phức hợp mới này, Scap
gắn với Insig (một polytopic protein khác của màng lưới nội chất). Insig sẽ
khóa Scap trong phức hợp này và không cho nó gắn với COPII protein để đưa
SREBP vào bộ máy Golgi. Quá trình này được gọi là bẫy phức hợp
Scap/SREBP trong lưới nội chất và làm giảm sự phiên mã gen LDLR. Sự
phiên mã gen LDLR bị giữ ở mức thấp đến khi cholesterol trong lưới nội chất
giảm xuống, phức hợp Scap/SREBP được giải phóng khỏi cholesterol và gắn
trở lại với COPII protein để tiếp tục chu trình [44], [67].

Những nghiên cứu sau này đã bổ sung thêm thông tin về SREBP,
SREBP điều hòa sự chuyển hóa lipid bao gồm SREPB-1 và SREBP-2. Trong
đó, SREBP-1 có hai đồng dạng là SREBP-1a và SREBP-1c. SREBP-1a có
biểu hiện cao ở các tế bào bình thường phát triển nhanh và các tế bào ung thư,
nó hoạt hóa sự tổng hợp acid béo cũng như sự tổng hợp cholesterol, giúp cung
cấp lượng lớn cholesterol cho màng tế bào. SREBP-1c được biểu hiện chủ yếu
ở gan nơi nó hoạt hóa sự tổng hợp acid béo đáp ứng với insulin, do đó, đóng
góp vào tình trạng gan nhiễm mỡ trong đái tháo đường type 2. Trong khi đó,
SREBP-2 được sản xuất bởi một gen khác, và là một yếu tố hoạt hóa tương
đối cụ thể của gen mã hóa LDLR và enzym sinh tổng hợp cholesterol. Tất cả
 9

ba dạng SREBP đều được xử lý qua con đường SREBP [54]. SREBP-2 được
tổng hợp dưới dạng tiền chất 125kDa ở lưới nội chất. Đầu tận COOH- của
SREBP-2 liên kết với vùng lặp lại WD của protein cắt và hoạt hoá SREBP
(SREBP cleavage-activation protein, SCAP), trong khi đầu tận NH2- của
SCAP liên kết với các Insig (ER-resident insulin-induced gene protein) gồm
có Insig1 và Insig2, để hình thành nên phức hợp Insig/Scap/SREBP-2 duy trì
SREBP trên lưới nội chất. Khi nồng độ sterol giảm, Scap phân tách khỏi các
Insig và tạo thuận lợi cho sự liên hợp của Scap/SREBP với COPII (coatomer
protein II), sau đó phức hợp này được vận chuyển từ lưới nội chất đến bộ máy
Golgi. Tại bộ máy Golgi, SREBP-2 được phân cách bởi hai protease liên kết
màng là S1P (site-1 protease) và S2P (site-2 protease) để chuyển thành dạng
yếu tố phiên mã có đầu tận NH2 gọi là nSREBP-2 (nuclear SREBP-2). Dạng
này được chuyển vào nhân và liên kết với yếu tố điều hoà sterol (sterol
regulatory element, SRE) của gen đích, bao gồm các men then chốt của sinh
tổng hợp và hấp thu cholesterol. Tại nhân, nSREBP-2 liên kết với các SRE tại
vùng khởi động (promoter) của các gen đích để hoạt hoá sự biểu hiện gen của
hầu hết các men liên quan trong con đường mevalonat, bao gồm HMGCR
(HMG-CoA reductase), MVK (mevalonate kinase), SQS (squalene synthase),
và DHCR24 (24-dihydrocholesterol reductase), đồng thời làm tăng biểu hiện
của LDLR (low-density lipoprotein receptors) để hấp thu cholesterol ngoại
sinh. Trong con đường mevalonat, hai phân tử acetyl-CoA từ chuyển hoá
đường hoặc thoái giáng acid béo hình thành acetoacetyl-CoA bởi men
acetoacetyl-CoA thiolase. Với sự hiện diện của HMG-CoA synthase
(HMGCS), acetyl-CoA và acetoacetyl-CoA hình thành HMG-CoA, nó được
chuyển thành mevalonate bởi HMGCR. Sau đó, mevalonat được phosphoryl
hoá thành 5-phosphomevalonat bởi men phosphomevalonat kinase (PMK),
tiếp tục được tổng hợp thành isopentenylpyrophosphat (IPP) bởi men
mevalonat diphosphat decarboxylase. IPP và đồng phân của nó, dimethylallyl
 10

pyrophosphat (DMPP), hình thành nên geranyl pyrophosphat (GPP) bởi men
farnesylpyrophosphat synthase (FPPS, FDPS), nó được ngưng kết với IPP
khác để hình thành farnesylpyrophosphat (FPP). Dưới tác động của SQS, FPP
được chuyển thành squalen, và tiếp tục chuyển thành monooxidaosqualen
(MOS) và lanosterol bởi men squalen monooxygenase (SM) và lanosterol
synthase. Cuối cùng, lanosterol được chuyển hoá thành cholesterol bởi 19
men, bao gồm CYP51A (lanosterol-14α demethylase), TM7SF2 (steroid 14
reductase), SC4MOL (4 methyl sterol oxidase), NSDHL (C3 sterol
dehydrogenase), HSD17B7 (3-ketoreductase), EBP (phenylalkylamine Ca2+
antagonist binding protein), SC5D (sterol-C5-desaturase), 7-
dehydrocholesterol reductase (DHCR7), và DHCR24 [100].

Sự hoạt hoá và con đường SREBP-2 được điều hoà bởi nhiều tín hiệu.
Chất ức chế sinh u chính, p53, có thể khoá sự hoạt hoá của SREBP-2 để làm
giảm sự phiên mã của các gen trong con đường mevalonat thông qua việc làm
tăng phiên mã các gen ABCA1 (ATP-binding cassette transporter A1), làm
trung gian cho việc ức chế u. Mặt khác, SREBP-2 có thể làm tăng sự hình
thành của các oxysterol ligand cho các thụ thể gan X (LXRs) để điều hoà tăng
sự phiên mã của gen ABCA1. Các LXR động vai trò duy trì hằng định nội môi
cholesterol thông qua thúc đẩy dòng phun trào cholesterol và ức chế de novo
sự tổng hợp và hấp thu cholesterol. Một phần của p53, protein kinase B (Akt)
có thể hoạt hoá tức thì SREBP-2 để thúc đẩy biểu hiện gen liên quan trong con
đường tổng hợp cholesterol. Ngoài ra, vi môi trường của khối u như thiếu oxy,
pH ngoại bào, và nồng độ dinh dưỡng cũng động vai trò then chót trong điều
hoà sự hoạt hoá SREBP-2. Yếu tố 1α cảm ứng thiếu oxy (Hypoxia inducible
factor-1α) có khả năng làm tăng hoạt tính của HMGCR bằng cách chuyển vị
SREBP-2 vào trong nhân. Tính acid ở ngoại bào (pH 6.8) kích phát chuyển vị
vào trong nhân của SREBP-2. Các chất dinh dưỡng, như glucose thúc đẩy sự
chuyển phức hợp SCAP/SREBP từ lưới nội chất vào bộ máy Golgi và sau đó
 11

hoạt hoá SREBP thông qua sự N-glycosyl hoá của SCAP. Khi cholesterol ở
lưới nội chất hạ thấp xuống dưới 5% tổng lipid tại lưới nội chất, sự phân cắt
của SREBP được hoạt hoá. Androgen có thể kích hoạt sự hoạt hoá của SREBP
trong điều kiện sinh lý bình thường hoặc điều kiện bệnh lý, như ung thư tiền
liệt tuyến. Các men tham gia vào con đường mevalonat như HMGCR, MVK,
SQS, DHCR24, được điều hoà bởi các phân tử hoặc các chất chuyển hoá khác
nhau từ con đường chuyển hoá mevalonat. Cả sự phosphoryl hoá bởi AMPK
(AMP activated protein kinase) và sự dephosphoryl hoá bởi protein
phosphatase 2A đều có thể điều hoà hoạt tính của HMGCR. Sự liên kết của
Insig trên vùng nhạy cảm sterol có thể dẫn đến ubiquitin hoá và thoái hoá của
HMGCR. Ngoài ra, PPARγ có thể điều hoà nhiều con đường, bao gồm giảm
biểu hiện của SREBP-2 và HMGCR, và tăng biểu hiện của LXRα để làm giảm
nồng độ cholesterol. LXRα có vai trò quan trọng trong điều hoà các men của
con đường mevalonat như SQS, CYP51A, và DHCR24. Một số chất chuyển
hoá then chốt có thể điều hoà các men chuyển hoá của con đường mevalonat
do SREBP điều hoà. Cholesterol và 25-hydroxycholesterol có thể điều hoà
HMGCR bằng cách làm tăng sự phân cắt thay thế chính nó. Mevalonat và các
dẫn xuất của nó như dioxidolanosterol và geraniol điều hoà sự dịch mã của
mRNA HMGCR hoặc sự phân bố các polysome để làm giảm sự tổng hợp và
dịch mã của chính nó. Lanosterol và C4-dimethylated sterol trung gian khác
có thể điều hoà cả sự thoái hoá của HMGCR và phân cắt SREBP-2.
Geranylgeranyl diphosphat (GGPP), FPP và IPP, những chất trung gian này
ức chế hoạt tính MVK hậu phiên mã bằng đáp ứng phản hồi âm tính. Các chất
chuyển hoá khác, như phytosterols, 24(S), 25-epoxycholesterol (24,25-EC) và
các hormon steroid (progesteron) có thể ức chế trực tiếp hoạt tính DHCR24
hậu phiên mã. Tóm lại, SREBP-2 và các men tổng hợp cholesterol, như
HMGCR, MVK, SQS, và DHCR24 có thể được điều hoà bởi nhiều con đường
 12

tín hiệu khác nhau và các chất của hoá của con đường mevalonat ở thời điểm
phiên mã và hậu phiên mã [100].

Hình 1.2. Sự điều hòa con đường mevanonate của SREBP-2 [100]

AMPK đóng vai trò quan trọng trong điều hoà quá trì beta oxy hoá,
tổng hợp acid béo và cholesterol. Sự dị hoá acid béo qua con đường beta oxy
hoá dẫn đến hình thành acetyl-CoA, sau đó sẽ tham gia vào chu trình acid
citric để hình thành ATP. Mặt khác, cả hai quá trình tổng hợp acid béo và
cholesterol là những quá trình đồng hoá, và đều cần phải sử dụng ATP. Tổng
hợp acid béo là quá trình tiêu thụ năng lượng trong nhiều bước để hình thành
acid béo từ acetyl CoA và malonyl CoA. Tương tự, cholesterol được tổng hợp
từ acetyl CoA để hình thành hydroxymethylglutaryl CoA (HMGCoA).
 13

HMGCoA sau đó được chuyển thành mevalonate và tiếp theo đó được chuyển
thành cholesterol thông qua con đường mevalonat [92].

Ruột
TG, PP, CE

Chylomicron
Acid mật
PCSK9
LPL FX
SREBP R LDL
Cholesterol SREBP
Chylomicron LDLR
LX LDL
IDL
Tàn dư R R
LDLR-related
protein
SREBP HMG-CoA VLDL VLDL

reductase Apo B100

Acetyl coA TG FXR

Peroxid hóa lipid gây LXR
tổn thương tế bào
Gan gan Acid béo tự do
HDL
SREBP
FA synthesis LXR

Mô mỡ

Hình 1.3. Chuyển hóa lipid ở gan

TG: Triglycerid, PP: Phospholipid, CE: Cholesterol ester, LPL:

Lipoprotein lipase, LDLR: LDL receptor, SREBP: Sterol regulatory element
binding protein, FXR: Farnesoid X receptor, LXR: Liver X receptor, VLDL:
Very low density lipoprotein, LDL: Low density lipoprotein, IDL:
Intermediate density lipoprotein, HDL: High density lipoprotein.

Thụ thể X của gan (LXR) và thụ thể farnesoid X (FXR) giúp duy trì cân
bằng cholesterol, acid mật và triglycerid [53]. Trong đó, LXR bao gồm LXRα
và LXRβ (NR1H2) là những thụ thể nhân giúp điều hòa sự chuyển hóa một số
 14

lipid quan trọng như cholesterol và acid mật. Xử lý chủ vận LXR làm giảm sự
biểu hiện của các gen liên quan đến sự sinh tổng hợp acid béo, điều này làm
tăng nồng độ triglycerid trong huyết tương trên mô hình động vật. Các dữ liệu
còn cho thấy sự tăng triglycerid huyết liên quan đến sự giảm chủ vận phụ thuộc
LXR của chương trình tổng hợp lipid của SREBP-1 [53], [82].

Tham gia vào quá trình điều hòa LDL còn có phân tử PCSK9
(proprotein converse subtilisin/kexin 9), đó là một protein có thể phá hủy
LDLR, do đó, làm tăng LDL trong huyết tương. PCSK9 được phóng thích vào
huyết tương bởi gan và một số cơ quan khác, PCSK9 gắn với LDLR của gan
và làm gián đoạn cơ chế trả LDLR lại bề mặt tế bào sau khi phóng thích LDL
nên làm giảm lượng LDLR ở bề mặt tế bào, kết quả là làm tăng lượng LDL.
Như vậy, việc gây đột biến làm mất chức năng của PCSK9 sẽ làm giảm nồng
độ LDL (Cohen và các cộng sự năm 2006). Việc giảm các biến cố về mạch
vành trên người với sự đột biến PCSK9 đã thúc đẩy việc sản xuất ra kháng thể
gắn vào PCSK9 và làm bất hoạt chúng. Tuy nhiên, cũng giống như statin,
kháng thể kháng PCSK9 cũng thất bại trong việc làm giảm LDL ở những bệnh
nhân tăng lipid máu gia đình đồng hợp tử [44]. Điều hoà hậu phiên mã của
biểu hiện LDLR là quá trình then chốt giữ cho sự ổn định nồng độ của chính
nó trong nội bào, nó xảy ra cùng với sự loại bỏ cholesterol. PCSK-9 giữ vai
trò quan trọng trong điều hoà giảm hậu phiên mã của LDLR. PCSK-9 trạng
thái tiền chất chưa trưởng thành, được tổng hợp tại lưới nội chất là một phân
tử nặng 72kDa, chứa đoạn peptid tín hiệu ở đầu N tận, sau đó là một vùng
prodomain, một vùng xúc tác, và một vùng C tận giàu cysteine. Tiền chất của
PCSK-9 tự động xúc tác phân cắt tại vị trí thứ 152 giữa vùng prodomain và
vùng xúc tác, hình thành một mảnh prodomain nặng 14kDa và một mảnh
trưởng thành nặng 65kDa chứa vùng cấu trúc xúc tác và vùng C tận. Mảnh
prodomain vẫn liên kết với mảnh trưởng thành thông qua liên kết cộng hoá trị
sau phân cắt, hình thành một phức hợp chứa đoạn trưởng thành. Mảnh liên kết
 15

động vai trò như một phân tử đi kèm trong quá trình protein trưởng thành
chuyển vị từ lưới nội chất đến bộ máy Golgi. PCSK-9 trưởng thành và vùng
prodomain cả hai đều chịu sự tyrosine sulfat hoá, acetyl hoá, và một chuỗi các
quá trình biến đổi tại bộ máy Golgi, và cưới cùng được bài tiết vào trong máu
tuần hoàn. Dạng bài tiết vào trong máu của PCSK-9 liên kết đặc biệt với vùng
N tận của vùng EGF-A đầu tiên của LDLR trên màng tế bào trong quá trình
phụ thuộc calcium, từ đó hình thành phức hợp PCSK-9/LDLR. Sự nội bào hoá
của phức hợp này yêu cầu một protein tương thích nội tế bào (endocytic
adaptor protein) gọi là ARH (autosomal recessive hypercholesterolaemia).
Trong khi có sự hiện diện của protein tương thích này, phức hợp PCSK-
9/LDLR được nội bào hoá vào trong tế bào. Sau khi vào trong endosome,
tương tác giữa PCSK-9 và LDLR được tăng cường lên do sự giảm pH. Phức
hợp bền vững này ức chế sự thay đổi cấu hình của LDLR, ngăn cản sự tái sử
dụng LDLR từ endosome trở về bề mặt tế bào và/hoặc điều hướng LDLR vào
trong tiêu thể, nơi mà chúng sẽ bị thoái giáng. Ngoài ra, một con đường nội
bào điều hướng PCSK-9 chưa trưởng thành gắn kết với LDLR tại bộ máy
Golgi và trung gian cho sự thoái giáng trong tiêu thể. PCSK-9 liên quan đến
xơ vữa động mạch, phản ứng viêm, nhiễm trùng, đái tháo đường và các bệnh
chuyển hoá khác. Viêm có thể kích thích sự biểu hiện của PCSK-9, gây ra sự
thoái giáng của LDLR, làm tăng nồng độ LDL huyết tương. Nồng độ mRNA
của PCSK-9 tăng trong gan của chuột nhắt được nuôi với cholesterol và được
cho thêm lipopolysaccharid (LPS). LDLR là một thụ thể lipoprotein then chốt
trong tế bào gan, giữ vai trò quan trọng trong thanh thài cholesterol khỏi gan.
Nó không chỉ thanh thải cholesterol khỏi tuần hoàn, mà còn duy trì hằng định
cholesterol trong tế bào ngoại vi. Chuột nhắt làm khiếm khuyết chức năng gen
LDLR (chuột nhắt LDLR-/-) sẽ có tăng cholesterol gấp hai lần so với chuột
type hoang dại (wild-type) và được chấp nhận là mô hình kinh điển gây xơ
vữa động mạch. Lipoprotein huyết tương cho thấy sự tăng rõ rệt nồng độ LDL-
 16

c trên chuột nhắt LDLR-/-, trong khi sự biểu hiện không kiểm soát của LDLR
tại gan làm giảm có ý nghĩa hàm lượng lipid tại gan. Sự khiếm khuyến LDLR
cũng đã được chứng minh làm tăng hàm lượng lipid và sự thâm nhập đại thực
bào vào động mạch, gây ra các tổn thương xơ vữa động mạch. Ngoài ra, sự
biểu hiện quá mức của LDLR một cách bất thường trong cơ quan ngoại biên
hoặc một vài tế bào, mà ban đầu không có biểu hiện LDLR cũng gây rối loạn
chuyển hoá nghiêm trọng. Các nghiên cứu cho thấy chuột knockout gen LDLR
gián tiếp chứng minh rằng sự điều hoà ngược âm tính của LDLR cung cấp
hiệu ứng bảo vệ lên sự hằng định cholesterol. Vì vậy, sự gián đoạn trong con
đường LDLR có thể liên quan đến cơ chế gây xơ vữa động mạch [103].

1.1.3. Chẩn đoán rối loạn lipid máu

Hướng dẫn giảm cholesterol để giảm nguy cơ bệnh tim mạch do xơ vữa
của ACC/AHA (American College of Cardiology/American Heart
Association) và hướng dẫn điều trị rối loạn lipid máu của ESC/EAS (European
Society of Cardiology/European Atherosclerosis Society) được xem như
những tài liệu tham khảo chính trong điều trị rối loạn lipid máu. Theo các
hướng dẫn này, việc thay đổi lối sống bao gồm can thiệp chế độ ăn uống, tập
thể dục vừa phải và giảm cân là lựa chọn hàng đầu cho điều trị rối loạn lipid
máu và có thể đáp ứng đủ với chứng rối loạn lipid nhẹ ở những bệnh nhân có
nguy cơ thấp. Tuy nhiên, ở các đối tượng bệnh nhân có nguy cơ tim mạch cao
hoặc có tình trạng rối loạn lipid máu vừa và nặng, việc sử dụng thuốc để điều
chỉnh lipid máu vẫn là lựa chọn hàng đầu và mang lại nhiều lợi ích. Mặt khác,
việc sử dụng các thuốc điều trị rối loạn lipid máu lâu dài hoặc ở nồng độ cao
cũng có thể gây ra những phản ứng bất lợi trên bệnh nhân. Do đó, các nguy
cơ khi sử dụng thuốc điều trị rối loạn lipid máu cần được đánh giá kỹ và những
giải pháp dự phòng hoặc thay thế cần được nghiên cứu và áp dụng [28], [79].

Các bước chẩn đoán rối loạn lipid máu theo ACC/AHA 2013: [79]
 17

Bước 1: Xét nghiệm mỡ máu (bilan lipid máu)

Phân tích lipoprotein máu nên được thực hiện sau 12 giờ nhịn đói bao
gồm cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL và LDL. LDL thường được ước
lượng từ công thức Friedewald: LDL = cholesterol toàn phần – (VLDL +
HDL). VLDL được ước lượng bằng 1/5 nồng độ triglycerid nên có thể có một
số sai số liên quan đến tính LDL. Công thức chỉ có giá trị khi nồng độ
triglycerid dưới 400mg/dL. Nếu triglycerid trên mức này, LDL cần được đo
trực tiếp bằng phân tích siêu ly tâm hay kỹ thuật kết tủa miễn dịch [67].

Bước 2: Xác định bệnh nhân có các dạng lâm sàng của bệnh tim mạch
xơ vữa (BTMXV) như hội chứng vành cấp, đau thắt ngực ổn định, tiền căn
nhồi máu cơ tim cũ, đau thắt ngực không ổn định, tái tưới máu mạch vành hay
động mạch khác, đột quỵ, cơn thiếu máu não thoáng qua, bệnh động mạch
ngoại biên do xơ vữa hay không. Nếu có các dạng lâm sàng của BTMXV thì
bắt đầu điều trị bằng statin. Nếu không các dạng lâm sàng của BTMXV thì
qua bước 3.

Bước 3: Xác định bệnh nhân có LDL ≥ 190 mg/dL hay không. Nếu có
LDL ≥ 190 mg/dL thì bắt đầu điều trị statin mạnh. Nếu không có LDL ≥ 190
mg/dL thì qua bước 4.

Bước 4: Xác định bệnh nhân có trong nhóm tuổi từ 40-75 và có đái tháo
đường hay không. Nếu có tuổi từ 40-75 và có đái tháo đường thì bắt đầu điều
trị statin. Nếu không tuổi từ 40-75 và có đái tháo đường thì qua bước 5.

Bước 5: Đánh giá nguy cơ BTMXV trong 10 năm bằng công thức
Pooled Cohort Equations. Nếu nguy cơ BTMXV 10 năm ≥ 7,5% thì sử dụng
statin trung bình - mạnh. Nếu nguy cơ BTMXV 10 năm < 7,5%, qua bước 6.

Bước 6: Một số trường hợp đặc biệt, nếu nguy cơ BTMXV 10 năm <
7,5% thì đánh giá lại nguy cơ BTMXV 10 năm mỗi 4 - 6 năm. Xem xét một
số yếu tố có lợi khi dùng statin như LDL > 160 mg/dL, tăng lipid máu di
 18

truyền, tiền căn gia đình có BTMXV lâm sàng sớm, nam < 55 tuổi / nữ <65
tuổi, CRP siêu nhạy > 2 mg/L, điểm vôi hóa mạch vành > 300 đơn vị Agatston
(> 75% theo tuổi, giới tính và chủng tộc), ABI (chỉ số huyết áp cổ chân - cánh
tay) < 0,9, nguy cơ BTMXV lâu dài cao.

Bước 7: Kiểm tra bệnh nhân có tăng triglycerid ≥ 500 mg/dL hay
không. Nếu có tăng triglycerid ≥ 500 mg/dL thì điều trị fibrat để giảm nguy
cơ viêm tụy cấp.

1.1.4. Điều trị rối loạn lipid máu

Xử trí rối loạn lipid máu (RLLM) bao gồm thay đổi lối sống và điều trị
dùng thuốc. Thay đổi lối sống là cơ bản trong điều trị RLLM. Trong số các
thuốc điều trị RLLM, statin có vai trò vượt trội, là thuốc có chỉ định bắt buộc
trong một số trường hợp như bệnh nhân có BTMXV lâm sàng, bệnh nhân có
LDL ≥ 190 mg/dL, bệnh nhân có trong nhóm tuổi từ 40 – 75 tuổi và có đái
tháo đường, nguy cơ BTMXV 10 năm ≥ 7,5% [28], [79].

Thay đổi lối sống

Quá cân, béo phì, béo bụng góp phần gây rối loạn lipid máu. Do đó,
giảm cân làm cải thiện lipid máu và tác động có lợi lên các yếu tố nguy cơ
BTMXV thường đi kèm trên các bệnh nhân này. Xác định tình trạng quá cân
khi BMI ≥ 25 kg/m2 và < 30 kg/m2, béo phì khi BMI > 30kg/m2, béo bụng với
người châu Á khi vòng eo ở nam ≥ 90 cm và ở nữ ≥ 80 cm. Cần khuyên bệnh
nhân giảm thức ăn giàu năng lượng cũng như tăng tiêu thụ năng lượng bằng
tăng vận động thể lực, nên hoạt động thể lực 3 - 4 lần/tuần, mỗi lần trung bình
40 phút với cường độ thể lực trung bình - nặng [28]. Lượng rượu tối đa mỗi
ngày mà không làm tăng triglycerid là 20 - 30g với nam và 10 - 20 g ở nữ. Đối
với người tăng triglycerid, khuyến cáo bỏ rượu. Ngưng hút thuốc lá có lợi rõ
ràng trên nguy cơ BTMXV. Tuy nhiên, cần chú ý phòng ngừa sự tăng cân ở
những bệnh nhân ngưng hút thuốc lá [28]. Tổng lượng lipid trong thức ăn nên
 19

khoảng 25 - 35% tổng số năng lượng của khẩu phần ăn. Tuy nhiên, nếu lượng
lipid quá thấp có nguy cơ làm giảm hấp thu vitamin E và các acid béo thiết
yếu, góp phần làm thay đổi bất lợi trên HDL. Cơ thể người hấp thu lipid chủ
yếu dưới dạng các acid béo tự do và một phần nhỏ hơn là cholesterol, lượng
acid béo bão hòa nên < 6% calo thu nhập, lượng acid béo chuyển hóa < 1%
calo thu nhập, lượng cholesterol trong chế độ ăn lý tưởng nên < 150 mg/ngày,
nên ăn loại chứa nhiều acid béo không bão hòa đơn và acid béo không bão
hòa đa n-3, n-6 (omega-3, omega-6), lượng acid béo không bão hòa đa n-6
nên < 10% calo thu nhập. Khuyến khích ăn nhiều rau, trái cây, hạt và ngũ cốc
nguyên hạt. Lượng đường cần giảm < 10%, hạn chế nước ngọt. Để điều trị
tốt mỡ máu, chế độ ăn cần 25 – 40 g chất xơ, tối thiểu 7 -13 g chất xơ hòa tan
[28], [39].

Điều trị bằng thuốc

Hiện tại, có sáu loại thuốc khác nhau để giảm mức cholesterol. Trong
đó, có 7 chất ức chế HMG-CoA reductase (statin) được chấp thuận để điều trị
tăng cholesterol máu, có thể làm giảm mức LDL tới 60% và statin cũng có
hiệu quả trong việc giảm nồng độ triglycerid ở những bệnh nhân bị tăng
triglycerid máu. Tùy theo mức độ rối loạn lipid máu và mục tiêu điều trị của
bệnh nhân mà có những hướng dẫn sử dụng thuốc phù hợp, tuy nhiên, nhóm
thuốc được lựa chọn hàng đầu cho đến nay vẫn là statin [28], [41], [79].

Statin

Vào năm 1970, Akira Endo đã khám phá ra những hợp chất được phân
lập từ nấm có khả năng ức chế HMG-CoA reductase [38]. Những nghiên cứu
sau đó đã giúp phát triển chất ức chế HMG-CoA reductase tổng hợp đầu tiên
là atorvastatin, chất được chứng minh tác dụng điều trị tăng lipid máu vào năm
1987 [41].
 20

Bảng 1.1. Đặc điểm của các thuốc statin

Đặc điểm Ator Fluva Lova Prava Rosu Simva

38 - 17 - 29 - 19 - 52 - 28 -
Giảm LDL
54% 33% 48% 40% 63% 48%
theo liều
(10 - 80) (20 - 80) (20 - 80) (10 - 40) (10 - 40) (10 - 80)
Thời gian
15 - 30 0,2 - 2,3 2,9 1,3 - 2,8 19 2-3
bán hủy (g)
Ảnh hưởng Tăng Giảm
Không Có Không Không
của thức ăn hấp thu hấp thu
Thời gian Vào bữa
Tối Đi ngủ Ngủ Bất kỳ Tối
dùng thuốc ăn

Ghi chú: Ator: atorvastatin; Fluva: Fluvastatin; Lova: lovastatin;

Prava: pravastatin; Rosu: rosuvastatin; Simva: simvastatin.

Nguồn: Feingold Kenneth R, Grunfeld Carl (2018) [41]

Bảng 1.2. Phân loại các thuốc statin

Statin mạnh Statin trung bình Statin yếu

Atorvastatin (40) 80 mg Atorvastatin 10 (20) mg Simvastatin 10 mg
Rosuvastatin 20 (40) mg Rosuvastatin (5) 10 mg Pravastatin 10 - 20 mg
Simvastatin 20 – 40 mg Lovastatin 20 mg
Pravastatin 40 (80) mg Fluvastatin 20 – 40 mg
Lovastatin 40 mg Pitavastatin 1 mg
Fluvastatin XL 80 mg
Fluvastatin 40 mg
Pitavastatin 2 - 4 mg

Nguồn: Feingold Kenneth R, Grunfeld Carl (2018) [41]

Hiện nay, có 7 chất ức chế HMG-CoA reductase (statin) được phê

duyệt để giảm mức cholesterol. Trong đó, có 3 statin có nguồn gốc từ nấm
 21

(lovastatin, simvastatin, pravastatin) và 4 statin được tổng hợp (atorvastatin,

rosuvastatin, fluvastatin, pitavastatin). Sự chọn lựa loại statin trong điều trị có
thể phụ thuộc vào mức độ giảm cholesterol cần thiết và tiềm năng tương tác
thuốc - thuốc [28], [79]. Statin làm giảm LDL 20 - 60%; giảm triglycerid 10 -
33%; tăng HDL 5 - 10%. Về cơ chế, statin là chất ức chế cạnh tranh của HMG-
CoA reductase, dẫn đến giảm tổng hợp cholesterol trong gan. Sự ức chế tổng
hợp cholesterol trong gan làm giảm cholesterol trong lưới nội chất dẫn đến sự
vận chuyển của SREBP (Sterol regulatory element binding protein) từ lưới nội
chất sang bộ máy golgi, nơi chúng được phân tách bởi protease thành các yếu
tố phiên mã hoạt động. Các mảnh SREBP sau đó chuyển dịch sang nhân, làm
tăng sự biểu hiện của một số gen bao gồm HMG-CoA reductase và quan trọng
nhất là thụ thể LDL (LDL receptor). Sự tăng biểu hiện của HMG-CoA
reductase khôi phục tổng hợp cholesterol gan về bình thường, trong khi sự
tăng cường biểu hiện của thụ thể LDL làm tăng số lượng thụ thể LDL trên
màng tế bào gan làm tăng sự thanh thải LDL, do đó, làm giảm nồng độ LDL
và triglycerid trong huyết tương [28], [41]. Như vậy, khi nồng độ cholesterol
nội bào giảm bởi statin, sẽ làm tăng sự phiên mã của SREBP-2 để chống lại
sự giảm cholesterol và do đó làm giới hạn tác dụng làm giảm cholesterol của
statin. Cơ chế thứ hai giải thích cho hiện tượng này bao gồm: (1) statin làm
tăng biểu hiện MicroRNA33 (miR33), một chất gây ức chế các gen khác bao
gồm gen kênh vận chuyển cholesterol và phospholipid ABCA1 và ABCG1
(ATP-binding cassette, ABC); (2) thông qua việc statin làm giảm oxysterol,
nó là ligand của yếu tố phiên mã LXR (liver X receptor) dẫn đến điều hoà biểu
hiện của ABCA1 và ABCG1. Cả hai cơ chế này ngăn việc loại bỏ cholesterol
quá mức từ màng tế bào. Có mối liên quan mạnh giữa nồng độ HDL-c và nguy
cơ tim mạch trên dân số không sử dụng các thuốc điều hoà lipid, và điều này
có liên quan đến vai trò vận chuyển cholesterol đảo ngược của HDL. Hầu hết
các bệnh nhân có nguy cơ tim mạch được điều trị với statin vẫn còn hiện diện
 22

việc nồng độ HDL-c thấp. Cholesterol trong HDL hầu như chỉ bắt nguồn từ
ABCA1, khi không có ABCA1 hoặc giảm biểu hiện và chức năng của
ABCA1, nồng độ HDL-C trong huyết tương bị ảnh hưởng tương ứng. Các
nghiên cứu cũng đã chứng minh các statin làm giảm biểu hiện của ABCA1 ở
mô gan và mô ngoại biên in vitro, trong đó atorvastatin làm giảm biểu hiện
mRNA ABCA1 và ABCG1 [71]. Sử dụng statin mạn tính làm tăng PCSK9 và
làm giới hạn hoạt tính của LDLR và giảm hiệu quả của statin. Cơ chế là do
statin làm tăng sự hoạt hoá SREBP-2 và tăng biểu hiện của HNF1a. Điều trị
với statin đơn độc làm tăng 45% nồng độ PCSK-9, nếu kết hợp thêm với
ezetimibe làm tăng nồng độ PCSK-9 lên 77% ở người có tăng cholesterol máu
[61]. Statin hoạt hoá AMPK dẫn đến apoptosis và ức chế sự sinh tồn của tế
bào ung thư. Statin hoạt hoát AMPK từ đó hoạt hoá men nitric oxid synthase
tế bào nội mô (eNOS), thúc đẩy sinh mạch máu, kháng viêm, kháng xơ hoá,
và kháng phì đại. Nghiên cứu cho thấy atorvastatin làm phosphoryl hoá và
hoạt hoá AMPK và làm tăng eNOS. Statin làm giảm tích tụ mỡ ở gan và có
thể ứng dụng trong điều trị bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD).
Statin hoạt hoá AMPK dẫn đến ức chế men acetyl CoA carboxylase, một men
chính trong việc hình thành lipid cũng như điều hoà chuyển hoá acid béo ở
gan trong qua việc điều hoà các chất chứa trong ty thể và chức năng ty thể.
Atorvastatin được chứng minh làm ức chế sự tiến triển NAFLD thông qua
thúc đẩy con đường tín hiệu AMPK trong mô hình gây NAFLD bằng chế độ
ăn giàu chất béo. Statin ngăn ngừa sự thoái hoá thần kinh do phản ứng viêm
thần kinh. Cơ chế thông qua việc statin làm giảm sự tự thực bào (autophagy)
dẫn đến hiệu quả bảo vệ thần kinh. Sự tích tụ các amyloid β (Aβ) dẫn đến tăng
hoạt hoá của Tau protein và gây chết tế bào thần kinh. Điều này có thể do hiện
tượng đề kháng insulin của thần kinh, hiện tượng khoá dòng thác Akt, và hoạt
hoá glycogen synthase và gây apoptosis tế bào thần kinh. Statin làm giảm sự
đề kháng insulin, tăng con đường Akt, ức chế sự phosphoryl hoá quá mức của
 23

Tau do men glycogen synthase kinase-3β dẫn đến làm giảm sự apoptosis tế
bào thần kinh do tích tụ Aβ [81].

Các thuốc điều trị RLLM khác chỉ nên sử dụng trong các trường hợp
không đạt đích điều trị hạ LDL khi: (1) đã dùng liều statin tối ưu dung nạp
được hoặc (2) trường hợp không dung nạp với statin, (3) trường hợp tăng
triglycerid > 500 mg/dL. Trường hợp statin liều tối ưu không đạt đích điều trị
thì kết hợp statin với thuốc ức chế hấp thu cholesterol hoặc thuốc gắn acid
mật. Trường hợp không dung nạp statin thì sử dụng thuốc gắn acid mật, thuốc
ức chế hấp thu cholesterol đơn độc hay phối hợp với gắn acid mật. Trường
hợp tăng triglycerid > 500 mg/dL (tăng triglycerid là nguyên nhân gây 10%
viêm tụy cấp) thì tiết chế calo và lượng mỡ (khuyến cáo 10% - 15%), bỏ rượu
và điều trị thuốc tích cực, hạ triglycerid bằng các thuốc: Fibrat đơn độc khi
không có chỉ định bắt buộc của statin, statin kèm fibrat khi có chỉ định bắt
buộc của statin [28], [79].

