Seminarium 1

Chromosomowa organizacja genomu.

- 2 m DNA jest w każdej komórce człowieka

- 5 x 1010 km DNA w ludzkim ciele
- całkowita długość chromosomów metafazowych człowieka wynosi 200 mikrometra

Materiał do badań cytogenetycznych

- hodowla limfocytów z krwi
- przy mozaikowatości wykorzystuje się komórki innych tkanek np. fibroblasty.

Materiał Opis metody pobrania

Krew żylna pobrana z probówki z heparyną litową (2-3 krople na

Krew obwodowa
5ml probówkę),całk objętość 4-5ml, transport do 48h w temp 2-80C

Pobrany na drodze biopsji cienkoigłowej, objętość, czas i warunki

Szpik kostny
przesłania jak krew obwodowa

Pobrana z żyły pępkowej przebiegającej w pępowinie. Należy

łożysko umieścić np. na statywie laboratoryjnym w taki sposób,
aby jego biegun z żyłą pępkową znajdował się w najniższym
punkcie. Na oczyszczoną i zdezynfekowaną pępowinę założyć
kleszczyki naczyniowe. W ten sposób wykorzystując grawitację,
Krew pępowinowa
krew zalegająca w naczyniach łożyska spływa do żyły pępkowej.
Następnie za pomocą jałowej igły i probówki heparynizowanej
pobrać krew z żyły pępkowej, która jest wypełniona i dobrze
widoczna. Krew przechowywać w temp. 6–10°C przez 24 h,
maksymalnie 48 h

Nakłucie jamy owodni i pobranie płynu owodniowego z

amniocytami
Amniopunkcja
próbka o objętości 3–5 ml – niezawierająca domieszki krwi
przezpowłokowa
(możliwość kontaminacji próbki krwią matki) Krew przechowywać
w temperaturze pokojowej do 24 h, maksymalnie 48 h

Materiał Uzyskany na drodze biopsji cienkoigłowej lub wycinek tkanki w

histopatologiczny przypadków guzów litych

Badanie wykonuje się w przypadku stwierdzenia we krwi mozaiki

Fibroblasty skóry chromosomowej, a więc wystąpienia dwóch lub więcej różnych
kariotypów komórkowych
Cechy identyfikujące i klasyfikujące chromosomy:
- wielkość
- lokalizacja centromeru
- wzór prążkowy

W celu identyfikacji prążków poddawane są barwieniu.

- Jasne prążki
* replikacja wczesna w fazie S
* aktywne transkrypcyjnie
* bogate w GC
- Ciemne prążki (G)
* replikacja późna
* skondensowana chromatyna
* bogate w AT

Rutynowo badane są chromosomy

* metafazowe
* trawione trypsyną
* barwione odczynnikiem Giemsy
> (błękit metylenowy, azur B, eozyna)
> Prążkowanie GTG, efektem są prążki G
> Regiony bogate w AT silnie wiążą barwnik tworząc ciemne pasma

Prążkowanie Q
- barwienie przy udziale fluorescencyjnej chinakryny
- Fluorescencja przy związaniu par AT jest silniejsza
- prążki Q są równoważne prążkom G

Technika Ag-NOR
- barwienie regionów jąderkotwórczych, znajdujących się regionach NOR
chromosomów akrocentrycznych (13-15; 21-22)
- wysrebrzanie regionów jąderkotwórczych przy użyciu azotanu srebra
- Umożliwia identyfikację aberracji, w których biorą udział krótkie ramiona
chromosomów akrocentrycznych.

Inne popularne barwienia:

Prążki R – prążki jasne
prążki Q – zastosowanie quinakryny/ chinakryna
prążki C – uwidaczniają chromatynę konstytutywną
prążki T – uwidaczniają telomery

Skróty stosowane w cytogenetyce przy analizie kariotypu

Skrót Opis

P Ramię krótkie

q Ramię długie

Koniec krótkiego ramienia

pter
chromosomu

qter Koniec długiego ramienia chromosomu

 Skrót Opis

cen Centromer

h Heterochromatyna

del Delecja

Der (rob) Rearanżacja chromosomów

dic Dicentryzm

dup Duplikacja

i izochromosom

ins Insercja

inv Inwersja

mar Chromosom markerowy

mat Chromosom matczyny

pat Chromosom ojcowski

r Chromosom pierścieniowy

t Translokacja

:: Połączone złamanie

Mos, / mozaicyzm

+ Przed chromosomem, dodatkowy chromosom

- Przed chromosomem, ubytek całego chromosomu

tel Telomer

S Satelity

fra Miejsca łamliwe

chi Chimera

: załamanie

Ph Chromosom Philadelfia

Rob Translokacja robertsonowska

ish Kariotyp z metody Fish

* Po lewej od po prawej do;

