Xac Dinh Dong Thoi Du Luong Khang Sinh Nhom Nitrofuran Trong

8/20/2019 Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực phẩm
ực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội b…
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
TR ẦN THỊ HỒNG
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢ NG

KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG
MỘT SỐ LOẠI THỰ C PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN
ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2012
http://slidepdf.com/reader/full/xac-dinh-dong-thoi-du-luong-khang-sinh-nhom-nitrofuran-trong 1/77
8/20/2019 Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội b…
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
TR ẦN THỊ HỒNG
KHÁNGXÁC ĐỊNH
SINH ĐỒNG
NHÓM THỜI DƢ LƢỢ
NITROFURAN NG MỘT
TRONG
SỐ LOẠI THỰ C PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN
HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ LC/MS/MS
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60 44 29
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚ NG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO
Hà Nội – 2012
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔ NG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. Giớ i thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran ....................................................... 3
1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? ...................................................................................... 3
1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran ................................................................................. 3
1.2. Tác dụng ca các chất kháng sinh nhóm nitrofuran……………………………. 6
1.3. Dƣ lƣợng kha ng sinh nho m nitrofuran trong thực phẩm ..................................... 6
́ ́
1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector UV ....................................................... 6
1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay-
ELISA) ........................................................................................................................ 7
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .............................................. 8
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U ....................... 11
2.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu..................................................... 11
2.1.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu nghiên cứu...................................................................... 11
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 12
2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 12
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................................. 18
2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23
2.3.1. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 23
2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................................ 24
2.3.3 Pha chế chất chuẩn ........................................................................................... 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N ............................................................ 27
3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằ ng LC/MS/MS ......... 27
3.1.1. Khảo sát các điề u kiện khối phổ ..................................................................... 27
3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient ....................................................................... 30
3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu .......................................................................... 33
3.2. Thâ ̉m đi nh
̣ phƣơng pha p .................................................................................... 38
́
3.2.1 Tính đc hiệu .................................................................................................... 38
3.2.1. Khảo sát lập đƣờ ng chuẩn ............................................................................... 38
3.2.2. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lƣợ ng ca phƣơng pháp ......................... 43
3.2.3. Độ l p lại và độ thu hồi ................................................................................... 46
K ẾT LUẬ N ............................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 56
́ C BẢ NG
DANH MỤC CA
STT Nội dung Trang
Bảng 1.1 Cấ u tru ́c ho ́a ho c̣ cu ̉a mô t ̣ số chất nho ́m nitrofuran 4
đƣơ
c̣ xa ́c đi nh
̣ trong đề tai
Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 27
Bảng 3.2 K ết quả bắn phá các ion mẹ 28
Năng lƣợ ng bắn phá và các ion con ca các chấ t 29
Bảng 3.3
chuyển hóa nitrofuran
Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 35
Bảng 3.4
chiết lỏng – lỏng
Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 37
Bảng 3.5
chiết pha r ắn
Bảng 3.6 So sa ́nh độ thu hồi ca 2 quá trình chiết 37
Bảng 3.7 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn 41
Bảng 3.8 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội 43
chuẩn
Bảng 3.9 Giớ i hạn phát hiện ca AOZ trên nền mẫu thịt 44
Bảng 3.10 Giớ i hạn phát hiện ca AMOZ trên nền mẫu thịt 45
Bảng 3.11 Giớ i hạn phát hiện ca AHD trên nền mẫu thịt 45
Bảng 3.12 Giớ i hạn phát hiện ca SEM trên nền mẫu thịt 46
Bảng 3.13 Độ l p lại và độ thu hồi ca các nitrofuran trên nền 47
mẫu thịt lợ n tại 1 ppb
Độ l p lại và độ thu hồi ca các nitrofuran trên nền 48
Bảng 3.14
mẫu thịt lợ n tại 1,5 ppb
Độ l p lại và độ thu hồi ca các nitrofuran trên nền 49
Bảng 3.15
mẫu thịt lợ n tại 2 ppb
Bảng 3.16 K ết quả phân tích trên mẫu thực 51
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Nội dung Trang

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ 13
Hình 2.2 Sơ đồ phân tích khối phổ 3 tứ cực 16
Hình 2.3 Các bƣớ c ca quá trình chiết pha r ắn 19
Hình 3.1 Sắ c đồ hô ñ hơ

p̣ chuâ ̉n khi cha ỵ chế đô gradient
̣ 30
1 ở nồng đồ 20 ng/ml
Hình 3.2 p̣ chuâ ̉n khi cha ỵ chế đô gradient
Sắ c đồ hô ñ hơ ̣ 31
Hình 3.6 ṇ thêm chuâ ̉n hô ñ hơ
Sắc đồ mâ ũ thi t ̣lơ p̣ 35
nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồng đô 20
̣ ng/ml sƣ ̉ du ng
̣
quy tr nh
̀ chiết lo ̉ng - lỏng
Hình 3.7 Sắc đồ mâ ũ thi t ̣lơ
ṇ thêm chuâ ̉n hô ñ hơ
p̣ 38
nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồng đô 20
̣ ng/ml sƣ ̉ du ng̣
quy tr nh
̀ chiết pha rắ n
Hình 3.8 Đƣờ ng chuẩn AOZ sử dụng nội chuẩn 39
Hình 3.9 Đƣờ ng chuẩn AMOZ sử dụng nội chuẩn 39
Hình 3.10 Đƣờ ng chuẩn SEM sử dụng nội chuẩn 40
Hình 3.11 Đƣờ ng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.12 Đƣờ ng chuẩn AOZ không sử dụng nội chuẩn 41
Hình 3.13 Đƣờ ng chuẩn AMOZ không sử dụng nội chuẩn 42
Hình 3.14 Đƣờ ng chuẩn AHD không sử dụng nội chuẩn 42
Hình 3.15 Đƣờ ng chuẩn SEM không sử dụng nội chuẩn 43
nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồng đô 1̣ ng/g
nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồng đô 1,5
̣ ng/g
Hình 3.18 Sắc đồ mâ ũ thi t ̣lơ

p̣ 49
nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồng đô 2̣ ng/g
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

CAD Collision Gas Presure Áp suất khí mang trong tứ cực Q2
CE Collision Energy Thế áp vào tứ cực Q
CUR Curtain Gas Khí mang
CXP Collision Cell Exit Potential Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3
DP Declustering Potential Thế đầu vào áp vào màn chắ n
EP Entrance Potential Thế áp vào nguồn ion mẹ
ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử
EU European Union Liên minh châu Âu
GS1 Ion Source Gas 1 Áp suất khí hai bên đầu phun
GS2 Ion Source Gas 2 Áp suất ca luồng khí nóng
High performance liquid
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao
chromatography
IP Identification point Điê ̉m nhâ ṇ da ng
̣
IS IonSpray Voltage Thế ion hóa
Liquid chromatography –
LC – MS Sắc kí lỏng khối phổ
mass spectrometry
LOD Limit of detection Giớ i hạn phát hiện

LOQ Limit of quality Giớ i hạn định lƣợ ng
MeOH Methanol Methanol
Minimum required Yêu cầu giớ i hạn hiệu năng nhỏ nhất
MRPL
performance limit ca phƣơng pháp
RSD% Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối
SPE Solid phase extraction Chiết pha r ắn

TEM Temperature Nhiệt độ ca nguồn khí nóng thổi vào
MỞ ĐẦU
An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợ c cả xã hội quan tâm, đc biệt
là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát
hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh
doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiề u vấn đề
đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình tr ạng s ử
dụng các chất bổ tr ợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa
chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đế n sức
khỏe ngƣời tiêu dùng.

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợ c sử dụng cho va ̀o
thức ăn gia súc đê ̉ kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điề u tr ị dự phòng, điều
tr ị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong
chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã đƣợ c sử dụng để điều tr ị nhiễm trùng do
vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồ ng thy sản...Vì vậy sự tồn dƣ ca
chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở
ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợ ng chất chuyển hóa ca nitrofuran trong
số lƣợ ng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thy sản các sản phẩm nhậ p khẩu
vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớ c Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn
đến l ệnh c ấm s ử d ụng nitrofuran trong sản xu ất th ực ph ẩm động v ật tại nhiều qu ốc
gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nƣớc này đã đt lệnh cấm trên tất cả các loại
thực phẩm nhậ p khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy
định yêu cầu giớ i hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất
chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông
nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết đị nh cấm sản xuất, nhậ p khẩu, lƣu thông và
sử dụng m ột s ố lo ại kháng sinh hóa chất trong sản xu ất và kinh doanh TACN trong
đó có nitrofuran [9].
Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động
ảnh hƣở ng tớ i sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậ y vớ i nhu cầu bức thiết về vấn
1
đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp
“Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong mộ t số loại
thự c ph ẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nộ i b ằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối
phổ LC/MS/MS”.
2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giớ i thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran
1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì?
Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợ p có chứa nhóm 5-nitro, thƣờ ng
đƣợ c sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣở ng, ch yếu đối với gia súc
(nhƣ gia cầm, lợ n), nuôi trồng thy sản (cá, tôm) và nuôi ong đê ̉ điều tr ị các vi
khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bở i
Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầ u
[12].
1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran

Các chất nhóm n itrofuran bao gồ m Furazolidone, furaltadone, furazolidone,
nitrofurazone, khi đi va ̀o cơ thê ̉ sinh vâ t ̣ nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng
ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kết trong ca ́c mô tồn ta i ̣ trong nhiều tuần sau
khi sƣ ̉ du ng
̣ [12]. Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa ca nitrofurazone nhƣ sau :
3
Bảng 1.1: Cấu tru ́c ho ́a ho c̣ cu ̉a mô t ̣ số chất nho ́m nitrofuran đƣơ
c̣ xa ́c đi nh
̣ trong đề ta ̀i
Khô ́i
lƣơ
ng
̣
STT Các chất nitrofuran Công thƣ
́ c phân ́ c câ ́u ta
Công thƣ ọ
phân tƣ
̉
tƣ
̉
(g/mol)
AOZ
1 C3H6 N2O2 102,09
3-amoni-2-oxazolidinone
NPAOZ
3-(2-nitrobenzylidenamino)-
2 C10H9 N3O4 235,2
2-oxazolidinone)
AMOZ
3 3-amoni-5-morpholinomethyl C8H15 N3O3 201,22
-1,3-oxazolidinone
NPAMOZ
5-(morpholinomethyl)-3-(2-
4 nitrobenzylidenamino)-2- C15H18 N4O5 334,33
oxazolidinone
AHD
5 C3H5 N3O2 116,05
1-aminohydantoin
NPAHD
6 [3-(2-nitrobenzylidenamino) C10H8 N4O4 248,19
-2,4-imidazolidinedione]
4
SEM CH5 N3O
7 semicarbazide 75,08
NPSEM
3[(2-nitrophenyl)methylene]- C8H8 N4O3 208,174
8
hydrazinecarboxamide
1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran
McCracken va ̀ ca ́c cô ng
̣ sƣ ̣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra r ằng các
hợ
p chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng
ứng liên kết trong các mô .
Về mt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ ̀ nitrofuran đã kìm hãm hoc
phá hy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không
phát triển va ̀ không sinh sản đƣợ c nữa. Tác dụng tốt vớ i vi khuẩn gram âm và gram
dƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác
dụng tốt trong viê c̣ giê t ̣ trƣ giun đũa [7].
̀
Vơ ́ i nồng độ thấ p, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác
dụng diệt khuẩn.
Theo nhiều báo cáo, nitr ofuran tác dụng r ất tốt trong viê c̣ diê t ̣ khuâ ̉n
salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡ ng.
Tr ộn nitrofuran vớ i thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp se
giúp cho gà và lợn còn tăng trọng
̃
nhanh.
Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến
[7], khi thƣ c̣ phâ ̉m co tồn dƣ nitrofuran va ca c dâ
ñ xuấ t cu ̉a no .
́ ̀ ́ ́
Do đó hầu hết ca ́c nƣơ
́ c trên thế giơ
́ i đa cấm
̃ sƣ ̉ du ng
̣ kha ́ng sinh nho ́m
nitrofuran trong chăn nuôi . Ở Việt Nam , bô Nông
̣ nghiê p̣ va ̀ pha ́t triê ̉n nông thôn đa ̃
quyết đi nh
̣ cấ m sƣ ̉ du ng
̣ ni trofuran cho va ̀o trong thƣ ́c ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy
5
định yêu cầu giớ i hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất
chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29].
1.3. Dƣ lƣợ ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thự c phẩm
Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơ
c̣ phát hiện thấy trong thịt
gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thy s ản nhậ p khẩu vào các nƣớ c EU từ Thái
Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ , Việt Nam, Ecuador và Brazil [25].
Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấ y trong sản phẩm gia súc và
gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạ p, Romania và Bulgari. Sau đó EU
đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn
9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc
(37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm
tôm, mật ong và thị t hộ p [25].
Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiệ n thy sản nhậ p
khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. K ết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê,
cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran
trong tôm [11].
Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát ca TS . Nguyê ñ Quố c Ân , phó trƣởng
phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đa ̃ phát hiện 5 mâ ũ thu ̉y sa ̉n nuôi lấy
tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mâ ũ tôm , 1 mâ ũ ca ́ va ̀ 1 mâ ũ cua lô t)̣ vơ
́ i ha ̀m lƣơ
ng
̣ tƣ ̀ 0
– 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mâ ũ tôm the ̉ chân trắ ng ta i ̣ Phu ́ My ̃ – Bình Định
nhiê m
̃ AOZ vơ
́ i ha ̀m lƣơ ̣ 12,6 ng/g; 2/754 mâ ũ cua lô t ̣ ta i ̣ Cầ n Guô c̣ – Long An
ng
nhiê m
̃ SEM vơ
́ i ha ̀m lƣơ
ng
̣ tƣ ̀ 2 – 2,2 ng/g [1].
1.4. Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran
́ đê ̉ xa ́c đi nh
Hiê ṇ nay co ́ nhiều phƣơng pha p ̣ kha ́ng sinh nho ́m nitrofuran , bao
gồm: phƣơng pha p
́ sắ c ky ́ lo ̉ng v ới detector UV , phƣơng pha p
́ vi sinh (kỹ thuật
Elisa), phƣơng pha p sắ c ky lo ̉ng vơ
i detector MS /MS.
́ ́ ́
1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏ ng vớ i detector UV
Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector tử ngoại khả
kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất ca
6
nó trong một số đối tƣợ ng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp
xác định AOZ, AMOZ trong gan lợ n s ử d ụng HPLC – UV . Phƣơng pháp dựa trên
sự dẫn xuất các nitrofuran vớ i 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết vớ i ethyl acetate,
làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kết hơ
p̣ vơ
́ i
detector UV ơ
̉ bƣơ
́ c so ́ng 275nm. Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là 5 và 10
µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ vơ
́ i độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18].
Tác giả Cooper và cộng sự cũng giớ i thiệu phƣơng pháp xác định AOZ,
AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận ca lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợ c 4 chất
chuyển hóa nhóm nitrofuran. Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg
[21].
Phƣơng pháp HPLC -UV co ́ ƣu điê ̉m là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng
phân t ́ch rô ng
̣ ra ĩ . Tuy nhiên phƣơng pha p
́ la i ̣ không đa p
́ ƣ ́ng đƣơ
c̣ yêu cầu về đô ̣
nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t
tơ
́ i (MRPL) là 1 µg/kg.
1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme -linked immunosorbent assay-
ELISA)
Hiện nay, ELISA đƣợ c sử dụng r ộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ
y học, nông nghiệ p và đc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợ ng
các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự k ết hợp đc hiệu giữa
kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợ c gắn vớ i một enzyme, enzyme
s thy phân thành một chất có màu .
Phòng thí nghiệm randox ca Anh đa ̃ nghiên cứu xác định các chất chuyển
hóa nhóm nitr ofuran sử dụng phƣơng pha ṕ Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thy phân
và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣơ ̀ ng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH,
chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giớ i hạn phát hiện ca
phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28].
Vass và cộng sự (2008) sử dụng k ỹ thuật Elisa tr ực tiế p sử dụng kháng thể
đc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợ c gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong tr ứng
với quy trình xử lý mẫu: m ẫu đƣợc đồng nhất, thy phân và dẫn xu ất b ằng o-NBA
7
trong môi trƣơ

̀ ng axit HCl , sau đo ́ trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu
bằng ethyl acetate và n -hexane. Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là 0,13 µg/kg,
CCα = 0,3 µg/kg [25].
Diblikova và cộng sự (2005) giơ
́ i thiê ụ k ỹ thuật Elisa tr ực tiế p, sử dụng
kháng thể đc hi ệu c ho NPAOZ, kháng thể đƣợ c g ắn 1 enzym HRP xác đị nh AOZ
trong tôm, thịt gà, thịt lợ n, thịt bò vớ i CCβ là 0,4 µg/kg, độ thu hồi từ 66 – 119%
[20].
Lui và cộng sự (2007) giơ
́ i thiê ụ k ỹ thuật Elisa gián tiế p, s ử d ụng kháng thể
NFT, kháng thể đƣợ c gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nƣớ c. Giớ i hạn phát
hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31].

Tƣơng tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà và cá vớ i
giớ i hạn phát hiện lần lƣợt là 0,19; 0,24; 0,18 µg/kg [15].
Phƣơng pha p
́ Elisa đa p
́ ƣ ́ ng đƣơ ̣ ỵ , đơn gia ̉n dê thƣ
c̣ yêu cầu về đô nha ̃ c̣ hiê ṇ ,
tuy nhiên đô đă
̣ c̣ hiê ụ bi giơ ̀ ̉ i đa ́nh dấu cho tƣ ̀ng kha ́ng thê ̉ chuyên biê t ̣
̣ ́ i ha ṇ v pha
cho tƣ ̀ng đối tƣơ
ng
̣ .
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS
Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạ y để xác định đồng thờ i dƣ lƣơ ng
̣
nitrofuran. Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợ
p chất hữu cơ
trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh ca phân tử mang điện
dƣơng hoc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo
khối lƣợ ng. Từ các tín hiệu thu đƣợ c, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng
vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ
liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợ c ch ất phân tích một
cách chính xác.
Ở Vi ệt Nam năm 2004, Bộ Thy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển
nông thôn) đa ban
̃ hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm
nitrofuran trong thy sản và sản ph ẩm thy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối
phổ phân t ch dƣ lƣợng liên kết với mô ca các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran
́
trong sản phẩm thy sản đƣợ c thy phân bằng axit clohydric loãng để thu đƣợ c
8
mạch nhánh ca các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này đƣợ c dẫn xuất bằng
2-nitrobenzaldehyde, sau đó đƣa pH đến 7 và đƣợ c chiết bằng ethyl axetat. Dịch
chiết ̣ mâ ũ na ̀y
đƣợ c thổi khô bằng N2 đến cạn, hòa tan cn, sau đó đo dung di ch
bằ ng hệ thống LC/MS/MS vơ
́ i pha đô ng
̣ kênh A la ̀ axit acetic , kênh B la ̀ acetonitril .
Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là 1 µg/kg [10].
Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi ca Thái Lan đƣa ra quy
trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM)
bằng LC/MS/MS giớ i hạn phát hiện lần lƣợ t ca từng chất là AHD 0,1 µg/kg; AOZ
0,04 µg/kg; SEM 0,15 µg/kg; AMOZ 0,02 µg/kg [29].
Tác giả Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyển hóa nhóm
nitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS vơ ́ i pha đô ng
̣ kênh A la ̀ axit acetic 0,025%,
kênh B la ̀ acetonitril , sƣ ̉ du ng
̣ quy tr nh
̀ làm sạch bằng cột chiết pha r ắn polymeric
trƣớc khi phân tích bằng LC/MS/MS và thu đƣợc CCα từ 0,11 – 0,21 µg/kg, CCβ t ừ
0,19 – 0,36 µg/kg [26].
Trong ta ̀i liê ụ [25] ca tác giả M .Vass, tác giả Boket và cộng sự (2007) xác
định các chất chuyển hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CCα lần lƣợ t ca
từng chất AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2. Độ thu hồi từ 95,2 –
102,1 %.
Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt
gia súc, gia cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối ph ổ LC/MS/MS vơ
́ i pha đô ng
̣
kênh A la ̀ amoniacetat 10mM, kênh B la ̀ methanol , sƣ ̉ du ng
̣ qua ́ tr nh
̀ la ̀m sa cḥ bằng
cột chiết pha r ắn SPE vớ i chất hấ p thụ polystyrene đƣợ c k ết hợ p bằng cách thy
phân các chấ t chuyển hóa hình thành liên kết trong các mô và đƣợ c dẫn xuất bằng
2-nitrobenzaldehyde. Giớ i h ạn phát hiện c a phƣơng pháp là 0,5 – 5 ng/g; giớ i h ạn
định lƣợ ng từ 2,5 – 10 ng/g [12].
Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định các
chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợ n b ằng LC/MS/MS vơ
́ i cô t ̣ C 18, pha
đô ng
̣ kênh A la ̀ amonifomiat 1mM, kênh B la ̀ methanol , sử dụng phƣơng pha p
́ chiết
lỏng – lỏng thu đƣơ
c̣ CCα = 0,08 – 0,54 µg/kg và CCβ = 0,10 – 0,66 µg/kg [19].
9
Tác giả C.Bock và cộng sự đã thẩm định phƣơng pháp xác định dƣ lƣợ ng 4
chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong tr ứng bằng LC/MS/MS vơ
́ i CCα từ 0,03 –
0,22 µg/kg [14].
Các tác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác
định các chất chuyển hóa nitrofuran trên LC/MS/MS vớ i pha đô ng
̣ kênh A la ̀
amoniacetat 20mM, kênh B la ̀ methanol co ́ giớ i h ạn định lƣợng 1 µg/kg vơ
́ i CCα =
0,19 – 0,43 µg/kg. Khoảng tuyến tính từ 1 – 10 µg/kg [16].
Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyển hóa nitrofuran
trong sữa b ằng LC/MS/MS vơ
́ i pha đô ng
̣ kênh A la ̀ amoniacet at 0,5mM, kênh B la ̀
methanol. Phƣơng pháp có hê ̣số biến thiên nho hơn 9,3%, độ tái lậ p nội bộ nhỏ hơn
̉
13%, CCα từ 0,12 – 0,29 µg/kg, CCβ từ 0,15 – 0,37 µg/kg [22].
Tác giả Caroline Douny và cộng sự (2012), đã xác định các chất chuyển
hóa nhóm nitrofuran, nghiên cứu ứng d ụng để đánh giá furanzolidone trong tôm sú
ở Việt Nam. Mẫu đƣợc đồng nhất, thy phân và dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte,
chiết l ỏng – lỏng b ằng etylacetat trƣớc khi xác định bằ ng h ệ thống LC/MS/MS vơ
́ i
pha đô ng
̣ kênh A la ̀ axit acet ic 0,1%, kênh B la ̀ acetonitril thu đƣơ
c̣ CCα t ừ 0,08 –
0,36 µg/kg, CCβ từ 0,12 – 0,61 µg/kg [13].
Tóm lại : Các phƣơng pháp ( phƣơng pha p
́ sắ c ky ́ lo ̉ng vơ
́ i detector UV -VIS, phƣơng
pháp hóa sinh Elisa , phƣơng pha p
́ s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm
chung là thy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô
thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành
các dẫn xuất tƣơng ứng. Các dẫn xuất này sau đó đƣợ c chiết lỏng lỏng hoc chiết
pha r ắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏ ng khối ph ổ. Phƣơng pháp này có
ƣu điểm là có độ nhạy r ất tốt, thƣờ ng từ 0,1 µg/kg có độ chọn lọc cao và có độ
chính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm. Do đó trong nghiên cứ u
đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS vớ i quá trình thy
phân bằ ng axit clohydric và dẫn xu ất v ớ i 2- nitrobenzaldehyde để xác định các chất
chuyển hóa ca nitrofuran.
10
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu và nội dung nghiê n cứ u
2.1.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu nghiên cứ u
Đối tƣợng nghiên cứu là các chấ t chuyển hóa ca nitrofuran, bao gồm: AOZ,
AMOZ, SEM và AHD.
Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan
ca gia súc gia cầ m.
Mục tiêu chung ca đề tài là nghiên cứu xây dƣ ng
̣ phƣơng pháp xác định
đồng thờ i 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thự c
phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụ
thê ̉ nhƣ sau:
- Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thờ i 4 chất chuyển hóa ca nitrofuran trong
thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS.
- Ứ ng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa ca nitrofuran trong thực
phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn , thịt bò, thịt gà, gan.
2.1.2. Nội dung nghiên cứ u
2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp
 Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:
 Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,
 Điều kiện tách chiết lấ y chấ t phân t ́ch .
 Thẩm định phƣơng pháp:
 Giớ i hạn phát hiện LOD, giớ i hạn định lƣợ ng LOQ,
 Khoảng tuyến tính,
 Độ chụm (độ l p lại),
 Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch).
2.1.2.2. Ứ ng dụng phƣơng pháp
Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm
nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống
đang ba ́n trên địa bàn Hà Nội.
11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứ u