Fibrat

Cơ chế chính trong tác dụng giảm triglycerid của fibrat là đẩy mạnh
quá trình phân hủy mỡ (lipolysis) nội mạch thông qua kích hoạt PPARα, làm
tăng biểu hiện của lipoprotein lipase (LPL) và giảm biểu hiện của
apolipoprotein (apo) CIII ở gan. LPL chịu trách nhiệm phân hủy triglycerid
của VLDL và chylomicron, sản xuất ra các lipoprotein tàn dư và gan sẽ bắt
giữ các tàn dư này. Apo CIII là chất ức chế tự nhiên sự phân hủy mỡ của LPL,
do đó, việc giảm biểu hiện của apo CIII làm tăng quá trình thủy phân
triglycerid. Hơn nữa, apo CIII cạnh tranh với apoE trên bề mặt của các
lipoprotein giàu triglycerid, vì vậy, khi giảm lượng apo CIII sẽ làm cho có
nhiều apo E hiện diện trên bề mặt lipoprotein tàn dư, làm tăng quá trình làm
sạch các lipoprotein tàn dư này. Gần đây, PPARα còn được phát hiện các khả
năng điều hòa biểu hiện của apo AV (một chất có vai trò quan trọng trong điều
hòa nồng độ TG huyết tương). Kích hoạt PPARα bởi fibrat còn gây ra quá
 24

trình phiên mã các gen cho các apoprotein chính của HDL là apoA-1 và apoA-
II [28], [40], [41]. Fibrat có 2 thuốc chính là fenofibrat và gemfibrozil.
Fenofibrat làm giảm triglycerid 41 - 53%, tăng HDL 5 - 20%, giảm LDL 6 -
20%. Trong khi gemfibrozil làm giảm triglycerid 35 - 50%, giảm LDL 10 -
15%, tăng HDL 5 - 20%. Fibrat có thể dùng đồng thời với statin loại trung
bình - thấp khi không đáp ứng với statin đơn độc, tuy nhiên, cần thận trọng
khi dùng statin và fibrat cùng lúc với các thuốc chuyển hóa qua cytochrome
P450. Dùng fenofibrat khi triglycerid > 500 mg/dL với liều 200 mg / ngày.
Thuốc có một số tác dụng không mong muốn: Khó tiêu, đau bụng, mẩn đỏ,
sỏi mật, tiêu chảy và có tương tác thuốc làm tăng độc tính của cydosporine,
tương tác với warfarin làm tăng hoạt tính kháng đông. Cần theo dõi chức năng
thận khi khởi trị, không nên cho fenofibrat nếu GFR < 30 ml/phút/1,73m2.
Gemfibrozil dung liều 600 mg x 2 lần khi tăng triglycerid nặng, thuốc có thể
gây khó tiêu, đau bụng, tiêu chảy và làm tăng hoạt tính của warfarin nếu dùng
chung, làm tăng nguy cơ hủy cơ vân nếu dùng đồng thời với statin [28], [41].

Thuốc gắn acid mật

Thuốc gắn acid mật có khả năng làm giảm LDL 15 - 30%, tuy nhiên,
có thể gây tăng triglycerid, không ảnh hưởng hay làm tăng nhẹ HDL. Về cơ
chế, nhóm thuốc này liên kết với các acid mật trong ruột, ngăn cản sự tái hấp
thu của chúng, dẫn đến tăng bài tiết qua phân của acid mật, kích thích chuyển
hóa cholesterol thành acid mật trong gan. Sự gia tăng tổng hợp acid mật làm
giảm nồng độ cholesterol trong gan dẫn đến sự hoạt hóa chu trình SREBP,
điều chỉnh sự biểu hiện của các enzym cần thiết cho quá trình tổng hợp
cholesterol và sự biểu hiện của các thụ thể LDL [37]. Vì vậy, tương tự như
statin, acid mật làm giảm nồng độ LDL trong huyết tương bằng cách giảm
nồng độ cholesterol trong gan, kích thích sản xuất thụ thể LDL và do đó làm
tăng tốc độ thanh thải LDL khỏi máu. Ngoài ra, sự suy giảm acid mật sẽ dẫn
đến giảm hoạt hóa yếu tố điều chỉnh chính của quá trình tổng hợp acid mật là
 25

FXR (farnesoid X receptor) trong gan và ruột, do đó, làm tăng sự biểu hiện
của cholesterol 7α hydroxylase và làm tăng chuyển hóa cholesterol thành acid
mật nên làm giảm lượng cholesterol trong gan [36], [75]. Ngoài ra, thuốc gắn
acid mật còn làm giảm CRP (C - reactive protein). Colesevelam giảm hs-CRP
18% so với giả dược. Khi kết hợp với statin, colesevelam giảm nồng độ hs-
CRP xuống 23% so với chỉ sử dụng statin. Bên cạnh đó, các thuốc gắn acid
mật đã được chứng minh là làm giảm mức đường huyết lúc đói và nồng độ
hemoglobin A1c. Colesevelam được nghiên cứu nhiều nhất và trong một số
nghiên cứu khác nhau, colesevelam đã làm giảm nồng độ A1c khoảng 0,5 -
1,0% ở những bệnh nhân cũng được điều trị bằng nhiều loại thuốc hạ glucose
như metformin, sulfonylurea và insulin. Tuy nhiên, cần lưu ý thận trọng khi
sử dụng thuốc gắn acid mật cho bệnh nhân vì có thể gây táo bón, chướng bụng,
đầy hơi, buồn nôn, đau thượng vị. Ngoài ra, thuốc gắn acid mật có tương tác
quan trọng với amiodaron, digoxin, warfarin, statin, thiazid, thuốc ức chế beta,
thyroxin, phenobarbital. Có thể làm kém hấp thu các vitamin tan trong dầu (A,
D, E, K), làm tăng khuynh hướng chảy máu, làm giảm hấp thu nhiều thuốc
khác, do đó, nên dùng thuốc khác 1 giờ trước hay 4 giờ sau. Khi điều trị bằng
thuốc gắn acid mật, phải theo dõi bilan lipid máu 3 tháng sau khởi trị và mỗi
6 - 12 tháng sau đó. Trường hợp 250 < triglycerid < 299 mg/dL, thận trọng
khi cho thuốc gắn acid mật, theo dõi sát bilan lipid máu trong 4 - 6 tuần sau,
ngưng thuốc khi triglycerid > 400 mg/dL [41].

Ezetimib

Ezetimib là thuốc giảm lipid đầu tiên ức chế hấp thu cholesterol trong
thức ăn và mật mà không ảnh hưởng chất dinh dưỡng tan trong chất béo. Trong
các thử nghiệm lâm sàng, đơn trị ezetimib giảm LDL 15 - 22% ở bệnh nhân
tăng cholesterol máu. Điều trị phối hợp ezetimib và statin làm giảm thêm 15 -
20% nồng độ LDL [44]. Cơ chế tác dụng của ezetimib liên quan đến protein
NPC1L1 (Niemann-Pick C1-like 1 protein). NPC1L1 được biểu hiện cao
 26

trong ruột với biểu hiện lớn nhất ở hỗng tràng, là nơi hấp thụ cholesterol chính
qua ruột. Ezetimib liên kết với NPC1L1 và ức chế hấp thụ cholesterol.
Cholesterol trong lòng ruột có nguồn gốc từ cả cholesterol trong khẩu phần ăn
(khoảng 25%) và cholesterol mật (khoảng 75%). Do đó, ngay cả ở những bệnh
nhân có rất ít cholesterol trong chế độ ăn, ezetimib cũng sẽ làm giảm sự hấp
thu cholesterol. Ezetimib rất hiệu quả trong việc ngăn chặn sự hấp thu
cholesterol trong ruột mà không ảnh hưởng đến sự hấp thụ triglycerid, acid
béo, acid mật hoặc các vitamin tan trong dầu bao gồm vitamin D và K [27],
[95]. Khi hấp thu cholesterol đường ruột giảm, các chylomicron hình thành
bởi ruột chứa ít cholesterol hơn và do đó, việc phân phối cholesterol từ ruột
đến gan bị giảm đi. Điều này dẫn đến sự suy giảm hàm lượng cholesterol của
gan, dẫn đến sự hoạt hóa của SREBP, làm tăng sự biểu hiện của các thụ thể
LDL. Ngoài ra, việc giảm lượng cholesterol đến gan cũng làm giảm sự hình
thành và tiết ra VLDL [95]. Ngoài biểu hiện trong ruột, NPC1L1 cũng được
biểu hiện ở gan, nơi nó làm trung gian vận chuyển cholesterol từ mật trở lại
gan. Sự ức chế NPC1L1 trong gan sẽ dẫn đến sự tăng tiết cholesterol trong
mật và do đó, cũng có thể góp phần làm giảm hàm lượng cholesterol của gan
và tăng sự biểu hiện thụ thể LDL và giảm sản lượng VLDL [76]. Chỉ định
ezetimibe khi không đạt đích điều trị hạ LDL khi đã dùng liều statin tối ưu
dung nạp được. Sử dụng thuốc lipid này cần phối hợp cùng với statin, bệnh
nhân có chỉ định dùng statin nhưng không dung nạp với statin, dùng 10
mg/ngày. Khuyến cáo đo ALT của bệnh nhân trước khởi trị và ngưng
ezetimibe khi ALT > 3 lần ngưỡng [28], [41].

Thuốc ức chế PCSK9

Thuốc ức chế PCSK9 là một nhóm thuốc mới, có mặt trên thị trường
với cơ chế nhắm vào protein PCSK9 liên quan với kiểm soát thụ thể LDL.
EMA (European Medicines Agency) và FDA (US Food and Drug
Administration) đã chấp thuận hai kháng thể đơn dòng kiểm soát LDL huyết
 27

tương. Hiệu quả giảm LDL khoảng 50 – 70% độc lập với điều trị nền (statin,
ezetimib …) [70]. Thuốc không có tác dụng lên HDL, tác dụng lên triglycerid
phải được xác nhận lại trong các dân số với nồng độ triglycerid cao hơn. Nhóm
thuốc này có hiệu quả giảm LDL ở tất cả bệnh nhân có khả năng biểu hiện thụ
thể LDL ở gan [47]. Mối liên hệ giữa PCSK9 với chuyển hóa lipoprotein lần
đầu tiên được Abifadel và cộng sự xác định vào năm 2003, khi họ chứng minh
rằng những đột biến nhất định trong PCSK9 có thể dẫn đến sự xuất hiện kiểu
hình của tăng cholesterol máu gia đình [16]. Năm 2005, các nhà nghiên cứu
đã chứng minh rằng, sự đột biến mất chức năng trong PCSK9 dẫn đến mức
LDL thấp hơn và mức LDL giảm này có liên quan đến việc giảm nguy cơ biến
cố tim mạch [32]. Con đường chính của sự thanh thải của LDL huyết tương là
thông qua các thụ thể LDL trong gan. Khi LDL liên kết với thụ thể LDL, phức
hợp thụ thể LDL - hạt LDL được đưa vào gan bằng sự nhập bào. Các hạt LDL
và thụ thể LDL sau đó tách rời và hạt LDL lipoprotein được phân phối tới các
lysosome, nơi nó bị thoái hóa và thụ thể LDL quay trở lại màng [67]. Sau khi
các thụ thể LDL nhập bào, chúng tuần hoàn trở lại màng tế bào trên 100 lần.
PCSK9 có thể liên kết với thụ thể LDL và làm thay đổi sự trao đổi chất của
thụ thể LDL. Thay vì thụ thể LDL quay lại vào màng, phức hợp receptor LDL
- PCSK9 vẫn liên kết với hạt LDL nhưng sau đó, thụ thể LDL được chuyển
tới các lysosome, nơi nó bị thoái hóa. Điều này dẫn đến giảm số lượng thụ thể
LDL màng, làm giảm độ thanh thải LDL và tăng nồng độ LDL trong huyết
tương. Các kháng thể đơn dòng PCSK9 sẽ liên kết với PCSK9, ngăn cản
PCSK9 tương tác với các thụ thể LDL và do đó, ngăn ngừa việc PCSK9 gây
thoái hóa thụ thể LDL [50]. Như vậy, các chất ức chế PCSK9 làm giảm sự
xuống cấp của các thụ thể LDL, trong khi statin, ezetimib và các thuốc gắn
acid mật kích thích việc sản xuất các thụ thể LDL [28].
 28

Các thuốc khác

Ngoài những thuốc được đề cập ở trên, một số thuốc điều trị rối loạn
lipid máu khác cũng đã và đang được nghiên cứu, sử dụng ở những trường
hợp khác nhau như lomitapid và mipomersen. Lomitapid (Juxtapid) là một
chất ức chế MTP (microsomal triglycerid transfer protein) chọn lọc, đã được
phê duyệt vào tháng 12 năm 2012 để giảm mức cholesterol LDL ở người lớn
có tăng cholesterol máu gia đình đồng hợp tử; các tác dụng không mong muốn
thường gặp là trên hệ tiêu hóa và nguy cơ tiềm ẩn của bệnh gan; thuốc nên
được dành riêng cho một số ít bệnh nhân mà các liệu pháp khác không đủ để
giảm LDL. Mipomersen (Kynamro) là một oligonucleotid kháng
apolipoprotein thế hệ thứ hai, được chấp thuận vào tháng 1 năm 2013 để điều
trị cho bệnh nhân trên 12 tuổi với tăng cholesterol máu gia đình đồng hợp tử;
thuốc được dùng dưới dạng tiêm dưới da 200 mg mỗi tuần một lần;
mipomersen được sử dụng như một thuốc hỗ trợ cho các liệu pháp hạ lipid
khác ở bệnh nhân tăng cholesterol máu gia đình đồng hợp tử [28], [41].

Thảo dược điều trị rối loạn lipid máu

Hiện nay, các thuốc có nguồn gốc thảo dược được sử dụng khá phổ
biến trên toàn thế giới để điều trị rối loạn lipid máu, với mong muốn làm tăng
hiệu quả điều trị, giảm độc tính của thuốc và giảm chi phí điều trị cho bệnh
nhân. Trong những thập niên gần đây, hàng trăm thuốc thảo dược đã được báo
cáo có hiệu quả trong điều trị và dự phòng tăng lipid máu dưới các dạng bào
chế khác nhau như hợp chất, dịch chiết của một loại dược liệu hay công thức
phối hợp (bài thuốc). Ở Trung Quốc, hiện đã có hơn 50 bài thuốc cổ truyền
được chấp thuận cho sử dụng để điều trị tăng lipid máu. [86].
 29

Bảng 1.3. Một số dược liệu được sử dụng dự phòng và điều trị rối loạn
lipid máu

Dược liệu Thành phần có Cơ chế làm giảm lipid máu

hoạt tính
Trạch tả Triterpen Giảm tổng hợp cholesterol ở gan.
(Alismatis Giảm sự peroxid hóa lipid và hoạt
Rhizoma) hóa các enzym chống oxy hóa.
Sơn tra Polyphenol, Hoạt hóa PPARα. Ức chế hoạt tính
(Crataegi Fructus) acid triterpenic ACAT ruột ở dòng tế bào ung thư
trực tràng ở người Caco-2.
Hoàng liên Alkaloid Làm giảm sự peroxid hóa lipid.
(Coptidis (berberin) Điều hòa tăng PPARα. Điều hòa
Rhizoma) ngược FXR làm tăng biểu hiện gen
của CYP7A1 để chuyển cholesterol
vào acid mật. Giảm sự thoái hóa các
polysacharid từ thức ăn. Điều hòa
tăng LDLR in vitro và in vivo.
Nhân sâm Saponin, Cải thiện sự peroxid hóa lipid ở gan
(Gingseng Radix acidic bằng cách giảm MDA huyết thanh.
Rhizoma) polysaccharid, Hoạt hóa hoạt động LPL. Ức chế
dịch chiết lipase tụy. Giảm sự thèm ăn qua sự
phenol thay đổi lượng trong huyết tương và
sự biểu hiện mRNA của thụ thể
neuropeptid Y, Y2, peptid YY.
Tam thất Saponin Giảm HMG-CoA reductase.
(Radix Giảm sự peroxid hóa lipid bằng cách
Notoginseng) tăng hoạt tính chống oxy hóa SOD
gan và glutathion peroxidase.
 30

Dược liệu Thành phần có Cơ chế làm giảm lipid máu

hoạt tính
Giảm sinh tổng hợp acid mật từ
cholesterol, thúc đẩy β-oxidation
acid béo trong gan. Hoạt động như
một chất chủ vận kép FXR/LXR α.
Men gạo đỏ Các monacolin Chứa các chất thuộc gia đình
(Oryzae cum monacolin có hoạt tính giống với
Monasco Semen) các chất ức chế HMG-CoA
reductase.
Sắn dây Puerarin Thúc đẩy đào thải cholesterol, các
(Puerariae acid mật ở gan. Tác dụng giống
Lobatae Radix) estrogen trên chuyển hóa lipid ở gan
và mô mỡ. Tác dụng bảo vệ gan trên
gan nhiễm mỡ do OVX gây ra.
Đại hoàng Rhein Tác dụng ức chế HMG-CoA
(Rhei Radix và reductase. Có sự đối kháng LXR và
Rhizoma) điều hòa sự đối kháng sự biều hiện
protein-1 ở mô mỡ vàng.
Đan sâm Danshensu Chứa chất chống oxy hóa để phòng
(Salvia A. rosmarinic ngừa sự tổn thương nội mô, ức chế
Miltiorrhizae A. Salvianolic sự oxy hóa LDL. Hoạt động như
Radix) một chất đồng vận FXR/LXR α.

Nguồn: Sham Tung-Ting, et al. (2014) [86]

 31

Bảng 1.4. Một số bài thuốc (công thức phối hợp) được sử dụng dự phòng
và điều trị rối loạn lipid máu

Bài thuốc (công Sự tác động lên các chỉ số Cơ chế làm giảm lipid
thức phối hợp) lipid máu máu
Đương Quy Bổ Giảm nồng độ cholesterol Giảm sự biểu hiện mRNA
Huyết thang toàn phần và LDL, tăng nồng của MCP-1, ICAM-1,
độ HDL trong huyết tương. CD36.
Nhị Tiên thang Giảm nồng độ cholesterol Giảm biểu hiện HMG-
toàn phần và LDL. CoA. Tăng biểu hiện
LDL receptor.
Đan sâm - Cảo Làm giảm cholesterol tự do Sự thu hồi phụ thuộc liều
Bản và ester hóa (phụ thuộc liều) của sự hấp thu acetylate
trên tế bào bạch cầu người in LDL do đại thực bào.
vitro. Giảm nồng độ
cholesterol toàn phần và
LDL trên lâm sàng.
Linh - Quế - Giảm nồng độ triglycerid và Tăng nồng độ hormon
Truật - Cam cholesterol toàn phần trên thyroid trong huyết
thang chuột cống. tương. Cải thiện β-
oxidation thông qua
TRβ1 và biểu hiện
CPT1A trong gan. Thúc
đẩy chuyển hóa và vận
chuyển acid béo thông
qua điều hòa SREBP-1c
và biểu hiện ApoB100.
 32

Bài thuốc (công Sự tác động lên các chỉ số
thức phối hợp) lipid máu
Sinh Mạch tán Giảm lượng triglycerid và
cholesterol trong gan.
Tăng lượng acid mật đào
thải qua phân.
Quy Linh cao Giảm nồng độ cholesterol
toàn phần và LDL trong
huyết tương, tăng nồng độ
HDL trên chuột cống tăng
cholesterol do chế độ ăn.
Huyết Phủ Trục Giảm nồng độ cholesterol
Ứ thang toàn phần và LDL, tăng
nồng độ HDL trong huyết
tương.
Giảm nồng độ triglycerid và
tỷ lệ cholesterol toàn
phần/HDL ở chuột cống
Wistar gây tăng cholesterol
máu bằng chế độ ăn.
Cơ chế làm giảm lipid
máu
Thúc đẩy sinh tổng hợp
acid mật. Tăng sự dị hóa
cholesterol ở gan.
Chặn sự điều hòa giảm
LDLR và PEPCK mRNA
và sự biểu hiện protein.
Điều hòa giảm PPARα
mRNA và sự biểu hiện
protein ở gan.
Đảo chiều sự rối loạn
chuyển hóa lipid.
Giảm sự tích lũy acetyl-
glycoprotein. Thúc đẩy
sự sinh tổng hợp
glutathion.
Ức chế sự sản xuất IL8.

Nguồn: Sham Tung-Ting, et al. (2014) [86]

Ở Việt Nam hiện nay, có nhiều cây thuốc, vị thuốc có khả năng điều trị
rối loạn lipid máu được ghi nhận trong y văn như: Tỏi (Allium
sativum, Liliaceae) được xem là một loại thực phẩm chức năng có tác dụng
chống oxy hoá, bảo vệ màng tế bào, giảm cholesterol, giảm huyết áp để phòng
chống các loại bệnh tim mạch; Sơn tra (Crataegus cuneara S.et Z., Rosaceae.)
là quả chín thái mỏng hay phơi sấy khô của cây bắc hay nam Sơn tra; Ngưu
 33

tất (Achyranthes Bidentata Blume., Amaranthaceae) có bộ phận dùng là rễ

phơi hay sấy khô của cây Ngưu tất với thành phần hoá học chính là saponin
triterpene. Ngoài ra, nhiều dược liệu khác như: Đậu nành, vỏ Đậu xanh, Nghệ,
… cũng có tác dụng làm hạ lipid máu đã được sử dụng theo kinh nghiệm và
được chứng minh tác dụng qua các nghiên cứu khoa học [6].

1.1.4. Hậu quả của rối loạn lipid máu

Sự hình thành mảng xơ vữa

Những mảng xơ vữa trên bề mặt của thành mạch đã được mô tả đầu
tiên bởi nhà nghiên cứu bệnh học người Đức Leibowitz vào năm 1970. Từ xơ
vữa “atherosclerosis” bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp là “atheros” có nghĩa là một
chất dịch giống như cháo, từ này mô tả cho một hợp chất giống như phô mai
chảy ra từ mẫu cắt các mảng xơ vữa. Sau đó, người ta tìm thấy những mảng
xơ vữa động mạch từ người, có chứa cholesterol gấp 25 lần so với động mạch
của người bình thường. Đến năm 1913, nhà khoa học Nikolaj Anitschkow qua
nghiên cứu trên thỏ đã dự đoán khả năng chế độ ăn có chứa cholesterol là
nguồn gốc của các “atheros” này [44].

LDL được phát hiện từ năm 1955, khi John Gofman bắt đầu một thử
nghiệm mới, bằng cách sử dụng siêu ly tâm để tách các lipoprotein vận chuyển
cholesterol trong huyết tương theo tỷ trọng và 2 phân đoạn chính đã được xác
định đó là lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) và lipoprotein tỷ trọng cao (HDL).
Khi nghiên cứu huyết tương của những bệnh nhân bị cơn đau tim (nhồi máu
cơ tim), Gofman đã phát hiện ra sự tăng đáng kể LDL và sự giảm HDL. Cho
đến nay, mặc dù một số lượng lớn các nghiên cứu đã được công bố về sự liên
quan giữa HDL với nhồi máu cơ tim, tuy nhiên, cơ chế về vai trò của HDL
trong bệnh mạch vành vẫn chưa rõ. Trong khi đó, sự tăng LDL trong huyết
tương cho thấy sự hình thành xơ vữa thành mạch ở tất cả các loài động vật có
vú được nghiên cứu. Giả thuyết về việc LDL bắt đầu hình thành các mảng xơ
 34

vữa là khi nó xâm nhập vào thành động mạch thông qua sự rối loạn chức năng
nội mô. LDL được giữ lại ở đây có khuynh hướng gắn vào glycosaminoglycan.
Lipid trong LDL bị oxy hóa và các sản phẩm phản ứng thay đổi lượng lysin
trên apo B, apo B đã thay đổi được nhận diện bởi thụ thể dọn dẹp của đại thực
bào và biến đổi. Tiến trình này hình thành những tế bào bọt chứa đầy
cholesterol. Những tế bào bọt này tiết ra các cytokine khác nhau và khởi đầu
cho phản ứng viêm, tế bào cơ trơn của thành động mạch tăng sản xuất collagen
hình thành các mảng bám. Các mảng bám này mở rộng và cuối cùng vỡ ra, dẫn
đến sự hình thành huyết khối và làm tắc nghẽn mạch máu [44], [47]. Bên cạnh
LDL, sự hình thành mảng xơ vữa còn được thúc đẩy bởi các yếu tố nguy cơ
khác, bao gồm hút thuốc lá, tăng huyết áp và đái tháo đường. Các cơ chế về
gen trong xơ vữa mạch vành hiện nay vẫn còn chưa được sáng tỏ, có thể là do
sự thay đổi trong nội mô. Nếu không có sự bất thường về nồng độ LDL thì rất
khó để dự đoán chính xác về khả năng bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim [47], [67].

Bệnh lý gan nhiễm mỡ không do rượu

Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD) hoặc "gan nhiễm mỡ"
tương ứng với sự hiện diện của các thay đổi vĩ mô mà không bị viêm (nhiễm
mỡ) và viêm thùy trong khi bệnh nhân sử dụng rượu không đáng kể. Nó có
thể được chia thành hai nhóm nhỏ là NAFL (Gan nhiễm mỡ không do rượu)
hoặc đơn giản là Steatosis và NASH (Viêm gan nhiễm mỡ không do rượu).
NAFL được định nghĩa là sự hiện diện của gan nhiễm mỡ mà không có bằng
chứng về tổn thương ballooning của tế bào gan. NASH được định nghĩa là sự
hiện diện của gan nhiễm mỡ và viêm với tổn thương tế bào gan (ballooning),
Malloryhyalin, lympho và bạch cầu trung tính hỗn hợp xâm nhập ở các khu vực
quanh màng, có hoặc không có xơ hóa [14], [25]. Bệnh gan nhiễm mỡ không
do rượu (NAFLD) là một vấn đề lâm sàng nghiêm trọng và đang gia tăng, ước
tính tỷ lệ mắc NAFLD nằm trong khoảng 20% trong dân số Hoa Kỳ và từ 11,5%
đến 46% trong dân số nói chung. Tuổi trung bình khi chẩn đoán là 50 tuổi
 35

(khoảng 16 đến 80 tuổi) [25]. Các nghiên cứu trước đây cho thấy 10% - 29%
bệnh nhân NASH có thể bị xơ gan trong vòng 10 năm và 4% -27% trong số
những bệnh nhân này có thể bị ung thư gan. Do đó, NAFLD / NASH sẽ dần trở
thành nguyên nhân chính của bệnh gan mạn tính trên toàn thế giới [14].

Phần lớn lipid tế bào gan được lưu trữ dưới dạng triglycerid, nhưng các
chất chuyển hóa lipid khác như axit béo tự do, cholesterol và phospholipid,
cũng có thể có mặt và đóng vai trò trong sự tiến triển của NAFLD. NAFLD
có liên quan đến béo phì và đề kháng insulin, nó được coi là biểu hiện trên gan
của hội chứng chuyển hóa (sự kết hợp của đái tháo đường týp 2, tăng huyết
áp, tăng lipid máu và mỡ nội tạng). Stress oxy hóa có vai trò chính trong sinh
bệnh học của NAFLD khi nồng độ peroxid hóa lipid tăng trong cả NASH và
gan nhiễm mỡ. Stress oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong lần tấn công
thứ hai và cũng liên quan đến peroxid hóa lipid trong tế bào gan nhiễm mỡ.
Hơn nữa, các phản ứng miễn dịch đối với các sản phẩm peroxid hóa lipid có
thể đóng góp vào sự tiến triển NAFLD [14], [25].

Chẩn đoán xác định NAFLD thường có thể đạt được bằng các xét
nghiệm hình ảnh; tuy nhiên, chẩn đoán phân biệt bệnh đòi hỏi phải sinh thiết
gan [14], [25], [58]. Khoảng 50% bệnh nhân NAFLD có mức xét nghiệm sinh
hóa gan cao hơn bình thường, tỷ lệ này là 80% ở bệnh nhân mắc NAFLD tiến
triển. Ngoài ra, nồng độ AST / ALT huyết thanh hoặc cả hai chỉ số này thường
được tăng lên tới 1,5 đến 4 lần và hiếm khi vượt quá 10 lần giới hạn trên của
bình thường. Trong khi đó, nồng độ GGT và phosphatase kiềm có thể tăng,
thời gian prothrombin, nồng độ bilirubin và nồng độ albumin huyết thanh là
bình thường; ngoại trừ ở bệnh nhân xơ gan liên quan đến NAFLD. Khoảng
một phần tư bệnh nhân NAFLD có thể có kháng thể kháng nhân (ANA) (dưới
1: 320) và có thể được coi là một dấu hiệu cho bệnh tiến triển. Tăng đường
huyết và rối loạn lipid máu được phát hiện ở 30% đến 50% đối tượng NAFLD,
tương quan với mức độ nghiêm trọng mô học [14].
 36

Các tổ chức khoa học từ các khu vực khác nhau (Châu Âu, Châu Mỹ
và Châu Á - Thái Bình Dương) đã đề xuất các hướng dẫn điều trị dựa trên
bằng chứng gần đây nhất về NAFLD. Những hướng dẫn này phù hợp với các
yếu tố chính trong quản lý NAFLD, tuy nhiên, vẫn có sự khác biệt đáng kể về
một số điểm quan trọng. Sự khác biệt đã được ghi nhận là: Định nghĩa
NAFLD, khả năng sàng lọc NAFLD ở bệnh nhân có nguy cơ cao, xét nghiệm
không xâm lấn được đề xuất để chẩn đoán NAFLD và xác định bệnh nhân
NAFLD bị xơ hóa tiến triển [58]. Hướng dẫn điều trị hiện tại của NAFLD là
(1) thay đổi lối sống, (2) điều trị bằng thuốc, (3) phẫn thuật barective cắt dạ
dày và ruột non, (4) ghép gan. Thay đổi lối sống gồm điều chỉnh chế độ ăn
uống, tập thể dục và giảm cân đã được đề nghị để điều trị bệnh nhân bị NAFLD
trong tất cả các hướng dẫn, giảm cân 7% - 10% là mục tiêu của hầu hết các
biện pháp thay đổi lối sống. Điều trị bằng thuốc (Vitamin E, metformin, statin,
…) được khuyến cáo trong một số hướng dẫn, tuy nhiên, hiện tại, không có loại
thuốc nào được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ hoặc Cơ quan
Dược phẩm Châu Âu chấp thuận để điều trị NASH. Phẫu thuật barective ở
những bệnh nhân không đáp ứng với thay đổi lối sống và thuốc là một lựa chọn
để giảm cân và giảm biến chứng chuyển hóa với kết quả ổn định trong thời gian
dài. Ghép gan đang trở thành một chỉ định cho NASH ở các nước phương Tây.
Tuy nhiên, do tỷ lệ béo phì, bệnh tim mạch và bệnh thận mãn tính cao ở những
bệnh nhân mắc NASH, nên các biến chứng sau ghép có tỷ lệ cao [58].

1.2. Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae)

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Bụp giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L., thuộc họ Bông
Malvaceae, còn được gọi là hibiscus, roselle, red sorrel hay karkadeh. Cây một
năm, cao 1,5 - 2 m, phân nhánh gần gốc, màu tím nhạt. Lá hình trứng, nguyên,
mép lá có răng cưa. Hoa đơn độc, mọc ở nách, gần như không có cuống. Tràng
hoa màu vàng, hồng hay tía, có khi trắng. Quả nang hình trứng, có lông thô
 37

mang đài màu đỏ sáng tồn tại bao quanh quả. Ra hoa tháng 7 - tháng 10. Bộ
phận dùng: Lá, hạt, đài hoa [6], [23], [105].

Hình 1.4. Cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae)

(wikimedia.org)

Giới Thực vật (Plantae)

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Sổ (Dilleniidae)

Bộ Bông (Malvales)

Họ Bông (Malvaceae)

Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae

Hình 1. 5. Vị trí cây Bụp giấm trong bảng phân loại hệ thống thực vật
 38

Nguồn gốc của Bụp giấm chưa chắc chắn, một số tài liệu cho rằng nó
có nguồn gốc từ Ấn Độ hoặc Ả Rập, một số tài liệu khác thì chứng minh Bụp
giấm có nguồn gốc ở Tây Phi. Ngày nay, cây được trồng rộng rãi ở những
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Ấn Độ, Ả Rập, Trung Quốc, Malaysia,
Indonesia, Philipine, Việt Nam, Sudan, Hy Lạp, Nigeria và Mexico [34].

1.2.2. Thành phần hóa học

Cả lá và đài hoa Bụp giấm đều chứa nhiều acid và protein; các acid
chính tan trong nước là acid citric, acid malic, acid tartric, acid hibiscus. Hoa
chứa flavonol glucosid là hibiscitrin, hibiscetin, gossypitrin và
sabdaritrin. Quả khô chứa calci oxalat, gossypetin, anthocyan và vitamin C.
Hạt chứa 7,6% nước, 22,3% dầu, 24% protein, 13,5% chất xơ, 7% chất
khoáng. Dầu hột Bụp giấm tương tự như dầu hột bông vải, chứa vitamin và
các chất béo không no [6]. Hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết cồn 100%
là ít nhất, 1,23 mg/g; trong khi đó, hàm lượng tìm thấy trong dịch chiết cồn
50% và dịch chiết nước lần lượt là 3,83 mg/g và 3,22 mg/g. Đài hoa của Bụp
giấm được sử dụng nhiều nhất do có chứa nhiều các acid hữu cơ, vitamin C
và đặc biệt là anthocyanin với hàm lượng đạt 1,5g/kg đài hoa khô, trong đó,
delphinidin và cyanidin là hai anthocyanin chính chiếm gần 71% và 29%
[105]. Theo nghiên cứu của Edgar Vinicio Villalpando-Arteaga và các cộng
sự, năm 2013, phân tích dịch chiết nước đài hoa Bụp giấm có thành phần chính
là các anthocyanin như delphinidin-3-sambubiosid và cyanidin-3-
sambubiosid, cùng với sự hiện hiện của một số flavonoid như quercertin,
luteolin và dạng glycosid của chúng, acid chlorogenic, gossypetin, hibiscetin,
polyphenol và một vài acid phenolic [96].
1.2.3. Tác dụng dược lý
Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Bụp giấm có khả năng làm giảm lipid, giúp phòng ngừa các bệnh tim
mạch. Các dịch chiết (dịch chiết nước và cồn của đài hoa hoặc lá) có thể làm
 39

giảm lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp (LDL), triglycerid (TG), cholesterol

toàn phần (TC) và giảm sự peroxid hóa lipid trên in vivo. Một vài nghiên cứu
còn cho thấy dịch chiết Bụp giấm làm giảm lipoprotein cholesterol tỷ trọng rất
thấp (VLDL) và làm tăng nồng độ trong huyết tương của lipoprotein
cholesterol tỷ trọng cao (HDL) [48]. Bụp giấm cũng làm giảm sự hình thành,
ức chế sự di chuyển tế bào bọt và giảm sự vôi hóa của tế bào cơ trơn trong
mạch máu của thỏ. Tác dụng làm giảm LDL có thể liên quan đến sự ức chế
tổng hợp triacylglycerol hoặc thông qua khả năng chống oxy hóa, chống lại
sự phá hủy do quá trình oxy hóa LDL và sự thanh thải LDL ở gan. Một vài
nhóm hợp chất trong dịch chiết như anthocyanin và acid protocatechuic có thể
liên quan đến tác dụng này của Bụp giấm [30], [57], [94]. Kết quả nghiên cứu
của Mon-Yuan Yang và các cộng sự nghiên cứu trên giống chuột hamster vào
năm 2010 cho thấy, các polyphenol trong Bụp giấm, ức chế quá trình tạo mỡ
và thúc đẩy sự thanh thải lipid ở gan) [101]. Dầu hạt Bụp giấm cũng có tác
dụng làm giảm sự tăng lipid máu và cholesterol máu ở chuột cống nuôi bằng
chế độ ăn giàu acid béo bão hòa [24].