* kropka oddziela prążek od podprążka;
* delecja terminalna ma tylko jedno pęknięcie
* 7q31.2 – ramię długie chromosomu 7, region 3, prążek 1, podprążek 2

* 46, XY, dup (6)(p2.37:q1.37) – męski, duplikacja w chromosomie 6 od prążka 2,

podprążka 3, podpodprążka 7, ramienia krótkiego do prążka 1, podprążka 3,
podpodprążka 7, ramienia długiego

* 46, XY, t(7;20)(q2.13;q1.25) - kariotyp męski, translokacja pomiędzy prążkiem 2,

podprążkiem 1, podpodprążkiem 3, ramienia długiego chromosomu 7 oraz prążkiem 1,
podprążkiem 2, podpodprążkiem 5, ramienia długiego chromosomu 20

* 46, XX, der (3,1) (10;10) – żeński, rearanżacja chromosomowa pomiędzy

chromosomem 3 i 1

* 46, XX, dup(21) (p11.21;q22.1) – żeński, duplikacja w chromosomie 21 od regionu 1,

prążka 1, podprążka 2, podpodprążka 1, ramienia krótkiego do regionu 2, prążka 2,
podprążka 1 ramienia długiego

* 46, XY, inv (7)(p31.23;q11.21) – męski, inwersja w chromosomie 7, miejsce pęknięcia

region 3, prążek 1, podprążek 2, podpodprążek 3, ramienia krótkiego oraz region 1,
prążek 1, podprążek 2, podpodprążek 1 ramienia długiego

* 46, XX, del (5)(p25) – żeński, delecja terminalna na krótkim ramieniu chromosomu
pary 5 od prążka 25

* 46, XX, del (5)(q13q33) – żeński, delecja interstycjalna fragmentu od q13 do q33
ramienia długiego w 5 parze chromosomów

* 46, XY, inv (11)(p15q14) – męski, inwersja pericentryczna w obrębie pary 11

pomiędzy prążkiem 15 krótkiego ramienia do prążka 14 na ramieniu długim

Definicje:

* Mozaicyzm
- Sytuacja w której część komórek organizmu ma prawidłową liczbę
chromosomów
- dochodzi na dwa sposoby:
1) nondysjunkcja na etapie wczesnych podziałów komórkowych w
zdrowym zarodku
2) nondysjunkcja w aneuploidalnym zarodku prowadzącej do powstania
linii komórkowej z prawidłową liczbą chromosomów
- Procent aneuploidalnych komórek w przypadku mozaicyzmu jest bardzo
zmienny
- jest to przyczyna 1–2% przypadków zespołu Downa

* Chimeryzm
– obecność komórek różniących się materiałem genetycznym w jednym
organizmie;
- powstaje np. w wyniku podwójnego zapłodnienia komórki jajowej

* Inwersja paracentryczna
– obejmuje obszar tylko na jednym ramieniu rodzaj mutacji
- chromosom ulega pęknięciu w dwóch miejscach
- powstały swobodny fragment ulega przed ponownym wbudowaniem do
 chromosomu odwróceniu o 180°
- Odwrócony fragment nie zawiera centromeru.

* Chromosom markerowy
- dodatkowy, najczęściej mały chromosom
- niepodobny morfologicznie do innych chromosomów
- Jest on możliwy do wykrycia w klasycznym badaniu cytogenetycznym (ocena
prążków)
- na podstawie badania klasycznego nie można z całą pewnością określić jego
pochodzenia oraz wpływu na fenotyp pacjenta
- Zbadanie pochodzenia takiego chromosomu oraz określenie skutków
klinicznych dla pacjenta wymaga badań molekularnych (najczęściej
fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondą molekularną specyficzną dla
regionu danego chromosomu oraz badania rodziców nosiciela.

