CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM ẨM

Xác định hàm ẩm theo TCVN 10788:2015.
Nguyên tắc: sấy mẫu đến khối lượng không đổi. Sau đó, dựa trên lượng
chất khô còn lại và lượng ẩm bốc hơi để xác định hàm ẩm.
Dụng cụ, thiết bị:
- Tủ sấy, cân điện tử, bình hút ẩm, chén sấy, cối
Cách tiến hành
- Sấy chén đến khối lượng không đổi: Chén được rửa sạch, úp khô, sấy ở
nhiệt độ từ 100 đến 105℃ trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút
ẩm, đem cân, sấy tiếp ở nhiệt độ trên trong 30 phút, làm nguội trong bình hút
ẩm, đem cân và sấy lặp đi lặp lại nhiều lần đến khi nào giữa hai lần liên tiếp sai
khác không quá 0,05%; xác định khối lượng chén là m0
- Chuẩn bị mẫu: nghiền 5g- 10g mẫu thành những mẫu nhỏ và cho vào
chén sấy đã xác định khối lượng (m0). Khối lượng chén và mẫu trước sấy là m1.
- Thực hiện sấy mẫu trong chén đến khối lượng không đổi ở 100-105℃
trong ít nhất 2 giờ. Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân trên cân
phân phân tích khi sai khác không quá 0,05%. Khối lượng của mẫu và chén sau
sấy là m2.
Tính kết quả
Hàm ẩm theo % (X) tính bằng công thức:
𝑚1− 𝑚2
X= × 100%
𝑚1− 𝑚0

Trong đó:
X: Độ ẩm của thực phẩm
m0: Khối lượng chén sấy
m1: Khối lượng chén sấy và mẫu thử trước khi sấy (g)
m2: Khối lượng chén sấy và mẫu thử sau khi sấy (g)
 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITO TỔNG THEO
PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
Hàm lượng nitơ tổng số của sản phẩm được xác định theo phương pháp
Kjeldahl.
Nguyên tắc: thủy phân phần mẫu thử bằng acid sulfuric đậm đặc, ở nhiệt độ
cao và chất xúc tác, để chuyển nitơ hữu cơ thành amoni sulfat. Chỉnh dung dịch
pha loãng đến pH kiềm, chưng cất amoniac giải phóng trong dung dịch acid
boric dư, chuẩn độ bằng acid sulfuric hoặc acid clohydric để xác định amoniac
liên kết bởi acid boric và tính hàm lượng nitơ trong mẫu từ lượng amoniac tạo
thành.
Hóa chất:
- Dung dịch acid H2SO4 đậm đặc.
- K2SO4 : CuSO4, tỷ lệ = 3:7
- Dung dịch acid H3BO3 3%
- Chất chỉ thị tasiro
- NaOH 40%,
- H2SO4 0,1N.
Dụng cụ, thiết bị:
- Hệ thống vô cơ hóa mẫu Kjeldahl,
- Hệ thống chưng cất đạm,
- Bình tam giác 250 ml,
- Buret, piped.

Cách tiến hành

- Vô cơ hóa mẫu:
+ Cân chính xác 1,5 g mẫu phân tích cho vào ống Kjeldahl với thêm 10 ml
H2SO4 đậm đặc và 1,5 g xúc tác (K2SO4 : CuSO4 = 3 : 7);
+ Đặt ống vào hệ thống công phá mẫu ở nhiệt độ 420°C trong vòng 3 giờ.
Sau đó, làm nguội ống xuống nhiệt độ 80°C và đưa qua hệ thống chưng cất đạm.
- Chưng cất đạm:
+ Rửa thật sạch bộ chưng cất đạm bằng nước cất. Chuyển dung dịch đã vô
cơ hóa vào bình phản ứng;
+ Cho vào bình hứng 20 ml H3BO3 3%, thêm vài giọt tasiro;
 + Cho vào bình phản ứng 250 ml NaOH 40% và đổ đầy bình nước cất.
+ Tiến hành chưng cất: NH3 trong bình phản ứng bay lên cùng với hơi nước
qua ống làm lạnh sang bình hứng và tác dụng với H 3BO3 tạo thành muối amoni
tetraborat
+ Thử xem đã cất hết NH3 chưa bằng giấy quỳ tím ở miệng ống sinh hàn;
Nếu quỳ tím không đổi màu là được. Sau đó, hạ bình hứng xuống, dùng nước
cất tráng sạch acid dính đầu ống làm lạnh;
+ Định lượng amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1 N cho
đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.
Tính kết quả
Hàm lượng nitơ tổng số có trong mẫu được tính bằng công thức:
𝑉 × 0,0014 ×100
N=
𝑤