Trong nghiên cứu lâm sàng tiến hành năm 2007, sử dụng viên nang
chứa cao chiết hoa Bụp giấm đường uống cho tác dụng giảm nồng độ
cholesterol trong huyết thanh sau 4 tuần sử dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy,
sử dụng 2 viên trong mỗi bữa ăn cho kết quả tốt nhất với liều sử dụng là 2 viên
(tương đương 1 g), uống 3 lần 1 ngày (tổng cộng 3 g/ngày) [60]. Dựa trên kết
quả đó, một nghiên cứu lâm sàng khác được tiến hành với 53 bệnh nhân đái
tháo đường type II cũng cho kết quả về tác dụng của trà Bụp giấm trên lipid
máu. Trong nghiên cứu này, bệnh nhân sử dụng Bụp giấm (1 gói trà 2 g pha
trong nước) 2 lần 1 ngày trong 1 tháng (Mozaffari-Khosravi và cộng sự, năm
2009). Tuy nhiên, trong nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên, mù đôi, đối chứng
placebo, với liều 1 g/ngày sử dụng trong 90 ngày, dịch chiết ethanol lá Bụp
giấm không cho thấy tác dụng giảm lipid máu so với tác dụng của việc ăn
 40

kiêng và thay đổi lối sống (Kuriyan và cộng sự, năm 2010). Sự khác biệt về
kết quả của các nghiên cứu lâm sàng trên có thể do sự khác biệt về loại dịch
chiết, liều sử dụng [34].

Tác dụng khác

Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo trong những năm từ 1997 đến 2011
đều cho thấy dịch chiết Bụp giấm có tác dụng chống oxy hóa. Polyphenol
trong số những anthocyanin, cụ thể như delphinidin-3-glucosid và acid
protocatechuic là những hợp chất quan trọng góp phần vào khả năng chống
oxy hóa của Bụp giấm [34]. Dịch chiết nước đài hoa Bụp giấm có tác dụng
bảo vệ, chống lại stress oxy hóa trên màng tế bào hồng cầu ở chuột cống gây
đái tháo đường bằng streptozotocin; nồng độ malondialdehyd của màng tế bào
hồng cầu trong nhóm gây bệnh cao hơn nhóm chứng uống dịch chiết Bụp
giấm. Bụp giấm được khuyến cáo sử dụng cho những bệnh nhân đái tháo
đường như là một nguồn bổ sung chất chống oxy hóa tự nhiên [68]. Trong một
nghiên cứu lâm sàng với 8 tình nguyện viên khỏe mạnh, dịch chiết nước Bụp
giấm làm tăng hiệu lực chống oxy hóa hệ thống ở huyết tương và nước tiểu,
làm tăng đào thải acid hippuric với sự giảm nồng độ malondialdehyd trong
nước tiểu (chỉ dấu sinh học của stress oxy hóa) [42].

Bên cạnh đó, dịch chiết nước đài hoa Bụp giấm (100 - 800 mg/kg) cho
thấy khả năng bảo vệ gan trên một số mô hình gây độc gan như gây tổn thương
gan bằng tert-butylhydroperoxid, lipopolysaccharid, azathioprim, carbon
tetrachlorid, cadmium, ammonium chlorid, acetaminophen hay bức xạ trên in
vitro và in vivo, [48] làm giảm độc tính của acetaminophen trên gan chuột
cống Wistar thông qua việc làm giảm số tế bào chết và sự oxy hóa tế bào [62].
Các anthocyanin hiện diện trong dịch chiết có vai trò quan trọng trong tác
dụng bảo vệ gan của Bụp giấm. Hoạt chất khác cũng được dự đoán là có vai
trò trong tác dụng bảo vệ gan của Bụp giấm là acid protocatechuic và hợp chất
phenolic [34]. Theo nghiên cứu của Edgar Vinicio Villalpando-Arteaga và các
 41

cộng sự (2013), dịch chiết nước đài hoa Bụp giấm (với thành phần chính là
các anthocyanin như delphinidin-3-sambubiosid và cyanidin-3-sambubiosid)
làm giảm gan nhiễm mỡ thông qua cơ chế điều hòa của PPAR-γ và SREBP-
1c trên chuột nhắt gây béo phì bằng chế độ ăn [96].

Nước sắc Bụp giấm đã và đang được sử dụng ở Tây Phi và Mexico như
là một phương pháp truyền thống để chống tăng huyết áp. Một số nghiên cứu
in vitro và in vivo đã cho thấy dịch chiết đài hoa Bụp giấm trong khoảng liều
từ 125 mg/kg đến 500 mg/kg làm giảm cả huyết áp tâm thu và huyết áp tâm
trương, giảm nhịp tim và nó hoạt động giống như một thuốc giãn mạch. Sự
giãn mạch do Bụp giấm có thể độc lập với nội mô một phần, phụ thuộc hoạt
tính qua trung gian nitric oxid nguồn gốc nội mô (EDNO) và có thể liên quan
đến sự ức chế kênh Ca++ (Ajay, Chai, Mustafa, Gilani, năm 2007). Hiệu quả
chống tăng huyết áp của Bụp giấm cũng có thể thông qua ức chế men chuyển
angiotensin (ACE) (Jonadet và cộng sự, năm 1990; Ojeda và cộng sự, năm
2010) hoặc cơ chế giống acetylcholin và histamin (Adegunloye và cộng sự,
năm 1996), nghiên cứu của Mojiminiyi và cộng sự năm 2000 lại cho thấy tác
dụng lợi tiểu của Bụp giấm. Trên in vitro, Bụp giấm cũng thể hiện tác dụng
kháng tiểu cầu nhưng không có khả năng làm tan huyết khối (Shehata và El
Menoufy, năm 2008) [34]. Bụp giấm làm giảm cả huyết áp tâm thu (khác biệt
trung bình -7,58 mmHg) và huyết áp tâm trương (khác biệt trung bình 3,53
mmHg) [84].

Dịch chiết nước đài hoa Bụp giấm và acid protocatechuic (5 mg/ml) ức
chế sự phát triển của các chủng kháng methicillin như Staphylococcus aureus,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii
(Liu, Tsao và Yin, năm 2005), kháng khuẩn chống lại Streptococcus mutans,
vi khuẩn gây bệnh tử khoang miệng với nồng độ ức chế tối thiểu là 2,5 mg/ml
(Afolabi và cộng sự, năm 2008); ở nồng độ 96 - 152 μg/ml, Bụp giấm có tác
dụng kháng chủng Campylobacter (Campylobacter jejuni, Campylobacter
 42

coli và Campylobacter fetus), vi khuẩn nhiễm trong thịt như thịt gia cầm, thịt
bò, thịt heo (Yin và Chao, năm 2008). Theo nghiên cứu của Olaleye năm 2007,
dịch chiết nước - methanol của đài hoa Bụp giấm khô cũng cho thấy tác dụng
ức chế in vitro đối với một số dòng vi khuẩn như S. aureus, Bacillus
stearothermophilus, Micrococcus luteus, Serratis mascences, Clostridium
sporogenes, Escherichia coli, K. pneumonia, Bacillus cereus và Pseudomonas
fluorescence nhưng không có tác dụng trên sự phát triển của nấm Candida
albicans. Dịch chiết nước đài hoa Bụp giấm tươi, dịch chiết ethanol và acid
protocatechuic (10 mg/ml) có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn
làm hư thực phẩm như Salmonella typhimurium DT104, E. coli O157:H7,
Listeria monocytogenes, S. aureus và B. cereus. Theo nghiên cứu của Nwaiwu
và cộng sự công bố năm 2012, dịch chiết thô của hạt Bụp giấm (200 mg/l)
cũng cho thấy tác dụng kháng khuẩn với ba chủng Gram âm, trong đó, tác
dụng kháng Salmonella cao hơn Shigella và Enterobacter [34]. Theo nghiên
cứu của Emad Mohamed Abdallah, năm 2016, dịch chiết methanol 80% của
đài hoa khô Bụp giấm (500 mg/ml) có tác dụng kháng khuẩn, đánh giá thông
qua vòng kháng khuẩn (> 10 mm) của các test với vi khuẩn Gram âm (S.
aureus, S. epidermidis, B. cereus) và Gram dương (P. aeruginosa, E. coli, K.
pneumonia, S. enterica, P. vulgaris). Tác dụng này ngang với gentamicin và
cao hơn penicillin (tác dụng yếu / không có tác dụng) [15].

Theo kinh nghiệm dân gian, lá Bụp giấm có vị chua, dùng làm rau ăn.
Đài hoa có vị chua làm gia vị thay giấm, chế nước giải khát hoặc làm mứt, có
nơi dùng chế siro. Lá còn có thể dùng như chất thơm. Toàn cây được dùng để
chế rượu vang, cho sản phẩm rượu có màu đỏ đẹp, vị chát, chua dịu của vang
Bordeaux. Đài hoa mọng nước đem sắc lấy nước uống hay hãm uống giúp cho
tiêu hoá và trị các bệnh về mắt, tim và thần kinh, huyết áp cao, xơ cứng động
mạch. Nhai, ngậm đài hoa Bụp giấm có thể trị viêm họng, ho. Ở Thái Lan, lá
 43

đài Bụp giấm phơi khô sắc uống là thuốc lợi tiểu mạnh chữa sỏi thận.
Ở Philipin, rễ Bụp giấm là thuốc bổ và kích thích tiêu hoá [6].

1.2.4. Tính an toàn của Bụp giấm

Các dạng bào chế của Bụp giấm, chủ yếu là dạng trà và dịch chiết nước,
là loại sản phẩm truyền thống đã được sử dụng từ lâu. Nhìn chung, các sản
phẩm này được đánh giá là an toàn khi sử dụng. Tuy nhiên, vẫn có một số dữ
liệu về độc tính của Bụp giấm được công bố mặc dù chưa có ca lâm sàng nào
báo cáo về tác dụng có hại khi sử dụng các dạng bào chế từ Bụp giấm đường
uống. Trong nghiên cứu sàng lọc dịch chiết của dược liệu Bụp giấm để đánh
giá tác dụng sinh học, liều gây chết 50% động vật thử nghiệm (LD50) của 3
loại dịch chiết Bụp giấm đã được đánh giá trên tôm biển. Kết quả cho thấy,
dịch chiết nước Bụp giấm cho LD50 ở nồng độ 9,59 μg/ml [85]. Liều LD50 trên
chuột nhắt (trọng lượng 30 g) được báo cáo là khoảng 0,4 - 0,6 ml (tiêm phúc
mô, i.p.) nước sắc Bụp giấm 30% (Bụp giấm được ngâm trong nước cất 30
phút, lấy dịch chiết) [87]. Theo nghiên cứu khác của Onyenekwe và các cộng
sự, tác giả dự đoán LD50 của Bụp giấm trên chuột nhắt là trên 5000 mg/kg cân
nặng. Trên chuột cống, khi sử dụng dịch chiết Bụp giấm ở mức liều 1000
mg/kg, từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 21, ghi nhận có động vật chết ở nhóm tăng
huyết áp, không có động vật chết ở nhóm bình thường. Theo tác giả, nguy cơ
tử vong do bệnh lý tim mạch tăng ở những bệnh nhân sử dụng thuốc lợi tiểu
không tiết kiệm kali, do đó, trong trường hợp này, có thể suy đoán cái chết của
động vật là do tác dụng lợi tiểu của Bụp giấm [74]. Trong nghiên cứu của
David O Adeyemi, năm 2014, LD50 của phân đoạn nước dịch chiết methanolic
của Bụp giấm trên chuột cống là 3200 mg/kg [18]. Theo báo cáo của Kirdpon
và các cộng sự, 36 người tình nguyện là nam giới, khỏe mạnh, sau khi sử dụng
16 g Bụp giấm/ngày có sự giảm kali và natri. Trong khi nhóm sử dụng liều
cao hơn là 24 g Bụp giấm/ngày lại không có hiện tượng này. Sự lý giải về kết
quả nghiên cứu này vẫn chưa được làm rõ. Nghiên cứu của Herrera-Alrellano,
 44

năm 2004, nghiên cứu trên 171 người có tăng huyết áp mức độ nhẹ đến trung
bình, dịch chiết Bụp giấm cho tác dụng lợi tiểu natri, không có tác dụng trên
chlorid, kali và pH [48].

1.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của thuốc lên chuyển hóa lipid
Khi đánh giá tác động của một thuốc lên quá trình chuyển hóa lipid,
cần áp dụng đa dạng các phương pháp/mô hình sẽ cho kết quả thuyết phục
nhất. Nếu dự đoán trước được cơ chế tác dụng của thuốc thì sự chọn lựa các
phương pháp sẽ thuận lợi hơn. Hiện nay, các mô hình truyền thống đánh giá
tác động của thuốc trên chuyển hóa lipid như sử dụng chế độ ăn giàu lipid hay
tiêm chất diện hoạt triton WR-1336 vẫn được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu. Bên cạnh đó, các phương pháp đánh giá tác động của thuốc ở mức
độ phân tử, tế bào, định lượng một số yếu tố có vai trò quan trọng trong chuyển
hóa lipid như HMG-CoA reductase, lipoprotein lipase, LDL receptor, SREBP,
AMPK, LXRs, PCSK9… ngày càng được quan tâm.

Nghiên cứu nhằm xác định mức độ biểu hiện của HMG-CoA reductase,
SREBP, LDL receptor (LDLR), … bằng cách dùng tế bào HepG2. Tế bào
được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, tìm nồng độ dùng trong nghiên cứu
của thuốc thông qua thử nghiệm độc tế bào, cho tế bào phơi nhiễm với thuốc
và xác định mức độ biểu hiện của các phân tử quan tâm bằng kỹ thuật RT-
PCR và Western blot. Lượng cholesterol toàn phần và trilycerid trong tế bào
cũng có thể được xác định như một thông số tham khảo cho tác động của thuốc
lên quá trình tổng hợp cholesterol và triglycerid [101]. Các chỉ số này cũng có
thể xác định bằng cách dùng mô gan chuột thay vì một dòng tế bào cụ thể.
[29], [93] Đánh giá tác động của thuốc lên thụ thể X của gan - LXRs (liver X
receptor) cũng đã được một số tác giả nghiên cứu [83].
 45

Bảng 1.5. Một số nghiên cứu đánh giá tác động của thuốc lên quá trình
chuyển hóa lipid mức độ phân tử và tế bào

Tác giả Năm Thông số đánh giá

công bố
Joshua R. Schultz 2000 LXR, SREBP-1 ở gan
và cộng sự [83]
Mon-Yuan Yang 2010 HMG-CoA reductase, AMPK, LDL
và cộng sự [101] receptor, SREBP-1, lipid trong tế bào gan
Yi-Seong Kwak và 2010 Lipoprotein lipase, NEFA (non-esterified
cộng sự [56] fatty acid)
Stephen CW Sze và 2011 HMG-CoA reductase, LDL receptor ở gan
cộng sự [93]
Wei Xia, Caihong 2011 HMG-CoA reductase, superoxid
Sun, Yan Zhao, dismutase, glutathion peroxidase, lipid
Lijie Wu [98] peroxidation.
Xin-xia Chang và 2012 HMG-CoA reductase, LDL receptor, apo
cộng sự [29] E, apo AI, thụ thể dọn dẹp (SR) ở gan.
Xiaoyan Sheng và 2012 LXR, UCPI (uncoupling protein I), BAT
cộng sự [88] (brown adipose tissue).

Các enzym có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp hoặc ly
giải protein cũng được xác định bằng một số phương pháp định lượng hoặc
đánh giá biểu hiện qua mRNA như: Đánh giá tác động của thuốc lên hoạt tính
enzym HMG-CoA reductase ở gan bằng cách sử dụng mô gan chuột cống,
đồng hóa trong dung dịch đệm Tris-HCl, đem ly tâm để lấy phần dịch chứa
enzym. Hoạt tính enzym được xác định từ tỷ lệ HMG-CoA/mevalonat. Sự
tăng tỷ lệ này cho thấy sự giảm hoạt tính enzym (theo phương pháp của Rao
và Ramakrisman, năm 1975) [98]. Đánh giá tác động của thuốc lên hoạt tính
lipoprotein lipase (LPL) bằng cách sử dụng test ELISA. Hoạt tính được biểu
 46

hiện bằng đơn vị đại diện cho nmol acid béo tự do được giải phóng trong mỗi
ml huyết tương. Đánh giá biểu hiện của mRNA LPL bằng phản ứng RT-PCR,
lượng mRNA được tách từ mô gan chuột cống [56].

Các động vật bình thường nuôi với chế độ ăn thường quy và được cho
uống thuốc qua ống thông hoặc trộn vào thức ăn. Ở chuột cống trắng, cho uống
thuốc trong 4 ngày và thực hiện phân tích huyết thanh vào ngày thứ 5 của thí
nghiệm. Các hợp chất làm giảm cholesterol huyết thanh với tỷ lệ ít nhất 20% ở
liều 400 mg/kg được coi là có hoạt tính, và tiếp đó, thử nghiệm các hoạt chất
này ở liều thấp hơn. Tuy nhiên, một kết quả âm tính không nhất thiết có nghĩa
là thuốc sẽ không có tác dụng trên người (Steinberg, 1962). Thử nghiệm này là
một phương pháp đánh gía tác dụng tương đối nhanh và đơn giản, thường dùng
để sàng lọc ban đầu [13].

Gây tăng cholesterol máu cũng có thể được thực hiện ở nhiều loài động
vật bằng cách cho mỡ và cholesterol vào thức ăn. Chứng tăng cholesterol này
có tính chất ngoại sinh (đưa từ bên ngoài vào). Các thuốc có tác dụng chống
tăng cholesterol máu bởi chế độ ăn tác động do một hoặc nhiều cơ chế có liên
quan với sự ức chế hấp thu cholesterol ở ruột, tăng sự thoái biến cholesterol ảnh
hưởng đến sự sản sinh lipoprotein hoặc tăng nhanh sự thải trừ (thanh thải)
lipoprotein. Trong những thí nghiệm ban đầu phát triển cho mô hình này, chuột
cống trắng trưởng thành được gây tăng cholesterol máu bằng cách bổ sung thức
ăn với cholesterol 1%, mỡ và các acid mật (như acid cholic) 1%, và chất đối
kháng tuyến giáp propyl thiouracil 0,01% trong nước uống (Wissler và cộng sự,
1954; Anderson và Bowman, 1969; Fukushima và Nakatani, 1969; Nakamara
và cộng sự, 1969) [13]. Sau này, mô hình gây tăng lipid máu ngoại sinh được
sử dụng rộng rãi, chủ yếu trên chuột với các chế độ ăn giàu lipid.
 47

Bảng 1.6. Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng chế độ ăn

Thời
Động vật
Tác giả Năm Chế độ ăn giàu lipid điểm
thử nghiệm
khảo sát
1% cholesterol, 0,5%
T. Yokozawa và Chuột cống
2003 acid cholic, 18% 30 ngày
cộng sự [102] Wistar
casein
Emmy Hainida 2008 Chuột cống Cholesterol 20 5 tuần
và cộng sự [46] đực Spague mg/kg, 2 g/kg acid
- Dawley cholic
Yi-Guan Zhang 2008 Chuột cống 3% cholesterol, 10% 9 tuần
và cộng sự [104] Wistar mỡ heo, 0,5% acid
cholic, 5% sucrose
Seock-Yeon 2008 Thỏ trắng 2% dầu bắp, 0,5% 4 tuần
Hwang và cộng New cholesterol
sự [51] Zealand
Pooja C Ochani 2009 Chuột cống Cholesterol 25 30 ngày
và Priscilla dòng mg/kg, dầu dừa
D’mello [72] Wistar
Mon-Yuan-Yang 2010 Hamster Cholesterol 0,2%, 10 tuần
và cộng sự [101] 10% dầu dừa
Healther M. 2010 Chuột nhắt Dầu cọ, 0,1% - 0,2% 6-8
Anger và cộng sự cholesterol tuần
[21]
Tine M Comhair 2011 Chuột nhắt Hỗn hợp các loại dầu 3 tuần
và cộng sự [33] béo, 0,2% cholesterol
Wei Xia và cộng 2011 Chuột cống 10% mỡ heo 4 tuần
sự [98]
 48

Bảng 1.7. Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339)

Tác giả Năm Động vật thử Liều dùng và Thời điểm
nghiệm đường sử khảo sát
dụng sau tiêm
Frantz và 1955 Chuột cống 100 mg/kg, IP 18 giờ
Hinkelman [13] Wistar
Tamasa và cộng 1968 Chuột cống 200 mg/kg, IP 6 giờ
sự [13] Wistar đực
Phil-sun Oh và 2006 Chuột nhắt đực 400 mg/kg, IP 18 giờ
cộng sự [73]
Jingjing Chen MD 2007 Chuột nhắt trắng 400 mg/kg, IP 6, 12, 24
và cộng sự [31] giờ
Weidong Xie và 2007 Chuột nhắt trắng 500 mg/kg, IP 24 và 48
cộng sự [99] đực ICR giờ
Yi-Seong Kwak 2010 Chuột cống đực 150 mg/kg, 3 giờ
và cộng sự [56] Spague - Dawley IV
Ibrahim AY và 2016 Chuột nhắt 200 mg/kg, IP 7 giờ và
cộng sự [52] albino 24 giờ

Tyloxapol (triton WR-1339; C44H66O3) là chất diện hoạt ức chế

lipoprotein lipase. Việc dùng chất diện hoạt triton WR-1339 cho chuột nhắt và
chuột cống trắng nhịn đói hoặc không nhịn đói dẫn đến sự tăng các nồng độ
cholesterol và triglycerid huyết tương (Tamasa và cộng sự 1968, Fukushima
và cộng sự 1969) [13]. Chứng tăng cholesterol này có 2 giai đoạn. Đầu tiên,
có sự tăng đột ngột các nồng độ cholesterol huyết thanh, đạt mức đỉnh vào lúc
24 giờ sau khi cho tyloxapol (giai đoạn 1). Mức độ tăng cholesterol máu giảm
xuống trong vòng 24 giờ tiếp theo (giai đoạn 2). Tuy nhiên, nồng độ tyloxapol
sử dụng và thời điểm đánh giá là khác nhau trong các nghiên cứu. Cơ chế của
tăng cholesterol máu do tyloxapol trong giai đoạn 1 được cho là do tăng sinh
 49

tổng hợp cholesterol ở gan, do khả năng của tyloxapol tác động đến sự tiếp
nhận lipid huyết tương bởi các mô (Garrattini và cộng sự, 1959) [13], [73].

Trên chuột cống mãn kinh, các thông số về lipid máu cũng gia tăng do
sự thay đổi về hormon. Do đó, mô hình này cũng có thể sử dụng để đánh giá
tác dụng điều hòa lipid máu của thuốc [93]. Dong Wook Lim và các cộng sự
vào năm 2013 sử dụng chuột cống 8 tuần tuổi bị cắt buồng trứng để gây ra sự
thay đổi về hormon, dẫn đến thay đổi chuyển hóa lipid và đánh giá tác dụng
của thuốc trên những chuột này [59].

1.4. Phương pháp đánh giá tác động của thuốc trên động vật bị
bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD)

Trong những năm gần đây, gan nhiễm mỡ không do rượu - NAFLD
(nonalcoholic fatty liver disease) đã trở thành nguyên nhân phổ biến nhất gây
ra bệnh gan mạn tính trên toàn thế giới. Một cơ chế phổ biến và được chấp
nhận cho NAFLD là do sự tích lũy acid béo trong gan và đề kháng insulin có
vai trò thúc đẩy cho quá trình này [17], [49]. Mặc dù vậy, hiện nay chưa có
một thuốc nào được FDA công nhận và cũng chưa có phác đồ cho điều trị
NAFLD bằng thuốc. Có một mối liên quan mạnh giữa NAFLD và rối loạn
lipid máu, gần đây đã có một số chứng cứ về việc sử dụng tác nhân giảm lipid
để cải thiện tình trạng gan nhiễm mỡ ở bệnh nhân bị NAFLD. Trên động vật,
sự nuôi dưỡng bằng chế độ ăn giàu chất béo thường dẫn đến NAFLD, biểu
hiện bằng các tình trạng: (1) tăng lipid trong gan và trong huyết tương (tăng
lipid, giảm HDL, triglycerid cao hơn bình thường [66]), (2) sự đề kháng
insulin, (3) sự peroxid hóa lipid và (4) sự bất thường aminotransferase (enzym
gan thường dao động, khi nó tăng thì thường tăng nhẹ và giới hạn ở một hoặc
hai enzym là ALT và AST [17]. Theo Giulio M, transaminase tăng tối đa
khoảng 5 lần bình thường, ALT tăng cao hơn cả AST và sau cùng trở về bình
thường trong khoảng 53% trường hợp [66]). Kiểm tra về mặt mô học, sự tổn
 50

thương gan do NAFLD như tăng kích thước gan, gan nhiễm mỡ, viêm và sự
lắng đọng colagen được quan sát thấy [49].

Các mô hình được xây dựng để đánh giá tác dụng của thuốc đối với
NAFLD vẫn còn hạn chế. Dựa trên các hiểu biết nhất định về cơ chế của
NAFLD, thuốc thường được đánh giá tác động lên quá trình điều hòa lipid ở
gan, tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa. Trên động vật, người ta sử dụng chế
độ ăn giàu lipid trên chuột nhắt hoăc chuột cống để xây dựng mô hình [49],
[88]. Cơ chế của mô hình này dựa trên yếu tố về lượng lipid hấp thu, khi lượng
lipid hấp thu ở gan gia tăng sẽ tác động lên thành phần chất béo trong gan và
trở thành gánh nặng cho chức năng gan, gây quá tải cho tế bào gan. Mức độ
xâm nhập của chất béo vào gan sẽ tạo ra tình trạng gan nhiễm mỡ và quá trình
này cũng liên quan đến sự phát triển tiếp theo của tình trạng hoại tử, viêm gan,
xơ gan và có thể dẫn đến ung thư gan [101].
 51

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Đài hoa Bụp giấm khô được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và
Sản xuất Dược liệu Miền Trung đạt các tiêu chuẩn chất lượng cơ sở: Cảm
quan (đài hoa màu đỏ đậm, có mùi thơm đặc trưng, vị chua), độ ẩm 12,44%
(< 13%), tạp chất 0,63% (< 1%), kim loại nặng < 10 ppm, dư lượng thuốc bảo
vệ thực vật (không có DDT, 666), định tính có anthocyanin, hạn sử dụng 2
năm kể từ ngày sản xuất (PL tiêu chuẩn nguyên liệu đài hoa Bụp giấm).

Hình 2.1. Đài hoa Bụp giấm

Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm (BSP) được chiết xuất từ đài hoa khô
Bụp giấm theo quy trình sau: 50 kg đài hoa Bụp giấm ngâm trong 200 lít nước
(đạt tiêu chuẩn nước uống) ở 80 oC trong 60 phút, rút dịch chiết 1; phần bã
dược liệu tiếp tục được ngâm trong 100 lít nước ở 80 oC trong 30 phút, rút
dịch chiết 2; trộn đều dịch chiết 1 và 2, lọc qua vải thu được dịch chiết tổng
hợp; đem dịch chiết tổng hợp sấy phun, thu được 10 kg bột sấy phun đài hoa
Bụp giấm (BSP). Hiệu suất đạt 20%. Hình thức cảm quan: BSP có màu đỏ, vị
chua, độ ẩm < 5% (Tham khảo quy trình của Trung tâm nghiên cứu và sản
xuất dược liệu miền Trung).
 52

2.1.2. Động vật nghiên cứu

Chuột nhắt đực, trắng chủng Swiss albino, 5 - 6 tuần tuổi, trọng lượng
18 - 22 g, được cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
Chuột được nuôi ổn định 1 tuần trước mỗi thí nghiệm trong lồng nhựa.
Điều kiện nhiệt độ, độ ẩm ổn định, chu kỳ 12 giờ sáng, 12 giờ tối. Mỗi lồng
nuôi 6 – 8 chuột.
2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất
Máy phân tích sinh hóa bán tự động DIRUI DR-7000 - Trung Quốc,
cân phân tích Sartorius - Đức, dụng cụ nuôi và chăm sóc chuột, máy trộn cao
tốc KBC-ST-5 (công suất trộn 3 - 5 kg, công suất động cơ cánh trộn chính 3
Kw với tốc độ 237 (v/ph)), tủ vi khí hậu Shellab, máy đóng gói tự động JS-10
(kiểu đóng gói được: gói chữ nhật, 3 đường hàn, kích thước gói: (D) 63 mm x
(R) 50 mm, khổ giấy: 100 mm), tủ sấy Spectroline, máy xát hạt TS 250 (công
suất 1200 kg/giờ, tốc độ 0 – 1440 vòng /phút), bể siêu âm RK–1028H
Bandelin - Đức, cân phân tích PA214 Ohaus - Mỹ, cột RP C–18 Kyatech -
Nhật Bản, hệ thống HPLC, detector PDA LC–8A Shimadzu - Nhật Bản.
betcher, ống đong, đũa thủy tinh, ống nghiệm, cối chày và một số dụng cụ thí
nghiệm thông thường khác.
Hóa chất: Chất chuẩn delphinidin-3-O-sambubiosid (độ tinh khiết
99,8%) và cyanidin-3-O-sambubiosid (độ tinh khiết 98,6%) được phân lập và
tinh chế tại Ban Nghiên cứu khoa học - Thư viện, khoa Dược, Đại học Y Dược
TP Hồ Chí Minh. Tyloxapol (triton WR-1339) – Sigma, fenofibrat (Fenostad)
200 mg - STADA - VN (061215 - 091217), thuốc thử định lượng sinh hóa
máu: Chema Diagnostica – Ý, cholesterol – Sigma, acid cholic - Sigma,
atorvastatin (Lipistad 20) – Stada VN (230518 – 230520), thuốc thử định
lượng sinh hóa máu Chema Diagnostica - Ý. Dung môi: acetonitril J.T. Baker
HPLC - Mỹ, methanol J.T. Baker HPLC - Mỹ, acid phosphoric (Xilong
 53

Chemical PA - Trung Quốc. Formol, ethanol, nước cất và một số hóa chất thí
nghiệm thông thường khác.
Dòng tế bào Hep G2 do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trong
môi trường E’MEM có bổ sung L-glutamin (2 mM), HEPES (20 mM),
amphotericin B (0,025 μg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100
μg/ml), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37 0C, 5% CO2.
2.2. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu
Nơi thực hiện các thử nghiệm dược lý trên động vật thí nghiệm: Phòng
Thí nghiệm Y dược cổ truyền - Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y dược TP.
Hồ Chí Minh. Nơi thực hiện các thí nghiệm bào chế cốm Bụp giấm: Phòng Bào
chế - Bộ môn Bào chế Đông dược - Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y dược
TP. Hồ Chí Minh, phòng nghiên cứu và phát triển - Xí nghiệp công ty cổ phần
dược phẩm OPC, công ty cổ phần dược phẩm BV Pharma - TP. Hồ Chí Minh.
Nơi thực hiện các thử nghiệm khảo sát cơ chế tác dụng của cốm Bụp giấm trên
một số gen điều hòa chuyển hóa: Bộ môn Di truyền – Trường Khoa học Tự
nhiên – ĐH Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Nơi thực hiện giải phẫu bệnh, soi vi
phẫu mẫu gan, thận: Bệnh viện Chợ Rẫy – TP. Hồ Chí Minh. Nơi thực hiện
các nghiên cứu định tính, định lượng, xây dựng tiêu chuẩn cở sở của chế phẩm:
Phòng Thí nghiệm Y dược cổ truyền - Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y dược
TP. Hồ Chí Minh, ban Nghiên cứu khoa học - Thư viện - Khoa Dược - Đại
học Y dược TP. Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện nghiên cứu: Từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2020.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun
từ đài hoa Bụp giấm
Cơ sở chọn liều trong nghiên cứu
Liều đài hoa khô Bụp giấm sử dụng ở người là khoảng 1,5 g/ngày (10
- 20 g đài hoa tươi) [6], tương đương ở chuột nhắt là 0,3 g/kg [13]. Đài hoa
 54

khô được chiết xuất với nước, phun sấy thành dạng cao khô (bột sấy phun) với
hiệu suất đạt 20% (theo quy trình được mô tả ở trang 51). Như vậy, liều dự
kiến có tác dụng của ở chuột nhắt là khoảng 60 mg BSP/kg. Trong nghiên cứu
tiền đề, đài hoa Bụp giấm cho thấy hiệu quả điều hòa lipid máu và bảo vệ gan
nhưng tác dụng không tỷ lệ thuận với liều. Do đó, khoảng liều lựa chọn để tìm
liều tối ưu trong nghiên cứu này là 15 mg/kg, 30 mg/kg, 45 mg/kg, 60 mg/kg,
75 mg/kg và 90 mg/kg.
Phương pháp nghiên cứu
Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng và
xét nghiệm các thông lipid máu ban đầu (cholesterol toàn phần, triglycerid,
HDL, LDL). Tiến hành tiêm phúc mô (i.p.) tyloxapol 500 mg/kg, 0,1 ml/10 g
cho tất cả chuột. Định lượng triglycerid máu sau 6 giờ tiêm tyloxapol, chọn
những chuột có triglycerid máu tăng 3 - 5 lần so với ban đầu và chia ngẫu
nhiên thành 8 lô (n = 6): (1) lô bệnh lý uống nước cất, (2) lô chứng dương
uống fenofibrat 50 mg/kg, (3) lô thử 1 uống BSP 15 mg/kg, (4) lô thử 2 uống
BSP 30 mg/kg, (5) lô thử 3 uống BSP 45 mg/kg, (6) lô thử 4 uống BSP 60
mg/kg, (7) lô thử 5 uống BSP 75 mg/kg, (8) lô thử 6 uống BSP 90 mg/kg.
Chuột thử nghiệm được cho uống nước cất, fenofibrat hoặc BSP vào 16 giờ
chiều và 9 giờ sáng với thể tích 0,1 ml/10 g chuột. Định lượng nồng độ lipid
máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) sau 48 giờ tiêm tyloxapol.
Máu chuột thử nghiệm được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy
huyết tương ở 3000 vòng trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ
với thuốc thử đặc hiệu trước khi đo quang xác định hàm lượng lipid máu.
Tiến hành cân, kiểm tra trọng lượng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm
trước và sau thí nghiệm. Thống kê, phân tích số liệu, xác định liều tối ưu có
tác dụng điều hòa lipid máu của BSP để thực hiện những thí nghiệm kế tiếp.
Phương pháp định lượng cholesterol:
 55

Theo hướng dẫn của bộ kit định lượng sinh hóa Chema Diagnostica.
Nguyên tắc định lượng: Tất cả cholesterol ester hiện diện trong huyết tương
bị thủy phân thành dạng cholesterol tự do và acid béo bởi men cholesterol
esterase. Với sự hiện diện của oxygen, cholesterol tự do bị oxy hóa bởi men
chesterol oxydase thành cholesten-4-ene-3-on và H2O2. H2O2 phản ứng với ρ-
chlorophenol và 4-aminoantipyrin với xúc tác của peroxidase để hình thành
chất màu quinoneimin. Độ mạnh của chất màu được hình thành này sẽ tỷ lệ
với nồng độ cholesterol và có thể đo được bằng quang phổ ở bước sóng từ 480
nm - 520 nm. LDL được ước lượng từ công thức Friedewald (LDL =
cholesterol toàn phần - (VLDL + HDL), VLDL được ước lượng bằng 1/5 nồng
độ triglycerid.

