Professional Documents
Culture Documents
Семинарски рад из предмета Дијагноза биљних патогена, Димић Никола
Семинарски рад из предмета Дијагноза биљних патогена, Димић Никола
СЕМИНАРСКИ РАД
Професор: Студент:
Лешак, 2021.
САДРЖАЈ
УВОД.........................................................................................................................1
4.3. ELISA.....................................................................................................................12
5. ЗАКЉУЧАК..................................................................................................16
6. ЛИТЕРАТУРА..............................................................................................17
УВОД
Винова лоза (Vitis vinifera L.) је врста велике агрономске важности, највише са
аспекта производње вина. Патогени који паразитирају на виновој лози, смањују приносе и
чине велику штету винској индустрији. Саднице винове лозе заражене вирусима дају
знатно лошију сировину за производњу вина и скраћују животни век винограда.
Продуктивни век винограда услед инфекције вирусом инфективне дегенерације винове
лозе (Grapevine fanleaf virus- ГФЛВ) износи 15-20 година уместо 30-40 или више. Квалитет
грожђа је смањен због ниже концентрације шећера и повећане укупне киселости, а
економски губици износе чак и до 80% (Andret-Link i sar ., 2004), односно 100% (Raski i
sar., 1983; Диклић, 2014). Према EPPO (2018) сертификационој шеми и Правилнику о
здравственом прегледу усева и објеката за производњу семена, расада и садног материјала
и здравственом прегледу семена, расада и садног материјала (“Сл. гласник РС” 2008),
сертификован садни материјал винове лозе мора бити слободан од свих вируса. Најчешће
присутни и економски најзначајнији вируси на виновој лози су: Grapevine fanleaf virus
(GFLV), Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) и А-вирус винове лозе (Grapevine
virus A, GVA).
(Извор: https://www.researchgate.net/figure/Transmission-electron-micrograph-of-negatively-
stained-purifiedGLRaV-3-particles-using_fig6_236173215)
Већина сорти винове лозе (Vitis vinifera L.) је осетљива на GLRaV-3 и након
инфекције показују типичне симптоме GLD-а, који се већином јављају касније током
вегетације без обзира на присуство вируса у дужем временском периоду у биљци, а могу
се заменити са неким гљивичним болестима, попут црвене палежи винове лозе
(Pseudopeziza tracheiphila). Типични симптоми су међупросторно црвенило листова и
некроза са увијање листова код црних сорти (Слика 2.) и хлоротичне пеге на листу са
његовим увијањем код белих сорти (Слика 3.).
(Извор: https://www.frontiersin.org/files/Articles/45092/fmicb-04-00082-HTML/image_m/
fmicb-04-00082-g001.jpg)
3. А-ВИРУС ВИНОВЕ ЛОЗЕ (Grapevine virus A, GVA)
Према (Mengu i sar. 2017) GVA је један од припадника рода Vitivirus који је
узрочник комплекса боре од дрвета. Осим што има исти тип нуклеинске киселине као
GLRaV-3, једноланчане + RNK молекула, честица овог вируса је такође нитасто издужена,
али много краћа (дужина 700 nm и пречника 12 nm) (Слика 4.) и поред вегетативне
трансмисије, може се преносити векторски, штитастим вашима.
(Извор: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_9th_report/positive-sense-rna-viruses2011/
w/posrna_viruses/242/betaflexiviridae-figures)
(Извор: https://www.google.com/search?q=zdravo+drvo+(lijevo)+i+simptom+jami
%C4%8Davosti+drveta+(desno)
+nakon+infekcije+virusom+iz+roda+vitivirus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=2ahUKEwi
Gq8ixwN70AhX4RPEDHdlqBZ0Q_AUoAXoECAEQAw&biw=1280&bih=689&dpr=1#imgrc=
bLKK7LC-4JW3dM)
Као извор GLRaV-3 и GVA вируса коришћена је биљка винове лозе Влашка која је део
институционалне „in vivo” колекције под интерном шифром VVL-112 (Слика 7.).
Присутност оба вируса потврђена је ензимско-серолошком методом на чврстој фази ((eng.
enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) и методом ланчане реакције полимеразом
након обрнутог преписивања (eng. reverse transcription polymerase chain reaction, RT- PCR).
Детаљнији опис обе методе налази се у наставку. Од ове матичне биљке добијене су
саднице заражене вирусом које су касније коришћене у поступку векторског преноса.