2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ
2.2.1.1. Nguyên tắc chung về phƣơng pháp sắc kí lỏng HPLC
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chấ t r ắn và
pha động là chấ t l ỏng (sắc ký lỏng – r ắn). Mẫu phân tích đƣợ c chuyển lên cột tách
dƣớ i dạng dung dịch. Khi tiến hành chạ y sắc ký, các chất phan tích đƣợc phân bố
liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗ n hợp các chất phân tích, do cấu trúc
phân tử và tính chất lí hóa ca các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác ca
chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyể n vớ i tốc độ
khác nhau và tách ra khỏ i nhau thành từng lớp ca mỗi chất .
2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC [8]
Trong LC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ
tách hỗn hợ p chất phân tích. Đó là nhữ ng chất r ắn, xốp và kích thƣớ c hạt r ất nhỏ, từ
3-7µm. Tuỳ theo bản chất ca pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết
thƣờng chia làm 2 loạ i: sắc ký pha thƣờ ng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC). Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đƣờng kính hạt 1,7 µm, chịu
đƣợc áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giả m thời gian phân tích
đó là những ƣu điểm ca sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid
Chromatography).
2.2.1.3. Pha động trong HPLC [8]

Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha
động có độ phân cực thấ p.
Loại thứ nhất có thành phần ch yếu là

nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chấ t
hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc dùng
trong sắc ký pha ngƣợ c.
Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực nhƣ cychlorpentan, n -pentan, n-
heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…Tuy nhiên
pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợ c khả năng rửa gi ải, ngƣờ i ta
12
thƣờ ng phối hợ p 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân cực từ thấp đến
cao phù hợ p với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễ n ra
theo thời gian, trƣờ ng hợp này ngƣờ i ta gọi là chƣơng trình r ửa giải gradient.
2.2.1.4. Detector trong HPLC [5]

Detector là bộ phận quan tr ọng quyết định độ nhạy ca phƣơng pháp. Đối
́ i ca ́c chất chuyê ̉n ho ́a nho ́m nitrofuran co ́ khối lƣơ
vơ ng
̣ phân tƣ ̉ thấp không co ́ kha ̉
năng hấp thu tiạ UV , có thể tạo dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde ta ọ sa ̉n phâ ̉m co ́
khả năng hấp thụ tia UV và đƣợc xác định bằng detector HPLC -UV.
Hiê ṇ nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấu trúc
ca các chất phân tích là detector khố i phổ.
2.2.1.5. Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử ca
các hợ p chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợ ng
và điện tích (m/z) ca chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
ca chúng nhƣ loại b ỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này đƣợc tách theo
tỉ s ố m/z và phát hiện, t ừ đó có thể cho thông tin về kh ối lƣợ ng hoc cấu trúc phân
tử ca hợ p chất.
Hình 2.1: Sơ đồ cấ u t ạo thiế t bị khố i phổ

Cấu t ạo c a m ột thiết b ị kh ối ph ổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết b ị
phân tích khối và bộ ph ận phát hiện. Trƣớ c h ết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồ n
ion, sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín
hiệu thu đƣợ c s chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.
Ƣu điểm ca phƣơng pháp là:
 Giúp phát hiện hầu hết các chất tan
13
 Độ nhạy cao
 Có thể giúp xác định đƣợc các chất tan ngay khi độ phân giải chƣa tốt.
 Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất.
Cung cấp đầy đ thông tin về cấu trúc và khối lƣợ ng
2.2.1.5.1. Bô ṇ guồn ion (Ion sources)
Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớ n nhất ở đây là
phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá ca
LC/MS, năng lƣợ ng c a máy trực ti ếp tác động vào pha lỏng hoc r ắn để t ạo thành
ion ở thể hơi. Trong máy khối ph ổ, có rất nhiều cách để ion hoá phân tử và nguyên
tử ca mẫu ở tr ạng thái khí hoc hơi. Sau đây là mộ t số k ỹ thuật thƣờng dùng:
a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI):

Trong phổ EI- MS, dòng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ s ợi dây
catot vonfram hoc reni đƣợc đốt nóng sinh ra dòng electron chuyển động vuông
góc vớ i mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử
hoc ion mảnh. Thông thƣờng các hợ
p chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng
8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợ c hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV .
ABC + e → ABC+● + 2e (1) (ion phân tử)

+● + ●
ABC → A + BC (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)
+● + ●
ABC → A + B +C
Ƣu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ. Tuy nhiên, một số
hợ
p ch ất d ễ phân mảnh thì thờ i gian sống ngắn, nhiều m ảnh nhỏ hay ít hoc không
thu đƣợc ion phân tử và đòi hỏi hợ p chất phải dễ bay hơi.
b) Chế độ ion hóa phun điện t ử (Electrospray Ionization- ESI)
Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu đƣợ c
dẫn vào điện trƣờ ng mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch
mẫu b ị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điệ n t ớ i l ối vào ca bộ
14
phép phân tích định lƣợ ng ở mức picomol tới femtomol, thích hợ p cho nh ững chất
có phân tử khối 1000 đơn vị nhƣng đòi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi.
2.2.1.5.2. Bộ phận phân giải khối

Sau khi đƣợ c ion hóa, chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phân giải khối.
Tại đây, các ion đƣợc tách ra khỏ i nhau theo tỉ số m/z. Bộ phận phân tích khối đƣợ c
chia thành 4 loại: bộ phân tích từ , b ộ phân tích tứ c ực, b ộ phân tích bẫ y ion tứ c ực
và bộ phân tích thờ i gian bay. Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
và bộ phân tích bẫ y ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) đƣợ c sử dụng
phổ biến.
a) Bộ phân
giải t ứ cự c (Quadrupole Analyser)
Tứ cực đƣợ c cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng
tr ống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợ c tạo ra bằng sự k ết hợ
p giữa dòng
một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một
bộ l ọc kh ối. Khi một trƣờng điện t ừ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó s
dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờ ng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z
phù hợ p mới có thể có thể đi qua đƣợ c bộ lọc này.
Bộ phân giải tứ cực đƣợc phát triển và cho ra đờ i bộ phận phân giải khối phổ
ba tứ cực (Triple Quadrupole).
Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân g iải khố i phổ ba t ứ cự c
16
Bộ phân tích khối phổ ba tứ cực gồm một buồng va chạm (collision cell,
đƣợc xem là tứ cực thứ hai Q2) đt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).
 Ở buồng Q1: Các ion đƣợc tách.
 Ở bu ồng Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm v ớ i khí trơ
có mt nhƣ nitơ, argon, heli nên chúng bị phân mảnh tiế p tạo ra các ion
nhỏ hơn (ion con).
 Ở buồng Q3: Làm nhiệm vụ tách các ion con.
b) Bộ phân giải bẫ
y ion t ứ cự c (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Loại thiết b ị này bao gồm một điện c ực vòng (ring electrode) vớ i nhiều điện
cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái vớ i
lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờ ng cong ổn
định đƣợ c bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đt trên điện cực vòng. Các ion
khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và s có hƣớng đi về phía detector. Do
điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợ c một phổ khối lƣợng đầy đ
Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợ c chọn riêng và phân tích theo sự khác
nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đƣợ c
các mảnh ion con từ đó thực hi ện phân tích theo m/z c a ion con (khối ph ổ 2 lần).
Về nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy th ờ i gian đ lâu để có thể thực
hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờ ng chỉ có khả năng thực hiện đến
khối phổ 3 lần.
2.2.1.5.3. Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân giải khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tớ i phần
cuối ca thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối
phổ tạo ra một tín hiệu ca các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợ c
khuếch đại hoc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loạ i bộ phận phát
hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Bộ ph ận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nh ất,
có độ nh ạy cao. Các ion đập vào bề m t dinot làm bật ra các electron. Các electron
17
thứ cấp sau đó đƣợ c dẫn tới các dinot tiếp theo và s tạo ra electron thứ cấ p nhiều
hơn nữa, tạo thành dòng electron.
Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion
ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng electron. Khác với detector nhân electron,
các electron sau đó s đập vào một màn chắn photpho và giải phóng ra các photon.
Các photon này đƣợc phát hiệ n bở i m ột bộ nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân
electron. Ƣu điểm ca phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đt trong chân
không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu
2.2.2.1. Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8]

Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật dựa trên sự phân bố khác nhau ca chất tan vào
2 pha không trộn l ẫn, từ đó tách chiết chất phân tích ra khỏi nền hoc tách các tạ p
chất ra khỏi ch ất phân tích. Cho nên, nguyên tắc c a k ỹ thuật chiết này là cho chất
tan (chất phân tích) ƣu tiên tan vào một trong hai pha l ỏng không trộn l ẫn, còn t ạ p
chất hay các chất khác ở lại trong pha kia.
Để có đƣợ c k ết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm
bảo đƣợc các yêu cầu nhất định sau đây:
- Dung môi chiết và dịch chất mâ ũ cầ n chiết g ọi t ắt là hai pha không đƣợ c
tr ộn lẫn vào nhau , trong đó dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo
không làm nhiễm bẩn chất phân tích.
K DA
- Hệ số tách    1 và hiển nhiên là α càng khác 1 càng tốt. Điề u
K DB
kiện tối ƣu là K DA . K DB = 1.

- Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớ p phải rõ ràng
để tách hai pha đƣợ c tốt.
- Phải chọn
đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm: pH ca dung dịch mâ ũ ,
nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia…
2.2.2.2. Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn [8]
18
Chiết pha r ắn là một phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để tách làm giàu và làm
sạch m ẫu phân tích từ dung dịch mâ ũ b ằng cách h ấ p ph ụ lên cột chiết pha r ắn. Sau
đó chất phân tích đƣợ c r ửa giải bằng một lƣợng nho ̉ dung môi thích hợp. Các chất
ảnh hƣởng đƣợ c loại bỏ.
Cột SPE đƣợ c nhồi ch t bằng những v ật li ệu x ố p, hạt nhỏ có các nhóm chức
khác nhau. Chất lỏng qua cột dƣới tác dụng ca áp suất hoc chân không.
Các bƣớ c tiến hành trong quá trình chiết pha r ắn:
Hình 2.3: Các bướ c của quá trình chiế t pha r ắ n
1. Hoạt hóa chấ t hấ

p phụ pha r ắ n
 Làm ƣớ t vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức ca chất hấ p phụ,
 Loại không khí trong các khoảng tr ống trong lớ p chất hấ p phụ,
 Không đƣợc để chất hấ p phụ bị khô.
1. M ẫu và chất phân tích đượ c chả y qua cột
 Chất phân tích đƣợc làm giàu trên chất hấ p phụ,
 Một vài thành phần ảnh hƣởng khác cũng có thể bị giữ lại,
19
 Các thành phần không bị hấ p phụ bị loại ra làm sạch chất phân tích.
2. Loại bỏ các chất gây ảnh hưở ng ra khỏi cột
 Giữ lại chất phân tích,
 Nếu mẫu là dung dịch nƣớ c, sử dụng dung dịch đệm hoc hỗn hợp nƣớ c-
dung môi hữu cơ ,
 Nếu mẫu b ị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rử a cột có thể sử dụng
chính dung môi hữu cơ .
3. Giải hấ
p chất phân tích bằng dung môi thích hợ
p
 Dung môi đƣợ c chọn đc trƣng đê phá vỡ tƣơng tác giữa chất phân tích
và chất hấ p phụ vớ i mục đích rửa giải đƣợ c chất phân tích vớ i hiệu quả
cao,
 Dung môi sử dụng r ửa giải đồng thời càng ít chất gây ảnh hƣở ng tới phép
phân tích càng tốt.
Chất hấ p phụ chiết pha r ắn thƣờng đƣợ c sử dụng gồm các loại:
- Chất hấ p thụ pha thƣờng: Các silica trung tính, oxit nhôm ,
- Chất hấ p phụ pha ngƣợc: Các silica đã đƣợc ankyl hóa nhóm OH,
- Chất có khả năng trao đổi ion,
- Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thƣớ c,
- Chất hấ p phụ pha khí-r ắn,
Hiện nay, phƣơng pháp chiết pha r ắn ngày càng đƣợ c sử dụng r ộng rãi và phổ
biến do những ƣu điểm vƣợ t tr ội sau:
- Hiệu suất thu hồi cao,
- Khả năng làm giàu, làm sạch các chất phân tích lớ n,
- Giảm lƣợng dung môi sử dụng,
- Có khả năng kết hợp các phƣơng pháp phân tích,
- An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt,
Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấ p phụ k ết hợp cơ
chế tƣơng tác pha đảo và tƣơng tác ƣa nƣớc. Pha tĩnh này đƣợc trùng hợ p từ hai
monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ƣa nƣớc và divinylbenzen
20
có tính kỵ nƣớ c. Chất h ấ p phụ Oasis có cấu trúc không gian lớ n (thể tích lỗ r ỗng là
2
1.3 cm /g), có diện tích bề mt trên một đơn vị khối lƣợng pha tĩnh cao (810 m 2/g).
Các nhóm chức phân cực ca monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân
cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lƣu giữ tốt đối với các chất phân tích phân cực đồng
thời có khả năng làm việc trong khoảng pH r ộng.
2.2.3. Thẩm định phƣơng pha p
́
2.2.3.1. Tính đc hiệu
Sƣ ̉ du ng
̣ ca ́c p hƣơng pha p ́ xa ́c nhâ ṇ (confirmation method ) là một cách rất
tốt đê ̉ đa ̉m ba ̉o t ́nh đă c̣ hiê ụ cu ̉a phƣơng pha p ́ . Hô i ̣ đồ ng châu Âu quy đi nḥ ca ́ch
tính điểm IP (điê ̉m nhâ ṇ da ng̣ – identification point) đối vơ ́ i ca ́c phƣơng pha p
́ kha ́c
nhau đê ̉ khă ̉ng đi nh
̣ chắ c chắ n sƣ co
̣ ́ mă t ̣ cu ̉a ca ́c chất . Cách tính điểm IP đƣợc chỉ
ra ơ
̉ phu lục
̣ 3.
2.2.3.2. Khoảng tuyến tính
Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn ca chất phân tích . Xác
định các giá trị đo đƣợ c y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có
khoảng khảo sát đƣờ ng biểu diễn là một phƣơng trình:
y = ax + b
và hệ số tƣơng quan:
r 
 ( xi  X )( yi  Y )
 ( xi  X )  ( yi  Y )
2
2
Nếu 0,995 < r ≤ 1 : Có tƣơng quan tuyến tính
Khi đã xác định đƣợ c khoảng tuyến tính, có thể xây dựng phƣơng trình hồi quy ca
khoảng này, tức là xác đị nh hệ số a và b. Trên đƣờ ng hồi quy, lấy đoạn tuyến tính
làm khoảng xác định (k ể cả hai điểm đầu và cuối).
2.2.3.3. LOD, LOQ
Tính LOD va ̀ LOQ theo biê ̉u thƣ ́c :
21

Tính giá trị trung bình , và độ lệch chuẩn SD
x
LOD = 3 x SD
LOQ = 10 x SD
Vơ i SD   i
(x  x)
́
n 1

Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R = x / LOD là hệ số đánh giá LOD
 Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợ p và LOD
tính đƣợc là đáng tin cậy.
 Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đc hơn, hoc thêm
một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và
tính lại R.
 Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoc pha loãng
dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
2.2.3.4. Độ l p lại, đô thu

̣ hồi
Độ thu hồi và độ l p lại đƣợc xác định theo các đại lƣợng SD và RSD nhƣ
công thức dƣới đây:
Trong đó:
Stb : Diện tích pic trung bình.
Si : Diện tích píc thứ i
n: Số lần đo.
SD: Độ lệch chuẩn
R SD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (%).
Độ thu hồi ca phƣơng pháp theo công thức sau :
22
m c 
(C C m )
H %   100
C
Trong đó: Cm+c : nồng độ nitrofuran xác định đƣợ c trong mẫu có thêm chuẩn (ng/g).
Cm: nồng độ nitrofuran có trong mẫu (ng/g).
C: nồng độ chuẩn nitrofuran đƣợc thêm vào (ng/g).

H: độ thu hồi (%).
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả phân tích trên LC-MS/MS đƣợc tính toán và xử lý bằng phần mềm
Analyst, Excel, origin 6.0.
Các công thức thống kê t ́nh đô lă
̣ p̣ la i,̣ đô thu
̣ hồi , tính LOD, LOQ…
2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứ u
2.3.1. Dụng cụ và thiết bị
2.3.1.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL c a
Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ ca Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung
môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt.

- Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm) .
- Cột chiết pha r ắn SPE (Oasis HLB).
- Máy lắc vortex VELP.
- Máy đồng nhất mẫu.
- Máy li tâm MIKRO 22R.
- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg).
- Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g).
- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt.
- Bể điều nhiệt
2.3.1.2 Dụng cụ
- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml.
- Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml.
- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 µl; 1000 µl; 5 ml…đầu côn.
23
- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm.

- Vial loại 1,8 ml.
- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml.
- Ống nghiệm thy tinh…
2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích
2.3.2.1 Chất chuẩn
- AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%
- AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%
- AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5%
- d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%
- d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%
- d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99%
13 15
- C N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98%
2.3.2.2 Hóa chất
- Methanol (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)
- Amoni acetate (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 98%)
- 2-NBA (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)
- K 2HPO4.3H2O (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)
- NaOH (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)
- HCl 37% (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)
- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch
bằng nƣớ c cất.
- 2- NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2- NBA hòa tan và định m ức vào bình 10 ml bằng
methanol. Dung dịch chuẩn bị hằng ngày.
- K 2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K 2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000
ml bằng nƣớ c cất 2 lần.
24
- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và đị nh mức vào bình định mức 1000 ml bằng
nƣớ c cất 2 lần.
- CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình
định mức 1000 ml bằng nƣớ c cất 2 lần.
2.3.3 Pha chế chất chuẩn
- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định
mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣
trong 6 tháng.
- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định m ức b ằng methanol
0
vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 20 C sƣ ̉ du ng

̣ đƣơ
c̣ trong 6 tháng.
- Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và đị nh
mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.
- Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l đị nh mức b ằng methanol
vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 6 tháng.
- Hỗn hợ
p chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lƣợ t 1 ml chuẩn
AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C
sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 3 tháng.
- Hỗn hợ
p chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗ n hợ p
chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định
0
mức 10 ml. Bảo quản ở - 20 C
sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 1 tháng.
- d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào
bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 6 tháng.
- d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình
định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 6 tháng.
- d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d 5-AMOZ định mức bằng methanol
vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 6 tháng.
- d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào
bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 6 tháng .
25
13 15
- H ỗn h ợ
p n ội chuẩn (d 4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, C N2-SEM.HCl) 1 mg/l:
hút lần lƣợ t 1 ml chuẩn d 4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l
và 13C15 N2-SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.
0
Bảo quản ở - 20 C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong 3 tháng.
13 15
- Hỗn hợ
p nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, C N2-SEM.HCl) 20 µg/l:
hút lần lƣợt 200 µl hỗn h ợ p n ội chuẩn (d 4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, 13C15 N2-
0
SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 20 C sƣ ̉ du ng
̣ đƣơ
c̣ trong
1 tháng.
26
CHƢƠNG 3: K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS
Phân tích dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các
chất chuyển hóa ca nhóm nitrofuran. Các chất chuyển hóa ca nitrofuran có khối
lƣợng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đc hiệu
cho sự phân mảnh (ch yếu là mất nƣớ c, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện bằ ng MS
tƣơng đối thấ p. Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa
nhóm nitrofuran để có đƣợc các hợ p chất dâ ñ xuất (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD,
NPSEM) vớ i nhiều đc tính thuận lợ i.
3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khô i

́
3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ
Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lƣợng phân tử nhỏ
và phân cực. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23,
26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM
bằng k ỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI vớ i chệ độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu
hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD,
SEM 500 ng/ml đã đƣợ c dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đƣa vào
detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối vớ i từng chất, tối ƣu hóa
từng ion mẹ, thu đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Điề u kiện chạ y nguồn ion hóa ESI
Khí màn (CUR) 20 psi

Khí va chạm (CAD) 8 psi
Thế ion hóa (IS) 5000 V
Nhiệt độ mao quản (TEM) 400 C
Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi
Áp suất ca luồng khí nóng (GS2) 40 psi
27
Trong k ỹ thuật ion hóa phun điện tử vớ i chế độ bắn phá ion dƣơng, các ion
+
mẹ có dạng (MH) vơ
i số khối m = (M+1) theo pha ̉n ƣ ng:
́ ́
0 + +
M + H → (MH)
Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, k ết quả đƣợ c chỉ ra ở bảng 3.2
Bảng 3.2: K ết quả bắn phá các ion mẹ
Chuyển hóa nhóm

Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+H)
nitrofuran
NPAOZ 235 236
NPAMOZ 334 335

