Bioorganic Chemistry Associate Professor

Phan Minh Giang

Những chương chọn lọc của Hóa

học các hợp chất thiên nhiên
dành cho cao học
Bioorganic Chemistry

Mục tiêu môn học

 Hóa học sự sống của tế bào

 Hóa học của liên kết glycoside: Oligosaccharide, Glycoprotein,
Glycopeptide
 Hóa học của liên kết peptide: Amino acid, peptide, protein
 Hóa học của liên kết nucleotide: Ribonucleotide, ADN
 Kiểm soát hóa học sự truyền tín hiệu: Thụ thể (Receptor) và sự truyền
tín hiệu (Signal transduction, Cell signaling)
 Tổng hợp phỏng sinh (Biomimetic synthesis) một số hợp chất thiên
nhiên

Tài liệu tham khảo

1) David van Vranken, Georgy Weiss, Introduction to Bioorganic Chemistry
and Chemical Biology, Taylor and Francis, New York, 2013.
2) Tim Bugg, Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry, Blackwell
Publishing, Oxford, 2004.
3) Phan Minh Giang, Những chương chọn lọc của Hóa học các hợp chất
thiên nhiên, NXB ĐHQG Hà Nội, 2018.
Bioorganic Chemistry Associate Professor
Phan Minh Giang

Chương 2:
Hóa học của liên kết peptide
Bioorganic Chemistry

Nội dung Chương 2

2.1 Amino acid và peptide

2.2 Các tương tác protein-protein
2.3 Các tương tác kiểm soát cấu trúc bậc hai của protein
2.4 Tổng hợp peptide bằng phương pháp thắt hóa học
tự nhiên (Native chemical ligation)
2.5 Tổng hợp peptide pha rắn
Bioorganic Chemistry

Ôn tập

1) Amino acid, các dạng acid, base, trung hòa, cấu hình, ký hiệu.
2) Liên kết amide, dạng hình học, độ bền và hiệu ứng không gian điện tử
3) Sự hình thành chuỗi polypeptide
4) Các dạng ion hóa của các gốc amino acid trong môi trường sinh lý
5) Tương tác của các gốc amino acid trong protein
6) Các dạng cấu trúc bậc hai
7) Vùng protein và sự hình thành các cấu trúc bậc ba và bậc bốn
8) Một số dạng vùng protein phổ biến
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc và chức năng sinh học của protein

- Protein là polymer của amino acid liên kết với nhau bằng liên kết amide.
- Cấu trúc và chức năng sinh học của protein được tạo thành từ 20 đơn
vị cấu trúc amino acid (building block).
- Khác với oligosaccharide sự đa dạng của protein thể hiện qua các hình
dạng cụ thể do sự gấp protein qua nhiều liên kết hydro của mạch khung
peptid trong khi vẫn thỏa mãn các tương tác kỵ nước của các gốc
amino acid.
- Protein có nhiều chức năng tế bào như xúc tác, cổng tế bào, nguyên
liệu cấu trúc, sensor môi trường,…
Bioorganic Chemistry

20 amino acid

- 20 amino acid được

ribosome đưa vào protein.
Con người tổng hợp được
11 amino acid, 9 amino acid
còn lại là thiết yếu (histidine,
lysine, methionine hoặc
cystein, phenylalanine hoặc
tyrosine, threonine,
tryptophan, valine).
- Glycine là achiral, cysteine
có cấu hình S và các amino
acid còn lại có cấu hình R.
Bioorganic Chemistry

20 amino acid không phân cực, phân cực, ion hóa

Bioorganic Chemistry

Ký hiệu các amino acid

- Peptide thường chứa 40 amino

acid (khối lượng phân tử <5
kDa).
- Peptide thường có nhiều cấu
dạng khác nhau.
- Peptide thường bắt đầu bằng
đầu N (amino) và kết thúc bằng
đầu C (carboxy).
Bioorganic Chemistry

Hướng của mạch peptide

Mạch peptid được định hướng: các peptid được đọc từ đầu N sang đầu C.
Peptid MRTGNAD và DANGTRM là hai đồng phân cấu tạo của nhau.
Bioorganic Chemistry

Trạng thái ion hóa của các gốc amino acid

- Trạng thái proton hóa và deproton hóa của mỗi nhóm chức được xác định ở pH
sinh lý 7.2. Các nhóm được proton hóa có pKa < 7,2. Các nhóm có pKa > 7.2 có xu
hướng deproton.
- Tỷ lệ dạng proton/deproton được tính theo phương trình Henderson-Haselbach =
10(pKa-pH).
Bioorganic Chemistry

Tương tác protein-protein qua gốc amino acid

- Cấu dạng của protein được xác định bằng tương tác giữa mạch nhánh của các
gốc amino acid. Các tương tác này cũng xác định các tương tác protein-protein,
protein thụ thể-ligand, protein enzyme-cơ chất.
- Bên trong protein các tương tác giữa các nhóm kỵ nước phổ biễn hơn các
tương tác giữa các nhóm phân cực.
- Trong các protein màng, các amino acid thơm có vài trò chính và định hướng
các protein màng khỏi môi trường nước. Các tương tác giữa các mạch nhánh
ưa nước như liên kết hydro đóng góp hạn chế vào việc ổn định và tương tác
của các protein màng.
Bioorganic Chemistry

Tương tác protein-protein qua gốc amino acid

- Phân tích các tương tác mạch nhánh có thể dựa trên tần số xuất hiện của các
amino acid, ví dụ như leucine xuất hiện phổ biến hơn tryptophan 7.6 lần trong
protein người.
- Các tương tác giữa các mạch nhánh không phân cực như Phe-Phe, Ile-Ile, Ile-
Leu là phổ biến hơn cũng như các tương tác cation-p.
- Các tương tác ion cầu muối như Asp-Arg hoặc Glu-Lys là ít phổ beiens hơn
trong khi các liên kết hydro như Ser-Thr và Asn-Gln kém phổ biến trong protein.
Nguyên nhân là do năng lượng cao cần cho sự desolvat hóa các mạch nhánh
phân cực như arginine, acid glutamic, acid aspartic, glutamine, asparagine,
histidine. Ví dụ như cần cân đối giữa tương tác ion aspartate carboxylat và
lysine ammonium hoặc liên kết hydro giữa serine và threonien với năng lượng
tương tác với môi trường nước.
- Các mạch nhánh béo như leucine, isoleucine, valine và alanine có thể được
desolvat hóa thuận lợi về nhiệt động học hơn.
Bioorganic Chemistry