Слика 7. Биљка винове лозе сорте Влашка (VVL-112) употребљена као извор GLRaV-3 и
GVA
Слика 8. Колонија штитастих ваши (P. ficus) на врсти Cucurbita moschata у стакленој
посуди
(Извор: https://repozitorij.agr.unizg.hr/islandora/object/agr%3A1259/datastream/PDF/view)
Сви тестови векторског преноса као и детекције вируса у биљкама рађени су у виролошкој
лабораторији. Они се пре свега односе на спречавање контаминације тестиране колоније
штитастих ваши другим популацијама, као и адекватно третирање инокулисаних биљака
инсектицидом и њихово даље изоловање на тестирање на вирусе.
4.3. ELISA
За потребе детекције вируса ELISA методом измерено је 0,1 г биљног ткива (углавном
петељке листа) (Слика 17.) које је уситњено у малтеру уз помоћ течног азота коришћењем
лупања у фини прах. Здробљено биљно ткиво је коришћено као потенцијални извор
антигена у детекција коришћењем ELISA прибора из Агритеста (Валенцано, Италија). У
откривању и једног и другог вируса, коришћена је метода двоструког антитела и сендвича
и сви кораци испитивања су обављени према упутствима произвођача (слике 18 - 20).
Резултати методе ELISA очитани су на спектрофотометру ELX800 (Биотек, САД) два сата
након додавања супстрата на таласној дужини од 405 nm (Слика 21.).
Спектрофотометријска очитања најмање три пута већа од просека вредности негативних
контрола су сматране позитивним. Код ELISA-позитивних узорака присутност GLRaV-3 и
GVA додатно је проверена методом RT-PCR.
Слика 17. Одређена маса биљног материјала Слика 18. Узорци биљног ткива спремни
(Извор: https://repozitorij.agr.unizg.hr/islandora/object/agr%3A1259/datastream/PDF/view)
(Извор: Исто)
Слика 21. Спектрофотометар ELX800 (Биотек, САД)
(Извор: Исто)
4.4. RT-PCR
1. Andret-Link, P., Laporte, C., Valat, L., Ritzenthaler, C., Demangeat, G. et al.. (2004):
Grapevine fanleaf virus: Still a major threat to the grapevine industry. Journal of Plant
Pathology 86 (3), 183-195.
2. Aydin, S. (2015): A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory
experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72: 4-15.
https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012.
3. Bagi, F., Jasnić, S., Budakov, Dragana (2016): Viroze biljaka. Univerzitet u Novom Sadu,
Poljoprivredni fakultet.
4. Bruisson, S., Lebel, S., Walter, B., Prevotat, L., Seddas, S., Schellenbaum, P. (2016):
Comparative detection of a large population of grapevine viruses by TaqMan® RT-qPCR
and ELISA. J Virol Methods. 240:73-77. doi: 10.1016/j. jviromet.2016.12.003.
5. Butler, J.M. (2012): DNA Quantitation. In: Butler JM (2012): Advanced Topics in
Forensic DNA Typing: Methodology. Academic press. Pages 49-67.
6. Butler, J.M. (2012): DNA Quantitation. In: Butler JM (2012): Advanced Topics in
Forensic DNA Typing: Methodology. Academic press. Pages 49-67
7. Clark, M.F. i Adams, A.N. (1977): Characteristics of the micro-plate method of enzyme-
linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol., 34: 475-483.
8. Cohn, E., Tanne, E., and Nitzany, F. E. (1970): Xiphinema italiae, a new vector of
Grapevine fanleaf virus, Phytopathology, 60, 181-182.
9. Caetano-Anollés, D. (2013): Polymerase Chain Reaction. In Maloy, S., and Hughes, K.
Brenner’s Encyclopedia of Genetics, 392–395. doi:10.1016/b978- 0-12-374984-0.01186-
4.
10. Čepin, U., Gutiérrez-Aguirre, I., Balažic, L., Pompe-Novak, M., Gruden, K., Ravnikar,
M. (2010): A one-step reverse transcription real-time PCR assay for thedetection and
quantitation of Grapevine fanleaf virus. J. Virol. Methods. 170,47–56,
http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2010.08.018.
11. Daane, K. M., Middleton, M. C., Sforza, R., Cooper, M. L., Walton, V. M.,, Walsh, D. B.,
Zaviezo, T., Almeida, R. P. (2011): Development of a multiplex PCR for identification of
vineyard mealybugs. Environ Entomol. 40(6): 159-1603.
12. Diklić, K. (2014): Zaraženost sorte Muškat momjanski (Vitis vinifera L.) virusima.
Diplomski rad Agronomski fakultet, Sveuþilište u Zagrebu.
13. Engvall, E., Perlmann, P. (1971): Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8(9): 871-874.
https://doi.org/10.1016/0019-2791(71)90454-X.
14. Erlich, H.A. (1989): Polymerase chain reaction. J Clin Immunol 9, 437–447. https://
doi.org/10.1007/BF00918012.