* Izochromosom
- wadliwy chromosom powstały zwykle z połączonych 2 jednakowych ramion
(2 krótkich albo 2 długich) chromosomów, z których powstał
- ma to miejsce zazwyczaj podczas podziału tetrady

* Chromosom pierścieniowy
- chromosom powstający na skutek szczególnego przypadku delecji
dystalnej, i połączenia się dwóch ramion chromosomu tak, że powstaje
pierścień
- Zazwyczaj takiej fuzji towarzyszy delecja fragmentów na końcach ramion

* Translokacja robertsonowska
- występuje, gdy dwa chromosomy akrocentryczne
- jeden z rodzajów chromosomów posiadający z jednej strony ramiona bardzo
krótkie (p) zaś z drugiej długie (q)) w miejscu centromeru
- (czyli przewężenia na chromosomie) pękają i krzyżowo łączą się ze sobą.
- Najczęstszą u człowieka jest translokacja pomiędzy chromosomami 13 i
14
- Powstający z połączenia ramion długich (q) nieprawidłowy chromosom
powoduje, że u nosiciela w komórkach ciała znajduje się 45 chromosomów
- Podczas powstawania komórek rozrodczych nosicielstwo takiej translokacji
może powodować zaburzenia liczby całych chromosomów u potomstwa
(brak 1 chromosomu w kariotypie)

Predyspozycja do downa – izochromosom 14 + 21

* penetracja
- częstość pojawiania się cechy warunkowanej przez dany gen w fenotypie
osobnika posiadającego ten gen
- Penetracja wyrażana jest jako stosunek liczby osobników posiadających
cechę warunkowaną przez dany gen do całkowitej liczby osobników
posiadających ten gen
- pełna, gdy dany gen przejawia się fenotypowo u wszystkich
osobników posiadających ten wariant genu
- niepełna, gdy gen ze względu na środowisko przejawia się, bądź też nie.

* ekspresyjność
- Ten sam odziedziczony allel może dawać różne efekty fenotypowe u różnych
organizmów
CO WPLYWA NA PENETRACJE I EKSPRESJE:
• stopień penetracji genu zależy od czynników środowiskowych, wpływu innych
genów, wieku osobnika.
• Wpływ środowiska, wieku, tła genetycznego
• Efekty epigenetyczne - Piętno genomowe wpływa na penetracje zależne
od płci rodzicielskiej

Dziedziczenie autosomalne recesywne

– w genetyce sposób dziedziczenia, w którym cecha dziedziczona jest w
sprzężeniu z chromosomami innymi niż chromosomy płci
- ujawnia się tylko w układzie homozygotycznym, co oznacza, że obydwa allele
genu muszą kodować daną cechę

* antycypacja – objawy pojawiają się szybciej i narasta ciężkość przebiegu choroby z

pokolenia na pokolenie.
- pląsawicę Huntingtona,
- zespół łamliwego chromosomu X,
- dystrofię miotoniczną,
- chorobę Friedreicha

* Ryzyko przekazania choroby dziedziczonej autosomalnie dominująco potomstwu

wynosi 50% i jest stałe w każdej, kolejnej ciąży, niezależnie od liczby posiadanych
zdrowych czy chorych dzieci.

Klasyfikacja chromosomów:

● Grupa A (chromosomy 1 – 3): duże chromosomy metacentryczne

● Grupa B (4 – 5): duże chromosomy submetacentryczne
● Grupa C (6 – 12, X): chromosomy metacentryczne lub submetacentryczne, pośredniej
długości
● Grupa D (13 – 15): pośredniej długości chromosomy akrocentryczne z satelitami
● Grupa E (16 – 18): krótkie chromosomy metacentryczne lub submetacentryczne
● Grupa F (19 – 20): bardzo krótkie chromosomy metacentryczne
● Grupa G (21 – 22, Y): krótkie chromosomy akrocentryczne; 21 i 22 posiadają satelity

Zapis kariotypu:
46, XY ; 46, XX (chromosomy płci po przecinku)
47, XY, +21 (trisomia 21 pary – po przecinku)
46, XX der (14 ; 21), +21 (transformacja robertsonowska)

Cytogenetyka molekularna CGH

- opiera się na technikach CGH (porównawcza hybrydyzacja genomowa) i
FISH
- CGH wykrywa obecność dodatkowego bądź też brak materiału genetycznego
- Metoda ta stosowana jest przede wszystkim w cytogenetyce onkologicznej
- Umożliwia wykrycie, delecji, duplikacji
- Polega ona na hybrydyzacji dwóch genomowych DNA
zmieszanych w proporcji 1:1, badanego i referencyjnego, do prawidłowych
chromosomów metafazowych na szkiełku podstawowym
- DNA od pacjenta i kontrola, hybrydyzowana jest do zmapowanych wcześniej i
umieszczonych na płytce krótkich sekwencji oligonukleotydowych stanowiących
sondy molekularne.
- Wykrywamy zmiany kolorów na szkiełkach, skanując, eksportując
do oprogramowania i interpretując dane.
 - CGH do mikromacierzy stosuje się też powszechnie w badaniach
podstawowych, np. w badaniu niestabilności chromosomowej i poszukiwaniu
krytycznych zmian w genomie nowotworowym.
- macierze do badania niezrównoważonych zmian w genomie, tzw. macierze
kliniczne, dostępne są z możliwością sprawdzenia heterozygotyczności badanych
sekwencji poprzez analizę