Tương tác protein-protein qua gốc amino acid

- Phân tích các tương tác mạch nhánh có thể dựa trên tần số
xuất hiện của các amino acdi, ví dụ như leucine xuất hiện phổ
biến hơn tryptophan 7.6 lần trong protein người.
- Các tương tác giữa các mạch nhánh không phân cực như
Phe-Phe, Ile-Ile, Ile-Leu là phổ biến hơn cũng như các tương
tác cation-p.
- Các tương tác ion cầu muối như Asp-Arg hoặc Glu-Lys là ít
phổ biến hơn trong khi các liên kết hydro như Ser-Thr và Asn-
Gln kém phổ biến trong protein. Nguyên nhân là do năng
lượng cao cần cho sự desolvat hóa các mạch nhánh phân
cực như arginine, acid glutamic, acid aspartic, glutamine,
asparagine, histidine. Ví dụ như cần cân đối giữa tương tác
ion aspartate carboxylat và lysine ammonium hoặc liên kết
hydro giữa serine và threonien với năng lượng tương tác với
môi trường nước.
- Các mạch nhánh béo như leucine, isoleucine, valine và
alanine được desolvat hóa thuận lợi về nhiệt động học hơn.
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc bậc hai và liên kết hydro

- Cấu trúc bậc hai bao gồm các dạng khác nhau của liên kết hydro giữa các mạch
peptid (khung amid) .
- Các dạng cấu trúc bậc hai phổ biến mô tả sự gấp của protein bao gồm chuỗi xoắn
alpha, tấm xếp nếp beta và vòng xoắn.
- Phân tích cấu trúc tinh thể cho thấy sự thuận lới của liên kết hydro giữa các nhóm
N-H và C=O. Lực liên kết phụ thuộc vào dạng hình học. Liên kết hydro lý tưởng ưu
tiên dạng góc thẳng N-H…O và khoảng cách khoảng 1.93 angstrom. Liên kết
C=O…HN thường nằm trong mặt phẳng nhóm carbonyl với góc nhỏ hơn 110o.
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc chuỗi xoắn alpha

- Nhóm C=O của mỗi gốc I

không tạo liên kết hydro với
nhóm N-H của gốc I và gốc
i+1.
- Với gốc i+2 không có trong
các cấu trúc bậc hai lặp lại, có
thể có trong vòng xoắn cô lập
gamma.
- Xoay chuỗi peptid quay phải
có thể có với gốc i+3 chuỗi 310
(vói 10 là số nguyên tử trong
vòng được tạo thành bằng liên
kết hydro).
- Với i+4 chuỗi xoắn alpha ổn
định và phổ biến hơn. Chuỗi
lặp lại 7 gốc mỗi hai vòng
xoắn. Cần khoảnng 7 vòng (21
gốc amino acid) cho các Sự lặp lại của các liên kết hydro giữa nhóm C=O
protein xuyên màng. của mỗi gốc i với nhóm N-H của mỗi gốc i+4.
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc chuỗi xoắn alpha

- Macrodipole chuỗi xoắn: Chuỗi xoắn alpha rất phân cực vì

tất cả các nhóm carbonyl được định hướng cùng phía. Đầu
N của protein là dương điện và đầu C là âm điện. Enzyme sử
dụng đầu N của chuỗi xoắn alpha để ổn định trạng thái
chuyển tiếp âm ở vị trí hoạt động.
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc tấm xếp nếp beta

- Tấm xếp nếp beta : Liên kết hydro giữa các các mạch khác nhau ở dạng song
song hoặc phản song song. Dạng phản song song phổ biến hơn vì được ổn định
bởi nhiều liên kết hydro thẳng hơn.
- Dạng này ưu tiên các amino acid phân nhánh beta như valine, isoleucine,
threonine. Proline bẻ gãy tấm xếp nếp beta, cũng như không ưu tiên chuỗi xoắn
alpha.
Tấm xếp nếp beta không
phẳng, có bề mặt cong và
lớn cho sự tập hợp
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc vòng với liên kết hydro tối thiểu

- Cấu trúc vòng giúp mạch protein thay đổi hướng ví dụ như với các protein có dạng
cầu.
- Dạng này thường được tìm thấy phía ngoài protein với các liên kết hydro. Các vị
trí này là phổ biến cho tương tác liên kết protein khi có các liên kết hydro với mạch
xương sống.

- Phổ biến nhất là dạng vòng beta bao gồm một liên kết hydro giữa nhóm carbonyl
của gốc i với N-H của gốc i+3. Mạch nhánh ở i+1 thường làm mất ổn định cấu trúc
vòng xoắn qua tương tác không gian.

- Vòng gamma bẻ mạch

peptid qua một góc phải
bao gồm một liên kết
hydro giữa nhóm carbonyl
của gốc i và nhóm N-H
của gốc i+2.
Bioorganic Chemistry

Vòng (turn) và nút thắt (loop)

- Vòng là cấu trúc có trật tự được ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử.
- Nút thắt không được định nghĩa rõ và thường có các gốc ưa nước và được tìm
thấy trên bề mặt của protein. Nút thắt có 4-5 gốc amino acid được gọi là vòng và
có liên kết hydro nội phân tử.
- Nút thắt và vòng nối các cấu trúc chuỗi xoắn alpha và tấm xếp nếp beta. Chuỗi
polypeptid được thay đổi hướng cho phép nó gập lại và tạo cấu trúc chặt hơn.
- Vòng beta (hay vòng ngược) khi mạch polypeptid đổi hướng 180o. Vòng thường
nối hai beta liền kề trong một tấm xếp nếp beta.