2.3.2. Xây dựng quy trình bào chế và tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ
ổn định của cốm Bụp giấm

Xây dựng quy trình bào chế cốm Bụp giấm

Dạng bào chế được xác định để bào chế chế phẩm từ nguyên liệu BSP
là dạng cốm hòa tan, có thể sử dụng trực tiếp hoặc pha với nước trước khi
uống. Do BSP có vị chua và khả năng hút ẩm rất cao nên cần nghiên cứu quy
trình bào chế và xác định loại tá dược cũng như lượng tá dược cần dùng để
đảm bảo khắc phục được hai nhược điểm này. Phương pháp bào chế cốm được
khảo sát tại phòng thí nghiệm bao gồm: (1) phương pháp xát hạt khô với tá
dược độn lactose khan, tá dược điều vị aspartam 0,5%, tá dược trơn talc 1%,
(2) phương pháp xát hạt ướt với tá dược độn manitol, tá dược điều vị aspartam
0,5%. Tỷ lệ BSP và tá dược độn được khảo sát bằng cách tăng dần lượng tá
dược đến khi tạo được khối bột khô và đồng nhất về màu trước khi thực hiện
các bước tiếp theo. Sau khi khảo sát tại phòng thí nghiệm, sẽ chọn ra công
thức đạt được yêu cầu về độ ẩm và mùi vị để đưa vào bào chế thử nghiệm.
Quy trình xát hạt khô: BSP được trộn đều với hỗn hợp các tá dược thành
khối bột đồng nhất, sau đó đem dập viên với lực nén thấp để tạo thành viên
 56

nén tạm thời, viên nén sau đó được đem đi tán và sửa hạt qua rây 1 - 2 mm,
thu được hạt cốm.
Quy trình xát hạt ướt: BSP được trộn đều với hỗn hợp các tá dược thành
khối bột đồng nhất, nước cất sử dụng như dung môi làm ẩm được phun vào
khối bột để tạo thành khối bột vừa đủ ẩm để xát hạt, xát hạt qua rây 2 mm,
đem sấy khô, sửa hạt qua rây 1 mm, thu được cốm.

Bảng 2.1. Các công thức bào chế được khảo sát

Quy trình Công BSP Lactose Talc Manitol Aspartam

thức (%) (%) (%) (%) (%)
1 5 93,5 1 - 0,5
Xát hạt 2 10 88,5 1 - 0,5
khô 3 15 83,5 1 - 0,5
4 20 78,5 1 - 0,5
5 5 - - 94,5 0,5
Xát hạt 6 10 - - 89,5 0,5
ướt 7 15 - - 84,5 0,5
8 20 - - 79,5 0,5
Công thức và quy trình có ưu thế hơn sẽ được chọn sản xuất 3 lô liên
tiếp, mỗi lô 1500 - 3000 đơn vị để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. Do
tính chất dễ hút ẩm của BSP và hoạt chất dễ bị phân hủy bởi ẩm độ và ánh
sáng, hạt cốm thành phẩm cần được đóng gói trong bao bì kín, tránh ẩm và
ánh sáng.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cốm Bụp giấm
Cảm quan: Thuốc cốm có dạng hạt nhỏ xốp, khô, đồng đều về hình dạng
và màu sắc, không có hiện tượng hút ẩm, không bị mềm và biến màu. Cách thử:
Trải một lượng bột vừa đủ tạo thành lớp mỏng trên một tờ giấy trắng, Quan sát
màu sắc bằng mắt thường, dưới ánh sáng tự nhiên.
 57

Độ ẩm: Xác định độ ẩm của chế phẩm theo phương pháp xác định mất
khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6, DĐVN V). Tiến hành 3 lần, lấy giá trị
trung bình (TB ± SD). Yêu cầu: Thuốc cốm có độ ẩm không quá 5,0 %.
Độ đồng đều khối lượng: Xác định độ đồng đều khối lượng theo phụ
lục 11.3, DĐVN V. Cân khối lượng của một gói thuốc cốm, cắt mở gói, lấy
hết thuốc ra, dùng bông lau sạch bột bám ở mặt trong, cân khối lượng vỏ gói.
Khối lượng thuốc trong gói là hiệu số giữa khối lượng gói thuốc và vỏ gói.
Tiến hành tương tự với 19 gói thuốc khác, lấy ngẫu nhiên. Tính khối lượng
trung bình của thuốc trong gói. Khối lượng thuốc phải nằm trong giới hạn ±
7,5% so với khối lượng ghi trên nhãn.
Độ tan: Thêm 20 phần nước nóng vào một phần thuốc cốm, khuấy
trong 5 phút. Đối với thuốc cốm tan, phải hoàn toàn tan hết. Đối với thuốc
cốm dạng treo phải lơ lửng đều trong nước, không được có những chất lạ.
Định tính: Định tính sự hiện diện của nhóm anthocyanin bằng phản ứng
hóa học. Nhóm anthocyanin có sự thay đổi màu trong các môi trường khác
nhau (Màu đỏ trong môi trường acid, màu tím trong môi trường trung tính và
màu xanh trong môi trường kiềm). Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp
mỏng với vết đối chiếu là nguyên liệu đài hoa Bụp giấm.
Định lượng: Định lượng đồng thời delphinidin-3-O-sambubiosid và
cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm bằng phương pháp HPLC.
Sửa dụng hệ thống HPLC Shimadzu 8A, cột C18 Kyatech (250 x 4,6 mm, 5
µm), hệ dung môi: CH3CN – H3PO4 0,35% (12 : 78), tốc độ dòng: 0,7 ml/phút,
bước sóng: 528 nm, thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Chất chuẩn delphinidin-3-O-
sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid phân lập bởi Ban Nghiên cứu khoa
học và Thư viện – Khoa Dược – ĐH Y dược TP. Hồ Chí Minh.
Thẩm định quy trình định lượng [64]:
Khảo sát tính tương thích hệ thống: Ổn định cột bằng pha động ít nhất
30 phút. Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn với ít nhất 6 lần tiêm mẫu liên tiếp. Khảo
 58

sát các thông số: Diện tích đỉnh, thời gian lưu, hệ số kéo đuôi AS, độ phân giải
RS và số đĩa lý thuyết N. Yêu cầu: Tất cả các thông số trên phải có RSD ≤ 2%.
Tính đặc hiệu: Đảm bảo kết quả xác định hàm lượng chất cần phân tích
trong mẫu là chính xác, tránh ảnh hưởng của các thành phần khác có trong
mẫu. Với kỹ thuật HPLC sử dụng đầu dò PDA để kiểm tra độ tinh khiết của
pic, tiến hành sắc ký lần lượt mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn và
mẫu trắng. Yêu cầu: Thời gian lưu của pic chất cần định lượng trong mẫu thử
phải tương đương với thời gian lưu của pic chất chuẩn tương ứng trong mẫu
chuẩn. Đối với mẫu thử thêm chuẩn, chiều cao và diện tích pic của chất khảo
sát phải tăng lên so với trước khi thêm chuẩn. Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất
hiện pic tại thời gian lưu của chất khảo sát. Phổ UV–Vis tại thời gian lưu của
pic chất khảo sát trong mẫu thử giống phổ UV–Vis tại thời gian lưu của pic
chất chuẩn tương ứng trong mẫu chuẩn.
Tính tuyến tính: Khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa
vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích đỉnh và nồng độ là một đường
thẳng. Tiến hành sắc ký tối thiểu 5 mức nồng độ khác nhau, đo và xác định
diện tích đỉnh ở từng nồng độ. Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đồ thị biểu
diễn mối tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ.
Phương trình hồi quy: ŷ = ax + b
Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số:
Nếu t0 < t0,05: Hệ số b không có ý nghĩa thống kê.
Nếu t0 > t0,05: Hệ số b có ý nghĩa thống kê.
Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình:
Nếu F < F0,05: Phương trình hồi quy không tương thích.
Nếu F > F0,05: Phương trình hồi quy tương thích.
Yêu cầu: Hệ số tương quan R2 ≥ 0,995.
Độ lặp lại: Mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẻ xi với giá trị
trung bình. Ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên. Tiến hành sắc ký tối thiểu 6 mẫu
 59

thử ở nồng độ 100%. Tiến hành xử lý thống kê các số liệu, xác định độ lệch
chuẩn tương đối. Yêu cầu: RSD phải đạt theo yêu cầu.
Độ đúng: Mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực.
Ảnh hưởng bởi sai số hệ thống. Sử dụng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu
thử, với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80%, 100%, 120% so với mẫu thử.
Tiến hành sắc ký ở mỗi nồng độ trên với 3 mẫu khác nhau, tính hàm
lượng của mẫu chuẩn thêm vào ở từng nồng độ, % tỷ lệ phục hồi ở từng nồng
độ thêm vào (delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid).
X
Tỷ lệ phục hồi = x100%

µ: Hàm lượng chất chuẩn cho vào.
X : Hàm lượng xác định được.
Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ phải đạt theo yêu cầu.
Đánh giá độ ổn định của cốm Bụp giấm
(Theo hướng dẫn ASEAN về nghiên cứu độ ổn định của thuốc 6.0, 2013)
Thuốc được đóng gói kín với bao bì là màng nhôm PVDC trong suốt
quá trình bảo quản và thử nghiệm. Nội dung: Theo dõi độ ổn định của 3 lô ở
quy mô thử nghiệm. Tần số thử nghiệm: Ở điều kiện bảo quản cấp tốc, thử
nghiệm ở 3 thời điểm: Ban đầu (T0), 3 tháng và 6 tháng. Nếu có “biến đổi đáng
kể” nào xảy ra trong vòng 3 đến 6 tháng khi thử nghiệm ở điều kiện lão hóa
cấp tốc, thì tuổi thọ dự kiến được dựa trên các số liệu thu được khi bảo quản
ở điều kiện dài hạn. “Biến đổi đáng kể” đối với một chế phẩm thuốc là khi
hàm lượng không đạt giới hạn cho phép hoặc không đạt các chỉ tiêu về hình
thức, tính chất vật lý và các thử nghiệm chức năng. Nếu “biến đổi đáng kể”
xảy ra trong vòng 6 tháng đầu của thử nghiệm ở điều kiện bảo quản cấp tốc
thì dừng thử nghiệm ở điều kiện này. Đánh giá và báo cáo: Mỗi một chỉ tiêu
cần đánh giá riêng biệt và đánh giá tổng thể để dự kiến tuổi thọ. Tuổi thọ dự
kiến của sản phẩm không được vượt quá tuổi thọ dự đoán tính theo từng chỉ
tiêu đơn lẻ. Tiến hành lập báo cáo, kết luận về độ ổn định của sản phẩm.
 60

Lập bảng hoặc vẽ biểu đồ dữ liệu Không ngoại suy; tuổi thọ ngắn
độ ổn định cho tất cả chỉ tiêu chất hơn và có thể yêu cầu thêm dữ liệu
lượng tại tất cả điều kiện bảo quản C độ ổn định khi vận chuyển;
và đánh giá mỗi chỉ tiêu một cách thực hiện phân tích thống kê nếu dữ
ó
độc lập liệu dài hạn cho thấy sự dao động

Có sự biến đổi có ý
nghĩa sau 3 tháng bảo
quản ở điều kiện cấp
tốc? Không

Không ngoại suy; tuổi thọ ngắn

hơn; thực hiện phân tích thống kê
nếu dữ liệu dài hạn cho thấy sự dao
Có Y động
es
Y
Có sự biến đổi có Có Y Không
ý nghĩa sau 6 tháng es
es Dự kiến bảo quản
bảo quản ở điều kiện trong tủ lạnh?
cấp tốc?

Không
No cho
to (1)
Không 1) Dữ liệu dài hạn có thể hoặc
(1) (2) Nếu được củng cố bởi dữ
N đem phân tích thống kê liệu hỗ trợ có liên quan:
và (2) phân tích thống kê Y = tới X + 3 tháng
o Or (2)
đã được thực hiện?

Không cho (1)

Dữ liệu dài hạn cho hoặc (2) hoặc
thấy: (1) ít biến đổi cho cả hai
hoặc không biến đổi
theo thời gian và (2) ít Có cho cả hai
Yes to
dao động hoặc không Nếu được củng cố bởi
dao động? both phân tích thống kê và dữ
liệu hỗ trợ có liên quan:
Y = tới 1,5X, nhưng
không quá X + 6 tháng
Có cho cả hai
Yes to
both

Không cho (1) hoặc

Dữ liệu cấp tốc cho (2) No to (1) hoặc No to
cho (1) Dữ liệu dài hạn có
thấy: (1) ít biến đổi or cả hai thể đem phân tích
Không
(1) cho (1) hoặc (2)
hoặc không biến đổi thống kê và (2) phân
theo thời gian và (2) ít (2) or both tích thống kê đã được Or (2)
dao động hoặc không thực hiện?
dao động?

Có cho cả hai Có cho cả hai

Y = Tuổi thọ đề xuất

X = Khoảng thời gian của dữ liệu thực

Phân tích thống kê thông

thường là không cần
thiết

Nếu được củng cố bởi phân tích

Y = tới 2X, nhưng không quá Nếu được củng cố bởi dữ liệu
thống kê và dữ liệu hỗ trợ có
X + 12 tháng; hỗ trợ có liên quan:
liên quan: Y = tới 2X, nhưng
hoặc nếu bảo quản trong tủ Y = tới 1,5X, nhưng không quá
không quá X + 12 tháng;
lạnh, X + 6 tháng;
hoặc nếu bảo quản trong tủ lạnh,
Y = tới 1,5X, nhưng không hoặc nếu bảo quản trong tủ lạnh,
Y = tới 1,5X, nhưng không quá
quá X + 6 tháng Y = tới X + 3 tháng
X + 6 tháng

Hình 2.2. Hướng dẫn dự đoán tuổi thọ của thuốc theo ASEAN (2013) (https://vnras.com)
 61

Bảng 2.2. Các chỉ tiêu thử nghiệm trong theo dõi độ ổn định

Thử nghiệm
Các chỉ tiêu thử Giới hạn cho phép
theo
Thuốc có dạng hạt nhỏ xốp hay sợi ngắn
Cảm quan TCCS xốp, khô, đồng đều về hình dạng và màu
sắc, không có hiện tượng hút ẩm.
Độ ẩm TCCS <5%
Định lượng TCCS 90% - 110% so với hàm lượng ban đầu

Bảng 2.3. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc

Điều kiện bảo quản Khoảng thời gian thử (tháng)

(Lão hóa cấp tốc) Ban đầu 3 6
40 oC ± 2 oC RH 75% ± 5% X X X

Bảng 2.4. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường

Điều kiện bảo quản Khoảng thời gian thử (tháng)

(Điều kiện dài hạn) Ban đầu 6 12
30 oC ± 2 oC X X X

2.3.3. Khảo sát tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều
hòa chuyển hóa lipid

Khảo sát nồng độ gây độc tế bào của cốm Bụp giấm trên Hep G2
[12], [69]
Mục tiêu: Xác định nồng độ cao nhất của cốm Bụp giấm (BG) không
gây chết Hep G2 để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Phương pháp thực hiện
là SRB (Sulforhodamin B) với chứng (+) là Camptothecin, chứng (-) là tế bào
chỉ nuôi trong môi trường không có chất thử nghiệm, đối chứng là mẫu cảm
ứng với dung môi pha mẫu ở nồng độ tương đương với mẫu.
 62

Thử nghiệm SRB (Sulforhodamin B) là một phương pháp so màu đơn

giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc
nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương
của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của
tế bào. Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau
đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có
màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein
tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh
độc tính tế bào của chất nghiên cứu.
Dòng tế bào Hep G2 do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy
trong môi trường E’MEM có bổ sung L-glutamin (2 mM), HEPES (20 mM),
amphotericin B (0,025 μg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100
μg/ml), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37 0C, 5% CO2. Tế bào
đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế bào/giếng.
Sau 24 giờ nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng độ
trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng
dung dịch trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộm với dung dịch
Sulforhodamin B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở
hai bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết
quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Xử lý kết quả: Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và
620 nm (ký hiệu là OD492 và OD620):
-Tính giá trị OD = OD492 - OD620 (1)
-Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb - ODblank (2)
-Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức:

Với:
 63

- ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào

- ODblank: giá trị OD của giếng blank (không có tế bào)
- ODTN: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)
- ODC: giá trị OD của mẫu chứng tính từ công thức (1) và (2)
IC50 được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Prism với phương
pháp hồi quy không tuyến tính đa thông số và R2 > 0.9.
Mẫu cốm Bụp giấm (BG) được pha trong nước ở nồng độ 50 mg/ml,
sau đó ly tâm bỏ cặn rồi lọc qua phin lọc 0,2 µm, nồng độ tính theo nồng độ
của cao chiết (0,15 g BSP/gói 2 g).
Mẫu Lipistad - atorvastatin (LP) được pha trong nước ở nồng độ 10
mg/ml, sau đó ly tâm bỏ cặn rồi lọc qua phin lọc 0,2 µm. Nồng độ tính theo
nồng độ của cao chiết (20 mg atorvastatin/viên 0,31g).
Đánh giá sự tác động của cốm Bụp giấm lên biểu hiện gen LDLR,
SREBP2, HMGcoA Reductase, AMPK

Bảng 2.5. Trình tự các nucleotid của các mồi (primer)

TT Kích
Gen Mồi Trình tự
thước

Mồi xuôi GTCTTGGCACTGGAACTCGT

1 LDLR 94
Mồi ngược CTGGAAATTGCGCTGGAC

Mồi xuôi GCAAGGCCATCGACTACATT

2 SREBP-1 188
Mồi ngược GGTCAGTGTGTCCTCCACCT

HMGcoA- Mồi xuôi GGGAACCTCGGCCTAATGAA

3 156
reductase Mồi ngược CACCACGCTCATGAGTTTCCA
 64

Mồi xuôi AGCAGTGGGACCATTCTGAC

4 SREBP-2 236
Mồi ngược TTCCTCAGAACGCCAGACTT

Tế bào Hep G2 được phủ lên đĩa nuôi cấy 100 mm với mật độ 1,7x106 tế
bào/ đĩa. Sau 24 h nuôi, tế bào được cảm ứng với BG nồng độ 1000 µg/ml, LP
10 µg/ml, phối hợp BG + LP ở nồng độ 250/2,5 µg/ml và với đối chứng tế bào
cảm ứng với nước nồng độ 2%. Sau 24 h và 48 h, tế bào được thu nhận.
RNA tổng số được tách chiết bằng kít SV Total RNA Isolation System
(Promega, Z3100) theo hướng dẫn của kít. RNA được chuyển thành cDNA
bằng kít SensiFAST cDNA Synthesis Kit (Bioline, BIO-65054) theo hướng
dẫn của kít.
Phản ứng PCR được thiết lập như sau: Mồi 440 nM (PDH Bio), Master
mix 1X(Solgent) Evagreen 0,25X (GAPDH, SREBP-2) hoặc 0,125X (LDLR)
(Biotium), cDNA 1 µg. Chu trình nhiệt: 95 oC – 5 phút, lặp lại 45 chu kì của
các bước 95 oC-30s, 57 oC-30s, 72 oC-30s, và 72 oC – 5 phút. Phân tích đường
cong nóng chảy từ 65 oC – 95 oC, 10 giây/1 oC. Gen chứng nội là GAPDH. Số
lần thay đổi biểu hiện tương đối được tính theo công thức 2-∆∆Ct.

2.3.4. Đánh giá tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu và tác dụng
dự phòng gan nhiễm mỡ của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng

Đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm
trên chuột nhắt tăng lipid máu nội sinh bằng tyloxapol
Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP
được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước.
Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng và
xét nghiệm các thông lipid máu ban đầu (cholesterol toàn phần, triglycerid,
HDL, LDL). Tiến hành tiêm phúc mô (i.p.) tyloxapol 500 mg/kg, 0,1 ml/10 g
cho tất cả chuột [99]. Định lượng triglycerid máu sau 6 giờ tiêm tyloxapol,
chọn những chuột có triglycerid máu tăng 3 - 5 lần so với ban đầu và chia ngẫu
 65

nhiên thành 3 lô (n = 10): (1) Lô không điều trị (bệnh lý) uống nước cất, (2)
lô chứng dương: Uống fenofibrat 50 mg/kg, (3) lô thử nghiệm uống cốm Bụp
giấm liều tối ưu.
Chuột thử nghiệm được cho uống nước cất, fenofibrat hoặc cốm BG vào
16 giờ chiều và 8 giờ sáng với thể tích 0,1 ml/10 g chuột (trong 24 giờ sau khi
tiêm tyloxapol). Định lượng nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần,
triglycerid, HDL, LDL) bằng phương pháp đo quang sau 48 giờ tiêm tyloxapol.
Tiến hành cân, kiểm tra trọng lượng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trước và
sau thí nghiệm. Thống kê, phân tích số liệu, đánh giá tác dụng điều hòa lipid
máu của cốm BG trên chuột nhắt gây rối loạn lipid máu bằng tyloxapol.
Phương pháp định lượng các thông số lipid máu: Máu chuột thử nghiệm
được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000 vòng
trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc hiệu
trước khi đo quang xác định hàm lượng lipid máu.
Đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm
trên chuột nhắt tăng lipid máu ngoại sinh bằng dung dịch giàu lipid
Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP
được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước.
Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng và
xét nghiệm các thông lipid máu ban đầu (cholesterol toàn phần, triglycerid,
HDL, LDL). Sau đó, được cho uống dung dịch giàu lipid (cholesterol 25 mg,
acid cholic 1%, dầu thực vật vđ 10 ml) mỗi ngày với thể tích 0,1 ml/10g chuột
trong 8 tuần.
Lấy máu chuột xét nghiệm lại các thông số lipid, chọn những chuột bị
rối loạn lipid máu (có triglycerid và/hoặc LDL tăng có ý nghĩa thống kê so với
ban đầu) chia ngẫu nhiên thành 3 lô (n = 8): (1) lô không điều trị (bệnh lý)
uống nước cất, (2) lô chứng dương uống atorvastatin 10 mg/kg, (3) lô thử
nghiệm uống cốm Bụp giấm liều tối ưu.
 66

Chuột thử nghiệm được cho uống nước cất, atorvastatin hoặc cốm BG
vào 15 - 16 giờ chiều hàng ngày với thể tích 0,1 ml/10 g chuột trong 1 tuần.
Định lượng nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL)
bằng phương pháp đo quang sau 1 tuần điều trị. Tiến hành cân, kiểm tra trọng
lượng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trước và sau thí nghiệm. Thống kê,
phân tích số liệu, đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu của cốm BG trên chuột
nhắt gây rối loạn lipid máu bằng dung dịch giàu lipid.
Phương pháp định lượng các thông số lipid máu: Máu chuột thử nghiệm
được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000 vòng
trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc hiệu
trước khi đo quang xác định hàm lượng lipid máu.
Đánh giá tác dụng dự phòng rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm
trên mô hình tăng lipid máu ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu lipid
Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP
được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước. Dung dịch giàu
lipid dùng để gây mô hình chứa cholesterol 25 mg, acid cholic 1%, dầu thực
vật vừa đủ 10 ml.
Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng và
xét nghiệm các thông lipid máu ban đầu (cholesterol toàn phần, triglycerid,
HDL, LDL). Sau đó, chia ngẫu nhiên chuột thử nghiệm thành 4 lô (n = 8): (1)
cho uống nước cất sáng, chiều (lô chứng), (2) cho uống dung dịch giàu lipid
buổi sáng, nước cất buổi chiều (lô bệnh lý), (3) cho uống dung dịch giàu lipid
buổi sáng, atorvastatin 10 mg/kg buổi chiều (lô đối chứng), (4) cho uống dung
dịch giàu lipid buổi sáng, cốm BG liều tối ưu buổi chiều (lô thử nghiệm).
Chuột thử nghiệm được cho uống nước cất, atorvastatin hoặc cốm BG
vào 15 - 16 giờ chiều hàng ngày với thể tích 0,1 ml/10 g chuột trong 6 tuần.
Định lượng nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL)
bằng phương pháp đo quang. Tiến hành cân, kiểm tra trọng lượng chuột ở tất
 67

cả các lô tại thời điểm trước và sau thí nghiệm. Thống kê, phân tích số liệu,
đánh giá tác dụng dự phòng rối loạn lipid máu của cốm BG trên chuột nhắt
gây rối loạn lipid máu bằng dung dịch giàu lipid.
Phương pháp định lượng các thông số lipid máu: Máu chuột thử nghiệm
được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000 vòng
trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc hiệu
trước khi đo quang xác định hàm lượng lipid máu.

Đánh giá tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD)
của cốm Bụp giấm [49], [66]

Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP
được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước.
Chất gây mô hình: Hỗn hợp giàu lipid được chuẩn bị gồm các thành
phần sau: Cholesterol 25 mg, acid cholic 1%, dầu dừa 20 ml, NaCMC 1%
được sử dụng làm chất nhũ hóa.
Thuốc đối chiếu: Atorvastatin 10 mg/kg chuột.
Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng,
loại khỏi thí nghiệm những chuột có cân nặng hoặc biểu hiện bất thường. Chia
chuột ngẫu nhiên làm 4 lô (n = 7). Lô 1 cho uống nước cất sáng, chiều trong
suốt thời gian thử nghiệm, chế độ ăn bình thường. Các lô chuột còn lại được
cho uống dung dịch giàu lipid trong 4 tuần. Buổi chiều, lô 2 uống atorvastatin
(Ator) 10 mg/kg, lô 3 uống cốm Bụp giấm (BG) liều tối ưu, lô 4 uống
atorvastatin kết hợp với cốm Bụp giấm. Thể tích sử dụng ở tất cả các lô là 10
ml/kg chuột. Cuối thí nghiệm, xét nghiệm các thông số lipid máu (cholesterol
toàn phần, triglycerid, HDL, LDL), enzym gan (AST, ALT), glucose huyết
tương, lấy mẫu gan soi vi thể xác định mức độ thoái hóa mỡ.
Phương pháp định lượng các thông số sinh hóa máu: Máu chuột thử
nghiệm được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000
vòng trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc
 68

hiệu trước khi đo quang xác định sinh hóa máu. Chuột ở cuối thử nghiệm được
gây mê bằng đá CO2, lấy mẫu gan bảo quản trong dung dịch formol 10%, cắt
nhuộm soi vi thể.

2.3.5. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của của cốm Bụp
giấm trên chuột nhắt trắng

Đánh giá độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng [3], [4]

Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt đực trắng chủng Swiss albino, 6 - 8
tuần tuổi, trọng lượng 18 - 22 g, đực và cái được cung cấp bởi Viện Pasteur
TP. Hồ Chí Minh, được nuôi ổn định 1 tuần trước thí nghiệm.
Điều kiện thí nghiệm: Thuốc thử nghiệm cốm Bụp giấm được hòa vào
trong nước cất. Dụng cụ thí nghiệm gồm kim đầu tù để cho uống, dụng cụ mổ,
dụng cụ pha thuốc. Đường dùng thuốc là đường uống (p.o.). Thể tích dùng
thuốc 20 ml/kg thể trọng. Dùng một lần thuốc duy nhất trong một ngày
trong khoảng thời gian từ 8 - 9 giờ sáng.
Phương pháp thử: Để thăm dò liều ban đầu, phải thực hiện qua 2 giai
đoạn: (1) giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều là 6 chuột, 50% đực, 50% cái), (2)
giai đoạn xác định (mỗi lô 10 - 20 chuột, 50% đực, 50% cái). Mỗi nhóm dùng
một liều tính theo kg thể trọng, bắt đầu từ liều tối đa có thể cho chuột thử
nghiệm uống và giảm dần. Theo dõi các lô thật chặt chẽ trong 72 giờ đầu sau
khi dùng thuốc. Sau đó nếu thấy cần thiết thì theo dõi trong suốt 2 tuần tiếp
theo. Kết quả được đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hoặc bất ứng (sống
hay chết) nhận thấy được ở mỗi chuột trong nhóm. Ghi nhận các biểu hiện
độc và mức độ nghiêm trọng: Sự xuất hiện độc tính, tiến triển và phục hồi
hoặc chết qua từng thời gian của từng nhóm. Các con vật chết trong thời gian
quan sát (nếu có), phải mổ xác xem chết do nguyên nhân gì. Những con vật
còn sống sau thời gian theo dõi cũng nên mổ để xem các phủ tạng và cơ quan
trong cơ thể có những thay đổi bất thường gì không. Xét nghiệm đại thể ngay
sau khi chết đối với chuột bị chết và làm xét nghiệm đại thể sau khi kết thúc
 69

thử nghiệm đối với súc vật còn sống. Xác định LD50 (nếu có) theo phương
pháp Karber-Behrens.

Đánh giá độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột
nhắt trắng (Theo hướng dẫn: General Guidelines for Methodologies on
Research and Evaluation of Traditional Medicine – WHO).

Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) được pha trong nước cất.
Chuột được nuôi ổn định 1 tuần trước khi tiến hành thử nghiệm, tiến
hành xét nghiệm các thông số sinh hóa và huyết học ban đầu, những chuột có
thông số xét nghiệm bất thường sẽ bị loại khỏi nghiên cứu. Chia ngẫu nhiên
chuột nhắt trắng đạt yêu cầu thành 4 lô, mỗi lô 20 con (10 đực, 10 cái), cho
uống với thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng vào lúc 8 – 9 giờ sáng, liên tục 12 tuần.
Các lô thử nghiệm: (1) lô chứng uống nước cất, (2) lô thử 1 uống thuốc cốm
liều tối ưu, (3) lô thử 2 uống thuốc cốm liều gấp đôi liều lô thử 1, (4) lô thử 3
uống thuốc cốm liều gấp 10 lần liều tối ưu.
Các thông số đánh giá hàng tuần: Hành vi (tăng đi lại, giảm đi lại, nằm
im, run rẩy, co giật); lông (mượt, rụng...), biểu hiện của các cơ quan; cân nặng,
tính chất phân, nước tiểu.
Mức độ ăn, uống được đánh giá tại thời điểm ban đầu, sau 6 tuần và
sau 12 tuần bằng cách nhốt riêng mỗi chuột vào lồng chuyển hóa, cho chuột
làm quen lồng trong ngày thứ nhất, cân lượng cám và lượng nước uống đã sử
dụng trong 24 giờ tiếp theo.
Sau 6 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu đuôi chuột và xét nghiệm
đánh giá các thông số: Sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid
máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết học (số lượng hồng cầu - RBC,
hematocrit - HCT, hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung bình -
MCH, nồng độ hemoglobin trung bình - MCHC, thể tích trung bình của hồng
cầu - MCV, số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu - PLT).
 70

Sau 12 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu đuôi chuột và xét nghiệm
đánh giá các thông số: Sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid
máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết học (số lượng hồng cầu - RBC,
hematocrit - HCT, hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung bình -
MCH, nồng độ hemoglobin trung bình - MCHC, thể tích trung bình của hồng
cầu - MCV, số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu - PLT). Gây mê, mổ
quan sát các cơ quan gan, thận, tim, lách, phổi, dạ dày, ruột. Xét nghiệm vi
thể gan, thận (lấy ngẫu nhiên 50% số động vật).
Cân trọng lượng gan, thận, lách chuột xác định:
- Chỉ số trọng lượng gan = Trọng lượng gan / trọng lượng cơ thể chuột
x 100%.
- Chỉ số trọng lượng thận = Trọng lượng thận / trọng lượng cơ thể chuột
x 100%.
- Chỉ số trọng lượng lách = Trọng lượng lách / trọng lượng cơ thể chuột)
x 100%.

2.4. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu

Tất cả dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M
± SD). Dùng phép kiểm Mann Whitney một chiều một yếu tố so sánh sự khác
biệt giữa các lô và Wilcoxon signed-rank so sánh sự khác biệt đầu - cuối trong
cùng một lô, phần mềm STADA và Microsoft Excel 2017 để thống kê dữ liệu
và vẽ đồ thị.
 71

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ

3.1. Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun
từ đài hoa của cây Bụp giấm
Bảng 3.1. Nồng độ lipid máu của các lô thử nghiệm tại thời điểm ban đầu
Lô (n = 6) Cholesterol TP Triglycerid HDL (mg/dl) LDL (mg/dl)
(mg/dl) (mg/dl)
Bệnh lý 81,81 ± 6,03 99,12 ± 5,96 44,88 ± 7,87 17,11 ± 5,40
Fibrat 50
81,76 ± 7,03 98,74 ± 10,61 44,91 ± 9,65 17,10 ± 4,29
mg/kg
BSP 15
81,07 ± 4,46 98,28 ± 10,09 44,39 ± 9,18 17,03 ± 6,49
mg/kg
BSP 30
82,53 ± 6,21 98,15 ± 18,51 44,27 ± 7,41 18,63 ± 5,71
mg/kg
BSP 45
82,22 ± 8,99 98,19 ± 16,02 44,33 ± 5,44 18,25 ± 8,91
mg/kg
BSP 60
83,63 ± 11,19 97,01 ± 13,82 44,43 ± 6,87 19,80 ± 12,26
mg/kg
BSP 75
82,11 ± 12,33 97,64 ± 12,52 44,06 ± 11,11 18,53 ± 6,21
mg/kg
BSP 90
82,40 ± 9,69 98,28 ± 16,28 44,13 ± 9,75 18,61 ± 5,46
mg/kg
Nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) giữa
các lô tại thời điểm ban đầu khi đưa vào thử nghiệm khác biệt nhau không có
ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, chỉ số ban đầu của các chuột được đưa
vào trong thử nghiệm là đồng đều và sẽ không ảnh hưởng đến kết quả được
đánh giá sau khi điều trị.
 72

Tất cả các chuột được đưa vào thí nghiệm đều có nồng độ triglycerid
máu sau 6 giờ tiêm tyloxapol tăng gấp 3 - 5 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê
(p < 0,001) so với nồng độ triglycerid ban đầu. Nồng độ triglycerid máu giữa
các lô sau 6 giờ tiêm tyloxapol khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê (p >
0,05). Chỉ số triglycerid giữa các lô vào thời điểm trước khi dùng thuốc là
đồng nhất. Việc này giúp hạn chế sai số do ảnh hưởng của mức độ gây bệnh
ban đầu giữa các lô.
Sau khi tiêm tyloxapol 48 giờ:
Ở lô bệnh lý không được điều trị, sau khi tiêm tyloxapol 48 giờ so với
thời điểm ban đầu, cholesterol toàn phần tăng 27%, triglycerid tăng 46%, LDL
tăng 136%. Khác biệt có ý nghĩa thống kê. Riêng thông số HDL đã trở về mức
bình thường. Như vậy, để khảo sát tác dụng điều trị của thuốc sau 48 giờ tiêm
tyloxapol có thể dựa trên các thông số nồng độ cholesrol toàn phần, nồng độ
triglycerid và nồng độ LDL.

Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý tại thời điểm ban đầu và sau 48 giờ
tiêm tyloxapol (n = 6)
180.00
160.00 ***
140.00
120.00 **
mg/dl

100.00
80.00
60.00 **
40.00
20.00
-
Cholesterol TP Triglycerid HDL LDL

Ban đầu Sau 48 giờ

Hình 3.1. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý tại thời điểm ban đầu và sau 48
giờ tiêm tyloxapol
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm ban đầu (p < 0,01)
***: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm ban đầu (p < 0,001)
 73

Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm sau 48 giờ tiêm
tyloxapol và điều trị (n = 6)
180.00
160.00
140.00
120.00 *
**
mg/dl

100.00
80.00
** * * **
60.00
* *
40.00 * *
**
20.00
-
Bệnh lý Fenofibrat BSP 15mg BSP 30mg BSP 45mg BSP 60mg BSP 75mg BSP 90mg

Cholesterol TP Triglycerid HDL LDL

Hình 3.2. Nồng độ lipid máu của các lô sau khi tiêm tyloxapol 48 giờ
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,01)
Đánh giá trên từng thông số lipid máu tại thời điểm 48 giờ sau khi tiêm
tyloxapol gây rối loạn lipid ở chuột nhắt, so với lô bệnh lý không được điều trị,
kết quả cho thấy: Fenofibrat sử dụng đường uống liều 50 mg/kg chuột nhắt
làm giảm LDL 35% (p = 0,0374). BSP sử dụng đường uống liều 15 mg/kg
chuột nhắt không làm giảm các thông số lipid máu so với lô bệnh lý. BSP sử
dụng đường uống liều 30 mg/kg chuột nhắt làm giảm cholesterol toàn phần
11% (p = 0,0065) và làm giảm LDL 65% (p = 0,0039). BSP sử dụng đường
uống liều 45 mg/kg chuột nhắt làm giảm LDL 42% (p = 0,0374). BSP sử dụng
đường uống liều 60 mg/kg chuột nhắt không làm giảm các thông số lipid máu.
BSP sử dụng đường uống liều 75 mg/kg chuột nhắt làm giảm LDL 35% (p =
0,0374). BSP sử dụng đường uống liều 90 mg/kg chuột nhắt làm giảm
cholesterol toàn phần 9% (p 0,025) và làm giảm LDL 56% (p = 0,0104).
Như vậy, liều có tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu tốt nhất của bột
sấy phun từ đài hoa bụp giấm (BSP) trong khoảng liều từ 15 mg/kg đến 90
mg/kg chuột nhắt là 30 mg/kg chuột nhắt. Đây cũng là liều được lựa chọn cho
các nghiên cứu tiếp theo.
 74

Trọng lượng của chuột giữa các lô trong nghiên cứu tại thời điểm ban
đầu và sau khi điều trị khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
3.2. Xác định quy trình bào chế, tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định
của cốm Bụp giấm từ Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm

3.2.1. Quy trình bào chế cốm Bụp giấm

Từ kết quả khảo sát các công thức trong phòng thí nghiệm, chọn được
công thức tối ưu là công thức số 6 của quy trình xát hạt ướt với ưu điểm cho
khối bột đồng đều, hạt cốm đều, mùi vị tốt, sau khi sấy khô đạt được độ ẩm <
5%. Đồng thời, tỷ lệ tá dược sử dụng thấp nhất trong số 2 công thức đạt yêu
cầu là 5 và 6. Công thức 1 gói cốm được xác định là BSP 0,15 g; manitol 1,84
g; aspartam 0,01 g; nước cất 0,12 ml.
Từ nghiên cứu trước xác định, liều BSP cho tác dụng tốt nhất trong
khoảng liều thử nghiệm từ 15 mg – 90 mg/kg là 30 mg/kg chuột (kết quả được
trình bày ở phần 3.1), tương đương khoảng 150 mg/người. Trong khi đó, tỷ lệ
BSP : tá dược được khảo sát = 1 : 9. Như vậy, gói cốm đơn liều sử dụng trên
người có thể chứa 0,15 g BSP : 1,35 g tá dược (bao gồm manitol và aspartam),
tổng khối lượng: 1,5 g/gói. Tuy nhiên, với trang thiết bị của phòng nghiên cứu,
máy đóng gói chỉ đóng gói được cốm 2 g/gói. Do đó, lượng tá dược độn
manitol được tăng lên để phù hợp với điều kiện và vẫn đảm bảo cốm BG đạt
các chỉ tiêu ban đầu đề ra. Tiến hành sản xuất 03 lô, mỗi lô 2000 gói x 2 g (tỷ
lệ hao hụt 10%), đóng gói nhôm hàn kín. Bảo quản ở nhiệt độ 30 oC, tránh ẩm
và ánh sáng. Sản phẩm này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
 75

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát các công thức phối hợp bào chế cốm Bụp giấm
Quy Công BSP Lactose Talc Manitol Aspartam
Kết quả
trình thức (%) (%) (%) (%) (%)
Hạt cốm không
1 5 93,5 1 - 0,5 đều, không tan
hết, lợn cợn
Hạt cốm không
Xát
2 10 88,5 1 - 0,5 đều, không tan
hạt
hết, lợn cợn
khô
Khối bột độ ẩm
3 15 83,5 1 - 0,5
cao, không chảy
Khối bột độ ẩm
4 20 78,5 1 - 0,5
cao, không chảy
Bột khô, tơi,
5 5 - - 94,5 0,5 xát hạt đều,
mùi vị tốt
Bột khô, tơi,
6 10 - - 89,5 0,5 xát hạt đều,
Xát
mùi vị tốt
hạt
Khối bột dính,
ướt
7 15 - - 84,5 0,5 trộn không đều,
BSP bị vón
Khối bột dính,
8 20 - - 79,5 0,5 trộn không đều,
BSP bị vón
 76

Nguyên liệu Giai đoạn Thông số

Số lần trộn: 3 lần

Bột sấy phun đài hoa Bụp
Thời gian 1 lần: 5 phút
giấm, manitol - TAG, Trộn bột kép
Yêu cầu: Khối bột khô,
aspartam
tơi, đồng nhất về màu.
Phun làm ẩm 2 lần
Nước cất Trộn bột
Mỗi lần trộn 5 phút
ướt
Yêu cầu: Khối bột vừa
đủ ẩm để xát hạt.
Cỡ rây: 2 mm
Xát hạt

Nhiệt độ sấy: 60 oC
Sấy cốm Thời gian sấy: 4 giờ
Độ ẩm < 5%

Cỡ rây: 1 mm
Sửa hạt
Độ ẩm < 5%

Đóng gói cốm 2 g

Màng PVDC Đóng gói
Hàn kín

Bảo quản ở 30 oC.

Lấy mẫu xây dựng
Thành phẩm
tiêu chuẩn cơ sở.
Lấy mẫu lưu tủ vi khí
hậu điều kiện lão hóa
cấp tốc.

Hình 3.3. Quy trình bào chế cốm Bụp giấm, lô nghiên cứu
 77

3.2.2. Xác định tiêu chuẩn cơ sở của cốm Bụp giấm

Cảm quan
Cốm Bụp giấm (BG) có dạng hạt nhỏ, xốp, khô, màu đỏ, đồng đều về
hình dạng và màu sắc. Không có hiện tượng hút ẩm, không bị mềm và biến
màu. Vị ngọt, hơi chua.

Hình 3.4. Cốm Bụp giấm

Độ ẩm, độ đồng đều khối lượng và độ tan
Bảng 3.3. Độ ẩm của cốm Bụp giấm
Độ ẩm (%) Trung bình (%)
Lần 1 3,43
Lần 2 3,56 3,56 ± 0,13
Lần 3 3,69
Bảng 3.4. Độ đồng đều khối lượng của cốm Bụp giấm
Gói cốm Khối lượng (g) Chỉ tiêu Kết quả
1 1,9875 Đạt
2 1,9901 Đạt
1,85 - 2,15 g
3 2,0012 Đạt
4 2,0237 Đạt
 78

Gói cốm Khối lượng (g) Chỉ tiêu Kết quả

5 1,9705 Đạt
6 1,9078 Đạt
7 1,9901 Đạt
8 1,9225 Đạt
9 2,0136 Đạt
10 2,0568 Đạt
11 1,9875 Đạt
12 1,9236 Đạt
13 2,0827 Đạt
14 2,0113 Đạt
15 1,9785 Đạt
16 1,9622 Đạt
17 1,9307 Đạt
18 1,9926 Đạt
19 1,9832 Đạt
20 2,0236 Đạt
Trung bình: 1,9870
Giới hạn phải đạt: 2 ± 0,15 g
Bảng 3.5. Độ tan của chế phẩm cốm Bụp giấm
Lần Cốm Bụp giấm Nước Nhận xét
1 1g 20 ml Tan hết
2 1g 20 ml Tan hết
3 1g 20 ml Tan hết
Như vậy, cốm Bụp giấm đạt yêu cầu của DĐVN V về độ ẩm, độ đồng
đều khối lượng và độ tan.
 79

Định tính
Định tính bằng phản ứng hóa học
Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml nước cất và 0,1 g chế phẩm cốm
BG, lắc đều. Lọc lấy dung dịch qua giấy lọc. Ống nghiệm 1 cho vào 5 giọt
dung dịch acid HCl 0,1 M; ống nghiệm 2 cho vào 5 giọt nước cất; ống nghiệm
3 cho vào 5 giọt dung dịch NaOH 0,1 M. Lắc đều, quan sát màu của 3 ống
nghiêm. Ống nghiệm 1 phải có màu đỏ hay hồng đậm hơn màu của dịch lọc, ống
nghiêm 2 có màu tím nhạt (hoặc màu hồng) và ống nghiệm 3 phải chuyển sang
màu xanh.
Bảng 3.6. Phản ứng thay đổi màu trong các môi trường của anthocyanin
Môi trường Màu dung dịch Nhận xét
Acid Đỏ Màu đậm hơn màu của dịch lọc ban đầu
Nước cất Tím nhạt Anthocyanin màu tím
Kiềm Xanh Anthocyanin màu xanh

Hình 3.5. Phản ứng thay đổi màu trong các môi trường của cốm Bụp giấm
Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Vết đối chiếu là nguyên liệu đài hoa Bụp giấm.
 80

Becher 1 cân 1 g đài hoa khô Bụp giấm, thêm vào 10 ml cồn 50 %,
chiết nóng ở 50 – 60 oC trong vòng 15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Để nguội,
lọc qua giấy lọc. Lắc dịch chiết với ethyl acetat 5 ml x 3 lần, gạn lấy dịch ethyl
acetat. Gộp chung các dịch ethyl acetat, cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong
1 ml ethyl acetat (dịch A).
Becher 2 cân 1 g cốm Bụp giấm, thêm vào 10 ml cồn 50 %, chiết nóng
ở 50 – 60 oC trong vòng 15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Để nguội, lọc qua giấy
lọc. Lắc dịch chiết với ethyl acetat 5 ml x 3 lần, gạn lấy dịch ethyl acetat. Gộp
chung các dịch ethyl acetat, cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml ethyl
acetat (dịch B).
Tiến hành chấm sắc ký, vết dược liệu (DL) chấm 50 μl dịch chiết A,
vết chế phẩm cốm Bụp giấm (CP) chấm 50 μl dịch chiết B.
Thành phần pha động 1: Chloroform : Ethylacetat : Acid formic (2 : 3 :1)
Thành phần pha động 2: n-Butanol : Acid acetic : Nước cất (4 : 1 : 5)
Để bản sắc ký khô ở nhiệt độ phòng, soi UV bước sóng 365 nm.
Nhúng thuốc thử KOH 10%, để khô ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành quan sát và xác định Rf.
Ở hệ pha động 1: Chloroform : Ethylacetat : Acid formic (2 : 3 :1), khi
quan sát dưới UV 365 nm xuất hiện 1 vệt tách rõ và trùng nhau ở Rf = 0,8.
Sau khi nhúng thuốc thử KOH, quan sát dưới ánh sáng thường, xuất hiện 3 vết
màu vàng có Rf = 0,75; 0,84 và 0,91, có 1 vết màu tím Rf = 0,8.
Pha động 2: n-Butanol : Acid acetic : Nước cất (4 : 1 : 5), khi quan sát
dưới UV 365 nm xuất hiện 1 vệt tách rõ và trùng nhau ở Rf = 0,8. Sau khi
nhúng thuốc thử KOH, quan sát dưới ánh sáng thường, xuất hiện 1 vết màu
vàng có Rf = 0,56.
Kết luận: Chế phẩm cốm BG có chứa các vết có màu sắc và Rf trùng
với nguyên liệu đài hoa Bụp giấm.
 81

Pha động 1: Chloroform : Ethylacetat : Acid formic (2 : 3 :1)

Rf = 0,91
Rf = 0,84
Rf = 0,8
Rf = 0,8
Rf = 0,75

Nhúng TT KOH 10% UV 365 nm

Pha động 2: n-Butanol : Acid acetic : Nước cất (4 : 1 : 5)

Rf = 0,8

Rf = 0,56

Nhúng TT KOH 10% UV 365 nm

Hình 3.6. Sắc ký đồ của cốm BG và đài hoa Bụp giấm ở UV 365 nm
và dưới ánh sáng thường.
 82

Định lượng
Định lượng hàm lượng delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-
sambubiosid trong cốm Bụp giấm bằng phương pháp HPLC:
Bảng 3.7. Hàm lượng hoạt chất trong 3 lô cốm Bụp giấm
Mẫu cốm Hàm lượng hoạt chất Hàm lượng hoạt chất
(2 g/gói) trung bình
Cốm Bụp Delphinidin-3-O-sambubiosid: 2,44 mg Delphinidin-3-O-
giấm lô 1 Cyanidin-3-O-sambubiosid: 0,66 mg sambubiosid: 2,47 mg
Cốm Bụp Delphinidin-3-O-sambubiosid: 2,44 mg (0,12 %)
giấm lô 2 Cyanidin-3-O-sambubiosid: 0,66 mg Cyanidin-3-O-
Cốm Bụp Delphinidin-3-O-sambubiosid: 2,52 mg sambubiosid: 0,67 mg
giấm lô 3 Cyanidin-3-O-sambubiosid: 0,7 mg (0,03%)
Tính tương thích hệ thống
Bảng 3.8. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh delphinidin-3-O-
sambubiosid trong 6 lần tiêm mẫu liên tiếp
Thời gian lưu Diện tích đỉnh Hệ số kéo đuôi Số đĩa lý thuyết
STT
(tR) (As) (t) (N)
1 16,97 2931645 1,55 1289
2 16,54 3025189 1,57 1300
3 16,87 3023412 1,49 1321
4 16,67 3023184 1,65 1268
5 16,38 2941280 1,6 1109
6 16,29 2942362 1,57 1297

TB 16,62 2981179 1,57 1264

SD 0,27 46983
RSD% 1,62 1,576
 83

Bảng 3.9. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh cyanidin-3-O-sambubiosid

trong 6 lần tiêm mẫu liên tiếp
Thời gian Diện tích Hệ số kéo Số đĩa lý
STT
lưu đỉnh đuôi thuyết
1 (t27,68
R) (As)
1856873 (t)
1,78 (N)
2532
2 27,45 1802342 1,67 1987
3 27,18 1832142 1,73 2362
4 27,54 1873234 1,82 2263
5 27,97 1842112 1,7 2918
6 27,13 1862341 1,69 1983
TB 27,49 1844840 1,73 2532
SD 0,32 25424
RS 1,15 1,38
D% Các thông số thời gian lưu, diện tích đỉnh đều có RSD < 2%.
Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống.
Tính đặc hiệu

Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC đánh giá tính đặc hiệu của quy trình định
lượng delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid
Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn xuất hiện đỉnh ở thời gian lưu khoảng
16 và 27 phút, đỉnh này không xuất hiện trên mẫu trắng. Sắc ký đồ mẫu thử
 84

thêm chuẩn xuất hiện đỉnh ở thời gian lưu 16 và 27 phút và cường độ hấp thu
cao hơn so với mẫu thử. Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu.
Khoảng tuyến tính
Bảng 3.10. Kết quả diện tích đỉnh theo nồng độ delphinidin-3-O-
sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid

Delphinidin-3-O-sambubiosid Cyanidin-3-O-sambubiosid
Mẫu
Nồng độ (ppm) Diện tích đỉnh Nồng độ (ppm) Diện tích đỉnh
1 30 736581 12 429290
2 60 1448922 24 998192
3 120 2931645 48 1856873
4 240 6023619 96 4029103
5 300 6989294 120 4879820
6 360 8723812 144 5728012

10000000
9000000 y = 23977x + 39941
R² = 0.9978
8000000
7000000
6000000 y = 40583x - 16278
R² = 0.9983
5000000 DEL

4000000 CYA

3000000
2000000
1000000
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400

Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa nồng độ và cường độ
hấp thu
Xét phương trình tuyến tính của DEL:
Hệ số B có │t│ = 0,32 < t0,05 = 2,78 nên hệ số B không có ý nghĩa.
 85

Hệ số B0 có │t│ = 42,4 > t0,05 = 2,78 nên hệ số B0 có ý nghĩa.

R2 = 0,9983 > 0,995: Có sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ.
Vậy phương trình hồi quy xác định nồng độ delphinidin-3-O-
sambubiosid theo diện tích đỉnh là: ŷ = 40583x. Khoảng tuyến tính: 30 ppm –
360 ppm.
Xét phương trình tuyến tính của CYA:
Hệ số B có │t│ = 0,21 < t0,05 = 2,78 nên hệ số B không có ý nghĩa.
Hệ số B0 có │t│ = 47,8 > t0,05 = 2,78 nên hệ số B0 có ý nghĩa.
R2 = 0,9983 > 0,995 : Có sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ.
Vậy phương trình hồi quy xác định nồng độ cyanidin-3-O-sambubiosid
theo diện tích đỉnh là: ŷ = 23977x. Khoảng tuyến tính: 12 ppm – 144 ppm.
Độ lặp lại
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ lặp lại quy trình định lượng delphinidin-
3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm
Delphinidin-3-O-
Khối Cyanidin-3-O-sambubiosid
Lần sambubiosid
lượng
bơm Diện tích Hàm lượng Diện tích Hàm lượng
cân
đỉnh (%) đỉnh (%)
1 3,0617 3631318 0,121 1666540 0,032
2 2,9872 3562812 0,122 1639244 0,032

3 3,0238 3728193 0,126 1748924 0,034

4 2,9372 3618391 0,126 1721942 0,034
5 2,9436 3671831 0,127 1634829 0,032

6 3,0982 3719823 0,123 1739201 0,033

TB 0,124 0,033
SD 0,003 0,001

RSD 2,082 2,962

 86

Nhận xét: Kết quả xác định hàm lượng delphinidin-3-O-sambubiosid và

cyanidin-3-O-sambubiosid trong mẫu cốm Bụp giấm có RSD lần lượt là
2,082% và 2,962%.
Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời delphinidin-3-O-sambubiosid
và cyanidin-3-O-sambubiosid đạt độ lặp lại.
Độ đúng
Tỷ lệ hồi phục của các mẫu ở cả 9 mẫu đều đạt yêu cầu.
Quy trình định lượng đạt độ đúng.
Bảng 3.12. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng delphinidin-3-O-
sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm
Delphinidin-3-O-
Cyanidin-3-O-sambubiosid
sambubiosid
Mức hàm
Lượng Lượng
lượng Lượng Tỷ lệ Tỷ lệ
thêm thêm Lượng tìm
(%) tìm thấy phục phục hồi
vào vào thấy (mg)
(mg) hồi (%) (%)
(mg) (mg)
2,98 3,000 100,81 0,788 0,769 97,59
80% 2,98 3,052 102,55 0,788 0,763 96,75
2,98 2,944 98,91 0,788 0,760 96,41
3,72 3,792 101,95 0,986 0,947 96,13
100% 3,72 3,640 97,84 0,986 0,963 97,74
3,72 3,650 98,13 0,986 0,960 97,37
4,46 4,570 102,38 1,183 1,150 97,23
120% 4,46 4,484 100,46 1,183 1,138 96,19
4,46 4,382 98,16 1,183 1,166 98,60
TB (%) 100,13 97,11
SD (%) 1,92 0,82
RSD (%) 1,92 0,84
 87

Như vậy, cốm Bụp giấm định lượng theo điều kiện trên có chứa 2,47
mg (0,12%) delphinidin-3-O-sambubiosid và 0,67 mg (0,03%) cyanidin-3-O-
sambubiosid. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng đồng thời
delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp
giấm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC nêu trên cho thấy độ tin cậy cao từ
cách xử lý mẫu đến điều kiện phân tích, đảm bảo tính tương thích hệ thống,
tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Phương pháp này hoàn
toàn có thể áp dụng trong việc định lượng cốm Bụp giấm, nhằm góp phần tiêu
chuẩn hóa chế phẩm này để đưa vào điều trị.

3.2.3. Độ ổn định của cốm Bụp giấm

Bảng 3.13. Kết quả theo dõi độ ổn định của cốm Bụp giấm ở điều kiện
lão hóa cấp tốc
Thời điểm Chỉ tiêu Kết quả
lấy mẫu theo dõi
Cảm quan Thuốc có dạng hạt nhỏ xốp hay sợi ngắn xốp,
khô, đồng đều về hình dạng và màu sắc, không
Ban đầu có hiện tượng hút ẩm.
Độ ẩm 3,56 %
Định lượng Đạt giới hạn ± 10%
Cảm quan Hạt cốm khô, bị đổi sang màu nhạt, mất mùi vị
Độ ẩm 3,21 %
3 tháng
Định lượng Không thấy hiện diện của delphinidin-3-O-
sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid.
Sau 3 tháng lưu ở điều kiện lão hóa cấp tốc, cốm Bụp giấm đã có những
“biến đổi đáng kể”, biến đổi về hình thức cảm quan và hàm lượng hoạt chất.
Do đó, tuổi thọ của Bụp giấm cần được xác định ở điều kiện bảo quản thường.
 88

Bảng 3.14. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm ban đầu
Hoạt chất DEL CYA
Khối Hàm Trung Hàm
Diện tích Diện tích Trung
Lần bơm lượng lượng bình lượng
đỉnh đỉnh bình (%)
cân (%) (%) (%)
3,0365 3671318 0,123 1699624 0,033
lô 1 3,0716 3687102 0,123 0,122 1700382 0,032 0,033
3,0143 3568312 0,121 1688762 0,033
3,0826 3628349 0,120 1707262 0,032
Lô 2 3,0167 3708123 0,126 0,122 1742872 0,034 0,033
3,0872 3612983 0,120 1727192 0,033
2,9978 3698122 0,126 1792922 0,035
Lô 3 3,0182 3708127 0,125 0,126 1817872 0,035 0,035
3,0281 3721720 0,126 1807321 0,035
Bảng 3.15. Kết quả theo dõi độ ổn định của cốm Bụp giấm ở điều kiện
bảo dài hạn
Thời điểm Chỉ tiêu Kết quả
lấy mẫu theo dõi
Cảm quan Thuốc có dạng hạt nhỏ xốp hay sợi ngắn xốp, khô,
đồng đều về hình dạng và màu sắc, không có hiện
Ban đầu tượng hút ẩm.
Độ ẩm 3,56 %
Định lượng Đạt giới hạn ± 10%
Cảm quan Thuốc có dạng hạt nhỏ xốp hay sợi ngắn xốp, khô,
đồng đều về hình dạng và màu sắc, không có hiện
6 tháng tượng hút ẩm.
Độ ẩm 3,58 %
Định lượng Đạt giới hạn ± 10%
 89

Thời điểm Chỉ tiêu Kết quả

lấy mẫu theo dõi
Cảm quan Thuốc có dạng hạt nhỏ xốp hay sợi ngắn xốp, khô,
đồng đều về hình dạng và màu sắc, không có hiện
12 tháng tượng hút ẩm.
Độ ẩm 3,62 %
Định lượng Đạt giới hạn ± 10%
Bảng 3.16. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm sau 6 tháng
Hoạt chất DEL CYA
Khối Diện Hàm Diện Hàm
Lần Trung Trung
lượng tích lượng tích lượng
bơm bình bình
cân đỉnh (%) đỉnh (%)
2,9903 3478199 0,124 1650268 0,037
Lô 1 2,9991 3582732 0,127 0,125 1668348 0,037 0,037
3,0832 3582833 0,124 1648390 0,036
3,0947 3563843 0,123 1654263 0,036
Lô 2 3,0045 3437333 0,122 0,123 1659839 0,037 0,037
3,0104 3491808 0,124 1658383 0,037
3,0111 3587283 0,127 1657349 0,037
Lô 3 3,0023 3534923 0,125 0,126 1643822 0,037 0,037
2,9904 3554679 0,127 1674943 0,037
Sau 12 tháng bảo quản ở nhiệt độ thường, cốm Bụp giấm vẫn giữ
nguyên tình trạng ban đầu về các chỉ tiêu cảm quan, độ ẩm, định lượng hoạt
chất delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid (thay đổi
trong giới hạn cho phép).
Như vậy, căn cứ theo hướng dẫn của ASEAN 2013,
Dự kiến tuổi thọ của thuốc: Y = X + 3 tháng = 15 tháng
(Y: Tuổi thọ đề xuất; X: Khoảng thời gian của dữ liệu thực).
 90

Bảng 3.17. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm sau 12 tháng
Hoạt chất DEL CYA
Khối Diện Hàm Diện Hàm
Lần Trung Trung
lượng tích lượng tích lượng
bơm bình bình
cân đỉnh (%) đỉnh (%)
3,0184 3573966 0,126 1666362 0,037
lô 1 3,0192 3427298 0,121 0,125 1675383 0,037 0,037
3,0004 3636823 0,129 1673931 0,037
2,9993 3463823 0,123 1656939 0,037
Lô 2 3,0083 3427128 0,121 0,124 1693829 0,038 0,037
3,0104 3583820 0,127 1643922 0,037
3,0107 3483933 0,123 1606984 0,036
Lô 3 3,1067 3526293 0,121 0,123 1649303 0,036 0,036
3,0065 3498595 0,124 1695475 0,038
3.3. Tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển
hóa lipid
3.3.1. Nồng độ gây độc tế bào của cốm Bụp giấm trên HepG2
Nồng độ được chọn cho các thử nghiệm tiếp theo đối với cốm Bụp
giấm là 1000 µg/mL, với Lipistad là 10 µg/mL, liều mẫu phối hợp BG và LP
là 250/2,5 µg/mL. Đây được xem là nồng độ cao nhất của mẫu không gây chết
tế bào Hep G2.
Bảng 3.18. Phần trăm gây độc của các mẫu trên dòng tế bào ung thư gan
Hep G2 ở các nồng độ khác nhau được xác định bằng phương pháp SRB

Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%)

Mẫu
(µg/mL) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 TB ĐLC

Bụp giấm 5000 55,50 46,52 43,07 43,95 45,68 46,94 4,97
(BG) 1000 16,67 15,82 5,73 6,17 17,80 8,05 11,71 5,63
 91

Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%)

Mẫu
(µg/mL) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 TB ĐLC

500 13,38 10,47 12,42 5,56 10,46 3,48

100 13,18 10,47 4,14 8,64 9,11 3,80
50 6,42 2,55 7,10 5,36 2,45
10 14,66 10,47 6,37 8,64 10,04 3,51
5 13,51 3,82 5,25 7,53 5,23
100 55,24 53,73 55,72 54,89 1,04
50 43,46 43,03 43,07 43,19 0,23
25 32,20 27,86 21,65 27,24 5,30
Lipistad
(LP) 10 14,19 8,92 10,49 7,16 14,05 14,00 9,13 5,27

5 11,49 2,55 0,00 4,68 6,03

3 10,81 4,14 -1,23 4,57 6,03

1000/10 21,83 24,13 22,61 22,86 1,17

500/5 18,90 16,20 13,03 16,04 2,94

Phối hợp
BG + LP 250/2,5 13,21 11,57 11,11 11,96 1,10
125/1,25 10,83 14,21 3,26 9,43 5,61

62,6/0,625 2,75 9,09 1,15 4,33 4,20

TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn

Kết quả kiểm tra mồi

Hình 3.9. Kết quả điên di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi ở các nhiệt
độ 54 oC, 57 oC, 60 oC và 63 oC bằng RT-PCR.
 92

Hình 3.10. Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi ở các nhiệt
độ 54 oC, 57 oC, 60 oC và 63 oC bằng RT-PCR (HMGCoA và AMPK).
Chỉ xuất hiện vạch mục tiêu ở cặp mồi LDLR, SREBP-2, HMGCoA
(HMGCR), AMPK và chứng nội GADPH. Cặp mồi SREBP-1 không tiếp tục
chạy realtime.

Đường cong nóng chảy gen LDLR Đường cong nóng chảy gen SREBP-2

Đường cong nóng chảy gen HMGCoA Đường cong nóng chảy gen AMPK
 93

Đường cong nóng chảy gen GAPDH

Hình 3.11. Kết quả khảo sát đường cong nóng chảy của các gen LDLR,
SREBP2, HMGCoA, AMPK
Kết quả kiểm tra đường cong nóng chảy đều chỉ xuất hiện một đỉnh
nóng chảy chứng tỏ chỉ có 1 sản phẩm, không có sản phẩm kí sinh, chứng tỏ
mồi là đặc hiệu.

3.3.2. Kết quả xác định sự thay đổi biểu hiện của các gen

Kết quả được xác định ở các thời điểm 24h và 48h sau khi cảm ứng
BG, LP và phối hợp BG và LP. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp sinh học,
mỗi phản ứng PCR lặp lại 2 lần kỹ thuật.
Đối với gen LDLR, sau 24 giờ cảm ứng, cả BG, LP và mẫu phối hợp
BG + LP đều làm tăng biểu hiện gen, trong đó, LP làm tăng biểu hiện nhiều
nhất (2 lần). Tuy nhiên, sau 48 giờ cảm ứng, BG làm tăng biểu hiện gen LDLR
đến 2,22 lần, đồng thời, mẫu phối hợp làm tăng cao nhất 3,51 lần.
Đối với gen SREBP-2, sau 24 giờ cảm ứng, cả 3 mẫu đều làm tăng biểu
hiện gen, với mẫu phồi hợp làm tăng cao nhất, đạt 4,72 lần. Tuy nhiên, sau 48
giờ, mẫu LP làm tăng biểu hiện cao hơn, đạt 4,23 lần.
Đối với gen HMGCoA, sau 24 giờ và 48 giờ cảm ứng, chỉ có mẫu LP
và mẫu phối hợp BG với LP làm tăng biểu hiện gen.
 94

Đối với gen AMPK, cả 3 mẫu đều làm tăng biểu hiện gen, trong đó,
tăng cao nhất là mẫu phối hợp BG với LP, đạt 3,34 lần. Sau 48 giờ, chỉ có mẫu
BG và mẫu phối hợp còn làm tăng biểu hiện gen.
Bảng 3.19. Sự thay đổi biểu hiện các gene của các mẫu
LDLR SREBP-2 HMGCoA AMPK
Mẫu
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Đối 1,00 ± 1,00 ± 1,00 ± 1,00 ± 1,00 ± 1,00 ± 1,00 ± 1,00 ±
chứng 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1,87 ± 2,22 ± 1,88 ± 2,53 ± 0,92 ± 0,72 ± 1,11 ± 1,52 ±
BG
0,67 0,47 0,50 0,76 0,21 0,49 0,17 0,24
2,00 ± 1,48 ± 4,66 ± 4,23 ± 2,64 ± 2,27 ± 1,77 ± 0,76 ±
LP
0,76 0,48 1,15 0,90 0,66 0,79 0,40 0,24
BG + 1,37 ± 3,51 ± 4,72 ± 3,03 ± 1,41 ± 1,85 ± 3,34 ± 1,16 ±
LP 0,91 0,69 1,19 1,21 0,26 0,75 0,87 0,27
Ghi chú: tăng biểu hiện khi giá trị >1, giảm biểu hiện khi giá trị <1.
Đánh giá về tác dụng cảm ứng gen của mẫu cốm BG, so với mẫu đối
chứng, mẫu cốm BG ở nồng độ 1000 µg/mL sau 24 giờ cảm ứng gen, làm tăng
biểu hiện LDLR 0,87 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 0,88 lần, giảm biểu hiện
HMGCoA 0,08, tăng biểu hiện AMPK 0,11 lần. So với mẫu đối chứng, mẫu
cốm BG ở nồng độ 1000 µg/mL sau 48 giờ cảm ứng gen làm tăng biểu hiện
LDLR 1,22 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 1,53 lần, giảm biểu hiện HMGCoA
0,28, tăng biểu hiện AMPK 0,52 lần.
Đánh giá riêng về tác dụng cảm ứng gen của mẫu Lipistad
(atorvastatin), so với mẫu đối chứng, mẫu Lipistad ở nồng độ 10 µg/mL sau
24 giờ cảm ứng gen, làm tăng biểu hiện LDLR 1,0 lần, tăng biểu hiện SREBP-
2 3,66 lần, tăng biểu hiện HMGCoA 1,64 lần, tăng biểu hiện AMPK 0,77 lần.
So với mẫu đối chứng, mẫu Lipistad ở nồng độ 10 µg/mL sau 48 giờ cảm ứng
 95

gen làm tăng biểu hiện LDLR 0,48 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 3,23 lần, tăng
biểu hiện HMGCoA 1,27, giảm biểu hiện AMPK 0,24 lần.