Trong đó:
N: Hàm lượng nitơ tổng số (%);
V: Số ml H2SO4 0,1N chuẩn độ;
0,0014: Số gam nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,1N;
w: Trọng lượng mẫu (mg).
Hàm lượng protein tổng số có thể được xác định dựa vào hàm lượng nitơ
tổng số. Hàm lượng protein tổng số bằng hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số
chuyển đổi, thông thường hệ số chuyển đổi là 6,25.
 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIPID TỔNG SỐ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SOXHLET
Hàm lượng lipid được xác định theo phương pháp Soxhlet.
Nguyên tắc: Dùng dung môi hữu cơ chiết lipid, làm bay hơi dung môi hữu
cơ và xác định lượng lipid còn lại theo phương pháp khối lượng.
Hóa chất, dụng cụ:
- nHexan
- Máy chiết lipid Soxhlet
- Cân phân tích
- Tủ sấy
 Cách tiến hành
- Giấy lọc được sấy khô đến khối lượng không đổi và được cân trên cân phân
tích,
- Cân 2g mẫu đã được sấy khô, nghiền nhỏ vào giấy gói
- Gói kín mẫu và đưa gói mãu vào trụ trích ly. Lắp hệ thống Soxlet, kiểm tra hệ
thống sinh hàn
Giấy
tra hệ thống sinh hàn;
- Rót dung môi vào đến nhập trụ trích ly thông qua miệng ống sinh hàn.
Lưu ý, phải rót dung môi vào trụ chiết cho đến khi dung môi chảy tràn xuống
đến 2/3 bình đun;
- Dùng bông bịt kín miệng ống sinh hàn tránh dung môi bay hơi;
- Cấp nước cho hệ thống sinh hàn;
- Gia nhiệt bình đun;

- Điều chỉnh tốc độ ngưng tụ của dung môi từ 2 đến 6 giọt/ giây;
- Tiến hành trích ly từ 6 đến 8 giờ, tùy thuộc vào hàm lipid có trong mẫu;
- Kiểm tra quá trình trích ly đã hoàn toàn chưa. Nếu đã hết lipid thì kết thúc
trích ly;
- Làm mát hệ thống trước khi lấy mẫu ra;
- Loại bỏ dung môi trong gói mẫu.
- Sau khi chiết xong, tiến hành lấy túi giấy ra khỏi bình chiết, cho bay hơi
hết dung môi, sấy khô đến khối lượng không đổi.
Tính kết quả

(𝑚1 − 𝑚) × 100%
X=
𝑚
Trong đó:
X: Phần trăm chất béo có trong nguyên liệu ban đầu (%);
m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g);
m1: Khối lượng túi mẫu trước khi chiết (g);
m2: Khối lượng túi mẫu sau khi chiết được sấy khô (g).
 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CELLULOSE
Nguyên tắc: thủy phân các chất hữu cơ không phải cellulose bằng acid
mạnh và kiềm mạnh phần còn lại là cellulose. Cellulose được định lượng bằng
phương pháp khối lượng.
Hóa chất, dụng cụ:
- NaOH 0,5%;
- HCl 10%;
- Dung dịch Javen;
- Bình tam giác;
- Tủ sấy;
- Phễu, giấy lọc.
Cách tiến hành:
- Sấy giấy lọc đến khối lượng không đổi và được cân trên cân phân tích;
- Cân chính xác 2 g mẫu nghiền nhỏ cho vào bình tam giác 250 ml, thêm
200 ml dung dịch NaOH 0,5%, đun sôi cách thủy trong 30 phút. Để nguội rồi lọc
hỗn hợp qua giấy lọc;
- Rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0,5% nóng. Tiếp tục cho cặn tác
dụng với 10ml HCl 10%. Thêm vào đó 10ml dung dịch natri hypochlorite từng
giọt một, vừa cho vừa khuấy đều. Để yên trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc đã
biết khối lượng. Cho cặn tiếp tục tác dụng trở lại với NaOH 0,5% ở nhiệt độ
40°C. Để yên vài phút và làm như thế một đến hai lần nữa để có cellulose thật
trắng. Sau cùng rửa sạch thật kỹ bằng nước sôi. Sấy khô và cân.
Tính kết quả
Hàm lượng cellulose trong mẫu được tính bằng công thức:
𝑎 × 100%
X=
𝑚
Trong đó:
X: hàm lượng cellulose tính bằng %
a: khối lượng cellulose (g)
m: khối lượng mẫu (g).
 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN C