15. Fuchs, M., Marsella-Herrick, P., Loeb, G.M., Martinson, T.E., Hoch, H.C. (2009):
Diversity of ampeloviruses in mealybug and soft scale vectors and in grapevine hosts
from leafroll-affected vineyards. Phytopathology, 99, 1177-1184.
16. Fuller, K. B., Alston, J. M., Golino, D. A. (2015): The economic benefits from
virusscreening: A case study of grapevine leafroll in the North Coast of California. Am. J.
Enol. Vitic. 66: 112-119.
17. Gambino, G., Gribaudo, I. (2006): Simultaneous detection of nine grapevine viruses by
multiplex RT-PCR with coamplifi cation of a plant RNA as internal control.
Phytopathology 96: 1223–1229.
18. Garibyan, L., Avashia, N. (2013): Polymerase chain reaction. The Journal of investigative
dermatology, 133(3), 1–4. https://doi.org/10.1038/jid.2013.1
19. Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R., Gelfand, D.H. (1991): Detection of specifi c
polymerase chain reaction product by utilizing the 5’----3’ exonuclease activity of
Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl Acad Sci U S A, 88(16):7276-80. doi:
10.1073/pnas.88.16.7276.
20. Raski, D.J., Goheen, A.C., Lider, L.A., Meredith, C.P. (1983): Strategies against
Grapevine fanleaf virus and its nematode vector. Plant Disease 67 (3), 335-338.
21. Lázár, J., Kölber, M., Lehoczky, J. (1990): Detection of some nepoviruses (GFV, GFV-
YM, GCMV, ArMV) in the seeds and seedlings of grapevines by ELISA. Kertgazdaság,
22, 58-72.
22. Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. and Erlich, H. (1986): Specific
Enzymatic Amplifi cation of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction, Cold Spring
Harbor Symposium on Quantitative Biology 51: 263.
23. Martelli, G. P.,Walter, B., Pinck, L. (2001): Grapevine fanleaf virus. CMI/AAB
Descriptions of Plant Viruses, No 385. Commonw Mycol Inst/ Assoc Appl Biol, Kew,
UK.
24. Maliogka,V.I., Martelli, G.P., Fuchs, M., Katis, N.I. (2015): Control of viruses infecting
grapevine. Advances in Virus Research, 91, 175-227
25. Van Weemen, B.K., Schuurs, A.H.W.M. (1971): Immunoassay using antigen—enzyme
conjugates. FEBS Letters, 15(3) 232-236. https://doi.org/10.1016/0014- 5793(71)80319-8
26. Meng, B., Martelli, P. G., Golino, D. A., Fuchs, M. (2017): Grapevine Viruses: Molecular
Biology, Diagnostics and Management 978: 167-197, 229-257
27. Mullis, K.B., Faloona, F.A. (1987): Specifi c synthesis of DNA in vitro via a polymerase-
catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155:335-50. doi: 10.1016/0076-
6879(87)55023-6. PMID: 3431465.
28. Nestorov, J., Matiü, G., Elakoviü, I., Taniü, N. (2013): Gene expression studies: how to
obtain accurate and reliable data by quantitative real-time rt pcr. Journal of Medical
Biochemistry, 32(4), 325-338.
29. Osman, F., Rowhani, A. (2006): Application of a spotting sample preparation technique
for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR (TaqMan).
J. Virol. Methods 133, 130–136.
30. Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka,
H., Morimoto, S. (2018): Enzyme-linked immunosorbent assay for the
quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. J Nat Med. 72(1):32-42.
doi: 10.1007/s11418-017-1144-z
31. Službeni Glasnik Republike Srbije br. 39/2006, 59/2006, 115/2006, 119/2007 i 107/2008:
Pravilnik o zdravstvenom pregledu useva i objekata za proizvodnju semena, rasada i
sadnog materijala i zdravstvenom pregledu semena, rasada i sadnog materijala
32. Trujillo, A.A, McCaustland, K.A., Zheng, D.P., Hadley, L.A., Vaughn, G., Adams, S.M.,
Ando, T., Glass, R.I., Monroe, S.S. (2006): Use of TaqMan real-time reverse
transcription-PCR for rapid detection, quantifi cation, and typing of norovirus. J Clin
Microbiol. 44(4):1405-12. doi: 10.1128/JCM.44.4.1405-1412.2006.
33. Wages, J.M. (2005): Polymerase Chain Reaction. In: Worsfold, P., Townshend, A., Poole,
C. Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition). Elsevier, 243- 250,
https://doi.org/10.1016/B0-12-369397-7/00475-1.
34. Weber E., Golino D., Rowhani A. (2020): Laboratory testing for grapevine diseases.