NPSC 208 209
NPAHD 248 249
d4-AOZ 239 240
d5-AMOZ 339 340
13 15
C- N2 SEM.HCl 211 212
D2-AHD.HCl 250 251
3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion me ̣ ̉ thu đƣơ
đê c̣ ion con
Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê kh
̣ ối phổ 2 lần, do đó để phát
hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn đƣợ c ion con là rất quan tr ọng. Ion con
phải có tín hiệu g ấp ít nhất 10 lần so vớ i ion mẹ. Để thu đƣợ c mảnh ion con có tín
hiệu cao cần ph ải ch ọn đƣợ c mức năng lƣợ ng b ắn phá thích hợp. Dùng xylanh 500
µl bơm từng chuẩn đã đƣợ c dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion con
đă c̣ trƣng có cƣờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lƣợ ng. Mảnh ion con
m/z có cƣờng độ lớ n nhất dùng để định lƣợ ng, mảnh ion con thứ 2 có cƣờng độ thấ p
hơn dùng để xác nhận chất phân tích. Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion
con đc trƣng có cƣờng độ cao nhất. K ết quả thu đƣợ c ở bảng 3.3
28
Bảng 3.3: Năng lượ ng bắn phá và các ion con củ a các chấ t chuyển hóa nitrofuran
Chuyển hóa
Ion mẹ
nhóm + Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V)
nitrofuran (M+H)
134 80 15 10
NPAOZ 236
104 80 27 14
291 80 15 16
NPAMOZ 335
262 80 21 16
192 80 11 18
NPSEM 209
166 80 13 14
NPAHD 249 134 80 15 18

104 80 27 14
d4-AOZ 240 134 80 17 16
d5-AMOZ 340 296 80 15 16
13 15
C- N2
212 168 80 13 12
SEM.HCl
d2-AHD.HCl 251 134 80 15 14
Nhâ
ṇ xe ́t:
Theo qui đi nh
̣ cu ̉a Châu Âu 2002/657/EC, số điê ̉m nhâ ṇ da ng
̣ (IP) đƣơ
c̣ t ́nh đối vơ
́ i
́ i 1 ion me ̣va ̀ 2 ion con, số điê ̉m nhâ ṇ da ng
kỹ thuật LC /MS/M, tƣơng ƣ ́ng vơ ̣ (IP) là
4. Nhƣ vâ ỵ phƣơng pha p đa
đa
̃ p ƣ ng đƣơ
c̣ yêu cầu cu ̉a Châu Âu [ phụ lụ c 4]. Phù
́ ́ ́
hơ
p̣ vơ
́ i ca ́c nghiên cƣ ́u kha ́c cu ̉a mô t ̣ số ta ́c gia ̉ nhƣ ta ́c gia ̉ Leitner , tác giả D .Tyler
ca phòng thí nghiệm ca Anh…
3.1.2. Lự a chọn cột tách
Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thờ i theo khuyến cáo
ca nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn vớ i thiết bị là các
dung môi phân cực và phân cực trung bình nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớ c, acid
formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha
đảo. Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 vơ
́ i ca ́c thông số dƣơ
́ i đây cho
các nghiên cứu tiếp theo :
- Cột C18 ca Agilent có:
29
- Chiều da ̀i 150mm,

- Đƣờng kính 2,1mm,
-
Cơ
ha
̃ t ̣ 3,5µm.
3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient pha đô
ng
̣
Các dẫn xuất ca nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng
chế độ r ửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợ p. C húng tôi tiến hành khảo sát
một số chƣơng trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17,
24] chúng tôi sử d ụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol.
Cố định các điều kiện sắc ký:
- Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm) ,

- Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol,
- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút,
- Mẫu phân tích: hỗn hợp dâ
ñ xuất nitrofuran , nồng độ: 20 ng/ml.
Tiến ha ̀nh thí nghiệm theo :
a) Chƣơng tr nh Gradient 1, thu đƣơ
c̣ sắc đồ nhƣ trong h nh 3.1 :
̀ ̀
Thời gian (phút) 0,01 12,00 14,00 15,00 20,00
% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.1: sắ c đồ hô ñ hơ ̣ 1 ở nồng đô 20
̣ ng/ml
30
b) Chƣơng tr nh

̀ Gradient 2, thu đƣơ
c̣ sắ c đồ trong h nh
̀ 3.2:
Thời gian (phút) 0,01 5 8 9 12
% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.2: sắ c đồ hô ñ hơ ̣ 2 ở nồng độ 20 ng/ml
c) Chƣơng tr nh Gradient 3, thu đƣơ c̣ sắ c đồ trong h nh
̀ ̀ 3.3 :
Thời gian (phút) 0,01 8 10 13 13,01
% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.3: sắ c đồ hô ñ hơ ̣ 3 ở nồng độ 20 ng/
31
d) Chƣơng tr nh Gradient 4, thu đƣơ

c̣ sắ c đồ trong h nh
̀ ̀ 3.4:
Thời gian (phút) 0,01 10 12 15 15,01
% MeOH 20 90 90 20 20

e) Chƣơng tr nh Gradient 5, thu đƣơ c̣ sắ c đồ trong h nh
̀ ̀ 3.5:
Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00

% MeOH 20 90 90 20 20

32
Bàn luận :
- Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thờ i gian ngắn (chƣơng tr nh
̀ gradient 1,
gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc ca AOZ r ất xấu và bị chẻ píc. Hiê ṇ tƣơ
ng
̣
chẻ pic này là do hàm lƣợng MeOH cao , AOZ tồn ta i ̣ đồng thơ
̀ i ơ
̉ hai da ng
̣ la ̀ amin
bâ c̣ nhấ t R -NH2 và dạng R -NH3+. Do đo ́ , nồng đô MeOH
̣ cầ n pha ̉i đƣơ
c̣ khố ng chế
phù hợp , đồng ngh ã vơ
́ i tăng nồng đô CH
̣ 3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin
thành dạng R -NH3+.
- Chƣơng trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng va ̀ co ́ t ́n hiê ụ p ́c ro ra
̃ ̀ng . Do đó
chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiế p theo.

Tóm lại : Các thông số ph hơp cho quá trình tách sắc ký là :
- Cột Agilent C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)
- Pha động kênh A (amoniacetat 10 mM) ; kênh B (methanol) theo chƣơng
trình gradient 5:
Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00
% MeOH 20 90 90 20 20
- Tốc độ pha đô ng:
̣ 0,4 ml/phút,
- Thể tích bơm mẫu : 10 µl,

- Nhiệt độ cột: 30 C.
0
3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu

Qua tham khảo một s ố tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có
một s ố quy trình đã và đang đƣợ c ứng d ụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran
bao gồm : quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng
chiết pha r ắn. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây đê ̉
tiến ha ̀nh th ́ nghiê ṃ .
3.1.4.1. Lự a chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng
Dự kiến quy trình xử lý mẫu nhƣ sau:
33
Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm

Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml

Thêm 100 µl hỗn hợ p nội chuẩn vào mỗi ống

Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa axit bằng 10 ml K 2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc
vortex 20 giây

Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấy dung di cḥ mâ ũ

Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấ y lớp trên thổi khô
bằng N2

Hòa tan cn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)

Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằ ng LC/MS/MS
Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợ n, sử dụng quy trình chiết lỏng
– lỏng nói trên làm l p lại 3 lần cho k ết quả chỉ ra ở bảng 3.4 và sắ c đồ ơ
̉ h nh
̀ 3.6:
34
Bảng 3.4: Độ thu hồi mẫ u thịt l ợn thêm chuẩ n 20 ng/g sử d ụng chiế t l ỏng – l ỏng
Chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
SD % RSD H (%)
phân tích (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g)
AOZ 8,51 7,66 9,11 8,43 0,729 8,65 42,1
AMOZ 9,32 10,2 7,55 9,01 1,38 15,3 45,0
AHD 6,82 5,89 7,43 6,71 0,776 11,6 33,7
SEM 6,12 6,27 5,98 6,12 0,145 2,37 30,6

Hình 3.6: Sắ c đồ mâ ũ thi t ̣lơ p̣ nitrofuran ơ
̉ mƣ ́c nồ ng đô 20
̣
ng/g sƣ ̉ du ng
̣ quy tr nh
̀ chiết lo ̉ng – lỏng.
3.1.4.2. Lự a chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn
Thƣ c̣ hiê ṇ theo sơ đồ sau :
35
Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm




Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K 2HPO 4
vortex0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc
20 giây

̣ mâ ũ
Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấ y dung di ch

Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H 2O

Nạp mẫu vào cột, rử a loại chất bẩn bằng 2 x 2,5 ml H 2O

Hút chân không cho khô cột SPE

R ử a giải châ ́t phân t ́ch bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm

Thổi khô bằng N2


Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợ n, sử dụng quy trình chiết pha
r ắn làm l p lại 3 lần cho k ết quả chỉ ra ở bảng 3.5 và hình 3.7:
36
Bảng 3.5: Độ thu hồi mẫ u thịt l ợn thêm chuẩ n 20 ng/g sử d ụng chiế t pha r ắ n
Chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
SD % RSD H (%)
phân tích (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g)
AOZ 17,3 18,4 16,9 17,5 0,777 4,43 87,7
AMOZ 19,3 18,5 17,8 18,5 0,750 4,04 92,7
AHD 15,7 14,8 13,5 14,7 1,11 7,54 73,3
SEM 14,3 13,2 14,8 14,1 0,818 5,80 70,5

Hình 3.7: Sắ c đồ thi t ̣lơ p̣ nitrofuran ơ
̉ mƣ ́c nồng đô 20
̣ ng/g sƣ ̉
dụng qui trình chiết pha rắn SPE
Bảng 3.6: So sa nh đô
thu
̣ hồi của 2 quy trình chiế t:
́
Chiết SPE Chiết lỏng-lỏng
Thịt lợn thêm chuẩn
H (%) H (%)
AOZ 20 ng/g 87,7 42,1
AMOZ 20 ng/g 92,7 45,0
AHD 20 ng/g 73,3 33,7
SEM 20 ng/g 70,5 30,6
37
Nhâ ṇ xe ́t : Nhìn vào bảng trên ta thấy quy trình chiết SPE cho độ thu hồi cao
hơn so với quy trình chiết lỏng lỏng và đáp ứng đƣợc quy định ca Châu Âu
2002/657EC. Do đó chúng tôi chọn quy trình chiết SPE cho các nghiên cứ u tiế p
theo
3.2. Thâ ̉m đi
nḥ phƣơng pha p ́
3.2.1 Tính đặc hiệu
Phƣơng pha p ̣ ky ̃ thuâ t ̣ sắc ky ́ lo ̉ng khối phô ̉ 2 lần, thƣ c̣ hiê ṇ bắ n
́ trên sƣ ̉ du ng
phá ion mẹ m/z, đi nḥ lƣơ ̣ theo ion con ta ọ tha ̀nh . Theo ca ́ch t ́nh điê ̉m IP th vơ
ng ̀ ́ i 1
ion me ̣va ̀ 2 ion thu đƣơ
c̣ 4 điê ̉m IP, nhƣ vâ ỵ phƣơng pha p
́ co ́ t ́nh đă c̣ hiê ụ đa p
́ ƣ ́ng
đƣơ
c̣ yêu cầu cu ̉a châu Âu 2002/657/EC [32].
3.2.1. Khảo sát lập đƣờ ng chuẩn
3.2.1.1. Đườ ng chuẩ n của các chất nhóm nitrofuran sử d ụng nội chuẩn (để phân
tích mẫ u thự c)
Chúng tôi khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính ca diện tích píc sắc kí, tỷ lệ diện
tích píc nitrofuran/nội chuẩn vào nồng độ chất phân tích ở các nồng độ khác nhau
xác định h ệ s ố tƣơng quan va ̀ phƣơng trình đƣờ ng chuẩn. Theo quy định c a Châu
Âu các chất nhóm nitrofuran là chất cấm, MRPL về yêu cầu giớ i h ạn hiệu năng nhỏ
nhất c a phƣơng pháp đối v ới các ch ất dẫn xuất nhóm nitrofuran là 1 µg/kg, do đó
chúng tôi khảo sát xây dựng khoảng đƣờ ng chuẩn từ 0,5 – 5 ppb, sử dụng các nội
chuẩn ở cùng nồng độ 2 ppb để phân tích mẫu th ực. Sƣ ̉ du ng
̣ phần mềm origin 6.0
để xây dựng đƣờng chuẩn ca các kháng s inh nho ́m nitrofuran thu đƣơ c̣ ca ́c h nh
̀
3.8, 3.9, 3.10, 3.11 và bảng 3.7 dƣơ ́ i đây:
38
1.8 Y = 0.12426 + 0.31607 * X
1.6 Parameter Value Error