Số lần làm tăng, giảm biểu hiện gen của cốm Bụp giấm
(1000 µg/mL )
2
1.5
1
0.5
0
-0.5
LDLR SREBP-2 HMGCoA AMPK

Sau 24 giờ Sau 48 giờ

Số lần làm tăng, giảm biểu hiện gen của LP_atorvastatin

(10 µg/mL )
4
3
2
1
0
-1 LDLR SREBP-2 HMGCoA AMPK

Sau 24 giờ Sau 48 giờ

Số lần làm tăng, giảm biểu hiện gen của mẫu phối hợp
BG + LP (250/2,5 µg/mL)
4
3
2
1
0
LDLR SREBP-2 HMGCoA AMPK
Sau 24 giờ Sau 48 giờ

Hình 3.12. Số lần làm tăng, giảm biểu hiện gen của các mẫu thử nghiệm
Ghi chú: Cốm Bụp giấm (BG), Lipistad_atorvastatin (LP) và mẫu phối
hợp (BG + LP).
 96

Đánh giá riêng về tác dụng cảm ứng gen của mẫu phối hợp cốm Bụp
giấm và Lipistad (atorvastatin), so với mẫu đối chứng, mẫu phối hợp BG + LP
ở nồng độ 250/2,5 µg/mL sau 24 giờ cảm ứng gen, làm tăng biểu hiện LDLR
0,37 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 3,72 lần, tăng biểu hiện HMGCoA 0,41 lần,
tăng biểu hiện AMPK 2,34 lần. So với mẫu đối chứng, mẫu phối hợp BG +
LP ở nồng độ 250/2,5 µg/mL sau 48 giờ cảm ứng gen làm tăng biểu hiện
LDLR 2,51 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 2,03 lần, tăng biểu hiện HMGCoA
0,85, tăng biểu hiện AMPK 0,16 lần.
Như vậy, kết quả trên cho thấy tiềm năng về sự kết hợp giữa cốm BG
và atorvastatin trong điều trị rối loạn lipid máu và các bệnh lý có liên quan
đến các gen điều hòa quá trình chuyển hóa lipid.
3.4. Tác dụng điều hòa lipid máu và tác dụng dự phòng gan nhiễm
mỡ của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng
3.4.1. Tác dụng điều hòa lipid máu của cốm Bụp giấm trên chuột
nhắt gây rối loạn lipid máu nội sinh bằng tyloxapol
Nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) giữa
các lô tại thời điểm ban đầu khi đưa vào thử nghiệm khác biệt nhau không có
ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 3.20. Nồng độ lipid máu của các lô thử nghiệm tại thời điểm ban đầu
Cholesterol Triglycerid HDL LDL
Lô (n = 10)
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl)
Bệnh lý 81,54 ± 5,75 106,72 ± 11,25 41,83 ± 3,72 18,36 ± 3,48
Fenofibrat
81,80 ± 6,31 106,95 ± 13,08 41,87 ± 6,68 18,55 ± 6,18
50 mg/kg
Cốm BG
82,60 ± 14,23 106,17 ± 14,85 41,84 ± 8,05 19,53 ± 77,07
400 mg/kg
Tất cả các chuột được đưa vào thí nghiệm đều có nồng độ triglycerid máu
sau 6 giờ tiêm tyloxapol tăng gấp 3 - 5 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <
 97

0,001) so với nồng độ triglycerid ban đầu. Nồng độ triglycerid máu giữa các lô
sau 6 giờ tiêm tyloxapol khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Nồng độ lipid máu lô bệnh lý tại thời điểm ban đầu và sau 48 giờ tiêm
tyloxapol (n = 10)
180.00 **
160.00
140.00
***
120.00
mg/dl

100.00
80.00 ***
60.00
**
40.00
20.00
0.00
Cholesterol TP Triglycerid HDL LDL
Ban đầu Sau 48 giờ

Hình 3.13. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý không được điều trị tại
thời điểm ban đầu và sau 48 giờ tiêm tyloxapol
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ban đầu (p < 0,01)
*** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ban đầu (p < 0,001)
Như vậy, so với thời điểm ban đầu, nồng độ lipid máu (cholesterol toàn
phần, triglycerid và LDL) của lô bệnh lý vẫn duy trì tăng và nồng độ HDL
giảm (khác biệt có ý nghĩa thống kê). Do đó, có thể sử dụng mô hình này để
đánh giá hiệu quả điều trị của thuốc thử nghiệm trên các thông số cholesterol
toàn phần, triglycerid máu, LDL và HDL.
Tại thời điểm 48 giờ sau khi tiêm tyloxapol gây rối loạn lipid ở chuột
nhắt, so sánh hiệu số nồng độ lipid máu đầu – cuối, so với lô bệnh lý không
được điều trị thì: Fenofibrat sử dụng đường uống liều 50 mg/kg chuột
nhắt/ngày x 3 liều làm giảm cholesterol toàn phần 11% (p = 0,0284), tăng
HDL 35% (p = 0,0002) và làm giảm LDL 44% (p = 0,0012). Cốm Bụp giấm
sử dụng đường uống liều 400 mg/kg chuột nhắt/ngày x 3 liều làm giảm
cholesterol toàn phần 12% (p = 0,0126), tăng HDL 51% (p = 0,0002) và làm
giảm LDL 53% (p = 0,0002).
 98

Nồng độ lipid máu sau 48 giờ tiêm tyloxapol so với ban đầu
mg/dl giữa các lô (n = 10)
50.00
40.00
30.00
20.00 * **
* ***
10.00
***
0.00
Cholesterol TP Triglycerid HDL LDL
-10.00
***
-20.00

Bệnh lý Fenofibrat 50 mg/kg Cốm BG 400 mg/kg

Hình 3.14. Nồng độ lipid máu so với ban đầu của các lô sau 48 giờ tiêm
tyloxapol
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,01)
*** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,001)
Như vậy, cả fenofibrat 50 mg/kg và cốm Bụp giấm 400 mg/kg đều có
tác dụng điều trị rối loạn lipid máu gây ra do tyloxapol 500 mg/kg sau 48 giờ.
Đồng thời, so với lô uống fenofibrat, lô uống cốm BG có nồng độ HDL tăng
25% (p = 0,0081).
Trọng lượng của chuột ban đầu và sau 48 giờ tiêm tyloxapol khác biệt
không có ý nghĩa thống kê giữa các lô thử nghiệm và trong cùng một lô tại hai
thời điểm.
3.4.2. Tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm trên
chuột nhắt gây rối loạn lipid máu ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu lipid
Nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) giữa
các lô tại thời điểm ban đầu khi đưa vào thử nghiệm khác biệt nhau không có
ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
 99

Bảng 3.21. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm tại thời điểm
ban đầu
Ban đầu (mg/dl)
Lô (n = 8)
Choles TP Triglycerid HDL LDL
Bệnh lý 79,78 ± 8,38 97,53 ± 13,74 39,56 ± 3,88 20,72 ± 7,40
Atorvastatin
78,66 ± 7,69 98,66 ± 4,82 39,26 ± 3,85 19,67 ± 7,15
10 mg/kg
Cốm BG
78,41 ± 8,87 98,87 ± 10,10 39,14 ± 7,62 19,50 ± 10,08
400 mg/kg
Sau 8 tuần gây bệnh, các chuột được đưa vào trong thử nghiệm đánh
giá tác dụng điều trị đều có tình trạng rối loạn lipid máu. Đồng thời, chuột
được phân bố ngẫu nhiên vào trong các nhóm, khác biệt về nồng độ lipid máu
giữa các nhóm không có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.22. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm sau 8 tuần
gây bệnh bằng dung dịch giàu lipid
Sau 8 tuần uống dung dịch giàu lipid (mg/dl)
Lô (n = 8)
Choles TP Triglycerid HDL LDL
Bệnh lý 122,33 ± 20,78 189,85 ± 4,25 31,77 ± 5,66 52,59 ± 24,29
Atorvastatin
121,03 ± 16,03 188,97 ± 3,79 31,62 ± 8,00 51,62 ± 15,43
10 mg/kg
Cốm BG
123,51 ± 19,40 188,11 ± 5,24 32,95 ± 5,31 52,94 ± 20,90
400 mg/kg
Lô bệnh lý, không điều trị được dùng làm nhóm để kiểm chứng mô
hình và tác dụng của thuốc. Từ kết quả xét nghiệm cho thấy, sau 8 tuần gây
bệnh, nồng độ cholesterol toàn phần tăng 53% (p = 0,0064), triglycerid tăng
95% (p = 0,000), HDL giảm 20% (p = 0,0106) và LDL tăng 153% (p =
0,00981).
 100

Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý, không điều trị (n = 8)

250.00 ***
#
200.00
***
** **
150.00
mg/dl

100.00 **
*

50.00 *

-
Cholesterol Triglycerid HDL LDL

Ban đầu Sau 8 tuần gây bệnh Sau 1 tuần không điều trị

Hình 3.15. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý, không được điều trị
(mg/dl)
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm ban đầu (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm ban đầu (p < 0,01)
***: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm ban đầu (p < 0,001)
# : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm sau 8 tuần (p < 0,05)

Mức độ thay đổi nồng độ lipid máu của các lô sau 1 tuần điều trị
(mg/dl)
30.00
**
20.00
10.00
0.00
-10.00 Cholesterol TP Triglycerid HDL LDL
mg/dl

-20.00
-30.00
*
-40.00
-50.00
-60.00
-70.00 * **
Bệnh lý Atorvastatin 10mg/kg Cốm BG 400 mg/kg

Hình 3.16. Mức độ thay đổi nồng độ lipid máu của các lô trong thử
nghiệm sau 1 tuần điều trị so với thời điểm sau khi gây bệnh 8 tuần
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,01)
 101

Ở lô bệnh lý, sau 1 tuần kể từ khi ngưng sử dụng dung dịch giàu lipid
để gây bệnh và không điều trị, so với thời điểm ban đầu thì nồng độ cholesterol
toàn phần tăng 47% (p = 0,00461), triglycerid tăng 67% (p = 0,00001), HDL
trở về mức bình thường và LDL tăng 146% (p = 0,01467). So với thời điểm
sau 8 tuần gây bệnh thì chỉ có triglycerid giảm có ý nghĩa thống kê (p = 0,01),
tuy nhiên, chỉ giảm 14% và vẫn còn duy trì nồng độ cao so với ban đầu. Như
vậy, mô hình gây rối loạn lipid máu trên chuột nhắt đã tiến hành có thể sử
dụng để đánh giá tác dụng điều trị của thuốc trên thông số cholesterol toàn
phần, triglycerid máu và LDL.
So sánh hiệu số giữa thời điểm sau 1 tuần điều trị và sau 8 tuần gây
bệnh, so với lô bệnh lý không được điều trị thì lô điều trị bằng atorvastatin 10
mg/kg có nồng độ cholesterol toàn phần và triglycerid máu đều giảm (p =
0,046 và 0,0117). Lô điều trị bằng cốm BG 400 mg/kg có nồng độ triglycerid
giảm (p = 0,0063), nồng độ HDL tăng (p = 0,0033).
Như vậy, cả atorvastatin 10 mg/kg và cốm Bụp giấm 400 mg/kg đều có
tác dụng điều trị rối loạn lipid máu sau 1 tuần điều trị đối với chuột nhắt bị rối
loạn lipid máu ngoại sinh do sử dụng dung dịch giàu lipid trong 8 tuần.
Trọng lượng chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt không có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05) trong suốt thời gian thử nghiệm.
3.4.3. Tác dụng dự phòng rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm
trên chuột nhắt rối loạn lipid máu ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu lipid
Nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) giữa
các lô tại thời điểm ban đầu khi đưa vào thử nghiệm khác biệt nhau không có
ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Sau 6 tuần thử nghiệm, so với lô uống nước cất, lô bệnh lý có chỉ số
cholesterol toàn phần và LDL tăng có ý nghĩa thống kê (p = 0,00019 và
0,00034), chỉ số triglycerid và HDL khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Như
 102

vậy, mô hình này có thể sử dụng để đánh giá tác dụng của thuốc nghiên cứu
qua hai thông số là cholesterol toàn phần và LDL.
Bảng 3.23. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm tại thời điểm
ban đầu
Choles TP Triglycerid
Lô (n = 8) HDL (mg/dl) LDL (mg/dl)
(mg/dl) (mg/dl)
70,83 106,26 30,51 19,07
Nước cất
± 10,14 ± 9,73 ± 8,47 ± 7,51
73,01 105,26 33,26 18,69
Bệnh lý
± 8,08 ± 10,52 ± 10,58 ±9,91
Atorvastatin 70,58 100,74 28,68 ± 21,75
10 mg/kg ± 9,57 ± 8,50 5,27 ± 6,57
Cốm BG 71,56 104,86 31,60 ± 18,99
400 mg/kg ± 7,48 ± 5,47 6,03 ± 8,60

Nồng độ lipid máu của các lô chuột sau 6 tuần thử nghiệm (n = 8)
160.00
140.00 ***
120.00 # ##
100.00
mg/dl

***
80.00
#
60.00
##
40.00
20.00
0.00
Choles TP Triglycerid HDL LDL
Nước cất Bệnh lý Atorvastatin Cốm Bụp giấm

Hình 3.17. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm sau 6 tuần
*** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,001)
# : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,05)
## : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,01)
 103

Sau 6 tuần thử nghiệm, so với lô bệnh lý, lô uống atorvastatin dự phòng
có chỉ số cholesterol toàn phần giảm 19%, LDL giảm 44% (p = 0,022 và 0,013);
lô uống cốm Bụp giấm dự phòng có chỉ số cholesterol toàn phần giảm 28%,
LDL giảm 56% (p = 0,0069 và 0,0016). Các chỉ số giữa lô uống atorvastatin và
uống cốm Bụp giấm khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê.
Như vậy, cả atorvastatin 10 mg/kg và cốm Bụp giấm 400 mg/kg đều có
tác dụng dự phòng rối loạn lipid máu đối với chuột gây rối loạn lipid máu sinh
bằng dung dịch giàu lipid trong 6 tuần.
Trọng lượng chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt không có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05) trong suốt thời gian thử nghiệm.

3.4.4. Tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ không do rượu của cốm
Bụp giấm

Chỉ số lipid máu của các lô chuột sau 4 tuần thử nghiệm (n = 7)
200.00 ** *
180.00
#
160.00 #
140.00 #
120.00
mg/dl

100.00 * ***
80.00 # ***
60.00 # #
40.00 ##
20.00
0.00
Nước cất Bệnh lý Atorvastatin 10 Cốm BG 400 Atorvastatin+Cốm
mg/kg mg/kg BG

Cholesterol TP Triglycerid HDL LDL

Hình 3.18. Chỉ số lipid máu của các lô chuột trong thử nghiệm sau 4 tuần
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01)
*** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,001)
# : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,05)
## : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p < 0,01)
 104

Chỉ số sinh hóa máu của các lô chuột sau 4 tuần thử nghiệm (n = 7)
140.00 *** * **
120.00

100.00 *
*
80.00 ***
60.00

40.00

20.00

0.00
Nước cất Bệnh lý Atorvastatin 10 Cốm BG 400 Atorvastatin+Cốm
mg/kg mg/kg BG

ALT (U/L) AST (U/L) Glucose (mg/dl)

Hình 3.19. Chỉ số sinh hóa máu của các lô chuột trong thử nghiệm sau
4 tuần
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01)

Cân nặng của chuột trong thời gian thử nghiệm (n = 7)

40.00

38.00

36.00

34.00

32.00
Gam (g)

30.00

28.00

26.00

24.00

22.00

20.00
Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
Nước cất Bệnh lý
Atorvastatin 10 mg/kg Cốm BG 400 mg/kg
Atorvastatin+Cốm BG

Hình 3.20. Trọng lượng các lô chuột trong 4 tuần thử nghiệm
 105

Trọng lượng của các lô chuột khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong
suốt thời gian thử nghiệm.

Mô gan trong giới hạn bình thường (lô nước cất)

Ổ viêm vùng giữa

Ổ viêm vùng giữa

Mô gan viêm gan mạn tính mức độ nhẹ có kèm thoái hóa mỡ (lô bệnh lý)
Hình 3.21. Hình ảnh vi thể gan bình thường và viêm gan mạn tính mức
độ nhẹ có kèm thoái hóa mỡ (lô bệnh lý)
Nhuộm Hematoxylin - eosin (HE), độ phóng đại X 100.
Sau 4 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất, chuột thử
nghiệm ở lô bệnh lý có cholesterol toàn phần tăng 38%, triglycerid tăng 23%,
LDL tăng 125%, ALT tăng 168%, AST tăng 18%, glucose tăng 13%, HDL
khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Kết quả xét nghiệm vi thể gan cũng cho
thấy, lô bệnh lý có tỷ lệ thoái hóa mỡ không bào nhỏ tăng 1%, tỷ lệ thoái hóa
mỡ không bào lớn tăng 2%. Như vậy, mô hình đã gây thành công các biểu
 106

hiện gan nhiễm mỡ trên chuột nhắt trắng và có thể sử dụng để đánh giá tác
dụng của thuốc nghiên cứu.
So với lô bệnh lý, chuột thử nghiệm ở lô uống atorvastatin có
cholesterol toàn phần giảm 28%, LDL giảm 62%, các chỉ số triglycerid máu,
HDL, ALT, AST và glucose khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên,
ALT và AST bất thường, hai thông số này có tăng 43% và 36% nhưng chỉ tập
trung ở 1 số chuột (tăng 2 – 3 lần), độ lệch chuẩn SD cao.
So với lô bệnh lý, chuột thử nghiệm ở lô uống cốm Bụp giấm có HDL
tăng 24%, LDL giảm 58%, AST giảm 20%, các chỉ số cholesterol toàn phần,
triglycerid, ALT và glucose khác biệt không có ý nghĩa thống kê. So với lô
chứng uống nước cất, chỉ số HDL tăng 30%, glucose tăng 9%. So với lô uống
atorvastatin, chỉ số HDL tăng 29%. Đồng thời, xét nghiệm vi thể gan cho thấy
tỷ lệ thoái hóa mỡ không bào nhỏ giảm 1%.
So với lô bệnh lý, chuột thử nghiệm ở lô uống thuốc kết hợp
atorvastatin và Bụp giấm có cholesterol toàn phần giảm 18%, triglycerid giảm
17%, LDL giảm 58%, các chỉ số HDL, ALT, AST và glucose khác biệt không
có ý nghĩa thống kê. So với lô chứng uống nước cất, chỉ số HDL tăng 27%,
ALT tăng 115%, glucose tăng 11%. So với lô uống atorvastatin, chỉ số HDL
tăng 27%.
Như vậy, cả atorvastatin và cốm Bụp giấm đều cho thấy khả năng dự
phòng tình trạng gan nhiễm mỡ với liều nghiên cứu. Sự kết hợp giữa hai thuốc
này còn cho thấy khả năng làm giảm triglycerid máu.
3.5. Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm
trên chuột nhắt

3.5.1. Độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt

Liều tối đa có thể bơm qua đầu kim của cốm Bụp giấm là 15 g/kg. Trong
suốt thời gian 72 giờ đầu tiên và 2 tuần quan sát tiếp theo, không ghi nhận
được bất kỳ dấu hiệu bất thường nào xảy ra trên chuột thử nghiệm. Tất cả các
 107

chuột đều ăn uống và hoạt động bình thường, không có chuột chết. Do đó,
không tìm được LD50 vì lô chuột uống 15 g/kg là liều tối đa thuốc phân tán
vào nước có thể qua kim để cho uống được mà không có chuột chết. Sau 2
tuần theo dõi, mổ chuột ở tất cả các lô để quan sát đại thể các phủ tạng của
chuột. Tất cả các chuột thực nghiệm không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào
về hình thái đại thể của các cơ quan tim, gan, thận, bàng quang và hệ thống
tiêu hóa. Như vậy, cốm Bụp giấm không thể hiện độc tính cấp đường uống
với liều tối đa có thể bơm qua đầu kim để cho chuột uống là 15 g/kg, tương
đương với 75 g/người 60 kg (gấp 32,5 lần liều dự kiến sử dụng hàng ngày là
2 g cốm). Cốm Bụp giấm sử dụng trong thử nghiệm có độ an toàn cao trên
động vật thử nghiệm và có Dmax = 15 g/kg (liều tối đa có thể cho uống mà
không có thú vật thử nghiệm nào chết).
Bảng 3.24. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cốm Bụp giấm
Liều dùng Số Số chuột chết Phân suất tử
Thử nghiệm
(g/kg chuột) chuột trong lô vong
Sơ khởi 15 6 0 0
Xác định 15 20 0 0
3.5.2. Độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt
Biểu hiện chung, cân nặng, mức độ ăn, uống
Trong suốt thời gian thử nghiệm (12 tuần), chuột trong lô uống cốm
Bụp giấm (BG) liều 1 (0,4 g/kg) và liều 2 (0,8 g/kg) có mức độ ăn uống, đi lại
bình thường; tình trạng phân, lông và các biểu hiện bên ngoài không khác biệt
so với lô chứng uống nước cất. Chuột trong lô uống cốm Bụp giấm liều 3 (4
g/kg) có biểu hiện đi phân mềm (phân ướt hơn so với phân của lô chứng và
không định hình) từ tuần thứ 6 trở đi.
Cân nặng chuột của cả 3 lô thử nghiệm uống cốm BG đều giảm ở tuần
thứ 5 và từ tuần thứ 8 đến tuần thứ 12 so với lô chứng uống nước cất.
 108

Bảng 3.25. Kết quả theo dõi cân nặng của các lô trong thử nghiệm độc
tính bán trường diễn
Trọng
T0 (g) T1 (g) T2 (g) T3 (g) T4 (g) T5 (g) T6 (g)
lượng
Nước 18,95 21,75 23,05 23,30 25,70 27,30 26,50
cất ± 1,28 ± 1,59 ± 2,16 ± 2,72 ± 2,87 ± 3,05 ± 2,54
BG 0,4 18,90 21,70 22,65 23,60 25,10 24,45** 26,10
g/kg ± 0,85 ± 1,63 ± 1,95 ± 2,48 ± 2,49 ± 2,74 ± 3,13
BG 0,8 18,70 20,90 22,90 22,80 24,85 24,40* 25,85
g/kg ± 0,92 ± 2,00 ± 1,92 ± 1,88 ± 2,25 ± 2,30 ± 3,05
BG 4 18,90 21,80 22,85 22,60 24,95 24,30** 26,60
g/kg ± 1,07 ± 1,88 ± 2,23 ± 1,90 ± 1,50 ± 1,84 ±2,30
Trọng
T7 (g) T8 (g) T9 (g) T10 (g) T11 (g) T12 (g)
lượng
Nước 27,15 30,20 30,30 31,05 31,35 31,40
cất ± 2,72 ± 3,07 ± 3,10 ± 2,61 ± 2,35 ± 2,35
BG 0,4 26,00 27,10* 27,75* 27,85** 28,45** 28,55**
g/kg ± 4,03 ± 3,77 ± 4,25 ± 3,56 ± 3,89 ± 3,17
BG 0,8 25,35 26,15*** 26,15*** 26,65*** 27,05*** 26,95***
g/kg ± 3,22 ± 3,05 ± 3,22 ± 2,98 ± 2,80 ± 2,93
BG 4 26,30 26,30*** 26,30*** 25,50*** 25,00*** 24,30***
g/kg ± 2,20 ± 3,15 ± 3,25 ± 3,49 ± 3,21 ± 3,11
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01)
*** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,001)
Lượng nước và lượng thức ăn tiêu thụ của chuột giữa các lô khác biệt
nhau không có ý nghĩa thống kê tại các thời điểm: Ban đầu, sau 6 tuần và sau
12 tuần thử nghiệm.
 109

Lượng nước tiêu thụ của chuột trong thí nghiệm BTD (n = 20)
7.00

6.00

5.00

4.00
ml

3.00

2.00

1.00

0.00
Nước cất Cốm BG 0,4 g/kg Cốm BG 0,8 g/kg Cốm BG 4 g/kg

Ban đầu 1,5 tháng 3 tháng

Hình 3.22. Lượng nước uống của các lô chuột trong thử nghiệm độc
tính bán trường diễn

Lượng thức ăn tiêu thụ của chuột trong thí nghiệm BTD
4.00

3.50

3.00

2.50
Gam (g)

2.00

1.50

1.00

0.50

0.00
Lô 1 (nước cất) Lô 2 (BG 0,4 g/kg) Lô 3 (BG 0,8 g/kg) Lô 4 (BG 4 g/kg)

Ban đầu (g) 1,5 tháng (g) 3 tháng (g)

Hình 3.23. Lượng thức ăn của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính
bán trường diễn
Chỉ số xét nghiệm sinh hóa
Chỉ số sinh hóa của chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt nhau
không có ý nghĩa thống kê tại thời điểm ban đầu.
 110

Bảng 3.26. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 6 tuần của các lô chuột trong
thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Chol
Lô AU Cre Glu ALT AST Trig
TP
(n = 20) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (U/I) (U/I) (mg/dl)
(mg/dl)
Nước 7,69 0,43 88,28 44,10 74,55 80,54 112,09
cất ± 1,32 ± 0,05 ± 12,25 ± 10,93 ± 15,34 ± 14,22 ± 22,20
BG 0,4 7,59 0,39 76,17** 45,30 73,35 80,98 108,72
g/kg ± 1,92 ± 0,07 ± 16,21 ± 8,90 ± 13,12 ± 10,84 ± 19,30
BG 0,8 7,36 0,40 86,28 43,55 70,80 79,76 110,47
g/kg ±1,66 ± 0, 12 ± 14,37 ± 11,69 ± 20,27 ± 13,30 ± 18,50
BG 4 6,85*** 0,40 ± 92,76 56,35** 83,15* 86,60* 114,94
g/kg ± 1,49 0,07 ± 23,42 ± 24,81 ± 20,66 ± 16,14 ± 16,63
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01)
Viết tắt: AU (acid uric), Cre (creatinin), Glu (glucose), Chol TP
(cholesterol toàn phần), Trig (triglcerid).
Bảng 3.27. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 12 tuần của các lô chuột
trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô AU Cre Glu ALT AST Chol TP Trig
(n = 20) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (U/I) (U/I) (mg/dl) (mg/dl)
Nước 7,37 0,39 86,65 45,65 78,25 82,97 115,34
cất ± 0,97 ± 0,08 ± 11,55 ±12,09 ± 18,71 ± 17,53 ± 21,10
BG 0,4 7,19 0,37 75,17 * 42,00 75,75 80,88 114,80
g/kg ± 1,46 ± 0,07 ± 10,67 ±14,84 ± 16,97 ± 15,87 ± 28,71
BG 0,8 7,39 0,39 85,64 45,80 78,20 74,79* 120,56
g/kg ± 1,29 ± 0,11 ± 13,24 ±12,65 ± 25,22 ± 13,18 ± 20,27
BG 4 7,24 0,35 89,76 48,70 83,40 86,08 126,28**
g/kg ± 1,33 ± 0,08 ± 20,47 ±15,18 ± 24,65 ± 21,45 ± 19,04
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01)
 111

Viết tắt: AU (acid uric), Cre (creatinin), Glu (glucose), Chol TP

(cholesterol toàn phần), Trig (triglcerid).
Sau 6 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất: Lô uống cốm
BG 0,4 g/kg có chỉ số glucose giảm 14% (p < 0,01). Lô uống cốm BG 0,8 g/kg
có các chỉ số sinh hóa khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Lô uống cốm BG
4 g/kg có chỉ số acid uric giảm 11% (p < 0,001), ALT tăng 28% (p < 0,01),
AST tăng 12% (p < 0,01).
Sau 12 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất: Lô uống cốm
BG 0,4 g/kg có chỉ số glucose giảm 13% (p < 0,05). Lô uống cốm BG 0,8 g/kg
có chỉ số cholesterol toàn phần giảm 8% (p < 0,05). Lô uống cốm BG 4 g/kg
có chỉ số triglycerid tăng 11% (p < 0,01).
Chỉ số xét nghiệm huyết học
Chỉ số huyết học của chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt nhau
không có ý nghĩa thống kê tại thời điểm ban đầu và sau 6 tuần thử nghiệm.
Bảng 3.28. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 6 tuần của các lô chuột
trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCH PLT
n = 20 10^9/L 10^12/L g/L % fL pg C g/L 10^9/L
Nước 6,24 5,56 12,41 32,90 59,67 23,05 37,08 903,45
cất ± 1,85 ± 0,57 ± 1,21 ± 6,21 ± 3,95 ± 3,85 ± 1,17 ± 191,10
BG 0,4 6,53 6,03 13,42 34,65 58,42 21,50 36,74 993,95
g/kg ± 1,57 ± 1,00 ± 1,93 ± 6,10 ± 3,74 ± 2,24 ± 2,89 ± 230,26
BG 0,8 6,55 5,42 12,85 31,55 58,05 22,17 37,69 946,50
g/kg ± 1,67 ± 1,07 ± 1,82 ± 6,92 ± 3,25 ± 1,90 ± 1,19 ± 323,83
BG 4 6,75 5,82 13,14 33,93 58,70 22,36 37,17 1007,95
g/kg ± 2,75 ± 0,88 ± 2,06 ± 6,19 ± 4,17 ± 3,11 ± 1,47 ± 226,90
Sau 12 tuần thử nghiệm, lô uống cốm Bụp giấm liều 0,4 g/kg có chỉ số
MCH giảm 9 % (p < 0,05), lô uống cốm Bụp giấm liều 4 g/kg có số lượng tiểu
cầu PLT giảm 5 % (p < 0,01).
 112

Bảng 3.29. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 12 tuần của các lô chuột
trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT
n = 20 10^9/L 10^12/L g/L % fL pg g/L 10^9/L
Nước 6,43 6,38 13,66 39,27 62,30 24,14 36,42 991,25
cất ± 1,85 ± 0,87 ± 1,87 ± 5,42 ± 3,17 ± 3,14 ± 3,59 ± 155,48
BG 0,4 6,70 6,63 14,64 38,52 61,26 22,08* 36,09 965,85
g/kg ± 1,85 ± 0,68 ± 1,49 ± 6,00 ± 3,37 ± 1,12 ± 1,14 ± 224,26
BG 0,8 6,44 6,48 13,94 38,84 60,06 22,63 36,54 982,35
g/kg ± 2,02 ± 0,55 ± 1,70 ± 3,87 ± 7,33 ± 1,26 ± 0,86 ± 275,78
BG 4 6,64 6,41 14,16 39,37 60,03 22,68 36,24 941,90**
g/kg ± 2,12 ±0,82 ± 1,64 ± 4,98 ± 9,23 ± 3,62 ± 1,15 ± 243,62
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05)
** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01)
Kết quả giải phẫu quan sát đại thể và vi thể
Ổ tế bào viêm quanh tĩnh mạch trung tâm

Lô 1 (nước cất) Lô 2 Lô 3 Lô 4
(BG 0,4 g/kg) (BG 0,8 g/kg) (BG 4 g/kg)
Hình ảnh vi thể gan của các lô thử nghiệm

Ổ tế bào viêm
trong mô kẽ thận

Lô 1 (nước cất) Lô 2 Lô 3 Lô 4
(BG 0,4 g/kg) (BG 0,8 g/kg) (BG 4 g/kg)
Hình ảnh vi thể thận của các lô thử nghiệm
Hình 3.24. Hình ảnh vi thể gan, thận của các lô trong thử nghiệm độc
tính bán trường diễn (Nhuộm Hematoxylin - eosin (HE), độ phóng đại x 100)
 113

Hình 3.25. Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của các lô chuột trong
thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của chuột giữa các lô trong thử
nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê sau 12 tuần.
Sau 12 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất, lô uống cốm
Bụp giấm 0,4 g/kg và 0,8 g/kg có kết quả vi phẫu gan bình thường. Lô uống
cốm Bụp giấm 4 g/kg có kết quả vi phẫu gan bình thường, vi phẫu thận có
viêm mô kẽ thận mức độ trung bình 2/10 chuột, mức độ nhẹ 8/10 chuột.
Sau 12 tuần uống thuốc, chuột được gây mê, giải phẫu, quan sát tim,
phổi, gan, thận, lách, ruột, bàng quang. Kết quả bình thường, không khác biệt
so với lô uống nước cất.
 114

CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN

4.1. Liều có tác dụng của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là đài hoa khô Bụp giấm,
một loại thực vật đã được trồng thành công ở Việt Nam và được sử dụng phổ
biến trong lĩnh vực thực phẩm cũng như xuất khẩu làm nguyên liệu trong các
thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Đài hoa Bụp giấm có ưu điểm là trong thành phần
có chứa một hàm lượng lớn anthocyanin (có thể đạt tới 1,5 g/kg đài hoa khô,
tùy loài và điều kiện nuôi trồng), nhóm chất đã được chứng minh có tác dụng
chống oxy hóa rất tốt qua nhiều nghiên cứu [22], [23]. Tuy nhiên, đài hoa Bụp
giấm muốn được bào chế thành một dạng thành phẩm dễ sử dụng và xác định
được liều thì cần được chuyển sang dạng chế phẩm trung gian. Qua nhiều năm
nghiên cứu, Trung tâm Nghiên cứu và sản xuất dược liệu Miền trung đã nghiên
cứu thành công quy trình sản xuất dạng bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm. Bên
cạnh đó, trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã kết hợp với công nghệ mới
giúp tạo được dạng bột sấy phun mà không cần chất mang maltoz-dextrin. Do
đó, dạng bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm sử dụng trong nghiên cứu này có
hiệu suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho cho các nghiên cứu bào chế tiếp theo.
Bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (BSP) mặc dù có hiệu suất chiết cao giúp
giảm thể tích và tiện dụng để xác định liều và bào chế các thành phẩm, tuy
nhiên, liều có tác dụng dược lý của BSP không tỷ lệ thuận với liều sử dụng qua
các nghiên cứu tiền đề [9]. Do đó, việc khảo sát mức liều có tác dụng của BSP
là rất quan trọng trước khi bào chế thành phẩm cũng như đánh giá tác dụng
dược lý và độc tính của dạng chế phẩm này.
Khoảng liều của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (BSP) được tiến hành
khảo sát liều tối ưu có tác dụng là 15 mg/kg, 30 mg/kg, 45 mg/kg, 60 mg/kg, 75
mg/kg và 90 mg/kg chuột. Cơ sở chọn các liều này để thử nghiệm là dựa vào
liều đài hoa Bụp giấm đang được khuyến cáo sử dụng trên người (1 g – 2 g đài
hoa khô, 10 – 20 g đài hoa tươi) và kết quả của nghiên cứu tiền đề [6], [9]. Dựa
 115

theo hiệu suất chiết của bột sấy phun là 20%, mức liều tương đương của đài hoa
Bụp giấm được kỳ vọng có hiệu quả là 75 mg – 450 mg/kg chuột nhắt, tương
đương khoảng 375 mg – 2250 mg trên người.
Các mô hình đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu trên động vật có hai
mô hình phổ biến đó là gây rối loạn lipid máu nội sinh và ngoại sinh [13]. Trong
nghiên cứu xác định liều tối ưu này, với yêu cầu nhanh, tiết kiệm thời gian và
kinh phí để có thể tiến hành nghiên cứu với nhiều lô. Do đó, mô hình được lựa
chọn là mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh với tyloxapol (triton WR-1339)
500 mg/kg tiêm phúc mô. Mức liều này của tyloxapol, có thể gây tình trạng rối
loạn lipid máu duy trì tới 48 giờ trên động vật thí nghiệm [99]. Mô hình được
tiến hành có điểm mới so với các nghiên cứu trước đó, do sau khi chuột thử
nghiệm được tiêm tyloxapol 6 giờ, sẽ được lấy máu xét nghiệm thông số
triglycerid (thông số tăng nhanh và cao nhất trong mô hình này); chỉ những
chuột nào có chỉ số triglycerid tăng gấp 3- 5 lần so với ban đầu mới được phân
bố vào các lô để thực hiện nghiên cứu. Điều này sẽ giúp khắc phục sai số trong
thử nghiệm liên quan đến chỉ số triglycerid tăng không đồng đều giữa các chuột
được tiêm tyloxapol mà nhóm tác giả đã gặp khi khảo sát mô hình. Fenofibrat
là một thuốc có tác dụng điều trị rối loạn lipid máu, giúp làm giảm mạnh thông
số triglycerid thông qua kích hoạt PPAR, làm tăng biểu hiện lipoprotein
lipase (LPL) (trong khi tyloxapol làm phân hủy LPL) và làm giảm biểu hiện
của apoCIII ở gan [41]. Fenofibrat được chỉ định dùng trên lâm sàng khi nồng
độ triglycerid > 500 mg/dl [28]. Do đó, fenofibrat được xem là một thuốc đối
chứng phù hợp với mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh bằng tyloxapol.
Kết quả sau khi khảo sát liều có tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu
của BSP với mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh bằng tyloxapol 500 mg/kg
(i.p.) trên chuột nhắt trắng cho thấy, liều có tác dụng điều hòa lipid máu tốt
nhất của BSP trong khoảng liều từ 15 mg/kg đến 90 mg/kg là 30 mg/kg, tương
đương 150 mg BSP hoặc 0,75 g đài hoa Bụp giấm khô khi sử dụng trên người
 116

[13]. Ở mức liều này, BSP làm giảm cholesterol toàn phần 11%, tăng HDL
56% và giảm LDL 65%. Kết quả cũng cho thấy, ở các mức liều tương đương
từ 1,125 g đến 2,25 g đài hoa Bụp giấm khô trên người đều cho tác dụng trên
thông số lipid máu ở các mức độ khác nhau. Kết quả này tương đồng với các
nghiên cứu tác dụng của Bụp giấm trên động vật đã được công bố [48]. Tuy
nhiên, tác động của BSP trên thông số triglycerid máu trong nghiên cứu này
chưa có ý nghĩa thống kê, có thể do thời gian sử dụng ngắn (3 liều) chưa đủ
để tác động lên thông số triglycerid với mức độ tăng rất cao (3 – 5 lần). Như
vậy, mức liều được lựa chọn để đưa vào các thử nghiệm tiếp theo của BSP là
30 mg/kg chuột.
4.2. Cốm Bụp giấm
4.2.1. Quy trình bào chế cốm Bụp giấm
Dạng bào chế được lựa chọn cho nguyên liệu bột sấy phun đài hoa Bụp
giấm là dạng cốm hòa tan, với ưu điểm tốc độ rã và hòa tan nhanh, dạng cốm
sẽ cho sinh khả dụng cao. Ngoài ra, dạng cốm còn có ưu điểm là dễ sử dụng
và dễ bào chế [35]. Bên cạnh đó, do BSP có khả năng hút ẩm rất cao và có vị
chua nên quá trình bào chế cần thêm tá dược hỗ trợ để điều vị và điều chỉnh
độ ẩm, giúp bảo quản lâu hơn và dễ uống hơn. Tá dược trong thuốc cốm có
thể là tá dược độn (saccharose, lactose, tinh bột…), tá dược dính (mật ong,
siro, dung dịch PVP…), tá dược tạo mùi, vị, tá dược tạo màu… Một số tá dược
đa năng có thể sử dụng trong điều chế thuốc cốm hòa tan như: (1) lactose, thu
được từ quá trình chế biến sữa động vật. Có 3 dạng lactose là lactose khan,
thích hợp cho xát hạt khô; lactose ngậm 1 phân tử nước, thích hợp cho xát hạt
ướt; lactose phun sấy, thích hợp cho viên nén dập thẳng. Lactose giúp làm rã,
giải phóng hoạt chất tốt, gần như không hút ẩm. Lactose nhạy cảm với nhiệt
và độ ẩm cao, đặc biệt có phản ứng với một số hoạt chất alkaloid hoặc có gốc
amin và một số người có thể không tiêu hóa được khi uống lactose do thiếu
men lactase ở ruột. (2) Mannitol, cho vị ngọt mát dễ chịu, hòa tan nhanh, thích
 117

hợp cho các dược chất dễ hư bởi ẩm. Ở RH = 90 %, mannitol chỉ hút ẩm
khoảng 1 %. Độ ngọt xấp xỉ 50 % sucrose và được xem là an toàn cho bệnh
nhân đái tháo đường [65]. Tá dược điều vị, nếu cần thiết, có thể sử dụng
aspartam, với độ ngọt gấp 180 – 200 lần sucrose, được chuyển hóa trong cơ
thể và có giá trị dinh dưỡng (1 g aspartam cung cấp 4 kcal). Trong thực tế, khi
sử dụng một lượng nhỏ aspartame thì cung cấp rất ít dinh dưỡng, do đó, có thể
sử dụng cho các đối tượng cần ăn kiêng [77].
Thuốc cốm thường được điều chế bằng hai phương pháp chính là
phương pháp xát hạt (xát hạt ướt hoặc xát hạt khô) và phương pháp phun sấy.
Phương pháp xát hạt khô thích hợp cho dược chất dễ hỏng bởi ẩm hoặc nhiệt
hoặc cả hai yếu tố này, cũng áp dụng trong trường hợp viên chứa hàm lượng
dược chất cao, khó áp dụng phương pháp dập trực tiếp. Phương pháp xát hạt
ướt rất thích hợp cho sản phẩm có hàm lượng hoạt chất thấp, liên kết giữa các
tiểu phần rắn để tạo thành hạt kết tụ là do tác động của tá dược dính lỏng. Sự
xát hạt ướt có thể được thực hiện bằng cách trộn tá dược dính dạng rắn vào
khối dược chất và các tá dược khác, sau đó, phun dung môi để tạo thành khối
ẩm hoặc phối hợp tá dược dính với dung môi để tạo thành tá dược dính lỏng
dạng dung dịch, hỗn dịch, khối nhão và dùng tá dược dính lỏng để làm ẩm
khối bột. Phương pháp phun sấy thường được áp dụng để điều chế cốm hòa
tan, cốm từ các dịch chiết dược liệu. Phương pháp phun sấy có ưu điểm là thời
gian làm khô nhanh, do đó, thích hợp với những dược chất nhạy cảm với nhiệt
[8], [35].
Phương pháp bào chế bột sấy phun của đài hoa Bụp giấm thành dạng
cốm được khảo sát ở cả quy trình xát hạt khô và xát hạt ướt với tá dược thích
hợp nhằm tìm ra dạng cốm vừa tiện dụng nhưng cũng phải có khả năng đưa
vào sản xuất ở các quy mô khác nhau, phục vụ mục tiêu thương mại hóa ở các
dự án kế tiếp. Với kết quả thu được trong nghiên cứu này, quy trình bào chế
cốm Bụp giấm bằng phương pháp xát hạt ướt đã được lựa chọn, quy trình giúp
 118

thỏa mãn các yêu cầu đề ra về điều kiện bào chế, đặc tính của chế phẩm và
yêu cầu bảo quản. Bước tiếp theo trong nghiên cứu là xây dựng tiêu chuẩn cơ
sở của cốm Bụp giấm về các chỉ tiêu: Cảm quan, độ ẩm, độ tan, định tính, định
lượng hoạt chất và tiến hành đánh giá độ ổn định của cốm Bụp giấm theo quy
định. Các kết quả nghiên cứu này sẽ giúp đánh giá chất lượng của chế phẩm
cốm Bụp giấm và giúp xác định mức độ ảnh hưởng của các tác nhân (nhiệt độ,
độ ẩm, …) trong quá trình bảo quản (nếu có) trước khi tiến hành các nghiên
cứu tiếp theo.