Xác định hàm lượng vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ Iod
Tiến hành: Cân 5g mẫu nghiền nhỏ trong cối sứ với 5 ml HCl 5%, nghiền
kỹ, cho vào ống đong và thêm nước cất tới vạch 50 ml, khuấy đều và lọc.
Sau đó, lấy 20ml dịch sau khi lọc cho vào bình tam giác 50 ml, cho thêm 5
giọt hồ tinh bột 1% vào. Chuẩn độ dung dịch iod 0,01N đến khi xuất hiện
màu xanh lam thì kết thúc. Đọc thể tích của dung dịch iod tiêu tốn. Thí
nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.

 Tính kết quả :

Trong đó:
+ V là số ml Iod dùng để chuẩn độ (ml).
+ V1 là số ml định mức lên (ml).
+ V2 là số ml lấy đi chuẩn độ (ml).
+ m là khối lượng mẫu mang đi phân tích (g).
+ 0,00088 là số gam vitamin C tương ứng với 1 ml dung dịch iod 0,01N.
 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHÁNG OXY HÓA
1. Tiến hành
 Dung dịch DPPH: cân 0,0098g DDPH pha trong 250ml methanol..
 Chiết dịch: Cân chính xác 0,05g bột hạt bơ đã được nghiền mịn cho
vào bình tam giá 100ml, bổ sung thêm 10 ml metanol 70 0, đậy miệng cốc
bằng giấy bạc, dùng dây cao su cột chặt. Đưa bình tam giác vào bể ổn nhiệt
đã nâng nhiệt độ lên 700C và tiến hành chiết trong 30 phút. Sau đó đem các
bình tam giác này trộn đều trên máy lắc ở nhiệt độ 70 0C với tốc độ 200
vòng/phút trong khoảng 10 phút. Lấy bình tam giác ra, để nguội đến nhiệt
độ phòng. Tiếp tục ly tâm dịch ở tốc độ 2000 vòng/ 10 phút. Gạn lấy phần
dịch trên ống ly tâm. Tiến hành pha loãng dịch chiết thành các tỷ lệ 1/5
(nồng độ 1000 μg/ml); 1/10 (nồng độ 500 μg/ml); 1/20 (nồng độ 250 μg/ml);
1/40 (nồng độ 125 μg/ml); 1/50 (nồng độ 100 μg/ml); 1/80 (nồng độ 62.5
μg/ml) bằng dung dịch metanol 700. Hút 2ml dung dịch ở mỗi nồng độ cho
vào ống nghiệm, bổ sung thêm 2ml dung dịch DPPH, ủ trong bóng tối
khoảng 30 phút, sau đó đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng
517nm.
Mẫu đối chứng: 2ml methanol + 2ml DPPH.

 Tính kết quả:

Trong đó:
+ ODc: giá trị mật độ quang OD của mẫu đối chứng
+ ODm: giá trị mật độ quang OD của mẫu dịch chiết
Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, xây dựng phương trình tương
quan tuyến tính, từ đó xác định giá trị IC50 để làm cơ sở so sánh khả năng
chống oxy hóa giữa các mẫu. Mẫu nào có giá trị IC 50 càng thấp thì có khả
năng chống oxy hóa càng cao.
Giá trị % bắt gốc tự do DPPH và giá trị IC 50 của các nghiệm thức được
xử lý trên phần mềm Microsoft Excel.
 So sánh sự khác biệt về mặt thống kê và xác định phương trình hồi quy
giữa nồng độ các mẫu thử và tỉ lệ % bắt gốc tự do DPPH được xây dựng
trên phần mềm thống kê Minitab 18.0. Kết quả được thể hiện qua phương
trình:
Phương trình linear : 𝑦 = 𝑏𝑜 + 𝑏1 × 𝑥
Trong đó:
+ y : tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
+ 𝑥 : nồng độ mẫu thử
+ bo : hằng số (constant)
+ b1, b2, b3: các hệ số hồi quy
Phương trình hồi quy được chọn là phương trình có hệ số tương quan
và tương quan hiệu chỉnh cao (phản ánh sự biến thiên của tỉ lệ % hoạt tính
bắt gốc tự do DPPH dược giải thích bởi nồng độ mẫu thử); với độ tin cậy
95% thì P-value của phương trình và các tham số thường ≤ 0,05 là có ý
nghĩa.
 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG SỐ