------------------------------------------------------------
1.4 A 0.01426 0.0141
B 0.31607 0.00606
1.2
a ------------------------------------------------------------
e
r
a 1.0
S
I R SD N P
/
a 0.8 ------------------------------------------------------------
e
r
a 0.99927 0.02411 6 <0.0001
e 0.6
t ------------------------------------------------------------
y
l
a
n 0.4
A
0.2
0.0
-0.2
0 1 2 3 4 5
Analyte conc/IS conc

Hình 3.8: Đƣờ ng chuẩn xác định AOZ sử dụng nội chuẩn
2.5
Y = 0.01807 + 0.45988 * X
2.0
Parameter Value Error
a ------------------------------------------------------------
A 0.01807 0.01616
e
r 1.5
a B 0.45988 0.00695
S
I ------------------------------------------------------------
/
a
e
r 1.0
a R SD N P
e
t
y ------------------------------------------------------------
l
a 0.99954 0.02764 6 <0.0001
n
A 0.5 ------------------------------------------------------------
0.0
0 1 2 3 4 5

Hình 3.9: Đƣờ ng chuẩn xác định AMOZ sử dụng nội chuẩn
39
8
Y = 0.26595 + 1.44626 * X
7

6 ------------------------------------------------------------
a
e
r 5 A 0.26595 0.09471
a
B 1.44626 0.0407
S
I
/ 4 ------------------------------------------------------------
a
e
r
a 3
e
R SD N P
t
y
l ------------------------------------------------------------
a 2
n 0.99842 0.16193 6 <0.0001
A
------------------------------------------------------------
1
-1
0 1 2 3 4 5

Hình 3.10: Đƣờ ng chuẩn xác định SEM sử dụng nội chuẩn
7
Y = 0.12446 + 1.22034 * X
6 Pa ra meter V alue Erro r

------------------------------------------------------------
5 A 0.12446 0.04298
a B 1.22034 0.01847
e
r ------------------------------------------------------------
a 4
S
I
/
a R SD N P
e 3
r ------------------------------------------------------------
a
e
t 0.99954 0.07348 6 <0.0001
y 2
l
a
------------------------------------------------------------
n
A
1
0 1 2 3 4 5
Analyte conc /IS con c

Hình 3.11: Đƣờ ng chuẩn xác định AHD sử dụng nội chuẩn
̀ ng chuâ ̉n xây dƣ ng
Dƣ ạ va ̀o đƣơ ̣ ph ́a trên kết hơ ̣ ̉ n t vơ
p̣ tra ba ̉ng gia ́ tri chuâ ́ i
bâ c̣ tƣ do
̣ f =4, đô tin
̣ câ ỵ 95% có t = 2,776 nên phƣơng tr nh
̀ hồ i quy y = (a ± t.Sa) +
(b ± t.S b)x co ́ da ng̣ nhƣ dƣơ
́ i đây:
40
Bảng 3.7: Phương trình hồ i quy 4 nitrofuran sử d ụng nội chuẩ n

TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R
1 AOZ y = (0,21426 ± 0,039142) + (0,31607 ± 0,016822)x 0,9992
2 AMOZ y = (0,01807 ± 0,044860) + (0,45988 ± 0,019293)x 0,9995
3 AHD y = (0,12446 ± 0,119312) + (1,22034 ± 0,051273)x 0,9995
4 SEM y = (0,26595 ± 0,262915) + (1,44626 ± 0,112983)x 0,9984
Nhận xét: tỉ lệ diện tích pic nitrofuran/diện tích pic nội chuẩn (IS) trong khoảng 0,5
– 5 ng/ml có hệ số tƣơng quan R 2 > 0,99.
3.2.1.2.Đườ ng chuẩ n của các chất nhóm nitrofuran không sử d ụng nội chuẩn (để
đánh giá hiệu suấ t thu hồi)
Lậ p m ối tƣơng quan tuyến tính giữa di ện tích pic và nồng độ các chất nhóm
nitrofuran, thu đƣợc đƣờ ng chuẩn ca các chất nhóm nitrofuran chỉ ra ở hình 3.12,
3.13, 3.14, 3.15 và bảng 3.8:
Y = 14569.47368 + 307751.51579 * X
1600000
1400000
------------------------------------------------------------
1200000 A 14569.47368 11729.11536
B 307751.51579 5039.63638
1000000 ------------------------------------------------------------
800000 R SD N P
a
e
r ------------------------------------------------------------
A 600000
0.99946 20053.27825 6 <0.0001
400000
------------------------------------------------------------
200000
-200000
0 1 2 3 4 5
conc AOZ (ppb)

Hình 3.12: Đƣờ ng chuẩn ca AOZ không sử dụng nội chuẩn
41
Y = 42232.68421 + 363894.58947 * X
2000000
------------------------------------------------------------
A 42232.6 8421 19272. 12625
1500000 B 36 38 94 .5 89 47 8 28 0. 63 37 6
------------------------------------------------------------
R SD N P
a
e
r 1000000
------------------------------------------------------------
a 0.99897 32949.57021 6 <0.0001
e
t
y
l ------------------------------------------------------------
a
n
A 500000
0 1 2 3 4 5
conc AMOZ (ppb)

Hình 3.13: Đƣờ ng chuẩn ca AMOZ không sử dụng nội chuẩn
Y = 6879.15789 + 36694.50526 * X
200000
Param eter Value Error
------------------------------------------------------------
A 6879 .1578 9 1594 .0673 3
150000
B 36694.50526 684.92119
a
------------------------------------------------------------
e
r
A 100000
e
R SD N P
t
l
y
a ------------------------------------------------------------
n 0.9993 2725.37823 6 <0.0001
A
50000 ------------------------------------------------------------
0 1 2 3 4 5
conc AHD (ppb)

Hình 3.14: Đƣờ ng chuẩn ca AHD không sử dụng nội chuẩn
42
200000
Y = 592.13158 + 35485.42105 * X
180000
160000 Pa ram eter Va lue Error

140000 ------------------------------------------------------------
A 592.1 3158 1504 .30234
120000 B 35485.42105 646.35197
a ------------------------------------------------------------
e
r 100000
a
e
t R SD N P
y 80000
l ------------------------------------------------------------
a
n 60000
A 0.99934 2571.90695 6 <0.0001
40000
------------------------------------------------------------
20000
-20000
0 1 2 3 4 5
conc SEM (ppb)

Hình 3.15: Đƣờ ng chuẩn ca SEM không sử dụng nội chuẩn
̀ ng chuâ ̉n xây dƣ ng
Dƣ ạ va ̀o đƣơ ̣ ph ́a trên kết hơ ̣ ̉ n t vơ
p̣ tra ba ̉ng gia ́ tri chuâ ́ i
bâ c̣ tƣ do
̣ f =4, đô tin
̣ câ ỵ 95% có t = 2,776 nên phƣơng tr nh
̀ hồ i quy y = (a ± t.Sa) +
(b ± t.S b)x co ́ da ng̣ nhƣ dƣơ
́ i đây:
Bảng 3.8: Phương trình hồi quy của 4 nitrofuran không sử d ụng nội chuẩ n
TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R
1 AOZ y = (14569 ± 32560) + (307751 ± 13990)x 0,9994
2 AMOZ y = (42233 ± 53499) + (363895 ± 22988)x 0,9989
3 AHD y = (6879 ± 4425) + (36695 ± 1902)x 0,9993
4 SEM y = (592 ± 4175) + (35485 ± 1793)x 0,9993
Nhận xét: Diện tích nitrofuran vớ i nồng độ trong khoảng 0,5 – 5 ng/ml có hệ số
2
tƣơng quan R > 0,99.
3.2.2. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lƣợ ng của phƣơng pháp
Giớ i hạn phát hiện đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất ca chất phân tích
mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc, có tín hiệu sắc ký lớ n gấ p 3 lần
tín hiệu đƣờ ng nền. Đây là một thông số đc trƣng cho độ nhạy c a phƣơng pháp.
Chất nào nhạy hơn s có giớ i hạn phát hiện nhỏ.
43
Cũng theo phƣơng pháp này giớ i hạn định lƣợng là nồng độ nhỏ nhất chất
phân tích mà có tín hiệu lớ n gấ p 10 lần tín hiệu nhiễu đƣờ ng nền hay mẫu tr ắng
(S/N = 10).
Chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thử không chứa chất phân tích,
làm 10 lần song song. Bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 chỉ ra giớ i h ạn phát hiện ca AOZ,
AMOZ, AHD, SEM
Bảng 3.9: Giớ i hạn phát hiện của AOZ trên nề n mẫ u thịt
Thêm
chuẩn LOD LOQ
x
Số TT x SD
AOZ 0,5 (ng/g) (ng/g) LOD
ng/ml
Lần 1 0,386
Lần 2 0,463
Lần 3 0,483
Lần 4 0,459
Lần 5 0,419
0,434 0,0333 0,100 0,300 4,34
Lần 6 0,432
Lần 7 0,395
Lần 8 0,412
Lần 9 0,456
Lần 10 0,436
44
Bảng 3.10: Giớ i hạn phát hiện của AMOZ trên nề n mẫ u thịt
Thêm
chuẩn LOD LOQ x
Số TT x SD LOD

AMOZ (ng/g) (ng/g)
0,5 ng/ml
Lần 1 0,405
Lần 2 0,504
Lần 3 0,520
Lần 4 0,508
Lần 5 0,432
0,485 0,0398 0,119 0,357 4,06
Lần 6 0,489
Lần 7 0,532
Lần 8 0,465
Lần 9 0,491
Lần 10 0,502
Bảng 3.11: Giớ i hạn phát hiện của AHD trên nề n mẫ u thịt
Thêm
chuẩn LOD LOQ x
Số TT x SD LOD

AHD 1 (ng/g) (ng/g)
ng/ml
Lần 1 1,01
Lần 2 1,13
Lần 3 0,983
Lần 4 1,10
Lần 5 0,94
1,06 0,0743 0,223 0,669 4,73
Lần 6 1,15
Lần 7 1,11
Lần 8 1,01
Lần 9 1,12
Lần 10 0,997
45
Bảng 3.12: Giớ i hạn phát hiện của SEM trên nề n mẫ u thịt
Thêm LOQ
chuẩn LOD x
Số TT x SD LOD