Dạng 1: liên kết hydro

C=O (Phe) và N-H (Gly).
Dạng 2: liên kết hydro
C=O (Val) và N-H (Asn).
Bioorganic Chemistry

Sự quay tự do trong alkene, amide và ester

- Amide và ester có một phần liên

kết đôi, trong amide là khoảng 40%.
Đặc tính liên kết đôi trong ester thấp
hơn trong amide.
- Trong amide đồng phân trans có
cấu hình Z.
- Hiệu ứng lập thể điện tử: các đồng
phân trans của amide và ester bền
hơn của alken. Ở alken hiệu ứng
chủ yếu là hiệu ứng không gian

Orbital sigma* của C-O của ester

và amide là các nhóm nhận điện
tử tốt và cặp điện tử của nhóm
carbonyl của ester cho điện tử tốt
hơn liên kết sigma N-H.
Bioorganic Chemistry

Cấu dạng và sự gấp protein

- Sức căng allyl giải thích sự ưu tiên của hai dạng cấu trúc bậc hai. Liên kết amide
không quay tự do và thường có dạng cấu hình trans (Z). Cấu dạng của mạch
peptide có thể được mô tả với các góc nhị diện phi và psi. Các góc này là 180o
với mạch peptide được mở rộng hoàn toàn và cấu dạng anti đồng phẳng với mỗi
liên kết. Các góc chi mô tả góc xoắn của mỗi liên kết ở mạch nhánh. Các liên kết
ở mach nhánh thường có xu hướng tiếp nhận cấu dạng mở rộng nhất.
- Biểu đồ hai chiều Ramachandran: biểu diễn các góc phi và psi được tìm thấy
trong số lớn protein khác nhau.
- Hai dạng sức căng allyl giới hạn các cấu dạng cho thấy các chuỗi xoắn alpha và
tấm xếp nếp beta là các vùng đươc chiếm nhiều nhất.
Bioorganic Chemistry

Sức căng allyl giới hạn cấu dạng

Tương tác giữa các nhóm thế allyl và nhóm thế
alken là sức căng A1,2 và A1,3 giới hạn các cấu
dạng. Các cấu dạng đặt các nhóm thế allyl trong
cùng một mặt phẳng như một nhóm thế cis tương
tác không gian lớn. Sức căng A1,3 mạnh hơn A1,2.

Một số cấu dạng được ưu tiên về năng

lượng. Tác dụng của sức căng allylic
đáng kể nhất khi alken có một nhóm
thế cis với carbon thế allyl.

A1,3 ưu tiên cấu dạng allylic trong các

phân tử sinh học có liên kết amide hoặc
ester. Khuynh hướng góc phi của
peptide xoắn khỏi sự đồng phẳng ưu
tiên tấm xếp nếp beta.
Bioorganic Chemistry

Hóa học liên kết disulfide

Cystein tự do không phổ biến

trong kháng thể và miền ngoại
bào của protein màng. Cystein dễ
dimer hóa với oxi ngoài tế bào
thành liên kết disulfide. Trong tế
bào là môi trường khử không
thuận lợi sự tạo thành disulfide.

- Khử hóa hóa học liên kết disulfide với DTT (dithiothreitol) và TCEP (tris-
carboxyethylphosphine).
- Nêu sự đổi chỗ liên kết disulfide chậm, protein có thể có các cấu dạng gấp
không đúng kết quả từ các liên kết chéo disulfide không đúng vị trí.
Bioorganic Chemistry

Sự trao đổi disulfide

- Disulfide có thể chịu sử trao đổi nhanh với các thiol tự do trong điều kiện pH sinh
lý. Thiol là nucleophile và là chất đệm cho việc hấp thụ các chất oxi hóa. Các tế
bào sử dụng glutathiol làm thiol, dạng khử được ký hiệu là GSH và dạng oxi hóa,
disulfide được ký hiệu là GSSG.

- Cơ chế trao đổi disulfide bao gồm sự tấn công SN2 của anion thiolate vào
disulfide. Glutathione và cystein thiol có giá trị pKa khoảng 8.8, có 5% thiol ở dạng
nucleophile anion thiolate rất phản ứng.
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc protein

- Cấu trúc bậc một: trình tự amino acid của protein.
- Cấu trúc bậc hai: thành phần protein bao gồm số lượng và vị trí
của các chuỗi xoắn alpha, tấm xếp nếp beta và vòng xoắn.

- Cấu trúc bậc ba: các cấu trúc bậc hai có

thế gấp thành dạng phức tạp hơn. Các
tương tác giữa các chuỗi xoắn alpha và
tấm xếp nếp beta dẫn đến các vùng nhỏ
của protein (thường nhỏ hơn 100 gốc
amino acid) (domain). Các vùng có thể
gấp độc lập khi được tách khỏi cấu trúc
protein lớn hơn.
- Cấu trúc bậc ba có thể chứa một vùng
đơn hoặc các vùng nhiều phần.
- Cấu trúc bậc bốn: tương tác giữa các
miền và các cấu trúc bậc ba. Các cấu
trúc bậc bốn có thể tương tác với nhau
định hướng hoặc không định hướng tạo
thành các tập hợp sinh học.
Bioorganic Chemistry

Vùng protein
- Vùng protein (domain) là các đơn vị module của cấu trúc protein.
- Protein domain chứa sự sắp xếp của các chuỗi xoắn alpha, dải beta, vòng xoắn
và vòng. Chúng tạo thành các cấu trúc bền, thậm chí khi được tách ra khỏi cấu
trúc protein lớn hơn.
Các vùng protein phổ biến của protein con người
Bioorganic Chemistry

Vùng protein
Bioorganic Chemistry

Vùng protein
Bioorganic Chemistry

Vùng protein
Bioorganic Chemistry

Vùng protein trong truyền tín hiệu tế bào

- Vùng protein kinase (protein kinase domain) và vùng bảy-xuyên màng (seven-
transmembrane domain) là các yếu tố phổ biến trong con đường truyền tín hiệu từ
bên ngoài vào bên trong tế bào kiểm soát quá trình phiên mã trong tế bào người.
- Protein kinase là enzyme phổ biến trong con người chuyển biến hoạt tính enzyme,
vị trí tế bào, tương tác với các protein khác của các protein bằng cách phosphoryl
hóa (thêm nhóm phosphat). Phần lớn protein kinase là serine/threonine và tyrosine.
- Vùng bảy-xuyên màng là là thụ thể (7TM) có 7 chuỗi xoắn alpha trong màng tế bào.
Các chuỗi xoắn của 7TM tạo thành vị trí liến kết thuận nghịch các phân tử truyền tín
hiệu nhỏ và hormon.