Hàm lượng đường tổng của sản phẩm được xác định theo phương pháp
Bertrand theo TCVN 4594:1988.
Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa khử giữa đường với ion kim loại để
xác định hàm lượng các đường monosaccharide có nguyên liệu.
Hóa chất:
- HCl 5%
- Chì acetat 30%
- NaOH 30%
- Dung dịch Na2SO4
- Fehling A, fehling B
- Dung dịch Fe2(SO4)3
- KMnO4 1/30N
Cách tiến hành
- Chuẩn bị nguyên liệu:
Cho 5 g mẫu đã nghiền vào bình tam giác 250 ml, sau đó thêm 25 ml HCl
5% thực hiện thủy phân trên nồi cách thủy ở nhiệt độ sôi trong 180 phút.
Sau khi thủy phân cần làm lạnh dưới vòi nước chảy, thêm 3 giọt
phenolphthalein. Trung hòa lại bằng NaOH 30% cho đến khi dung dịch có màu
hồng.
- Khử tạp chất:
Dung dịch sau khi thủy phân và trung hòa cho vào bình định mức 100 ml
cùng với nước rửa, thêm 7 ml chì acetate 30% lắc đều để lắng trong 5 phút, nếu
xuất hiện lớp chất lỏng trong suốt ở trên lớp cặn thì việc khử tạp chất đã xong.
Cho vào 15 – 20 ml Na2SO4 bão hòa để loại chì acetate dư, lắc đều và để
kết tủa lắng xuống. Thêm nước cất vừa đủ 100 ml, lọc qua giấy lọc thu được
dịch đường (dịch lọc).
- Tiến hành định lượng:
Hút 20 ml dịch lọc cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm vào 5 ml dung
dịch Feling A và 5 ml dung dịch Feling B, đậy kín bằng giấy bạc. Đun sôi 3 phút
trên bếp điện cho đến khi xuất hiện kết tủa đỏ.
 Lấy bình ra, để nghiêng cho cặn Cu 2O lắng xuống. Lúc này, dung dịch bên
trên lớp cặn phải có màu xanh của Cu(OH)2 dư. Trong trường hợp dung dịch
trên có màu lục, vàng hoặc nâu nghĩa là không đủ lượng đồng cần thiết, tiến
hành làm lại và lấy một lượng dịch lọc hoặc với lượng thuốc thử nhiều hơn.
Khi kết tủa Cu2O lắng xuống thì thực hiện quá trình rửa tủa trên phễu buchner
có gắn với máy lọc hút chân không. Chiết từ từ dung dịch Fehling qua phễu
buchner, giữ tủa Cu2O ở trong bình nón luôn ngập trong dung dịch để Cu2O không
bị tiếp xúc với oxy không khí tạo thành CuO. Bật máy lọc chân không để dung
dịch Feling được hút nhanh. Sau đó cho từ từ khoảng 20 ml nước cất vào bình
nón, lắc nhẹ và chiết nước rửa tủa tương tự như trên. Quá trình rửa tủa lặp lại 3
lần bằng nước cất.
Sau khi rửa tủa, tiến hành hòa tan tủa bằng 5 ml dung dịch Fe2(SO4)3 cho
đến khi không còn vết Cu2O trong bình nón. Thay bình hút lọc cũ bằng bình mới
rồi hút dịch hòa vừa hòa tan xuống bình lọc và tráng rửa lại bằng nước cất.
Dung dịch nhận được sau khi hòa tan đem chuẩn độ bằng dung dịch
KMnO4 1/30N cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững trong 15 giây. Đọc
số ml KMnO4 1/30N đã dùng, sau đó tra bảng Bertrand ta sẽ có lượng đường
glucose, lactose, maltose hoặc đường nghịch chuyển theo yêu cầu.

Tính kết quả

Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucose hoặc đường nghịch
chuyển (g/100 gam thực phẩm) tính bằng công thức:
𝑎 ×𝑉 ×0,9 ×100%
X= ×f
𝑉1 ×𝑚 ×1000
Trong đó:
X: Hàm lượng đường tổng tính theo %;
a: Khối lượng đường nghịch chuyển hoặc đường glucose (mg) tương ứng với
số ml KMnO4 1/30N đọc ở bảng;
V: dung tích bình định mức 100 ml;
V1: lượng dung dịch lấy để xác định đường tổng (20 ml);
m: khối lượng mẫu đem phân tích;
f: Độ pha loãng;
1000: Hệ số chuyển từ mg sang
g; 0,9: hệ số glucose.
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ
 Tính kết quả:
Hàm lượng polyphenol tổng số, wT (tính bằng phần trăm khối lượng mẫu khô), được
tính bằng công thức
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT KHÔ HÒA TAN