SEM 1,5 (ng/kg) (ng/g)
ng/ml
Lần 1 1,57
Lần 2 1,32
Lần 3 1,37
Lần 4 1,60
Lần 5 1,65
1,53 0,126 0,378 1,13 4,04
Lần 6 1,70
Lần 7 1,60
Lần 8 1,58
Lần 9 1,40
Lần 10 1,52
Trong đo ́:

- x là trung bình của 10 l ần làm lặ p l ại

- x / LOD là hệ số đánh giá LOD
Bàn luận:
- LOD cua cac chấ t khang sinh nhom nitrofuran nằ m trong khoảng từ 0,100 – 0,378

̉ tƣ ́ 0,300 – 1,13
́ ng/g đa ṕ ƣ ng đƣơ
ng/g; LOQ c̣ yêu cầu cu ̉a Châu Âu 2002/657/EC
̀ ́ ́
về đô nha
̣ ỵ cu ̉a phƣơng pha p
́ . Phù hợp với các nghiên cứu tƣơng tự .
3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi
Thực hi ện thêm chuẩn vào mẫu th ịt l ợ n k hông chứa nitrofuran ở các mức n ồng
độ (MRPL; 1,5MRPL; 2MRPL) đối vớ i mỗi chất là: 1 ng/g ; 1,5 n g/g ; 2 ng/g . Phân
tích l p lại 6 lần mỗi mẫu. Các kết quả thu đƣợ c ở bảng 3.13 đến 3.15:
46
Bảng 3.13: Độ l ặ p l ại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nề n mẫ u thịt l ợ n t ại 1 ng/g
Thông Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Trung %

Chất SD
số 1 2 3 4 5 6 bình RSD
C
0,994 0,979 1,06 1,10 0,985 0,991 1,02 0,050 4,89
AOZ (ng/g)
H (%) 99,4 97,9 106 110 98,5 99,1 102
C
1,03 1,07 0,998 1,04 1,06 1,03 1,038 0,025 2,45
AMOZ (ng/g) AOZ
H (%) 103 107 99,8 104 106 103 104
C 0,859 0,986 0,814 0,992 0,885 1,00 0,923 0,079 8,55

AHD (ng/g) AHD
H (%) 85,9 98,6 81,4 99,2 88,5 100 92,3

C
0,805 0,732 0,859 0,781 0,659 0,992 0,805 0,076 9,42
SEM (ng/g)
H (%) 80,5 73,2 85,9 78,1 65,9 99,2 80,5
̣ ṇ thêm chuâ ̉n hô ñ hơ

Hình 3.16: Sắ c đồ mâ ũ thi t lơ p̣ introfuran ta i ̣ mƣ ́c nồng đô 1 ng/g.
̣
47
Bảng 3.14: Độ l ặ p l ại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nề n mẫ u thịt l ợn
t ại 1,5 ng/g.
Chất SD
số 1 2 3 4 5 6 bình RSD
C 1,56 1,15 1,60 1,25 1,32 1,59 1,41 0,196 13,0
AOZ (ng/g)
H (%) 104 76,7 106 83,3 88,0 106 94
C
1,56 1,54 1,55 1,57 1,60 1,58 1,57 0,023 1,46
AMOZ (ng/g)
H (%) 104 103 103 105 107 105 105
C
1,44 1,61 1,54 1,60 1,63 1,67 1,58 0,077 4,87
AHD (ng/g)
H (%) 96 107 103 107 109 111 106
C
SEM (ng/g) 1,37 1,60 1,17 1,69 1,4 1,72 1,49 0,205 13,7
H (%) 91,3 107 78,0 113 93,3 115 99,6

Hình 3.17: Sắc đồ mâ ũ thi t ̣lơ p̣ nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồng 1,5
đô ng/g.
̣
48
Bảng 3.15: Độ l ặ p l ại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nề n mẫ u thịt l ợn
t ại 2 ng/g.
Chất SD
số 1 2 3 4 5 6 bình RSD
C
2,14 1,98 1,73 2,05 2,15 2,17 2,04 0,171 8,41
AOZ (ng/g)
H (%) 107 99,0 86,5 102 108 109 102
C
2,06 2,07 2,11 2,09 1,87 1,98 2,03 0,097 4,78
AMOZ (ng/g)
H (%) 103 104 105 93,5 99,0 102 101
C
2,04 1,89 1,76 2,24 1,84 1,90 1,95 0,171 8,80
AHD (ng/g)
H (%) 102 94,5 88,0 112 92,0 95,0 97,2
C
1,77 2,04 2,00 2,06 1,,82 2,04 1,96 0,125 6,47
SEM (ng/g)
H (%) 88,5 102 100 103 91,0 102 99,8

Hình 3.18: sắ c đồ mâ ũ thi t ̣lơ p̣ nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồ ng 2đông/g
̣
Bàn luận : Ta thấy đô thu ̣ hồi trung b nh ̀ cu ̉a ca ́c chấ t tƣ ̀ 80,5 – 106%, đô lă ̣ p̣ lại tốt
(%RSD < 13,7%) đa t ̣ yêu cầ u theo quy đi nh
̣ cua Châu Âu 2002/657/EC. Tƣ cac
̉ ̀ ́
49
điều kiê ṇ đa đƣơ

̃ c̣ tối ƣu ơ
̉ trên đu ̉ đa ̉m ba ̉o cho phe p
́ phân t ́ch xác định 4 chất
nhóm nitrofuran.
Từ những k ết quả khảo sát và thẩm định phƣơng pháp, chúng tôi đƣa ra
phƣơng pháp phân tích các chất chuyển hóa ca nitrofuran nhƣ sau:
Cân 2 g mẫu/blank/QC vào ống ly tâm



Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu thêm chuẩ n chỉ tính trên mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sang để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K 2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc
vortex 20 giây

Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấ y dung di cḥ mâ ũ

Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O

Nạ p mẫu vào cột chiết r ửa bằng 2 x 2,5 ml H2O

Hút chân không cho khô cột SPE

R ửa giải chấ t phân t ch bằng 4 ml EtAc vào ố ng nghiệm
́

Thổi khô dung di cḥ mâ
u bằng N2
̃


50
3.3. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích thực phẩm
Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng và thẩm định, chúng tôi ứng dụng để
phân tích một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội. Các kết quả đƣợ c
trình bày ở bảng 3.16
Bảng 3.16: K ế t quả phân tích mẫ u thự c theo phương pha p thêm chuâ ̉n
́
Lƣợng thêm Lƣợng tìm

STT Mẫu Nitrofuran R%
vào (ng) thấy (ng)
0 KPH -
AOZ
1 0,87 87
0 KPH -
AMOZ
Thịt lợ n chợ 1 0,96 96
1
Nguyễn Cao 0 KPH -
AHD
1 0,78 78
0 KPH -
SEM
1 0,72 72
0 KPH -
AOZ
1 1,12 112
0 KPH -
AMOZ
Thịt gà chợ 1 1,02 102
2
Nguyễn Cao 0 KPH -
AHD
1 0,95 95
0 KPH -
SEM
1 0,89 89
0 KPH -
AOZ
Thịt bò chợ Mai 1 0,99 99
3
Động 0 KPH -
AMOZ
1 1,05 105
51
0 KPH -
AHD
1 1,03 103
0 KPH -
SEM
1 1,09 109
0 KPH -
AOZ
1 0,88 88
0 KPH -
AMOZ
Gan chợ Mai 1 0,97 97
4
Động 0 KPH -
AHD
1 0,75 75
0 KPH -
SEM
1 0,69 69
0 KPH
AOZ
1 1,02 102
0 KPH
AMOZ
Thịt lợ n chợ Cầu 1 0,79 79
5
Giấy 0 KPH
AHD
1 1,01 101
0 KPH
SEM
1 1,03 103
0 KPH
AOZ
1 0,92 92
0 KPH
AMOZ
Thịt bò chợ Cầu 1 0,88 88
6
Giấy 0 KPH
AHD
1 0.79 79
0 KPH
SEM
1 1,06 106
52
0 KPH
AOZ
1 1,05 105
0 KPH
AMOZ
Thịt lợ n chợ Ngọc 1 1,11 110
7
Hà 0 KPH
AHD
1 0,98 98
0 KPH
SEM
1 0,67 67
0 KPH
AOZ
1 0,76 76
0 KPH
AMOZ
Thịt gà chợ Ngọc 1 0,82 82
8
Hà 0 KPH
AHD
1 0,97 97
0 KPH
SEM
1 0,73 73
KPH: không phát hiện < LOD của phương pháp ,
R %: Phần trăm độ thu hồi.
Bàn luận:
Qua quá trình phân tích một số mẫu thực trên địa bàn Hà Nội, không phát
hiện mẫu nào có chứa các chất nhóm nitrofuran.
Độ thu hồi hầ u hết ca ́c chấ t tƣ ̀ 67 – 112% đa p
́ ƣ ́ng đƣơ
c̣ qui đi nh
̣ cu ̉a Châu
Âu 2002/657/EC. Tƣ ̀ kết qua ̉ đô thu ̣ hồi na ̀y cho t hấy co ́ thê ̉ mơ

̉ rô ng
̣ phƣơng pha p
́
cho ca ́c sa ̉n phâ ̉m thƣ c̣ phâ ̉m tƣơi sống kha ́c .
3.4 Hƣớng phát triển của đề tài
Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định
đƣợc dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS trong một số mẫu thực
phẩm tƣơi sống (thịt gà , thịt lợn , thịt bò , gan). Phƣơng pháp còn có thể đƣợ c mở
r ộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau nhƣ: thức ăn chăn nuôi, mẫ u
53
sinh học, mẫu sữa…Vì vậy r ất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển
phƣơng pháp và áp dụng phu c̣ vu phân
̣ t ́ch mâ ũ va ̀o thực tiễn.
54
K ẾT LUẬN
Trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, vớ i mục đích ứng dụng ky ̃
thuâ t ̣ sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS để tách và xác định các kháng sinh nhóm
nitrofuran trong mẫu thực phẩm tƣơi sống, chúng tôi đa
thu
̃ đƣợc các kết quả sau:
1. Đã nghiên cứu đƣợc các điều kiện chạy s ắc ký lỏng khối phổ để xác định 4
chất chuyển hóa nhóm nitrofuran bao gồm:
- Khảo sát đƣợc các điều kiện đo phổ khối (thế phân nhóm (DP), năng lƣợ ng
va chạm (CE)..) để thu đƣợc các ion khố i đc trƣng ca từng chất nitrofuran.
- Khảo sát chọn đƣợc các điều ki ện s ắc ký lỏng: cột s ắc C18 Agilent (150mm
× 2,1mm × 3,5µm); pha độ ng vơ

́ i kênh A amoniacetat 10mM trong nƣớc va ̀
kênh B là metanol; chƣơng trình rửa giải gradient.
2. Đã khảo sát đƣợc điều ki ện tách và làm sạch các nitrofuran ra khỏi n ền m ẫu
thịt lợ n bằng chiết pha r ắn vớ i cột chiết oasis HLB.
3. Đã thẩm định các thông số ca phƣơng pháp bao gồm:

- Khoảng tuyến tính: trong khoảng từ 0,5 – 5 µg/kg vớ i hệ số tƣơng quan
2
tuyến tính R > 0,996.