- Trong thụ thể liên kết protein G

rhodopsin aldehyd ligand retinal liên kết Retinal là một phân
với một gốc lysine qua liên kết imine. tử carotenoid (màu
Sự đồng phân hóa liên kết đôi trong vàng) nhạy sáng
retinal từ cấu hình trans sang cấu hình liên kết cộng hóa trị
cis và sự thay đổi cấu dạng được truyền với thụ thể 7TM.
đến protein cho sự tương tác với tế bào.
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc bậc ba của protein

- Cấu trúc bậc ba là một chuỗi protein độc lập chứa một (single domain) hoặc nhiều
vùng protein (multiple domain).
- Trong nhiều trường hợp các vùng protein giúp tạo cấu dạng lớn, bền của protein,
trong các trường hợp khác chúng đưa lại chức năng module cho protein.

Tyrosine kinase Src là ví dụ của protein

với các vùng cùng hoạt động để điều
chỉnh hoạt tính protein. Rous sarcoma
virus mã hóa Src phosphoryl hóa nhiều
protein của các tế bào gà nhiễm virus
dẫn đến sự phát triển tế bào không kiểm
soát và khối u.

Các tế bào gà thường chứa kinase c-Src có hai vùng liên kết peptide kiểm soát hoạt
tính vùng xúc tác kinase. Vùng kinase không hoạt động khi vùng SH2 liên kết vào
peptide đầu C với gốc phosphotyrosien ở vị trí 527. Dạng này được ổn định bằng
liên kết yếu của vùng SH3 với một linker peptide liên kết SH2 với vùng xúc tác.
Vùng xúc tác được giải phóng bằng sự dephosphoryl hóa Tyr527 hoặc bằng protein
hoạt hóa Scr với polyproline SH3 ligand và phóphotyrosine SH2 ligand.
Bioorganic Chemistry

Cấu trúc bậc bốn của protein

- Cấu trúc bậc bốn chứa các tập hợp của các protein
độc lập.
- Các protein được tập hợp thành một phức lớn hơn
bằng các liên kết không cộng hóa trị.

Sự tạo thành có kiểm soát

cấu trúc bậc bốn (các fibril
collagen).

- Protein bảo quản sắt ferritin là phức của 24 phân tử

protein được gấp độc lập với nhau. Cấu trúc bậc
bốn bao các cụm ion sắt, ngăn cản các ion sắt khỏi
phản ứng oxi hóa khử.
- Các ví dụ khác như immunoglobulin, collagen, ADN
gyrase, histone, ADN polymerase, ribosome.
Bioorganic Chemistry

Protein enzyme và thụ thể

Cấu dạng Gauche của

acetylcholine

Hiệu ứng lập thể điện tử của glycerol ưu

tiên cấu dạng gauche: 2 orbital sigma C-H
đẩy điện tử vào 2 orbital sigma * C-O
Bioorganic Chemistry

Enzyme acetylcholinesterase

- Enzyme ở gần thụ thể choline.

- Mỗi enzyme có 3 nhánh và 4 tiểu đơn
vị protein, 12 vị trí hoạt động.
- Dạng enzyme tan có ở mô và huyết
tương là butyrocholinesterase có thể
thủy phân nhiều loại ester.
Bioorganic Chemistry

Enzyme acetylcholinesterase

- Histidine xúc tác

acid-base.
- Serine nucleophile.
- Glutamate tương tác
với histidine định
hướng và hoạt hóa
vòng.
Bioorganic Chemistry

Thuốc ức chế enzyme acetylcholinesterase

- Nhóm carbamate cần

thiết cho hoạt tính ức
chế enzyme.
- Vòng benzene cần
thiết cho tương tác.
- Vòng pyrrolidine cần
thiết cho tương tác và
được ion hóa ở pH
máu.
Bioorganic Chemistry

Thụ thể acetylcholine

Antagonist không hoạt hóa thụ thể

Phân tử truyền tín hiệu và thụ thể giả thiết

Agonist hoạt hóa thụ thể

Bioorganic Chemistry

Thụ thể acetylcholine

Antagonist Tubocurarine
với thụ thể nicotine

Thụ thể muscarine là thụ thể ghép cặp

protein G với 5 dạng M1-M5. Các tiểu dạng
này tập trung ở các mô cụ thể. M2 chủ yếu
ở tim và M4 ở CNS. M1, M3, M5 liên quan
đến quá trình truyền tín hiệu của chất
truyền tín hiệu thứ cấp inositol phosphate
(IP3). M1 và M4 bao gồm sự ức chế chất
truyền tín hiệu thứ cấp AMP vòng.

Agonist Atropine và Propantheline bromide hoạt hóa thụ thể muscarine

Bioorganic Chemistry

Ôn tập

1) Nguyên lý tổng hợp liên kết peptide

2) Các nhóm bảo vệ. Sự chọn lọc trong sử dụng các nhóm bảo vệ
3) Hóa học Boc và Fmoc trong bảo vệ nhóm chức mạch nhánh
4) Phản ứng ghép cặp với carbodiimide
5) Các phản ứng phụ trong tổng hợp peptide. Cách khắc phục các phản
ứng phụ
6) Nguyên lý tổng hợp pha rắn (SPPS)
7) Các loại nhựa ứng dụng trong tổng hợp pha rắn
8) Hóa học Boc và Fmoc trong lựa chọn nhựa pha rắn
9) Phương pháp thắt hóa học
10) Sự tự cắt nối protein và ứng dụng trong tổng hợp peptide mạch dài
Bioorganic Chemistry

Thuốc peptide
Bioorganic Chemistry

Thuốc peptide thiên nhiên và tổng hợp

Bioorganic Chemistry

Nguyên lý tổng hợp peptide

- Các nhóm đầu C và đầu N
được bảo vệ để tránh sự
polymer hóa.
- Các nhóm mạch nhánh được
bảo vệ để tránh các sản phẩm
phụ và sự phân nhánh.
- Các nhóm bảo vệ đầu N và
đầu C cần được loại bỏ không
ảnh hưởng đến các nhóm bảo
vệ mạch nhánh.