4.2.2. Tiêu chuẩn cơ sở của cốm Bụp giấm

Các sản phẩm bào chế hướng đến việc sử dụng làm thuốc hoặc hỗ trợ
điều trị bệnh thì nhất thiết phải được xây dựng tiêu chuẩn chất lượng. Đây
được xem như là chỉ dấu quan trọng trong việc đánh giá chất lượng sản phẩm,
xác định liều lượng sử dụng, cũng như làm cơ sở cho các lô sản xuất tiếp theo
và cho các nghiên cứu trên sản phẩm sau này.
Trong nghiên cứu này, cốm Bụp giấm được xây dựng các tiêu chuẩn
cơ sở theo tiêu chuẩn của một dạng cốm hòa tan sử dụng đường uống và theo
hướng dẫn của dược điển Việt Nam V [2], đây được xem như là tài liệu có
tính pháp lý và có giá trị cao nhất hiện nay. Đặc biệt, chỉ tiêu định lượng hoạt
chất được chú trọng trong quá trình thực hiện. Hoạt chất được lựa chọn để
định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong cốm
Bụp giấm là delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid, đây
là hai anthocyanin chính trong đài hoa Bụp giấm đã được các nghiên cứu công
bố [34]. Hàm lượng anthocyanin, cụ thể là delphinidin-3-O-sambubiosid và
cyanidin-3-O-sambubiosid có vai trò rất quan trọng và quyết định tác dụng
của sản phẩm. Dự đoán này là dựa theo cơ chế tác dụng và các công bố của
các tác giả trước về vai trò của anthocyanin trong Bụp giấm liên quan đến tác
dụng dược lý đã khảo sát [34], [94]. Theo các nghiên cứu đã được công bố,
trừ dòng Senegalese, các dòng Bụp giấm khác nhau được thu thập đều có chứa
 119

hai anthocyanin quan trọng là delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-

sambubiosid, lượng anthocyanin toàn phần đạt từ 1,7% đến 2,5% tùy các
giống trồng ở các nước và vùng thổ nhưỡng khác nhau [23]. Theo công bố của
Fakeye và cộng sự (2009), hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết nước là
3,22 mg/g. Đồng thời, delphinidin và cyanidin là hai anthocyanin chính trong
đài hoa Bụp giấm, chiếm gần 71% và 29% [105].
Kết quả định lượng cốm Bụp giấm cho thấy, trong gói cốm Bụp giấm
2 g có chứa 2,47 mg delphinidin-3-O-sambubiosid (chiếm 79% trên tổng hai
loại anthocyanin) và 0,67 mg cyanidin-3-O-sambubiosid (chiếm 21% trên
tổng hai loại anthocyanin). Quy đổi từ công thức bào chế và hiệu suất chiết,
trong 2 g cốm Bụp giấm có chứa 0,15 g bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm,
tương đương 0,75 g đài hoa khô. Như vậy, hàm lượng hai anthocyanin chính
trong đài hoa Bụp giấm sử dụng trong nghiên cứu dự đoán là khoảng 4,18
mg/g. Kết quả cho thấy, hàm lượng anthocyanin trong sản phẩm cốm Bụp
giấm cao, tỷ lệ hai anthocyanin chính khá tương đồng với nghiên cứu khác
[105], chứng tỏ phương pháp chiết xuất cho hiệu suất cao và ít làm ảnh hưởng
đến hoạt chất, chất lượng nguyên liệu đầu vào tốt. Đồng thời, khẳng định thêm
cho kết quả trước về mức liều cho tác dụng dược lý của BSP. Đồng thời, kết
quả thẩm định quy trình định lượng đồng thời delphinidin-3-O-sambubiosid
và cyanidin-3-O-sambubiosid bằng phương pháp HPLC trong cốm Bụp giấm
theo hướng dẫn [64] cũng cho thấy phương pháp đã sử dụng là tin cậy và đạt
yêu cầu. Quy trình này có thể được sử dụng để định lượng anthocyanin trong
các chế phẩm khác.
Các chỉ tiêu khác của cốm Bụp giấm (cảm quan, độ ẩm, độ hòa tan, …)
đều đạt theo yêu cầu của một dạng cốm hòa tan, theo quy định của dược điển
Việt Nam V. Như vậy, sản phẩm cốm từ bột sấy phun đài hoa Bụp giấm đã
đạt các yêu cầu cơ bản của một chế phẩm sử dụng trên người và có triển vọng
để thực hiện các nghiên cứu kế tiếp trên lâm sàng.
 120

4.2.3. Độ ổn định của cốm Bụp giấm

Mục tiêu của nghiên cứu độ ổn định là đánh giá các yếu tố có thể ảnh
hưởng đến chất lượng của sản phẩm và xác định tuổi thọ của sản phẩm. Tuổi
thọ của sản phẩm là khoảng thời gian tính từ khi sản phẩm được sản xuất đến
khi còn giữ được những chỉ tiêu chất lượng đã được quy định của tiêu chuẩn
chất lượng trong điều kiện bảo quản xác định (quy định của Bộ Y Tế). Độ ổn
định là một yếu tố quan trọng của chất lượng, độ an toàn và hiệu lực của chế
phẩm thuốc. Một thành phẩm thuốc không ổn định có thể gây ra các biến đổi
về mặt vật lý (như độ cứng, tốc độ hoà tan, sự tách pha, ...) cũng như các biến
đổi về đặc tính hoá học (sự hình thành các chất phân huỷ có nguy hại cao). Do
đó, trong nghiên cứu này, chế phẩm cốm Bụp giấm sau khi được bào chế ở 3
lô nghiên cứu, được lấy mẫu để xác định độ ổn định ở cả hai điều kiện là bảo
quản thường và lão hóa cấp tốc.
Kết quả thu được cho thấy, ở điều kiện lão hóa cấp tốc, hoạt chất
anthocyanin nhanh chóng bị phân hủy, sau 3 tháng, anthocyanin bị phân hủy
hoàn toàn, đồng thời, hình thức cảm quan cũng bị biến đổi. Nguyên nhân là
do đặc tính cấu trúc của các anthocyanin là các phân tử cực với các nhóm
hydroxyl, carboxyl, methoxyl và glycolyl liên kết với vòng thơm, rất dễ bị tác
động bởi nhiệt độ và ẩm độ. Anthocyanin là hợp chất gồm có gốc aglycon có
màu (được gọi là anthocyanidin hay anthocyanidol) kết hợp với các glucosid
có gốc đường glucose, galactose… Anthocyanin hòa tan trong nước và tham
gia vào việc tạo nên đa sắc màu cho hoa quả. Đồng thời cùng với chất tạo màu
khác như clorophin, carotenoid để tạo cho hoa quả có cường độ màu khác
nhau tùy thuộc vào hàm lượng và số đồng phân của chúng. Do đó, khi
athocyanin bị phân hủy thì màu sắc cảm quan của cốm Bụp giấm cũng biến
đổi theo [7]. Như vậy, đối với chế phẩm cốm Bụp giấm cần phải đánh giá độ
ổn định ở điều kiện thường.
 121

Sau 12 tháng bảo quản ở nhiệt độ thường, trong bao bì kín, hoạt chất
anthocyanin và hình thức cảm quan của cốm Bụp giấm vẫn duy trì trong giới
hạn cho phép, do đo, có thể dự đoán tuổi thọ của thuốc là khoảng 15 tháng
theo hướng dẫn của ASEAN về nghiên cứu độ ổn định của thuốc. Tuy nhiên,
do giới hạn về điều kiện nghiên cứu nên trong nghiên cứu này chưa đánh giá
được chất lượng cốm Bụp giấm duy trì thực tế sau 15 tháng, 18 tháng, 24
tháng, … đây cũng là một trong những điểm hạn chế của nghiên cứu. Vấn đề
này cần được lưu ý thực hiện bổ sung trước khi sản xuất chế phẩm.
4.3. Tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển
hóa lipid

Theo các nghiên cứu đã được công bố, dịch chiết Bụp giấm có khả năng
làm giảm LDL, triglycerid, cholesterol toàn phần và cả VLDL. Đồng thời, làm
giảm sự peroxid hóa lipid trên in vivo. Tác dụng làm giảm LDL có liên quan
đến sự ức chế tổng hợp hoặc thông qua khả năng chống oxy hóa giúp chống
lại sự phá hủy do quá trình oxy hóa LDL và sự thanh thải LDL ở gan với vai
trò của các polyphenol [34], [94], [101]. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của
Edgar Vinicio Villalpando – Arteaga và các cộng sự (2013), dịch chiết nước
đài hoa Bụp giấm với thành phần chính là các anthocyanin (delphinidin-3-O-
sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid) làm giảm tình trạng gan nhiễm
mỡ thông qua cơ chế điều hòa PPAR-γ và SREBP-1c [96]. Theo nghiên cứu
Qionghua Long và các cộng sự (2021), delphinidin-3-O-sambubiosid (Dp3-
sam) từ Hibiscus sabdariffa L. cho thấy tác dụng làm giảm chứng tăng lipid
máu ở chuột cống gây ra bởi chế độ ăn và làm giảm gan nhiễm mỡ trên tế bào
HepG2. Dp3-Sam làm giảm nồng độ triglycerid nội bào và tích tụ lipid trong
các tế bào HepG2 được xử lý bằng axit oleic , điều chỉnh giảm sự biểu hiện
mRNA của HMG-CoA reductase (HMGCR), sterol protein liên kết yếu tố
điều hòa-1 c (SREBP-1c), acid béo tổng hợp (FASN) và acetyl-CoA
carboxylase (ACC), điều chỉnh sự biểu hiện mRNA của cholesterol 7α-
 122

hydroxylase (CYP7A1), carnitine palmitoyltransferase1 (CPT1), acyl-

coenzyme A oxidase (ACOX) và thụ thể alpha được kích hoạt bởi peroxisome
(PPARα). Dp3-Sam đã khôi phục lại tỷ lệ pAMPK / AMPK so với mức bình
thường, cho thấy Dp3-Sam có khả năng ức chế sự hình thành lipid ở gan thông
qua việc kích hoạt tín hiệu con đường AMPK [63]. Mặt khác, các nghiên cứu
tiền đề của nhóm tác giả cũng đã cho thấy tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu
và bảo vệ gan của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm qua cơ chế chống oxy hóa
[9], [10], [11]. Các kết quả nghiên cứu trên đã cho phép dự đoán cơ chế điều
hòa lipid máu của cốm Bụp giấm là tác động trên quá trình tổng hợp lipid và
quá trình thanh thải lipid ở gan. Để hiểu rõ hơn về cơ chế của cốm Bụp giấm
trước khi thực hiện các nghiên cứu dược lý trên động vật, nghiên cứu đánh giá
tác động của cốm Bụp giấm trên một số gen quan trọng trong quá trình chuyển
hóa lipid đã được tiến hành.

Quá trình tổng hợp cholesterol ở gan có từ hai nguồn, nguồn thứ nhất
là tổng hợp từ acetyl coA với vai trò rất quan trọng của HMG CoA reductase,
nguồn thứ hai là từ LDL trong huyết tương với vai trò của LDL receptor
(LDLR) [44]. LDLR là một glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 160
kDa, có trên bề mặt của hầu hết tế bào trong cơ thể, nơi có mật độ LDLR cao
nhất là tế bào tuyến thượng thận và nơi có số lượng LDLR cao nhất là tế bào
gan. Do đó, 2/3 số lượng LDL được thanh lọc ở gan. Số lượng LDLR tùy
thuộc vào số lượng LDL lưu hành trong máu, nếu LDL cao thì số lượng LDLR
tăng và ngược lại [91]. LDL trong tuần hoàn được thanh thải khỏi tuần hoàn
bằng cách gắn kết với một thụ thể đặc biệt là LDLR. Khi LDLR gắn kết với
LDL trên bề mặt của màng tế bào, phức hợp này sẽ được nội bào hoá. Khi
không có mặt của PCSK9, LDL sẽ phân ly khỏi thụ thể của nó và bị thoái
giáng trong tiêu thể. LDLR sẽ được đưa trở lại màng tế bào để tiếp tục vận
chuyển LDL-c. Bằng cách tái sử dụng các LDLR này, LDL được thanh thải
khỏi huyết tương và làm giảm LDL trong tuần hoàn. Quá trình tái sử dụng
 123

LDLR bị giảm khi có sự hiện diện của PCSK-9, dẫn đến làm tăng cholesterol
máu có ý nghĩa. Khi PCSK-9 liên kết với LDLR, phức hợp PCSK-9-LDLR-
LDL được nội bào hoá. Tuy nhiên, liên kết chặt giữa PCSK-9 và LDLR ngăn
không cho giải phóng LDLR khỏi PCSK-9, và LDLR không thể quay trở lại
màng tế bào được. Vì LDLR vẫn liên kết với PCSK-9, nó được vận chuyển
đến lysosom để thoái giáng. Việc giảm nồng độ LDLR trên màng tế bào gây
tăng nồng độ LDL trong huyết tương và hình thành nên tình trạng tăng
cholesterol máu [55].

Cũng như các gen trung gian trong quá trình chuyển hoá lipid, biểu hiện
của LDLR được điều hoà phức tạp ở cả hai cấp độ là phiên mã và hậu phiên
mã. Cholesterol và các dẫn xuất của nó, cũng như các yếu tố không sterol
khác, bao gồm các háo chất trung gian gây viêm, yếu tố tăng trưởng, và một
số hormone khác, glucose và các chất chuyển hoá khác có thể điều hoà biểu
hiện của LDLR. Các SREBP là yếu tố chính điều hoà phiên mã gen LDLR.
Các SREBP này tương tác với yếu tố điều hoà sterol (SRE), hiện diện trong
vùng khởi động của gen mã hoá LDLR và các gen khác mã hoá cho các protein
liên quan đến sinh tổng hợp và hấp thu lipid, như LDLR, HMGR và acetyl
coenzyme A synthetase. SREBP có ba đồng dạng là SREBP-1a, SREB1c và
SREBP-2. Trong đó, SREBP-2 là yếu tố khởi động chính của gen LDLR. Khi
tế bào có nhiều cholesterol và các dẫn xuất của nó, vùng nhạy càm sterol
(sterol-sensing domain, SSD) của SCAP sẽ liên kết với sterol, dẫn đến thay
đổi và gắn kết SREBP/SCAP với Insig1 hoặc Insig2 (insulin induced gene)
trên màng lưới nội chất. Sự hình thành phức hợp SREBP/SCAP/Insig trên
màng lưới nội chất làm giảm việc SREBP di chuyển đến bộ máy Golgi để
phân cắt, do đó ức chế sự phiên mã của gen LDLR và các gen khác cần thiết
cho tổng hợp lipid. Hậu quả là tế bào không thể hình thành và hấp thu
cholesterol, từ đó tạo ra sự hằng định nội môi cholesterol. Ngược lại, khi sterol
nội bào thấp, SCAP phân ly khỏi Insig, cho phép phức hợp SREBP/SCAP
 124

chuyển đến bộ máy Golgi. Tại bộ máy Golgi, tiền chất SREBP được phân cắt
bởi protease S1P và S2P, thành sản phẩm có trọng lượng 68kDa, gọi là
nSREBP, trong khí đó SCAP trở lại lưới nội chất để được tái sử dụng. nSREBP
gắn với các gen đích của nó và hoạt hoá sự phiên mã trong nhân tế bào. Sau
đó, nồng độ cholesterol nội bào được tăng lên và quay trở về tình trạng bình
thường [103]. Khi chế độ ăn chứa một lượng cholesterol thấp, nồng độ
cholesterol trong gan giảm, SREBP-2 vào trong nhân để hoạt hóa gen LDLR,
gen HMG CoA reductase và một số gen khác cần thiết cho quá trình tổng hợp
cholesterol. Khi chế độ ăn chứa lượng cholesterol cao thì sẽ làm tăng lượng
cholesterol trên màng lưới nội chất tế bào gan (như trong mô hình gây rối loạn
lipid máu bằng chế độ ăn giàu lipid), việc này sẽ làm khóa chu trình SREBP,
làm giảm LDLR, dẫn đến tăng LDL trong huyết tương [89]. Lúc này, vai trò
của một chất điều hòa lipid máu là sẽ giúp làm giảm lượng LDL trong huyết
tương thông qua việc làm tăng LDLR. Mặt khác, nếu lượng cholesterol tích
lũy trong gan cao sẽ hình thành các giọt lipid và gây tổn hại đến tế bào gan,
như vậy lúc này cần có cơ chế thúc đẩy sự thanh thải LDL, đồng thời bảo vệ
tế bào gan trước tác động của quá trình này (một tác dụng đã được công bố
của Bụp giấm [94]).

AMPK phosphoryl hoá và ức chế các men, bao gồm acetyl CoA
carboxylase 1 (ACC1) và hydroxymethylglutaryl CoA reductase (HMGCR).
Các men ACC1/ACC2 và HMGCR là các bước giới hạn tốc độ trong quá trình
tổng hợp acid béo và cholesterol. Đặc biệt quan trọng là ACC1/ACC2 cần
thiết cho sự carboxyl hoá của acetyl CoA thành malonyl CoA. Malonyl CoA
sau đó lại ức chế carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1), một men thiết yếu
cho sự hoạt hoá các acid béo chuỗi dài để đưa vào trong ty thể trong quá trình
chuyển hoá thông qua con đường beta oxy hoá. Quá trình này dẫn đến tăng
tổng hợp ATP. Do đó, ức chế ACC1 bởi AMPK sẽ làm tăng hoạt tính của
CPT1, dẫn đến làm tăng cường sự beta oxy hoá và tổng hợp ATP. Hơn nữa,
 125

ức chế sự carboxyl hoá acetyl CoA thành malonyl CoA bởi AMPK, làm gián
đoạn quá trình tổng hợp acid béo. Tương tự, trong quá trình phosphoryl hoá,
HMGCR bị bất hoạt và dẫn đến giảm tổng hợp cholesterol bằng cách làm giảm
quá trình chuyển HMGCoA thành mevalonat. AMPK cũng cho thấy ức chế
tổng hợp acid béo bằng cách ức chế hoạt tính của sterol regulatory element-
binding protein-1 (SREBP1). SREBP1 là yếu tố phiên mã làm tăng biểu hiện
của các men fatty acid synthase (FASN) và ACC1. Cả hai men trên đóng vai
trò quan trọng trong tổng hợp acid béo, và với việc AMPK làm ức chế
SREBP1, sẽ dẫn đến ức chế biểu hiện của FASN và ACC1. Các tác động này
dẫn đến việc giảm tổng hợp acid béo, một quá trình cần phải có sự thuỷ phân
nhờ ATP [92].

Trong nghiên cứu này, để khảo sát cơ chế tác dụng của cốm Bụp giấm
đến quá trình chuyển hóa lipid, các gen được đưa vào khảo sát là những gen
đóng vai trò quan trọng và có liên quan mật thiết với nhau trong chu trình,
gồm có HMGCoA reductase, SREBP-1, SREBP-2, LDLR và AMPK. Kết quả
khảo sát kiểm tra sự bắt cặp của mồi ở các nhiệt độ khác nhau và điện di khảo
sát các gen cho thấy xuất hiện các vạch mục tiêu ở cặp mồi của HMGCoA
reductase, LDLR, SREBP-2 và AMPK, không xuất hiện vạch mục tiêu của
SREBP-1, có thể do SREBP-1 gồm 2 đồng phân 1a và 1c nên mồi thiết kế
chưa đặc hiệu, gen này cần được xem xét khảo sát trong các nghiên cứu tiếp
theo. Khảo sát đường cong nóng chảy của các gen HMGCoA reductase,
LDLR, SREBP-2 và AMPK đều chỉ xuất hiện một đỉnh nóng chảy. Đồng thời,
các gen cũng đã được giải trình tự và so sánh trên ngân hàng của gen (phụ lục
3). Các kết quả này cho thấy, có thể sử dụng các gen này để đánh giá cảm ứng
gen của cốm Bụp giấm (BG), đối chiếu là Lipistad (atorvastatin) (LP). Đồng
thời, nghiên cứu cũng sử dụng thêm một mẫu phối hợp BG và LP để đánh giá
tác dụng hiệp đồng của hai thuốc này. Atorvastatin là một chất ức chế
HMGCoA reductase thuộc nhóm statin, đã được chứng minh tác dụng điều trị
 126

rối loạn lipid máu vào năm 1987 [20]. Về cơ chế, atorvastatin (và statin nói
chung) là chất ức chế cạnh tranh của HMGCoA reductase, dẫn đến giảm tổng
hợp cholesterol trong gan, từ đó làm giảm cholesterol trong lưới nội chất, dẫn
đến sự vận chuyển của SREBP từ lưới nội chất sang bộ máy Golgi, nơi chúng
bị phân tách bởi protease thành các yếu tố phiên mã hoạt động. Cơ chế này
làm tăng biểu hiện của một số gen bao gồm HMGCoA reductase và LDLR
[41]. Như vậy, chất đối chứng atorvastatin sẽ làm tăng biểu hiện của gen
SREBP-2, HMGCoA reductase và LDLR (phù hợp với kết quả trong nghiên
cứu này).
Kết quả nghiên cứu cho thấy, so với mẫu đối chứng, mẫu cốm BG ở
nồng độ 1000 µg/mL sau 24 giờ cảm ứng gen, làm tăng biểu hiện LDLR 0,87
lần, tăng biểu hiện SREBP-2 0,88 lần, giảm biểu hiện HMGCoA 0,08 lần, tăng
biểu hiện AMPK 0,11 lần. Sau 48 giờ, so với mẫu đối chứng, mẫu cốm BG ở
nồng độ 1000 µg/mL làm tăng biểu hiện LDLR 1,22 lần, tăng biểu hiện
SREBP-2 1,53 lần, giảm biểu hiện HMGCoA 0,28, tăng biểu hiện AMPK 0,52
lần. Như vậy, cơ chế điều hòa lipid máu (thu nhận LDL) của cốm Bụp giấm
là thông qua cơ chế làm tăng biểu hiện của LDLR, thông qua yếu tố điều hòa
phiên mã SREBP-2 và có vai trò của AMPK. Bên cạnh đó, so với mẫu đối
chứng, mẫu phối hợp BG + LP ở nồng độ 250/2,5 µg/mL sau 24 giờ cảm ứng
gen, làm tăng biểu hiện LDLR 0,37 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 3,72 lần,
tăng biểu hiện HMGCoA 0,41 lần, tăng biểu hiện AMPK 2,34 lần. Sau 48 giờ,
mẫu phối hợp BG + LP ở nồng độ 250/2,5 µg/mL làm tăng biểu hiện LDLR
2,51 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 2,03 lần, tăng biểu hiện HMGCoA 0,85,
tăng biểu hiện AMPK 0,16 lần. Như vậy, atorvastatin và cốm Bụp giấm có tác
động hiệp đồng lên các gen có vai trò trong quá trình điều hòa lipid máu. Kết
quả cho thấy khả năng có lợi khi phối hợp cốm Bụp giấm và atorvastatin trong
việc điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm tăng biểu hiện
của SREBP-2, từ đó hoạt hóa tăng tổng hợp LDLR để bắt giữ các LDL trong
 127

huyết tương, làm giảm nồng độ LDL lưu thông trong máu. Bên cạnh đó, khả
năng bảo vệ gan của Bụp giấm cũng sẽ giúp giảm các tác dụng có hại của
statin lên chức năng gan khi sử dụng dài ngày.
4.4. Tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu và dự phòng gan nhiễm
mỡ không do rượu của cốm Bụp giấm

4.4.1. Tác dụng điều hoà lipid máu

Dựa trên cơ sở là kết quả của các nghiên cứu tiền đề, tác dụng của dịch
chiết đài hoa Bụp giấm lên quá trình chuyển hóa lipid và quá trình thanh thải
lipid ở gan, cùng với kết quả khảo sát tác động của cốm Bụp giấm lên các gen
LDLR, SREBP-2, AMPK. Cốm Bụp giấm được đánh giá tác dụng điều hòa
lipid máu với mức liều là 400 mg/kg chuột (tương ứng với 1 gói cốm 2 g/
người), trên cả hai mô hình đặc trưng trên động vật thí nghiệm là gây rối loạn
lipid máu nội sinh bằng tyloxapol và ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu lipid [13].
Tuy nhiên, điểm mới trong nghiên cứu này là đã đánh giá được cả tác dụng dự
phòng và tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm trên chuột
nhắt trắng.
Đối với mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh, chuột nhắt sau khi
tiêm phúc mô tyloxapol 6 giờ (thời điểm nồng độ lipid, đặc biệt là triglycerid
tăng cao) được lấy máu đuôi để định lượng triglycerid và chỉ những chuột nào
có nồng độ triglycerid máu tăng 3 – 5 lần so với ban đầu mới được đưa vào
trong nghiên cứu. Nồng độ triglycerid của các chuột giữa các lô nghiên cứu
trước khi cho uống thuốc phải khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê. Bước
chuẩn bị này giúp khắc phục các sai số có thể xảy ra do sự tăng triglycerid /
lipid máu không đồng đều giữa các chuột sau khi tiêm tyloxapol. Ngay sau
đó, chuột được cho sử dụng cốm Bụp giấm và thuốc đối chứng fenofibrat để
điều trị và lấy máu xét nghiệm, đánh giá các thông số lipid máu sau 48 giờ
tiêm tyloxapol (thời điểm các chỉ số lipid vẫn tăng có ý nghĩa nếu không được
điều trị) [99]. Đồng thời, một lô bệnh lý không được điều trị được tiến hành
 128

song song để đảm bảo mô hình vẫn có ý nghĩa sau 48 giờ tiêm tyloxapol và
giúp kiểm soát các yếu tố phòng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, so
với lô bệnh lý không được điều trị, cốm Bụp giấm với liều 400 mg/kg đã làm
giảm cholesterol toàn phần 12%, tăng HDL 51% và giảm LDL 53%. Tuy
nhiên, cả fenofibrat và cốm Bụp giấm đều không làm giảm triglycerid có ý
nghĩa thống kê. Như vậy, cốm Bụp giấm có tác dụng điều hòa lipid máu trên
mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh nhưng không có tác dụng giảm
triglycerid cấp.
Mô hình gây rối loạn lipid máu ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu lipid sử
dụng cholesterol kết hợp với acid cholic trong dầu thực vật để làm rối loạn
lipid máu. Cơ chế của mô hình này gồm hai cơ chế chính, đầu tiên, chế độ ăn
có bổ sung cholesterol dư thừa làm tăng lượng cholesterol trên màng lưới nội
chất tế bào gan, làm khóa chu trình SREBP, giảm LDLR nên làm tăng LDL
trong huyết tương [89]. Cơ chế thứ hai là nhờ sự hiện diện của acid cholic đã
làm tăng sự hấp thu cholesterol, đồng thời làm giảm sự tổng hợp acid mật từ
lượng cholesterol tự do. Cholesterol tự do dư thừa sẽ được ester hóa để dự trữ
dưới dạng những giọt nhỏ. Khi đó, LDLR bị thoái hóa để tránh trường hợp
quá tải cho tế bào gan. Cơ chế này dẫn đến sự tăng cholesterol và LDL trong
huyết tương [67]. Đối với mô hình này, chất đối chứng được sử dụng phù hợp
là atorvastatin (một statin có tác dụng trung bình) với cơ chế làm tăng cảm
ứng LDLR và ức chế cạnh tranh HMG-CoA reductase (enzym giúp tổng hợp
cholesterol tại gan) [41]. Mô hình ngoại sinh này được thiết kế làm hai mô
hình để đánh giá tác dụng điều trị và tác dụng dự phòng rối loạn lipid máu của
thuốc, tuy nhiên, vẫn dựa trên nguyên tắc chung về cơ chế. (1) Đối với mô
hình đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lipid máu, chuột thử nghiệm được cho
uống dung dịch giàu lipid trong 8 tuần, sau đó, chuột được lấy máu xét nghiệm
lipid máu (4 thông số) để đảm bảo đã gây tình trạng rối loạn lipid cho chuột
thử nghiệm. Chuột được phân bố vào các lô và tiến hành điều trị bằng
 129

atorvastatin hoặc cốm Bụp giấm trong vòng 1 tuần. Một lô chuột không điều
trị vẫn được nuôi dưỡng song song để đảm bảo mô hình vẫn duy trì thành công
và kiểm soát các yếu tố phòng thí nghiệm. Ưu điểm của mô hình là đã loại bỏ
được các yếu tố có thể ảnh hưởng đến mức độ gây bệnh ban đầu của chuột thí
nghiệm, từ đó là nhiễu kết quả điều trị. Tuy nhiên, điểm hạn chế của mô hình
này là thời gian điều trị ngắn (1 tuần), đồng thời, chuột vẫn có khả năng tự
phục hồi, nên chưa đánh giá được đầy đủ tác dụng của thuốc. Kết quả nghiên
cứu trên mô hình này cho thấy, sau 1 tuần điều trị, lô điều trị bằng cốm BG
400 mg/kg có nồng độ triglycerid giảm (p = 0,0063), nồng độ HDL tăng (p =
0,0033) so với lô bệnh lý. Thông số LDL cho thấy sự khác biệt không có ý
nghĩa thống kê giữa các lô, kể cả điều trị bằng atorvastatin. (2) Về tác dụng
dự phòng, cũng trên mô hình gây rối loạn lipid máu bằng chế độ ăn nhưng
chuột thử nghiệm được sử dụng cốm Bụp giấm hoặc atorvastatin cùng lúc để
dự phòng trong 6 tuần. Kết quả cho thấy, cốm Bụp giấm sử dụng liều 400
mg/kg đã làm giảm cholesterol toàn phần 28% và giảm LDL 56%. Kết quả
này hoàn toàn phù hợp với cơ chế làm tăng LDLR đã khảo sát trước đó và các
nghiên cứu đã công bố.
Theo báo cáo tổng hợp về tác dụng của Bụp giấm năm 2014 của Ines
Da-costa-Rocha và cộng sự đã được công bố, nhiều nghiên cứu đã chứng minh
dịch chiết Bụp giấm có khả năng làm giảm lipid, giúp phòng ngừa những bệnh
lý trên tim mạch. Các dịch chiết Bụp giấm có thể làm giảm LDL, triglycerid,
cholesterol toàn phần và sự peroxid hóa lipid trên in vivo. Một vài nghiên cứu
còn cho thấy Bụp giấm làm giảm VLDL cùng với sự tăng nồng độ trong huyết
tương của HDL [34]. Như vậy, kết quả nghiên cứu chính thu được trong
nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng với những báo cáo trước đó. Có thể
khẳng định, các tá dược sử dụng trong công thức và quy trình bào chế cốm
Bụp giấm không làm ảnh hưởng đáng kể lên tác dụng điều trị rối loạn lipid
máu của Bụp giấm. Đồng thời, kết quả nghiên cứu cũng đóng góp thêm một
 130

thông tin mới về cơ chế của Bụp giấm tác động lên sự biểu hiện của gen
SREBP-2 và LDLR là cơ chế chính làm giảm LDL trong huyết tương. Bên
cạnh đó, cơ chế làm giảm triglycerid máu của Bụp giấm cũng cần được quan
tâm trong những nghiên cứu tiếp theo. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy, tác
dụng của cốm Bụp giấm trong điều trị rối loạn lipid máu có hiệu quả gần giống
thuốc đối chứng fenofibrat và atorvastatin. Điều này mở ra khả năng sử dụng
phối hợp cốm Bụp giấm với các thuốc này để giảm liều hoặc tăng hiệu quả
điều trị, hoặc trong trường hợp sử dụng liều tối đa dung nạp, nhằm hạn chế
các tác dụng có hại (đặc biệt là trên gan) của các nhóm thuốc tân dược trên
bệnh nhân rối loạn lipid máu.

