3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nhân bản gen của β-glycosidase từ T. flavus AT-62
- Trong số 12.000 dòng E. coli Top10F’ tái tổ hợp được tạo ra từ thư viện bộ gen của
T. flavus AT-62: có tổng cộng 9 dòng dương tính với X-gal ở 70 C. Có dòng dương
tính chứa 3,5 – 14 kb mẫu chèn.
- Tất cả các đoạn chèn của dòng vô tính đều có nguồn gốc từ cùng một vùng của T.
flavus AT-62 DNA2 . Do đó, hoạt tính enzym cao nhất đối với X-gal có dòng vô tính
đại diện chứa đoạn chèn 8,5 kb và nó được chỉ định là pAT13.
- pAT13 phân thành hai đoạn 4 kb và 4,5 kb bằng cách phân hủy XbaI , và hoạt động
của enzym chỉ được duy trì trong một dòng con chứa đoạn 4 kb, được ký hiệu là
pAT1303.
3.2. Giải trình tự DNA và phân tích gen
- Để xác định cấu trúc của gen mã hóa -
hoạt động của enzym β-glycosidase,
toàn bộ trình tự DNA chèn vào của
plasmid pAT1301 đã được xác định.
- Trình tự nucleotide hoàn chỉnh có 3997
bp, và hàm lượng G + C tổng thể của nó
là 68,3%

- Lúc đầu, 843 bp-ORF, được đặt tên là

tat-per, mã hóa polypeptit gồm 280 axit
amin xuất hiện từ các nucleotide 756–
1598, và sản phẩm của tat-per có liên
quan đến một số protein màng hoặc chất
thấm đường .
- Sau đó, 1296 bp-ORF theo sau 19
nucleotide xuống dòng codon dừng của
tat-per.
- ORF mã hóa một polypeptit gồm 431
axit amin với khối lượng phân tử là
48,679 Da.
- Có liên quan nhiều đến các β-
glycosidase khác:
+ Thuộc họ glycosyl hydrolase 1
+ Hai mô-típ xúc tác đã biết (Asn-Glu-
Pro và Glu- Asn- Gly) cho glycosyl
hydrolase cũng được phát hiện trong
ORF
=> Do đó nó là tat β-gly

Hình 1. Trình tự nucleotit và axit amin suy ra

của gen Tat β-gly và của gen thẩm thấu đường
giả định, tat-per
 Hình 2. Sự liên kết trinh từ axit amin của gen Tat β-glycosidase với β-glycosidase từ các chủng
Thermus khác.

- Sự tương đồng cao về đầu N và gốc bên trong giữa enzyme Tat β-glycosidase từ T.
flavus AT-62 với enzyme β-glycosidase từ các loại Themus
- Nhận dạng của trình tự axit amin giữa T. flavus AT-62 và T. thermophilus HB27 là
98% với T. caldophilus GK24 là 98% và với T. nonproteoliticus HG102 là 94%.
- Thermus β-glycosidases có độ dài khác nhau trong trình tự axit amin. Một tính năng
là Tat β-glycosidase bắt đầu từ đầu N-termini của nó bằng Met-Asp-Asp-His trong
khi tất cả các β-glycosidase được báo cáo từ Thermus bắt đầu N-termini của họ với
Met-Thr-Glu
3.3. Biểu hiện và tinh sạch của Tat B-glycosidase

- Tat β-glycosidase được tinh chế bằng phương pháp tinh sạch .
- Các bước thanh lọc này rất đơn giản và hiệu quả rằng hầu hết lượng protein không
bền nhiệt từ vật chủ tế bào
- có thể được loại bỏ bằng cách xử lý nhiệt và enzyme tái tổ hợp được rửa giải bằng
sắc ký đơn trên Cột liên kết Ni2+ -affinity-His ở dạng đồng nhất.
- Enzyme cuối cùng đã được tinh chế 14,0 lần với hiệu suất 61,7%

Bảng quy trình tinh sạch Tat β-glycosidase biểu thị trong E.coli
- SDS-PAGE và zymogram của Tat -glycosidase. Gel được nhuộm
bằng Coomassie Brilliant Blue trong SDS-PAGE và với X-gal trong zymogram
trong điều kiện không bị biến tính, tương ứng.

Hình: Phân tích SDS-PAGE và zymogram của Tat β –glycosidase

=> Trình tự axít amin và với kết quả của SDS-PAGE, chỉ ra rằng Tat β-
glycosidase là một enzyme đơn phân.