- Tổng hợp thường đi từ đầu C->N vì sự đóng vòng nội phân tử từ nhóm
carbonyl (amide) vào nhóm carbonyl được hoạt hóa chỉ phá hủy tác nhân phản
ứng. Nếu tổng hợp đi từ đầu N->C sự đóng vòng sẽ phá hủy cả peptide.
- Sự đóng vòng được hạn chế bằng cách sử dụng nhóm bảo vệ đầu N
carbamate thay cho nhóm bảo vệ amide.
- Nhóm bảo vệ carbamate có thể được loại bỏ chọn lọc không làm ảnh hưởng
đến mạch nhánh và các nhóm bảo vệ đầu C.
Bioorganic Chemistry

Nguyên lý tổng hợp peptide

- Nhóm t-Boc (t-butoxycarbonyl)

bảo vệ đầu N và mạch nhánh
lysine (nhóm amine được bảo
vệ bằng một nhóm nhạy base).
- Loại bỏ với điều kiện acid yếu
(TFA/CH2Cl2) (SN1).
- Nhóm amine giải phóng dưới
dạng ion ammonium.

- Nhóm Fmoc (fluorenylmethoxy-

carbonyl) bảo vệ đầu N và loại
bỏ với điều kiện base
(piperidine/DMF) (E1CB).
- Nhóm amine giải phóng dưới
dạng tự do tham gia vào phản
ứng ghép cặp tiếp theo.
Bioorganic Chemistry

Nhóm bảo vệ mạch nhánh

- Các nhóm bảo vệ mạch nhánh

được loại bỏ khi tách mạch
peptide khỏi nhựa.
- Khi peptid được bảo vệ đầu N
với nhóm Boc phải bền với
CF3CO2H (TFA). Sau khi mạch
peptide được tạo thành các điều
kiện acid manh như HF hoặc
CF3SO3H (TFMSA) được dùng
để tách khỏi nhựa và loại nhóm
bảo vệ mạch nhánh. Benzyl
được sử dụng với các nhóm
halogen điều chỉnh khả năng
phản ứng.
- Khi peptide được tổng hợp với
Fmoc chúng bền với điều kiện
kiềm. Trityl (triphenylmethyl) và t-
butyl bảo vệ mạch nhánh. Các
nhóm này kém bền hơn benzyl
và có thể tách bằng TFA.
Bioorganic Chemistry

Nhóm bảo vệ mạch nhánh

- Hóa học Boc và Hóa học Fmoc

- Mạch nhánh chứa H, alkyl, aryl: không cần nhóm bảo vệ

- Mạch nhánh chứa OH: bảo vệ với t-Bu ether (loại bỏ với TFA).
- Mạch nhánh chứa CO2H: bảo vệ với t-Bu ester (loại bỏ với TFA).
- Mạch nhánh chứa SH: bảo vệ với trityl, acetyl (bền acid, loại bỏ với ion thủy
ngân (II) hoặc t-butyl (bền acdi, loại bỏ với thiol).
- Mạch nhánh chứa CONH2: bảo vệ với trityl.
- Mạch nhánh chứa nhóm base hoặc imidazole: bảo vệ với Boc (Lys) hoặc trityl
(histidine) .
Bioorganic Chemistry

Phản ứng ghép cặp với carbodiimide

- Tác nhân tách nước trong

tổng hợp peptide là DIC
(N,N’-diisopropylcarbodi-
imide) hoặc DCC (N,N’-
dicyclohexylcarbodiimide).
- Amine không cạnh tranh với
ion carboxylate do ở dạng
proton hóa.
- Ghép cặp DCC chậm trong
điều kiện kiềm mạnh vì nồng
độ carbodiimide được proton
hóa thấp.
- Tổng hợp peptide có thể kèm
theo các phản ứng phụ.

- Phương pháp tổng hợp anhydride: Khi không có amine ion carboxylate tấn công
O-acylurea và tạo thành một anhydride đối xứng.
Bioorganic Chemistry

Các phản ứng phụ trong tổng hợp peptide

- Tổng hợp peptide có thể kèm theo các phản ứng phụ.

- Chuyển dịch acyl O->N: phản ứng

phụ này phá hủy tác nhân acid
carboxylic trong tổng hợp với sự
ghép cặp carbodiimide.
- Amine cần tấn công nhanh để hạn
chế chuyển dịch acyl O->N. Các
yếu tố ảnh hưởng là cản trở không
gian, tính nucleophile của amine,
nồng độ amine.
- Các amino acid cản trở không gian
có mạch nhánh ở Cb như
threonine, isoleucine và valine.
- Có thể dùng dư amino acid và tác
nhân ghép cặp.
Bioorganic Chemistry

Các phản ứng phụ trong tổng hợp peptide

- Sự tạo thành azalactone từ mạch peptide: azalactone phản ứng tiếp với amine
dẫn đến sự epimer hóa.
- Các azalactone là acid do các enolate tạp thành là các hợp chất thơm.
- Các sản phẩm epimer hóa khó tách khỏi các sản phẩm peptide.
- Sự tạo thành azalactone nhanh khi acyl là các nhóm amide và chậm khi là các
carbamate như t-Boc hoặc Fmoc.
- Tổng hợp peptide thường không được thực hiện bằng cách thêm vào đầu C của
một peptide.
Bioorganic Chemistry

Tác nhân HOBt trong ghép cặp carbodiimide

- Tác nhân 1-hydroxybenzotriazole

(HOBt) giảm phản ứng phụ trong
tổng hợp peptide bằng cách
chuyển O-acylisourea thành tác
nhân acyl hóa benzotriazolyl
ester in situ.
- Các HOBt ester chống được sự
azalactone hóa.
- Một đương lượng mole HOBt
được thêm vào acid carboxylic và
tác nhân ghép cặp.

- Sự tạo thành chậm các azalactone giảm được sự epimer hóa ở Ca.
Benzotriazolyl ester phản ứng đủ nhanh với đầu N của peptide để kéo dài mạch
peptide.
Bioorganic Chemistry

Tác nhân BOP tổ hợp với HOBt

- Benzotriazolyl phosphonium
(BOP) tổ hợp với HOBt có cả
hai chức năng tác nhân tách
nước và xúc tác chuyển nhóm
acyl.
- BOP cần sử dụng 1 đương
lượng mole i-Pr2NEt (base
Huenig, một base cồng kềnh)
- Py-BOP là tác nhân thay thế
cho BOP do sản phẩm chứa
nhóm pyrrolidine thay cho
nhóm dimethylamino.

