Leucine Aminopeptidase (Leucine Arylamidase) (LAP) TestLeucine

Aminopeptidase (Leucine Arylamidase) (LAP) Test

I. NGUYÊN TẮC
Để phát hiện sự hiện diện của enzyme leucine aminopeptidases (LAP)

II. MỤC ĐÍCH

Mô tả sơ bộ giả định về catalase âm tính, cầu khuẩn Gram dương của liên cầu, cầu
khuẩn ruột và các giống liên cầu (4). LAP thường được sử dụng cùng với PYR và các xét
nghiệm sinh hóa khác (Bảng 21.1).

III. ENZYME / SUBSTRATE.

 Enzyme
 Leucine aminopeptidase (LAP) (leucine arylamidase) là một exopeptidase thủy
phân liên kết peptit liền kề với nhóm amin tự do. Nó được gọi là leucine
aminopeptidase vì nó phản ứng nhanh nhất với các hợp chất leucine (6).
 Aminopeptidases yêu cầu một nhóm, NH đầu cuối tự do và phụ thuộc vào các
ion kim loại cho hoạt động của chúng; sự phá vỡ chuỗi giải phóng axit amin tự
do (khử amin) (1). Sự hủy diệt bắt đầu phá vỡ sự phân hủy axit amin; bắt đầu với
việc loại bỏ nước (H2O). Leucine aminopeptidase là một peptidase được hoạt
hóa bằng kim loại (Na + hoặc Mg2 +). Các ion kim loại liên kết chặt chẽ và cần
thiết cho hoạt động của enzym. Kim loại tạo thành cầu nối giữa cơ chất và
enzym.

IV. REAGENT 0-DIMETHYLAMINOCINNAMALDEHYDE (DMACA)

(Lưu ý: Thuốc thử tương tự được sử dụng cho phép thử pyrrolidonyl-2-naphthylamide
(PYR))
A. Thuộc tính
1. p-Dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA) là một chất tương tự vinyl của p-
dimethylaminoben-zaldehyde (DMABA).
 2. Không phải là thuốc nhuộm hay chất nhuộm màu, nhưng khi thủy phân nó tạo
ra một chất được chuyển thành thuốc nhuộm azo hòa tan (3).
3. Dung dịch axit; nồng độ 1% trong axit clohydric đậm đặc 10% (HCI)
4. Chuẩn bị tươi 2 tháng một lần
B. Hóa chất tác dụng của thuốc thử
Thuốc thử LAP là dung dịch axit có chứa chất tẩy rửa tạo thành bazơ Schiff màu đỏ với
β-naphtylamin tự do. β-Naphtylamin không phản ứng vì nhóm amin tham gia liên kết
amit.
1. Bước 1: Leucine-β-naphthylamide bị thủy phân bởi leucine aminopeptidase, giải
phóng β-naphthylamine tự do.
2. Bước 2: Màu sắc cho kết quả khi nhóm azo mang màu -N = N-kết quả từ việc kết
hợp với naphthols hoặc naphtylamin được giải phóng enzymznati-cally (3).
 6 'Thử nghiệm hóa chấtI để xác định vi khuẩn y tế
1. Bước 1: Leucine aminopeptidase

Leucine-β-naphthylamide Leucine + β-naphtylamin tự do

Enzymatic hydrolysis
(Chất nền) C6H13O2N C10H7NH2

2. Bước 2:
Diazo
β-naphtylamin + p-Dimethylaminocinamaldehyde Chất màu đỏ
Dye coupler
(Chất nền, màu sắc) (Thuốc thử LAP/PYR)

Các hợp chất diazo kết hợp với các amin thơm hoặc phenol (ví dụ, β-naphtylamin).
Nhóm azo —N = N— (hoặc nhóm diazo nếu N được liên kết với một nguyên tố
không phải là cacbon) tạo ra hợp chất có màu (3).

V. CÁC HỆ THỐNG KIỂM TRA THƯƠNG MẠI

A. Các bài kiểm tra tại chỗ trên đĩa; đĩa với thuốc thử
1. Nhà sản xuất, làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất
a. Đĩa LAP: REMEL (5)
b. LAP (LAPNA): Khoa học chính
c. Leucine Minitek: BBL
2. Quy trình
a. Đĩa đệm bù nước; hai phương pháp:
 (1) Làm ẩm bằng nước cất vô trùng.
(2) Đặt đĩa lên bề mặt thạch; ví dụ, thạch huyết cừu (SBA).
b. Dùng que cấy bằng gỗ hoặc que cấy, chà mạnh vài khuẩn lạc nguyên chất từ
đĩa thạch 18 đến 24 giờ lên đĩa. Nếu phân lập phát triển chậm, ủ 2-3 ngày để có đủ chất
cấy,
c. Ủ nhiệt độ phòng (22-25 ° C) 5 phút
d. Sau khi ủ, thêm 1 giọt thuốc thử phát hiện vào đĩa; cho phép 1 phút để phát
triển màu sắc.
B. Xét nghiệm enzym có trong hệ thống kit (2)
1. Nhà sản xuất
a. API Rapid Strep; bioMérieux
b. Xét nghiệm Bacti Card Streptococcus; REMEL
(1) Hệ thống bao gồm thủy phân PYR, LAP và esculin.
(2) Thẻ được sử dụng với tính nhạy cảm với vancomycin cung cấp các đặc
điểm sơ bộ của Aerococcus, Enterococcus, Gemella, Globicatella, Lactococcus,
Leuconostoc và Pediococcus.
C. Lưu trữ: đĩa và hệ thống, 2-8 ° C
VI. KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG VI SINH VẬT
A. Dương tính: Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
B. Âm tính: Aerococcus viridans (ATCC 11563)