3.4. PH tối ưu, nhiệt độ tối ưu và khả năng điều nhiệt của enzyme

- Để xác định pH tối ưu của hoạt động

enzyme, hoạt tính Tat glycosidase được
kiểm tra ở 78 C ở các pH khác nhau (pH
3,8 và 9,8) với pNPGal làm chất nền
- Enzyme hiển thị hoạt động tối đa của
nó trong khoảng pH 5,0–6,0 => pH hơi
axit hoặc trung tính

Hình: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của

enzyme

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động khoảng 88-98 C, sau đó giảm mạnh
của enzym được điều chỉnh ở nhiệt độ dao trên 90 C.
động từ 30-95 độ C (pH 7.0) với pNPGal
làm cơ chất
-Hoạt động của enzyme tăng lên khi nhiệt
độ tăng lên và cho thấy mức tối đa của nó ở
 Hình : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt

động của enzym.

=> Phương pháp chung để thanh trùng sữa là quy trình Nhiệt độ thấp, Thời gian dài
(LTLT), bao gồm việc đun sữa đến nhiệt độ từ 62,8 độC đến 65,5 độC trong 30 phút

=> Tat β-glycosidase có tiềm năng rất thích hợp cho việc ứng dụng enzym trong sản
xuất sữa có hàm lượng lactose thấp trong quá trình LTLT. Tat β-glycosidase giữ lại
hơn 80% hoạt động của nó trong khoảng pH 4,5–6,5, tương ứng với pH 6,7 của sữa
bò bình thường và hiển thị 60–80% hoạt động của nó trong khoảng nhiệt độ 60–70 C.

- Khả năng ổn định nhiệt của Tat β-

glycosidase ở 70C, 80C và 90C ở pH 7,0
và nhận thấy rằng enzym này giữ lại
94% hoạt động của nó trong thời gian 12
giờ ủ ở 70 C . Thời gian bán hủy của
enzym ở 80 C là 3 giờ. Khả năng ổn
định nhiệt cao như vậy của enzyme ở
nhiệt độ phản ứng có thể ngăn cản kinh
tế.
Hình Cấu hình ổn định nhiệt của
enzyme
3.5. Đặc tính động học của enzym
- Sự thủy phân của lactose và cellobiose đảo ngược và hoạt động đối với lactose
ở 70 C và pH 7,8. Đồ thị của vận tốc là cao hơn nhiều so với cellobiose.
phản ứng (v, mol 1 mg / phút) so với
nồng độ cơ chất ([s])
=> Hoạt động cụ thể của enzyme tăng
liên tục mà không bị ức chế cơ chất cho
đến khi nồng độ lactose hoặc cellobiose
lên đến 258 mM đã kiểm tra. Ở nồng độ
cơ chất thấp (<68 mM), tốc độ phản ứng
đối với cellobiose cao hơn một chút so
với của lactose trong khi nồng độ cơ
chất được tăng lên, tình hình đã được
 Hình Ảnh hưởng của nồng độ lactose và
cellshiesa đến vận tốc. của phản ứng có sự xúc
tác của enzim

=> Để xác định các đặc tính động học, hoạt tính của enzyme được thử nghiệm bằng
cách theo dõi sự thủy phân của β -d-glycoside ở các khoảng nồng độ khác nhau
=> Tat β-glycosidase có thể dễ dàng bão hòa bởi β-d-glucoside hơn là bởi β-d-
galactoside ở nồng độ cơ chất thậm chí rất thấp vì có ái lực cao đối với β -d-glucoside
=> Tat β -glycosidase có thể là một enzym hiệu quả hơn đối với quá trình thủy phân β
-d-galactoside ở nồng độ cơ chất cao hơn β-d-glucoside mặc dù β -d-glucoside có ái
lực cao hơn
=> Người ta cũng chứng minh rằng hiện tượng hoạt hóa ở nồng độ cơ chất cao là do
hoạt động transgalactosyl hóa của β -glycosidase.
=> Hoạt tính đặc biệt của Tat β -glycosidase trên 138 mM lactose là
162,1 U / mg ở 70 ◦C và pH 7,0.

- Kết luận: Tat β-glycosidase có tính khả dụng nhỏ trong sản xuất sữa có hàm
lượng lactose thấp trong sữa thanh trùng liên quan đến độ pH tối ưu, nhiệt độ
tối ưu, khá năng điều nhiệt và thủy phân lactose.