- Cơ chế ghép cặp BOP: Phản ứng được chuyển dịch cân bằng do sự tạo thành
sản phẩm có liên kết P=O bền.
Bioorganic Chemistry

Tác nhân ghép cặp uronium

- Tác nhân ghép cặp benzotriazolyluronium cho sự tạo thành nhanh amide.
- HBTU tổ hợp một tác nhân tách nước với HOBt. Một đương lượng mole base cần
được thêm vào để ngăn amine bị proton hóa bới acid carboxylic.
- HATU là aza analog của HBTU cho tốc độ ghép cặp nhanh.
- DEBT được sử dụng do cản sự racemic hóa qua phản ứng azalacton hóa được
họat hóa xúc tác bằng base của chất trung gian ester .
Bioorganic Chemistry

Tổng hợp peptide pha rắn (SPPS)

- Tổng hợp peptide pha rắn (SPPS) có thể tổng hợp được peptide với 50 gốc
amino acid. Các peptide lớn hơn được tổng hợp tốt nhất sử dụng vi khuẩn
(bacterial overexpression).
- Tổng hợp pha rắn: thuận lợi tách bỏ lượng dư tác nhân và các sản phẩm phụ.
- Robert Bruce Merrifield (Nobel Prize 1984) liên kết peptide vào một polymer
không tan do đó lượng dư tác nhân có thể được rửa mà không bị mất sản
phẩm.
- Sự chọn lọc trong SPPS: nhựa liên kết peptide, amino acid với nhóm bảo vệ, tác
nhân tách mạch peptide.
Bioorganic Chemistry

Tổng hợp peptide pha rắn (SPPS)

- Nhựa Merrifield: Polystyrene được chức hóa với

formaldehyde và kẽm chloride thành chloromethyl
polystyrene. Amino acid đầu tiên được thêm vào qua liên kết
ester.
- Nhựa Merrifield dùng cho dung môi ít phân cực.

- TentagelTM: Polystyrene không được solvat

hóa với nước hoặc alcohol do đó nhựa được
chức hóa với poly(ethyleneglycol) (PEG) và
được solvat hóa bằng nhiều dung môi.
- Linker PEG tạo độ tan với các dung môi có
hydroxy như nước và alcohol.
Bioorganic Chemistry

Phân cắt peptide được tổng hợp

- N-Boc: các liên kết phải bền với TFA sau mỗi bước tổng hợp liên kết peptide.
- Nhựa Merrifield: 0,65% peptide bị tách khỏi nhựa bằng phản ứng SN1 với dung
môi sau mỗi vòng loại bỏ nhóm bảo vệ Boc với TFA.
- Bảo vệ nhóm ester với PAM: Một phenylacetamidomethyl (PAM) linker được gắn
vào và proton hóa nhanh hơn nhóm ester làm cho nhóm ester bền hơn 100 lần
với sự ion hóa.
- Peptide được tách khỏi nhựa theo cơ chế SN2 bằng acid mạnh như HF, TMFSA
(CF3SO3H, trifluoromethanesulfonic acid).
Bioorganic Chemistry

Phân cắt peptide được tổng hợp

- Khi nhóm tách là carboxamide (ưu tiên hơn

carboxylate với điện tích âm ở đầu C) nhựa
methylbenzhydrylamine (MBHA) được sử
dụng trong SPPS.
- Nhựa MBHA cho phép phản ứng theo cơ chế
SN1 cắt đứt liên kết carbon-nitơ tạo ra nhóm
carboxamide ở đầu C trong điều kiện sử dụng
HF hoặc TFMSA.

- Khi nhóm bào vệ là Fmoc peptide qua các bước tách nhóm bảo vệ bằng
base và ghép cặp. Các linker nhạy acid được sử dụng cho phép bước tách
nhóm bảo vệ và tách khỏi nhựa được thực hiện trong các điều kiện êm dịu
hơn sử dụng nhóm bảo vệ Boc như với TFA.
- Hai loại nhựa được sử dụng cho Fmoc là nhựa chlorotrityl và nhựa amide
Rink.
Bioorganic Chemistry

Phân cắt peptide được tổng hợp

- Nhựa chlorotrityl tạo cation triphenylmethyl bền dẫn đến sự phân cắt SN1.
- Nhựa Rink cho carbocation rất bền, thuận lợi cho phản ứng theo cơ chế SN1 cắt
đứt liên kết carbon-nitơ tạo ra nhóm carboxamide ở đầu C.
Bioorganic Chemistry

Phương pháp thắt hóa học tự nhiên

- Các peptide được bảo vệ có độ tan kém trong dung môi hữu cơ và nước, hạn chế
chiến lược tổng hợp các peptide mạch dài từ việc liên kết các đoạn peptide ngắn
hơn.
- Thắt hóa học tự nhiên (Native chemical ligation) tổng hợp amide qua aminolysis
của các thiol ester trong môi trường nước. Các mảnh peptide không cần được
bảo vệ trong môi trường nước.
- Phương pháp đòi hỏi một thành phần peptide có nhóm cysteine ở đầu N, các
thành phần peptide khác có một thioester ở đầu C.
- Thioester chịu sự trao đổi nhanh trong các điều kiện sinh lý. Các thioester dẫn
xuất từ cysteine chịu sự dịch chuyển S->N, tạo thành một liên kết peptide mới.
Bioorganic Chemistry

Phương pháp thắt hóa học tự nhiên

- Khả năng phản ứng của nhóm thioester. Thioester trao đổi nhanh ở điều kiện pH
sinh lý khi có dư tác nhân thiol. Thioester cũng tương đối bền với sự thủy phân ở
pH 7.0.
- Giá trị pKa thấp của thiol cystein (khoảng 9.0.
- Sự chuyển nhóm acyl S->N đi qua một trạng thái chuyển tiếp vòng năm.
Bioorganic Chemistry

Sự tự cắt nối protein (Protein self-splicing)

- Intein được tách khỏi chuỗi protein
- Một gốc asparagine (Asn) tấn công liên kết amide, cắt
đứt intein và giải phóng nhóm amino tham gia vào
chuyển nhóm acyl S->N
- Chuyển nhóm acyl N->S (amide -> thioester)
- Chuyển nhóm acyl S->N (thioester -> amide)
Bioorganic Chemistry