4.4.2. Tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ

Một trong những bệnh lý là hậu quả của rối loạn lipid máu kéo dài là
bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD) mà kết cục của nó có thể dẫn
đến xơ gan, ung thư gan và tử vong với tỷ lệ ngày càng cao. Mặc dù các hiểu
biết về yếu tố nguy cơ và sinh lý bệnh của NAFLD đã tăng lên, một số phương
pháp điều trị được phát triển, tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có phác đồ điều trị
NAFLD bằng thuốc được công nhận. Thuốc điều trị rối loạn lipid máu được
xem là một trong những lựa chọn ưu tiên vì nó có khả năng điều hòa được
lượng lipid trong huyết tương và trong gan, do đó, làm giảm tình trạng gan
nhiễm mỡ. Tuy nhiên, việc lựa chọn nhóm thuốc nào để cho tác dụng tốt nhất
mà không gây hại cho gan cần được nghiên cứu thêm vì một số nghiên cứu
cho thấy một vài tác nhân làm giảm lipid máu thành công trong việc cải thiện
tình trạng rối loạn lipid máu nhưng lại làm tích lũy mỡ ở gan và làm trầm trọng
thêm tình trạng gan nhiễm mỡ [49]. Như vậy, việc tiến hành nghiên cứu những
thuốc tiềm năng vừa có tác dụng điều trị rối loạn lipid máu, vừa có khả năng
bảo vệ gan hoặc đồng thời có tác dụng bảo vệ tế bào, chống dung nạp insulin,
... trên mô hình gây NAFLD ở động vật đã trở nên rất cấp thiết. Những nghiên
 131

cứu này sẽ mở rộng khả năng điều trị NAFLD, mang lại lợi ích đáng kể cho
bệnh nhân.
Mô hình được sử dụng để gây tình trạng gan nhiễm mỡ không do rượu
được phát triển từ mô hình gây rối loạn lipid ngoại sinh bằng chế độ ăn có bổ
sung cholesterol và acid cholic. Bên cạnh đó, chế độ ăn được bổ sung thêm
dầu dừa 20 ml/kg, một loại dầu thực vật có chứa hàm lượng lớn chất béo bão
hòa (phụ lục thành phần dầu dừa). Chế độ ăn này làm thúc đẩy nhanh chóng
quá trình tích lũy các giọt cholesterol dư thừa trong tế bào gan và làm quá tải
tê bào gan gây tổn thương tế bào [67]. Gan đóng vai trò vô cùng quan trọng
trong điều hòa nồng độ lipid trong huyết tương thông qua sự thanh thải LDL
và sự giải phóng HDL. Tuy nhiên, lượng lipid hấp thu tác động lên thành phần
chất béo trong gan và trở thành gánh nặng cho chức năng gan. Mức độ xâm
nhập của chất béo vào gan liên quan đến sự phát triển tiếp theo của tình trạng
hoại tử, viêm gan, xơ gan, có thể dẫn đến ung thư gan [67], [101]. Điều này
giải thích cho việc béo phì gây ra cả tình trạng xơ gan và sự hóa ứng động tế
bào lympho ở gan, tuy nhiên, chỉ số gan nhiễm mỡ có liên quan một cách độc
lập với yếu tố viêm cytokin IL-6 và TNF-α. Chứng cứ này cho thấy rằng, sự
điều hòa quá trình chuyển hóa lipid của gan cần được quan tâm để phòng ngừa
rối loạn lipid máu và những bệnh đi kèm [67], [97].
Dịch chiết nước Bụp giấm đã được chứng minh làm giảm gan nhiễm
mỡ thông qua cơ chế điều hòa PPAR-γ và SREBP-1c [96]. Với SREBP-1c
được biểu hiện chủ yếu ở gan nơi nó hoạt hóa sự tổng hợp acid béo đáp ứng
với insulin, do đó, đóng góp vào tình trạng gan nhiễm mỡ do đái tháo đường
type 2 [54]. Bên cạnh đó, dịch chiết đài hoa Bụp giấm cũng được chứng minh
về tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào và giảm glucose ở chuột
đái tháo đường [34]. Những dữ kiện này cho thấy tiềm năng sử dụng cốm Bụp
giấm trong dự phòng/điều trị bệnh lý gan nhiễm mỡ và kết quả trong nghiên
cứu này góp phần giúp phát triển chế phẩm thêm một hướng mới. Cốm Bụp
 132

giấm sử dụng ở liều 400 mg/kg trong 4 tuần đã làm giảm LDL 58%, trong khi
HDL tăng 25%, đồng thời, giúp AST giảm 20% so với lô bệnh lý có ý nghĩa
thống kê. Đặc biệt, mức độ thoái hóa mỡ không bào nhỏ giảm 1%.
4.5. Độc tính của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt

4.5.1. Độc tính cấp của cốm Bụp giấm

Kết quả nghiên cứu cho thấy, cốm Bụp giấm với thành phần chính là
bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm không thể hiện độc tính cấp đường uống
với liều tối đa có thể bơm qua đầu kim để cho chuột uống là 15 g/kg, tương
đương với 75 g/người 60 kg (gấp 32,5 lần liều dự kiến sử dụng hàng ngày là
2 g cốm). Cốm Bụp giấm sử dụng trong thử nghiệm có độ an toàn khá cao
trên động vật thử nghiệm và có Dmax = 15 g/kg. Kết quả này tương đồng với
các nghiên cứu trước đã công bố về độc tính cấp của dịch chiết nước đài hoa
Bụp giấm khi không tìm được LD50 sử dụng đường uống. LD50 sử dụng đường
tiêm phúc mô là khoảng trên 5000 mg/kg cân nặng [34].

4.5.2. Độc tính bán trường diễn

Cốm Bụp giấm sử dụng trong nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến
lượng thức ăn, nước uống tiêu thụ ở chuột và các biểu hiện hành vi khi sử
dụng dài ngày. Tuy nhiên, theo công bố của Iyare năm 2008 và 2010, dịch
chiết nước Bụp giấm làm giảm lượng thức ăn, nước uống tiêu thụ ở chuột cống
cái và tác dụng này phụ thuộc liều. Tác giả giải thích sự giảm lượng thức ăn
và nước uống tiêu thụ ở chuột có thể là do chúng không thích mùi vị của Bụp
giấm [34]. Như vậy, có thể do cốm Bụp giấm đã cải thiện được mùi, vị của
dược liệu nhờ bổ sung thêm mannitol và aspartam nên không làm ảnh hưởng
đến các chỉ số này. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy, có sự giảm trọng lượng
chuột ở lô uống cốm Bụp giấm so với lô chuột uống nước cất ở tuần thứ 5, 8,
9, 10, 11 và 12 trong khi lượng thức ăn và nước uống sử dụng không khác
biệt. Những nghiên cứu được tổng hợp đến năm 2014 đều không cho thấy sự
 133

giảm trọng lượng đáng kể gây ra bởi Bụp giấm trên động vật bình thường. Do
đó, tác động đối với trọng lượng cần được đánh giá thêm trong những nghiên
cứu tiếp theo để làm rõ hơn về lợi ích và nguy cơ.
Nồng độ glusose trong máu của lô uống cốm Bụp giấm (400 mg/kg)
giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất sau 6 tuần và sau 12
tuần thử nghiệm. Tuy nhiên, ảnh hưởng này lại không xuất hiện ở lô sử dụng
liều cao hơn (800 mg/kg và 4000 mg/kg). Như vậy, tác động trên glucose máu
của cốm Bụp giấm phụ thuộc liều sử dụng. Về tác động trên đường huyết, các
nghiên cứu khác đã công bố cho thấy, Bụp giấm cho hiệu quả ức chế α-
amylase tụy [19]; ở liều 200 mg/kg, Bụp giấm chống đề kháng insulin, làm
giảm sự tăng đường huyết và sự tăng insulin trong máu trên chuột cống. Do
đó, trong các nghiên cứu tiếp theo, cần đánh giá thêm khả năng gây giảm
đường huyết trên đối tượng bình thường.
Lô uống cốm Bụp giấm 4000 mg/kg có chỉ số acid uric giảm, ALT
tăng, AST tăng sau 6 tuần uống cốm BG. Tuy nhiên, sau 12 tuần, các chỉ số
này đã trở về mức bình thường (khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô
chứng). Có thể dự đoán, khi sử dụng liều cao, BG có tác dụng lợi tiểu, nên
làm ảnh hưởng đến thông số acid uric. Việc tăng chỉ số AST và ALT chưa có
báo cáo trước đây, hiện tượng này có thể là do sự tăng chuyển hóa của gan khi
sử dụng cốm BG ở liều cao, tuy nhiên, sau đó cơ thể chuột đã đáp ứng với
thuốc nên men gan trở về bình thường sau 12 tuần.
Chỉ số cholesterol toàn phần giảm sau 12 tuần sử dụng ở lô uống cốm
Bụp giấm 800 mg/kg giúp củng cố thêm về tác dụng có lợi trên lipid máu của
Bụp giấm ngay cả với chuột bình thường. Trong khi đó, số lượng tiểu cầu PLT
giảm ở lô uống cốm Bụp giấm liều 4000 mg/kg sau 12 tuần có thể liên quan đến
tác dụng kháng viêm của dược liệu này trong một số báo cáo trước đây. Tuy
nhiên, % giảm của tiểu cầu khá thấp (5%), chưa có ý nghĩa về mặt lâm sàng.
 134

Lô uống cốm Bụp giấm 4000 mg/kg có dấu hiệu đi phân mềm từ tuần
thứ 6 trở đi có thể do ảnh hưởng của lượng acid ascorbic và một số acid hữu cơ
cao trong Bụp giấm [6], [96]. Hiện tượng viêm mô kẽ thận ở lô này sau 12 tuần
thử nghiệm cần được đánh giá thêm về nguyên nhân và mức độ cũng như sự
liên quan đến liều sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ hơn vì
các xét nghiệm sinh hóa trong nghiên cứu chưa cho thấy sự bất thường về chức
năng thận và việc xử lý mẫu cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả vi phẫu (do
3/10 chuột lô uống nước cất cũng có biểu hiện viêm mô kẽ thận mức độ nhẹ).
Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra
khuyến cáo cho các nghiên cứu sau cần chú ý theo dõi cân nặng, chỉ số acid
uric, số lượng tiểu cầu, đánh giá lợi ích và nguy cơ; các thông số đường huyết
(tình trạng giảm đường huyết ở đối tượng bình thường), MCH (tình trạng thiếu
máu liên quan đến liều) và nên đánh giá chức năng thận khi sử dụng chế phẩm
dài ngày với liều cao.
 135

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận
Liều có tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu tốt nhất của bột sấy phun
từ đài hoa Bụp giấm (BSP) trong khoảng liều từ 15 mg/kg đến 90 mg/kg chuột
nhắt là 30 mg/kg.
Cốm Bụp giấm, 2g/ gói (BSP 0,15 g; manitol 1,84 g; aspartam 0,01 g;
nước cất 0,12 ml) được bào chế bằng quy trình xát hạt ướt cho thấy ưu thế
trong bào chế và được lựa chọn nghiên cứu thử nghiệm. Cốm Bụp giấm đạt
các chỉ tiêu: (1) cảm quan, (2) độ ẩm, (3) độ tan, (4) độ đồng đều khối lượng,
(5) định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng, (6) định lượng bằng
phương pháp HPLC với quy trình được thẩm định. Cốm Bụp giấm ổn định
sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện thường. Dự đoán tuổi thọ là 15 tháng.
Cốm Bụp giấm tác động lên quá trình chuyển hóa lipid máu thông qua
việc làm tăng cảm ứng LDLR, SREBP-2 và AMPK. Cốm Bụp giấm ở nồng
độ 1000 µg/mL sau 24 giờ cảm ứng gen, làm tăng biểu hiện LDLR 0,87 lần,
tăng biểu hiện SREBP-2 0,88 lần, giảm biểu hiện HMGCoA 0,08 lần, tăng
biểu hiện AMPK 0,11 lần. Sau 48 giờ cảm ứng gen làm tăng biểu hiện LDLR
1,22 lần, tăng biểu hiện SREBP-2 1,53 lần, giảm biểu hiện HMGCoA 0,28,
tăng biểu hiện AMPK 0,52 lần. Sự phối hợp giữa cốm Bụp giấm và LP
(atorvastatin) làm tăng hiệu quả trên các gen LDLR, SREBP-2 và AMPK.
Cốm Bụp giấm sử dụng liều 400 mg/kg chuột nhắt x 3 liều làm giảm
cholesterol toàn phần 12%, tăng HDL 51% và làm giảm LDL 53% trên chuột
nhắt gây rối loạn lipid máu nội sinh bằng tyloxapol 500 mg/kg trong 48 giờ.
Cốm Bụp giấm sử dụng trong 7 ngày với liều 400 mg/kg làm giảm triglycerid
và tăng HDL trên chuột nhắt gây rối loạn lipid máu ngoại sinh bằng dung dịch
giàu lipid trong 8 tuần. Đồng thời, làm giảm cholesterol toàn phần 28% và
LDL 56% khi sử dụng để dự phòng rối loạn lipid máu trong 6 tuần sử dụng chế
độ ăn giàu lipid. Cốm Bụp giấm cho thấy khả năng dự phòng bệnh lý gan
 136

nhiễm mỡ trên chuột nhắt với mức liều 400 mg/kg sử dụng trong 4 tuần. Trên
mô hình gây gan nhiễm mỡ do chế độ ăn, so với lô bệnh lý, chuột thử nghiệm
ở lô uống cốm Bụp giấm có HDL tăng 24%, LDL giảm 58%, AST giảm 20%,
tỷ lệ thoái hóa mỡ không bào nhỏ giảm 1%.
Cốm Bụp giấm có Dmax = 15 g/kg (liều tối đa có thể cho uống mà không
có thú vật thử nghiệm nào chết), tương đương 75 g/người 60kg. Cốm Bụp
giấm sử dụng ở cả ba mức liều 0,4 g/kg, 0,8 g/kg và 4 g/kg thể hiện độ an toàn
khi sử dụng liên tục trong 12 tuần, không gây chết động vật thử nghiệm hoặc
biểu hiện bất thường về đại thể.
 137

Kiến nghị

1. Khảo sát mức liều có tác dụng điều hòa lipid máu khi sử dụng phối
hợp cốm Bụp giấm và atorvastatin.
2. Khảo sát tác dụng của cốm Bụp giấm trên gen SREBP-1a, khảo sát
cơ chế làm giảm triglycerid của cốm Bụp giấm.
3. Nghiên cứu đánh giá độ ổn định của cốm Bụp giấm ở điều kiện
thường trong thời gian dài (trên 24 tháng).
 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN

1. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Minh Đức, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Nguyễn
Phương Dung (2017), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời
delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm
Bụp giấm bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh.
2. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2018), “Đánh giá độc tính cấp
và bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng”, Tạp chí Y
học TP. Hồ Chí Minh.
3. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2018), “Đánh giá tác dụng
điều trị rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng”, Tạp
chí Y học TP. Hồ Chí Minh.
4. Lê Thị Lan Phương (2021), “Đánh giá tác dụng dự phòng bệnh lý gan
nhiễm mỡ không do rượu của cốm Bụp giấm”, Tạp chí Y học TP. Hồ
Chí Minh.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh (2006), Miễn dịch sinh lý bệnh, NXB
Y học, pp. 145-155.
2. Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam, Tập V, Nhà xuất bản Y học.
3. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc,
NXB Y học Hà Nội, pp. 7-20.
4. Đỗ Trung Đàm (2017), Thuốc giảm đau chống viêm và các phương
pháp nghiên cứu tác dụng dược lý, NXB Y Học.
5. Trần Thị Thu Hằng (2019), Dược lực học, Nhà xuất bản Hồng Đức.
6. Đỗ Tất Lợi (2008), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học &
Thời Đại, pp. 48-49, 181-182, 355-357.
7. Dương Thị Phượng Liên, Nguyễn Nhật Minh Phương (2014), "Ảnh
hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến khả năng trích ly và sự ổn
định anthocyanin từ Bắp cải tím (Brassica oleracea)", Tạp chí Khoa
học trường đại học Cần Thơ. 1, pp. 1-7.
8. Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2009), Bào chế và sinh dược học,
NXB Y học Hồ Chí Minh, pp. 182 - 184, 203 - 204.
9. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2013), "Đánh giá tác dụng
điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus
sabdariffa L. Malvaceae) trên chuột nhắt", Y học Thành phố Hồ Chí
Minh. 17 (1), pp. tr.369-373.
10. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2014), "Đánh giá tác dụng
bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa bụp giấm (Hibiscus sabdariffa
L. malvaceae) trên chuột nhắt gây tổn thương tế bào gan bằng
acetaminophen", Y học Thành phố Hồ Chí Minh. 18 (1), pp. tr.82-86.
11. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2014), "Đánh giá tác dụng
bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa bụp giấm (Hibiscus sabdariffa
 L. malvaceae) trên chuột nhắt gây tổn thương tế bào gan cấp tính bằng
ethanol", Y học Thành phố Hồ Chí Minh. 18 (1), pp. tr.77-81.
12. Nguyễn Thái Hoàng Tâm, et al. (2007), "Chuẩn hóa thử nghiệm
Sulforhodamin B (SRB) để xác định tính gây độc tế bào của hợp chất
tự nhiên", Hội nghị khoa học toàn quốc - Nghiên cứu cơ bản trong khoa
học sự sống, p. tr.809.
13. Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của
thuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, pp. 131-138,
367-368.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
14. Abd El-Kader S. M., El-Den Ashmawy E. M. (2015), "Non-alcoholic
fatty liver disease: The diagnosis and management", World J Hepatol,
7(6), pp. 846-58.
15. Abdallah Emad Mohamed (2016), "Antibacterial efficiency of the
Sudanese Roselle (Hibiscus sabdariffa L.), a famous beverage from
Sudanese folk medicine", Journal of intercultural ethnopharmacology,
5(2), p. 186.
16. Abifadel Marianne, et al. (2003), "Mutations in PCSK9 cause autosomal
dominant hypercholesterolemia", Nature genetics. 34(2), p. 154.
17. Adams Leon A, Paul Angulo, Keith D. Lindor (2005), "Nonalcoholic
fatty liver disease", Canadian Medical Association Journal, 172(7), pp.
899-905.
18. Adeyemi D. O., et al. (2014), "Anti-hepatotoxic activities of Hibiscus
sabdariffa L. in animal model of streptozotocin diabetes-induced liver
damage", BMC Complement Altern Med, 14, p. 277.
19. Adisakwattana Sirichai, et al. (2012), "In vitro inhibitory effects of
plant-based foods and their combinations on intestinal α-glucosidase
 and pancreatic α-amylase", BMC Complementary and Alternative
Medicine, 12(1), p. 110.
20. Alberts Alfred W (1988), "Discovery, biochemistry and biology of
lovastatin", The American journal of cardiology, 62(15), pp. J10-J15.
21. Alger Heather M, et al. (2010), "Inhibition of acyl-coenzyme A:
cholesterol acyltransferase 2 (ACAT2) prevents dietary cholesterol-
associated steatosis by enhancing hepatic triglyceride mobilization",
Journal of Biological Chemistry, 285(19), pp. 14267-14274.
22. Ali Badreldin H, et al. (2012), "Effect of Hibiscus sabdariffa and its
anthocyanins on some reproductive aspects in rats", Natural product
communications, 7(1), pp. 41-44.
23. Ali Badreldin H, Wabel Naser Al, Blunden Gerald (2005),
"Phytochemical, pharmacological and toxicological aspects of
Hibiscus sabdariffa L.: a review", Phytotherapy Research, 19(5), pp.
369-375.
24. Ali Rehab FM, El-Anany Ayman M (2017), "Hypolipidemic and
hypocholesterolemic effect of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) seeds oil
in experimental Male rats", Journal of oleo science, 66(1), pp. 41-49.
25. Antunes C., Azadfard M., Bhimji S. S. (2019), "Fatty Liver",
StatPearls, StatPearls Publishing, Treasure Island (FL).
26. Benjamin Emelia J, et al. (2017), "Heart disease and stroke statistics-
2017 update: a report from the American Heart Association", 135(10),
pp. e146-e603.
27. Bruckert Eric, Giral Philippe, Tellier Philippe (2003), "Perspectives
in cholesterol-lowering therapy: the role of ezetimibe, a new selective
inhibitor of intestinal cholesterol absorption", Circulation, 107(25), pp.
3124-3128.
28. Catapano Alberico L, et al. (2016), "2016 ESC/EAS guidelines for the
management of dyslipidaemias: the task force for the management of
dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and
European Atherosclerosis Society (EAS) developed with the special
contribution of the European Association for Cardiovascular
Prevention & Rehabilitation (EACPR)", J Atherosclerosis, 253, pp.
281-344.
29. Chang Xin-xia, et al. (2012), "The effects of berberine on
hyperhomocysteinemia and hyperlipidemia in rats fed with a long-term
high-fat diet", Lipids in health disease, 11(1), p. 86.
30. Chang Yun-Ching, et al. (2006), "Hibiscus anthocyanins-rich extract
inhibited LDL oxidation and oxLDL-mediated macrophages
apoptosis", Food Chemical Toxicology. 44(7), pp. 1015-1023.
31. Chen Jing-Jing, Li Xiang-Rong (2007), "Hypolipidemic effect of
flavonoids from mulberry leaves in triton WR-1339 induced
hyperlipidemic mice", Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition.
16(S1), pp. 290-294.
32. Cohen Jonathan C, et al. (2006), "Sequence variations in PCSK9, low
LDL, and protection against coronary heart disease", New England
Journal of Medicine, 354(12), pp. 1264-1272.
33. Comhair Tine M, et al. (2011), "Dietary cholesterol, female gender and
n-3 fatty acid deficiency are more important factors in the development
of non-alcoholic fatty liver disease than the saturation index of the fat",
Nutrition metabolism. 8(1), pp. 4.
34. Da-Costa-Rocha Inês, et al. (2014), "Hibiscus sabdariffa L.–A
phytochemical and pharmacological review", Food chemistry, 165, pp.
424-443.
35. Dilip M Parikh (2016), Handbook of Pharmaceutical and Granulation
Technology, pp. 349 - 363, 488 - 493.
36. Edwards Peter A, Kast Heidi R, Anisfeld Andrew M (2002),
"BAREing it all: the adoption of LXR and FXR and their roles in lipid
homeostasis", Journal of lipid research, 43(1), pp. 2-12.
37. Einarsson K, et al. (1991), "Bile acid sequestrants: mechanisms of
action on bile acid and cholesterol metabolism", European journal of
clinical pharmacology, 40(1), pp. S53-S58.
38. Endo Akira (2008), "A gift from nature: the birth of the statins", Nature
medicine, 14(10), p. 1050.
39. Enkhmaa Byambaa, et al. (2018), "Lifestyle Changes: Effect of Diet,
Exercise, Functional Food, and Obesity Treatment on Lipids and
Lipoproteins", Endotext [Internet], MDText. com, Inc.
40. Fazio Sergio, Linton MacRae F (2004), "The role of fibrates in
managing hyperlipidemia: mechanisms of action and clinical efficacy",
Current atherosclerosis reports, 6(2), pp. 148-157.
41. Feingold Kenneth R, Grunfeld Carl (2018), "Cholesterol lowering
drugs", Endotext [Internet], MDText. com, Inc.
42. Frank Thomas, et al. (2012), "Consumption of Hibiscus sabdariffa L.
aqueous extract and its impact on systemic antioxidant potential in
healthy subjects", Journal of the Science of Food Agriculture, 92(10),
pp. 2207-2218.
43. Ginsberg, N Henry (1997), "Is hypertriglyceridemia a risk factor for
atherosclerotic cardiovascular disease? A simple question with a
complicated answer", Annals of internal medicine, 126(11), pp. 912-914.
44. Goldstein Joseph L, Brown Michael S (2015), "A century of cholesterol
and coronaries: from plaques to genes to statins", Cell, 161(1), pp. 161-172.
45. Gurrola-Diaz CM, et al. (2010), "Effects of Hibiscus sabdariffa extract
powder and preventive treatment (diet) on the lipid profiles of patients
with metabolic syndrome (MeSy)", Phytomedicine, 17(7), pp. 500-505.
46. Hainida Emmy, et al. (2008), "Effects of defatted dried roselle
(Hibiscus sabdariffa L.) seed powder on lipid profiles of
hypercholesterolemia rats", Journal of the Science of Food, 88(6), pp.
1043-1050.
47. Hansson Göran K, Jonasson Lena (2009), "The discovery of cellular
immunity in the atherosclerotic plaque", Arteriosclerosis, thrombosis,
vascular biology, 29(11), pp. 1714-1717.
48. Herrera-Arellano A, et al. (2004), "Effectiveness and tolerability of a
standardized extract from Hibiscus sabdariffa in patients with mild to
moderate hypertension: a controlled and randomized clinical trial",
Phytomedicine, 11(5), pp. 375-382.
49. Hong Xuezhi, et al. (2006), "Protective effects of the Alisma orientalis
extract on the experimental nonalcoholic fatty liver disease", Journal
of Pharmacy Pharmacology, 58(10), pp. 1391-1398.
50. Horton Jay D, Cohen Jonathan C, Hobbs Helen H (2009), "PCSK9: a
convertase that coordinates LDL catabolism", Journal of lipid
research, 50(Supplement), pp. S172-S177.
51. Hwang Seock‐Yeon, et al. (2008), "Korean red ginseng attenuates
hypercholesterolemia‐enhanced platelet aggregation through
suppression of diacylglycerol liberation in high‐cholesterol‐diet‐
fed rabbits", Phytotherapy Research: An International Journal
Devoted to Pharmacological Toxicological Evaluation of Natural
Product Derivatives, 22(6), pp. 778-783.
52. Ibrahim Abeer Y, et al. (2016), "Evaluation of hypolipidemic
Marrubium vulgare effect in Triton WR-1339-induced hyperlipidemia
in mice", Asian Pacific journal of tropical medicine, 9(5), pp. 453-459.
53. Kalaany Nada Y, Mangelsdorf David J (2006), "LXRS and FXR: the
yin and yang of cholesterol and fat metabolism", Journal Annuals of
Rev. Physiol, 68, pp. 159-191.
54. Kim Hyoun Ju, et al. (2002), "Sterol regulatory element‐binding proteins
(SREBPs) as regulators of lipid metabolism: polyunsaturated fatty acids
oppose cholesterol‐mediated induction of SREBP‐1 maturation",
Annals of the New York Academy of Sciences, 967(1), pp. 34-42.
55. Klein-Szantoa Andres J.P., Daniel E. Bassi (2019), "Keep recycling
going: New approaches to reduce LDL-C", Biochemical
pharmacology, 164, pp. 336-341.
56. Kwak Yi-Seong, et al. (2010), "Anti-hyperlipidemic effects of red
ginseng acidic polysaccharide from Korean red ginseng", Biological
Pharmaceutical Bulletin, 33(3), pp. 468-472.
57. Lee Chao-Hsin, et al. (2012), "A polyphenol extract of Hibiscus
sabdariffa L. ameliorates acetaminophen-induced hepatic steatosis by
attenuating the mitochondrial dysfunction in vivo and in vitro",
Bioscience, biotechnology, biochemistry, 76(4), pp. 646-651.
58. Leoni S., et al. (2018), "Current guidelines for the management of non-
alcoholic fatty liver disease: A systematic review with comparative
analysis", World J Gastroenterol, 24(30), pp. 3361-3373.
59. Lim Dong, Kim Jae, Kim Yun (2013), "Effects of dietary isoflavones
from Puerariae radix on lipid and bone metabolism in ovariectomized
rats", Nutrients, 5(7), pp. 2734-2746.
60. Lin Tzu-Li, et al. (2007), "Hibiscus sabdariffa extract reduces serum
cholesterol in men and women", Nutrition research, 27(3), pp.140-145.
61. Lina Xiao-Long, et al. (2018), "Role of PCSK9 in lipid metabolism and
atherosclerosis", Biomedicine & Pharmacotherapy, 104, pp. 36-44.
62. Liu Liang‐Chih, et al. (2010), "Aqueous extract of Hibiscus sabdariffa
L. decelerates acetaminophen‐induced acute liver damage by reducing
cell death and oxidative stress in mouse experimental models", Journal
of the Science of Food Agriculture, 90(2), pp. 329-337.
63. Longa Qionghua, et al. (2021), "Delphinidin-3-sambubioside from
Hibiscus sabdariffa. L attenuates hyperlipidemia in high fat diet-
induced obese rats and oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells",
Bioengineered, 1, pp. 3847-3849.
64. Ludwig Huber (2007), Validation and Qualification in Analytical
Laboratories, Informa Healthcare, New York, p. 144.
65. Lyn O' Brien Nabors (2001), Alternative Sweeteners, Taylor & Francis
Inc, New York, pp. 317-334.
66. Marchesini Giulio, et al. (2001), "Nonalcoholic fatty liver disease: a
feature of the metabolic syndrome", Diabetes, 50(8), pp. 1844-1850.
67. Melmed Shlomo, et al. (2015), Williams textbook of endocrinology,
Elsevier Health Sciences, 1642 - 1706.
68. Mohamed Jamaludin, et al. (2013), "The protective effect of aqueous
extracts of roselle (Hibiscus sabdariffa L. UKMR-2) against red blood
cell membrane oxidative stress in rats with streptozotocin-induced
diabetes", Clinics, 68(10), pp. 1358-1363.
69. My Nuong Thi Nguyen, Thuy Duong Ho Huynh (2016), "Selective
cytotoxicity of a Vietnamese traditional formula, Nam Dia long,
against MCF-7 cells by synergistic effects", BMC Complementary and
Alternative Medicine, 16, pp. 202-236.
70. Navarese Eliano P, et al. (2016), "Proprotein convertase
subtilisin/kexin type 9 monoclonal antibodies for acute coronary
 syndrome: a narrative review", Annals of internal medicine, 164(9), pp.
600-607.
71. Niesor Eric J., et al. (2015), "Statin-induced decrease in ATP-binding
cassette transporter A1 expression via microRNA33 induction may
counteract cholesterol efflux to high-density lipoprotein",
Cardiovascular drugs and therapy, 29(1), pp. 7-14.
72. Ochani Pooja C, D’Mello Priscilla (2009), "Antioxidant and
antihyperlipidemic activity of Hibiscus sabdariffa Linn. leaves and
calyces extracts in rats", Indian Journal of Experimenntal Biology, 47,
pp. 276 – 282.
73. Oh Phil-Sun, Lim Kye-Taek (2006), "Glycoprotein (90 kDa) Isolated
from Opuntia ficus-indica var. saboten M AKINO Lowers Plasma
Lipid Level through Scavenging of Intracellular Radicals in Triton
WR-1339-Induced Mice", Biological Pharmaceutical Bulletin, 29(7),
pp. 1391-1396.
74. Onyenekwe PC, et al. (1999), "Antihypertensive effect of roselle
(Hibiscus sabdariffa) calyx infusion in spontaneously hypertensive rats
and a comparison of its toxicity with that in Wistar rats", Cell
Biochemistry, 17(3), pp. 199-206.
75. Porez Geoffrey, et al. (2012), "Bile acid receptors as targets for the treatment
of dyslipidemia and cardiovascular disease Thematic Review Series: New
Lipid and Lipoprotein Targets for the Treatment of Cardiometabolic
Diseases", Journal of lipid research, 53(9), pp. 1723-1737.
76. Pramfalk Camilla, Jiang Zhao-Yan, Parini Paolo (2011), "Hepatic
Niemann–Pick C1-like 1", Current opinion in lipidology, 22(3), pp.
225-230.
77. Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn (2009),
"Handbook of Pharmaceutical Excipients ", Pharmaceutical Press and
American Pharmacists Association, pp. 48 - 50.
78. Reginald H Garrett, Charles M Grisham (2010), Biochemistry, Canada,
pp. 722 - 767.
79. Robinson Jennifer G., Stone Neil J. (2015), "The 2013 ACC/AHA
guideline on the treatment of blood cholesterol to reduce
atherosclerotic cardiovascular disease risk: a new paradigm supported
by more evidence", European Heart Journal, 36(31), pp. 2110-2118.
80. Roth Eli M, et al. (2014), "Monotherapy with the PCSK9 inhibitor
alirocumab versus ezetimibe in patients with hypercholesterolemia:
results of a 24 week, double-blind, randomized Phase 3 trial", Journal
of International journal of cardiology, 176(1), pp. 55-61.
81. Sajad Dehnavi, et al. (2021), "Targeting AMPK by Statins: A Potential
Therapeutic Approach", Drugs, pp. 1-11.
82. Schultz Joshua R, et al. (2000), "Role of LXRs in control of
lipogenesis", Journal of Genes development, 14(22), pp. 2831-2838.
83. Schultz Joshua R, et al. (2000), "Role of LXRs in control of
lipogenesis", Genes development, 14(22), pp. 2831-2838.
84. Serban C., et al. (2015), "Effect of sour tea (Hibiscus sabdariffa L.) on
arterial hypertension: a systematic review and meta-analysis of
randomized controlled trials", Journal Hypertens, 33(6), pp. 1119-27.
85. Serrano C, Ortega T, Villar AM (1996), "Biological activity of
traditional medicines from Spain and Guatemala. Artemia salina
bioassay: A revision", Phytotherapy Research.
86. Sham Tung-Ting, et al. (2014), "A review on the traditional Chinese
medicinal herbs and formulae with hypolipidemic effect", BioMed
research international, 2014, Doi: 10.1155/2014/925302..
87. Sharaf A (1962), "The pharmacological characteristics of Hibiscus
sabdariffa L", Planta medica, 10(01), pp. 48-52.
88. Sheng Xiaoyan, et al. (2011), "Rhein ameliorates fatty liver disease
through negative energy balance, hepatic lipogenic regulation and
immunomodulation in diet-induced obese mice", American Journal of
Physiology-Heart Circulatory Physiology, 300, E886 – E893.
89. Sheng Zeqi, et al. (1995), "Independent regulation of sterol regulatory
element-binding proteins 1 and 2 in hamster liver", J Proceedings of
the National Academy of Sciences, 92(4), pp. 935-938.
90. Shirani S et al (2009), "Awareness, treatment and control of
hypertension, dyslipidaemia and diabetes mellitus in an Iranian
population", the IHHP study, 15, pp. 1285-1293.
91. Stein Yechezkiel, Stein Olga (1977), "The origin and fate of LDL",
Atherosclerosis, Springer, pp. 413-420.
92. Sukriti Krishan, R. Richardson Des, Sahni Sumit (2015), "Adenosine
monophosphate–activated kinase and its key role in catabolism:
Structure, regulation, biological activity, and pharmacological
activation", Molecular pharmacology, 87(3), pp. 363-377.
93. Sze Stephen CW, et al. (2011), "Effects of Erxian decoction, a Chinese
medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of
menopause", Chinese medicine, 6(1), p. 40.
94. Tseng T-H, et al. (1997), "Protective effects of dried flower extracts of
Hibiscus sabdariffa L. against oxidative stress in rat primary
hepatocytes", Food Chemical Toxicology, 35(12), pp. 1159-1164.
95. Turley Stephen D, Dietschy John M (2003), "Sterol absorption by the
small intestine", Current opinion in lipidology, 14(3), pp. 233-240.
96. Villalpando-Arteaga Edgar Vinicio, et al. (2013), "Hibiscus sabdariffa
L. aqueous extract attenuates hepatic steatosis through down-regulation
 of PPAR-γ and SREBP-1c in diet-induced obese mice", Journal of
Food function, 4(4), pp. 618-626.
97. Wang Pei-Wen, et al. (2008), "Fatty liver and chronic inflammation in
Chinese adults", J Diabetes research clinical practice, 81(2), pp. 202-208.
98. Xia Wei, et al. (2011), "Hypolipidemic and antioxidant activities of
Sanchi (Radix Notoginseng) in rats fed with a high fat diet",
Phytomedicine, 18(6), pp. 516-520.
99. Xie Weidong, et al. (2007), "Hypolipidemic mechanisms of Ananas
comosus L. leaves in mice: different from fibrates but similar to
statins", Journal of pharmacological sciences, 103(3), pp. 267-274.
100. Xue Linyuan, et al. (2020), "Targeting SREBP-2-regulated mevalonate
metabolism for cancer therapy", Frontiers in Oncology, 10, pp. 1-20.
101. Yang Mon-Yuan, et al. (2009), "The hypolipidemic effect of Hibiscus
sabdariffa polyphenols via inhibiting lipogenesis and promoting
hepatic lipid clearance", Journal of agricultural food chemistry, 58(2),
pp. 850-859.
102. Yokozawa T, et al. (2003), "The effects of Coptidis Rhizoma extract on a
hypercholesterolemic animal model", Phytomedicine, 10(1), pp. 17-22.
103. Zhang Yang, et al. (2016), "Dysregulation of the low-density lipoprotein
receptor pathway is involved in lipid disorder-mediated organ injury",
International journal of biological sciences, 12(5), p. 569.
104. Zhang Yi‐Guan, et al. (2008), "Panax notoginseng saponins attenuate
atherosclerosis in rats by regulating the blood lipid profile and an anti‐
inflammatory action", Clinical Experimental Pharmacology, 35(10),
pp. 1238-1244.
TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI
105. Cisse Mady, et al. (2009), "Le bissap (Hibiscus sabdariffa L.):
composition et principales utilisations", Fruits, 64(3), pp. 179-193.