- Giớ i hạn phát hiện AOZ (0,100 µg/kg), AMOZ (0,119 µg/kg), AHD (0,223
µg/kg), SEM (0,378 µg/kg), đáp ứng yêu cầu về độ nhạy để phân tích các
chất nho ́m nitrofuran.
- Độ thu hồi trung b nh
̀ tƣ ̀ 80,5 – 106% cho thấy phƣơng pháp có độ đúng tốt.
- Độ lệch chuẩn tƣơng đối thấ p (RSD% < 13,7%) cho th ấy phƣơng pháp có độ
l p lại va ch nh xa c cao .
̀
́ ́
4. Đã ứ ng d ụng phƣơng pháp để phân tích các mẫu th ực ph ẩm tại các chợ trên
địa bàn Hà Nội, cho thấy phƣơng pháp có thể ứng dụng để phân tích xác định
dâ ñ xuất nho ́m nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống.
55
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Nguyê
n Quố c Ân (2009), Sư
̉ du ng
̣ kha ́ng sinh trong chăn nuôi thu ́ y ơ
̉ Viê t ̣ Nam ,
̃
Cục thú y.
2. Tr ần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa
học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ , Nhà xuất bản Khoa học
và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Đức Huệ (2005), Các phương pháp phân tích Hữu cơ, Nhà xuấ t bản Đại
học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nộ i.
4. Phạm Lu ận (2000), Cơ sở lý thuyế t sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC), Nhà xuất
bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.
5. Nguyễn Đình Thành (2011), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học
trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
6. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa học
trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
7. Bùi Thị Tho (2003), Thuốc kháng sinh và nguyên tắ c sử d ụng trong chăn nuôi,
Nhà xuất bản Hà Nội.
8. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trƣờ ng
Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
9. Số 54/2002/QĐ-BNN, ngày 20 tháng 06 năm 2002 về việc cấ m sản xuấ t, nhậ p
khẩu,lưu thông và sử d ụng một s ố lo ại kháng sinh hóa chấ t trong sản xuất và kinh
doanh thức ăn chăn nuôi ca Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
10. 28 TCN 194:2004, Các chấ t chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủ y sản
và sản ph ẩ m th ủ y s ản – Phương pháp định lượ ng b ằ ng s ắc ký lỏng khố i ph ổ - khố i
phổ
, Bộ Thy Sản.
56
11. Trang web (2008), http//vietbao.vn/Kinh-te/My-kiem-tra-thuy-san-nuoi-Trung-

Quoc-Viet-Nam-lo-ngai/55154852/93. Việt Báo
Tiếng Anh
12. Alexander Leitner, Peter Zollner, Wolfgang Lindner (2001) ,“Determination of
the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid
chromatography –tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A,
Volume 939, pp. 49-58.
13. Caroline Douny, Joelle Widart, Edwin De Pauw, Frederic sivestre, Packtrick
Kestemont, Huynh Thi Tu, Nguyen Thanh Phuong (2012), Development of an
analytical method to detect metabolites of nitrofurans: Application to the study of

furazolidone elimination in Vietnamese black tiger shrimp (Penaeus monodon),
Aquaculture, Volume 376-379, pp. 54-58.
14. C. Bock, C. Stachel, P.Gowik (2007), Validation of a confirmatory method for
the determination of residues of four nitrofurans in egg by liquid chromatography-
tandem mass spectrometry with the software interval, Analytica Chimica Acta,
Volume 586, pp. 348-358.
15. C. Chang, D.P. Peng, J.E. Wu, Y.L. Wang, Z.H. Yuan (2008), Development of
an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in
animal edible tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.53, pp
8934-8939.
16. Chung-Wei Tsai, chuan-ho tang and Wei-Hsien wang (2010) , “Quantitative
Determination of Four Nitrofurans and Corresponding Metabolites in the Fish
Muscle by Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass

Spectrometry” , Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 18, No. 2, pp. 98-106.
17. D. Tyler (2009), Analysis of nitrofurans in animal tissues a food of animal
origin by LC/MS/MS, sop FSG341.
18. E. Horne, A. Cadogan, M. OKeeffe, Hoogenboo, L.A.P. (1996), Analysis of
protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high
57
performance liquid chromatography and liquid chromatography mass spectrometry.

Analyst, Vol.121, 1463-1468.
19. E. Verdon, P. Couedor, P. Sanders (2007), Multi-residue monitoring for the
simultaneous determination of five nitrofurans (furazolidone, furaltadone,
nitrofurazone, nitrofurantoine, nifursol) in poultry muscle tissue through the
detection of their five major metabolites (AOZ, AMOZ, SEM, AHD, DNSAH) by
liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry – Inhouse
validation in line with Commission Decision 657/2002/EC. Analytica Chimica Acta,
Vol.586, pp 336-347.
20. I. Diblikova, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, M. Franek (2005), Monoclonal

antibody-based ELISA for the quantification of nitrofuran metabolite 3-amino-2-
oxazolidinone in tissues using a simplified sample preparation. Analytica Chimica
Acta, Vol.540, 285-292.
21. K.M. Cooper, P.P. Mulder, van Rhijn J.A. van Rhijn, L. Kovacsics, R.J.
McCracken, P.B. Young, D.G. Kennedy (2005), Depletion of four nitrofuran
antibiotics and their tissue-bound metabolites in porcine tissues and determination
using LC-MS/MS and HPLC-UV. Food Additives and Contaminants, pp 405-414.
22. Lech Rodziewicz (2008), Determination of nitrofuran metabolites in milk by
liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal
of chromatography, Vol.864, pp. 156-160.
23. Mayda I.Lopez (2007), “Determination and confirmation of Nitrofuran residues
in honey using LC-MS/MS”, Journal of agricultural and food chemistry, Vol.55,
pp. 1103-1108.
24. M. O’Keeffe , A. Conneely, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, L. Kovacsics, A.
Fodor, P.P.J. Mulder, J.A. van Rhijn, G. Trigueros (2004), Nitrofuran antibiotic
residues in pork the FoodBRAND retail survey. Analytical Chimica Acta, Vol.520,
125-131.
58
25. M. Vass*, K. Hruska, M. Franek (2008), “Nitrofuran antibiotics: a review on the

application, prohibition and residual analysis”, Veterinarni Medicina, Vol.53, pp.
469 – 500.
26. Pascal Mottier, Seu-Ping Khong, Eric Gremaud, Janique Richoz, Thierry
Delatour, Till Goldmann, Philippe A.Guy (2005), Quantitative determination of
four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-
electrospray ionization-tandem mass spectrometry, Journal of chromatography A,
Volume 1067, pp. 85-91.
27. P. Vinas, N. Campillo, L. Carrasco, M. Hernandez-Cordoba (2007), Analysis of
nitrofuran residues in animal feed using liquid chromatography and photodiode-

array detection, Chromatographia, Vol.65, pp. 85-89.
28. Randox laboratory (2008), “Measurement of four nitrofuran metabolites with
elisa kits using multi-analyte reagents”, Randox life sciences.
29. Sujittra Phongvivat, Bangkok, Thailand (2004), “Nitrofurans Case Study:
Thailand’s experience” , Joint FAO/WHO Technical Workshop on, Residues of
Substances without ADI/MRL in Food.
30. Tao Ding, Jingzhong Xu, Chongyu Shen and Kefei Wang (2007),
“Determination of trace level nitrofuran metabolites in crawfish meat by
electrospray LC-MS/MS on the TSQ quantum discovery MAX, Thermo fisher
scientific, San Jose, CA, USA.
31. W. Lui, C. Zhao, Y. Zhang, S. Lu, J. Liu, R. Xi (2007), Preparation of
polyclonal antibodies to a derivative of 1-amonihydantoin (AHD) and development
of an indirect competitive ELISA for the detection of nitrofurantoin residue in
water. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Vol.55, 6829-6834.
32. 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the
performance of analytical methods and the interpretation of results.
59
PHỤ LỤC
p̣ chuâ ̉n .
Phụ lục 1: Sắ c đồ cu ̉a hô ñ hơ
ñ hơ
P 1.1: Sắc đồ hô p̣ chuẩn nitrofuran 1 ppb.
P 1.2: Sắ c đồ hô ñ hơ

p̣ chuẩn nitrofuran1,5 ppb.
P 1.3: sắ c đồ hô ñ hơ

p̣ chuẩn nitrofuran 2 ppb.
P 1.4: sắ c đồ hô ñ hơ

p̣ c huẩn nitrofuran 5 ppb.
Phụ lục 2: Sắc đồ mâ ũ thêm chuâ ̉n
P 2.1: sắc đồ mâ ṇ thêm chuâ ̉n hô ñ hơ

ũ thi t ̣lơ p̣ nitrofuran ta i ̣ mƣ c nồng đô 1̣ ng/g.
́
P 2.2: sắ c đồ ṇ thêm chuâ ̉n hô ñ hơ

mâ ũ thi t ̣lơ p̣ nitrofuran ta i ̣ mƣ ́c nồ ng đô 1̣ ng/g.

mâ ũ thi t ̣lơ p̣ nitrofuran ta i ̣ mƣ ́ c nồ ng đô 1̣ ng/g.

ũ thi t ̣lơ
P 2.4: sắc đồ mâ p̣ nitrofuran ta i ̣ mƣ c nồ ng đô 1,5
́ ̣ ng/g.



Phụ lục 3: cách tính điểm IP
P 3.1: Quan hê ̣giƣ

́ ̃ t ̣ khối phô ̉ va số điê ̉m IP đa t ̣ đƣơ
ã ca c ky thuâ ̀ c̣
P 3.2: Ví dụ về số điểm IP đạt đƣợc đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau
Phụ lục 4:
P 4.1: Bảng qui định hệ số biến thiên tại các cấp nồng độ
P 4.2: Bảng qui định về độ thu hồi tại các cấp nồng độ

Xac Dinh Dong Thoi Du Luong Khang Sinh Nhom Nitrofuran Trong

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Xac Dinh Dong Thoi Du Luong Khang Sinh Nhom Nitrofuran Trong

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

8/20/2019 Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực phẩm

ực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội b…

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢ NG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚ NG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 56

Bảng 3.16 K ết quả phân tích trên mẫu thực 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Nội dung Trang

Hình 3.1 Sắ c đồ hô ñ hơ

Hình 3.11 Đƣờ ng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.18 Sắc đồ mâ ũ thi t ̣lơ

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

LOD Limit of detection Giớ i hạn phát hiện

SPE Solid phase extraction Chiết pha r ắn

khỏe ngƣời tiêu dùng.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran

trong môi trƣơ

hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31].

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứ u

2.2.1.3. Pha động trong HPLC [8]

Loại thứ nhất có thành phần ch yếu là

2.2.1.4. Detector trong HPLC [5]

2.2.1.5. Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry)

Hình 2.1: Sơ đồ cấ u t ạo thiế t bị khố i phổ

a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI):

8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợ c hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV .

ABC + e → ABC+● + 2e (1) (ion phân tử)

2.2.1.5.2. Bộ phận phân giải khối

Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân g iải khố i phổ ba t ứ cự c

2.2.2.1. Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8]

kiện tối ƣu là K DA . K DB = 1.

1. Hoạt hóa chấ t hấ

2.2.3.4. Độ l p lại, đô thu

C: nồng độ chuẩn nitrofuran đƣợc thêm vào (ng/g).

môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt.

- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm.

2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn

- AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 20 C sƣ ̉ du ng

CHƢƠNG 3: K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khô i

Bảng 3.1: Điề u kiện chạ y nguồn ion hóa ESI

Khí màn (CUR) 20 psi

Chuyển hóa nhóm

NPAMOZ 334 335

NPAHD 249 134 80 15 18

- Chiều da ̀i 150mm,

- Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm) ,

p̣ chuâ ̉n khi cha ỵ chế đô gradient

b) Chƣơng tr nh

p̣ chuâ ̉n khi cha ỵ chế đô gradient

p̣ chuâ ̉n khi cha ỵ chế đô gradient

d) Chƣơng tr nh Gradient 4, thu đƣơ

p̣ chuâ ̉n khi cha ỵ chế đô gradient

Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00