Sự tự cắt nối protein bán tổng hợp protein

- Phương pháp thắt protein được biểu hiện: Một peptide tổng hợp được gắn với đầu C của
một protein và có thể bao gồm các amino acid không thiên nhiên. Phương pháp sử dụng
biểu hiện gen trong E. coli để tổng hợp các protein.
- Intein được gắn vào vùng liên kết chitin (CBD) và protein được biểu hiện liên kết cộng hóa
trị với intein. Intein chuyển acyl N->S của protein liên kết với hạt gắn với chitin. Các hạt gắn
chitin ưu tiên chỉ bắt các protein tái tổ hợp trong khi các protein khác được rửa đi.
- Thiophenol được thêm vào để giải phóng protein dưới dạng phenyl thioester. Thioester này
được dùng trong thắt hóa học để tông hợp peptide với một gốc cystein ở đầu N.
Bioorganic Chemistry

Ôn tập

1) Vai trò enzyme và thụ thể của protein

2) Động học enzyme, hiệu quả của enzyme qua các hằng số kcat và Km
3) Protein kinase. Cơ chế xúc tác phosphoryl hóa
4) Protein protease. Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết peptide
5) Phân loại protease
6) Enzyme và cofactor
7) Các cofactor hữu cơ vitamin B
8) Vai trò của thiamine pyrophosphate cho enzyme pyvurate
decarboxylase
9) Vai trò của niacine cho oxidoreductase
10) Vai trò của pyridoxal cho decarboxydase, hydroxymethyltransferase
và aminotransferase
Bioorganic Chemistry

Chức năng enzyme của protein

- Sinh tổng hợp sử dụng enzyme cho các hợp chất cần thiết cho tế bào.
- Các enzyme cần có sự hoạt hóa qua sự định vị, phân cắt, hoặc hoạt hóa bởi
các phân tử nhỏ, không phải là cơ chất.
- Các enzyme có sự đặc thù trong chuyển hóa các hợp chất.
- Liên kết không cộng hóa trị là cần thiết cho tất cả các quá trình sinh hóa như
liên kết protein truyền tín hiệu, cơ chất enzyme và ligand thụ thể.

- Một phức enzyme-cơ chất (E.S) có hai con đường: phân ly với hằng số tốc độ
koff hoặc chuyển thành phức enzyme-sản phẩm với hằng số tốc độ kcat.
Bioorganic Chemistry

Mức độ hiệu quả của enzyme

- Mức độ hiệu quả của enzyme được đo bằng liên kết cơ chất và sự xúc tác.
- Hằng số Michaelis Km được sử dụng để mô tả tương tác enzyme-cơ chất như là
hằng số cân bằng cho sự tạo thành phức E.S. Km được coi là hằng số phân ly
enzyme-cơ chất, xác định cơ chất liên kết chặt như thế nào với enzyme.
- Hiệu quả enzyme được xác định bằng tỷ số kcat/Km.

Nồng độ cơ chất gấp 10 lần Km

Bioorganic Chemistry

Mức độ hiệu quả của enzyme

- Ở điều kiện Vmax phần lớn vị trí hoạt động
của enzyme được liên kết với cơ chất, tốc
độ của phản ứng xúc tác phụ thuộc vào
nồng độ enzyme.
- Bước xúc tác của enzyme là phản ứng
nội phân tử vì cơ chất đã được liên kết vào
enzyme.

Phần lớn enzyme

không hoạt động
nếu nồng độ cơ
chất ít nhất không
bằng Km.
Bioorganic Chemistry

Gen mã hóa protein enzyme người

EC1, oxidoreductase xúc tác phản ứng oxi hóa, khử hóa. EC2, transferase xúc tác
chuyển nhóm chức như phosphoryl, đường, nucleotide. EC3, hydrolase xúc tác thủy
phân nhóm chức như amide. EC4, lyase phân cắt liên kết qua cơ chế khác thủy phân
và redox. EC5, isomerase xúc tác sự đồng phân không thay đổi cấu tạo. EC6, ligase
xúc tác sự thắt hai phân tử độc lập. Enzyme pullulanase thủy phân liên kết O-
glycoside. Synthase (synthetase) xúc tác với phân tử năng lượng cao như ATP.
Bioorganic Chemistry

Protein kinase

- Protein kinase và protease xúc tác qua cơ chế nhiều bước.

- Protein kinase xúc tác sự chuyển nhóm gamma-phosphate của 2Mg2+.ATP đến
một nhóm chức protein, thường là nhóm hydroxy của serine, threonine hoặc
tyrosine. Mg2+ trung hòa điện tích của triphosphate và điện tích ở trạng thái
chuyển tiếp.
Bioorganic Chemistry

Cơ chế xúc tác của protein kinase

- Protein kinase có các gốc lysine và aspartate được bảo tổn ở vùng hoạt động.
- Gốc aspartate giúp deproton hóa nhóm hydroxy serine.
- Nhóm serine alkoxide tấn công phosphate, tạo thành chất trung gian
phosphorane, tách nhóm beta-phosphate của nhóm tách ADP.
Bioorganic Chemistry

Protease trong sự phân hủy và truyền tín hiệu

- Protease thủy phân liên kết trong protein và peptide. Trypsin, chymotrypsin,
elatase và carboxypeptidase trong đường ruột thủy phân protein thành peptide và
amino acid. Collagenase, eslatase và caththepsin K thủy phân các protein ngoại
bào. Các protease nội tế bào thủy phân protein thành amino acid building block.
- Protease chọn lọc chuỗi trong sự tổn thương và các con đường truyền tín hiệu
giữa các tế bào và trong các tế bào như plasmin, stromelysin, collagenase,
gelatinase, clotting factors VII-XII trong sự vón cục máu (thrombosis).
- Zymogen (pro-protease): enzyme được hoạt hóa qua sự biến đổi cộng hóa trị.

- Các protease chọn lọc chuỗi nội bào caspase trong các
con đường apoptosis (dẫn đến sự phân mảnh ADN) như
caspase-8, caspace-3, caspace-9. Caspace 3 phân cắt
ICAD (chất ức chế DNAse hoạt hóa caspase). Khi chất
ức chế được phản hoạt hóa, DNAse giải phóng AND.
Caspase-10 đươc hoạt hóa bằng phức Fas-FADD.
Caspase-10 phân cắt và hoạt hóa caspase-7; caspase-7
hoạt hóa MAP kinase dẫn đến sự chết tế bào.
Bioorganic Chemistry

Cysteine protease
- Protease người hoạt động qua cơ chế: xúc tác nucleophile, hoạt hóa ion kim loại,
xúc tác acid. Có hơn 500 protease chủy yếu là serine (176), threonine (27), cysteine
(143), metalloprotease (186) và aspartic protease (21).
- Cysteine protease xúc tác thủy phân liên kết amide qua nhóm cystein thiolate
nucleophile.
Bioorganic Chemistry

Cysteine protease

- Nguyên lý trạng thái chuyển tiếp tối thiểu: tối thiểu số trạng thái chuyển tiếp khác
nhau được ổn định bằng enzyme. Cơ chế enzyme của caspase-1 chuyển hóa
interleukin-1 beta bao gồm nhiều trạng thái chuyển tiếp tương tự.
Bioorganic Chemistry

Serine protease
- Các protease nucleophile sử
dụng ba gốc xúc tác: aspartate,
histidine và hoặc là serine,
threonine hoặc cysteine. Serine
protease thủy phân liên kết amide
sử dụng nucleophile alkoxide.
- Bước 1 là sự chuyển proton từ
serine hydroxyl vào histidine
(imidazole) và sau đó nhóm
aspartate. Serine alkoxide tấn
công liên kết amide. Amine tách
ra sau khi có sự proton hóa với
mạch imidazole và acid aspartic.
Nước có thể liên kết vào vị trí
nhóm tách amine và vòng
imidazole deproton nước; ion
hydroxide thủy phân chất trung
gian ester serine.
Bioorganic Chemistry

Metalloprotease
- Metallprotease sử dụng các ion Zn2+ để duy trì cấu trúc hoặc tham gia trực tiếp
vào sự xúc tác. Ion kẽm là một acid Lewis, không hoạt động redox và không có
trường ligand và có thể tiếp nhận nhiều ligand ở các dạng hình học phù hợp.
- Trong mettaloprotease người kẽm thường là ligand với mạch nhánh imidazole của
histidine hoặc mạch nhánh carboxylate của aspartate hoặc glutamate. Khi nước
liên kết vào dạng hình học là tứ diện.

- Trong cơ chế phản

ứng kẽm có vai trò
kép hoạt hóa
nucleophile
hydroxide và
electrophile carbonyl.
Bioorganic Chemistry

Enzyme với cofactor hữu cơ

- Enzyme sử dụng các cofactor

nhằm tăng cường chức năng
xúc tác.
- Các cofactor phổ biến chứa
các kim loại và hợp chất cần
thiết cho hoạt tính xúc tác của
enzyme.
- Các vitamin phức B tan trong
nước là các cofactor phổ biến
như thiamine (B1), ribofavine
(B2), niacin (B3), acid
pantothenic (B5), pyridoxine
(B6), biotin (B7), acid folic (B9)
và cyanocobalamin (B12)..
- Các vitamin nhóm A như
retinol là các chất tan trong
lipid.
Bioorganic Chemistry

Vitamin B1 (Thiamine pyrophosphate)

- Thiamine PP là cofactor cho pyvurate decarboxylase tạo ra ylide được ổn định

qua nhóm chức N-alkylthiazolium.
- Thiazolium là một carbon acid như HCN.
- Deproton hóa thiazolium cho ylide nucleophile có thể tấn công nhóm carbonyl và
khi được liên kết với carbon nó ổn định điện tích âm.
Bioorganic Chemistry

Vitamin B3 (Niacin)
Nhóm dihydropyridine của niacin
cung cấp hydride hoạt động.
Enzyme sử dụng dihydropyridine,
nicotinamide adenine dinucleotide
(NADH) làm chất cho hydride và
pyridinium (NAD+).

Alcohol dehydrogenase 1B (ADH1B) biểu hiện chủ yếu trong gan là enzyme chủ
yếu trong chuyển hóa ethanol trong người. Vị trí hoạt động của ADH1B có 2
cofactor, một nguyên tử kẽm và NAD+. Kẽm thuận lợi cho liên kết anion ethoxide.
Bioorganic Chemistry

Vitamin B6 (Pyridoxal phosphate)

Vòng pyridine của pyridoxal
phosphate (PLP) được proton hóa là
vùng hút điện từ của cả các chuyển
hóa xúc tác và phi xúc tác. Các phản
ứng của pyridoxal bao gồm sự tạo
thành imine với amine bậc một. Ở
dạng proton hóa vòng pyridinium là
vùng hút điện tử ổn định điện tích âm.

Aromatic amino acid decarboxylase sử

dụng pyridoxal cho sự decarboxyl hóa
amino acid như trong sự tạo thành
dopamine, serotonin và histamine
Bioorganic Chemistry

Vitamin B6 (Pyridoxal phosphate)

- Enzyme phụ thuộc pyridoxal như
serine hydroxymethyltransferase xúc
tác cho phản ứng retro-aldol.
- Sự tách proton của nhóm hydroxyl
mạch nhánh thuận lợi cho phản ứng
retro-aldol nối tiếp tạo thành một chất
trung gian enolate.

- Chất mang formaldehyde:

tetrahydrofolate ngưng tụ với
formaldehyde được tạo thành cho
methylene tetrahydrofolate. Chất này
được sử dụng trong tổng hợp ADN
nucleoside acid thimidylic từ ARN
nucleoside acid uridylic với enzyme
thymidilate synthase.
Bioorganic Chemistry

Vitamin B6 (Pyridoxal phosphate)

Sự thiếu hụt enzyme phenylalanine

hydroxylase và lượng dư phenylalanine dẫn
đến sự chậm trí tuệ trong phát triển của trẻ
em dự đoán được bởi nồng độ cao acid
phenylpyvuric trong nước tiểu.

Phản ứng chuyển nhóm amine

được xúc tác bởi amino acid
aminotransferase trong tổng hợp
amino acid. Aminotransferase
xúc tác cho sự tautomer hóa
chuyển alkylamine thành ketone
và pyridoxal thành
pyridoxylamine.