Technika FISH pozwala na badanie

- Metoda polega na hybrydyzacji krótkiego odcinka DNA (sondy) do nici DNA na
chromosomie
- W celu analizy badanego materiału konieczne jest użycie mikroskopii
fluorescencyjnej
- jąder komórkowych w stadium metafazy jak i interfazy
- Umożliwia wykrycie delecji i duplikacji
- Znajduje zastosowanie w detekcji konkretnych mutacji, miejsc pęknięć, czy
dokładnej analizie translokacji
- Badanie techniką FISH jąder interfazowych ma miejsce przy badaniach
prenatalnych i diagnostyce preimplantacyjnej
- W obu przypadkach FISH pozwala na wykrycie anomalii liczbowych i
strukturalnych w obrębie genomu
- DiGeorge’a, Pradera – Willego, diagnostyka nowotworów, aneuploidie
chromosomowe

Hodowle limfocytów zakładane są na podłożu z antybiotykiem i mitogenem. Po 72 h

poddawane są działaniu kolchicyny i podział zostaje zahamowany w metafazie.

Mutacje genomowe, mutacje chromosomowe liczbowe polegają na:

● utracie lub występowaniu dodatkowych pojedynczych chromosomów —
wskutek zaburzeń rozdziału chromosomów w mitozie bądź mejozie
● zwielokrotnieniu całego genomu — w wyniku zniesienia rozdziału wszystkich
chromosomów (poliploidalność)

Aneuploidie -zmiany obejmują poszczególne pary, skutek nierównomiernego rozdziału

chromosomów podczas mejozy

o Nullisomia –2n-2 brak pary chromosomów, letalne

o Monosomia 2n-1
o Trisomia 2n+1
o Tetrasomia 2n+2
o Poliploidie- zmiana liczby kompletów chromosomów
o Triploidia 3n
o Tetraploidia 4n

* cytogenetyka klasyczna wykrywa 3-4% zaburzeń

* XXXXY – zespół Fakaro
* Im więcej X tym większe Iq

* Badania cytogenetyczne:
- FISH
- MLPA
- aCGH
* Fenotyp chromosomowy – taki fenotyp pacjenta, który charakteryzuje:
- wrodzone opóźnienie rozwoju
- 1 lub więcej strukturalnych wad wrodzonych
- prenatalne opóźnienie rozwoju somatycznego
- cechy dystrofii twarzy
- zaburzenia zachowania
- obciążony wywiad rodzinny (liczne poronienia)

* Wskazania do badania kariotypu z krwi obwodowej

• wystąpienie u pacjenta wad rozwojowych i/lub cech dysmorficznych
• brak cech dojrzewania płciowego lub cechy przedwczesnego dojrzewania
płciowego
• nieprawidłowa budowa narządów płciowych kliniczne zaburzenia wzrostu- za
duży lub za mały wzrost
• występowanie znanej aberracji chromosomowej w rodzinie
• dwa lub więcej poronień
• azoospermia lub oligozoospermia w badaniu nasienia wady rozwojowe u
dziecka zmarłego po porodzie
• wykrycie abberacji chromosomowej u płodu
• niepłodność o nieznanej etiologii
• postępowanie diagnostyczne przed in vitro
• pierwotny lub wtórny brak miesiączki

* Wskazania do badania kariotypu z płynu owodniowego

• wiek pacjentki 35 lat i powyżej
• nieprawidłowy wynik testów biochemicznych
• nieprawidłowy wynik badania USG płodu
• nosicielstwo aberracji chromosomowej w rodzinie
• wada chromosomowa u poprzedniego dziecka lub wcześniejszej ciąży

* Aberracje chromosomowe
• delecję – utrata odcinka chromosome DEL
• deficjencję – utrata końcowego odcinka chromosomu
• inwersję – odwrócenie fragmentu chromosomu o 180 stopni INV
• duplikację – powielenie odcinka chromosome DUP
• translokację – przeniesienie odcinków między niehomologicznymi
chromosomami. T
• pęknięcie centromeru – rozdzielenie ramion chromosomu
• chromosom pierścieniowy – powstaje, kiedy ramiona chromosomu łączą się
tworząc pierścień; zazwyczaj towarzyszy temu delecja fragmentów położonych
na końcach chromosomu R
• INS - insercja
• DER – rearanżacja chromosomowa; translokacja Robertsonowska

* MLPA
- Nie jest metodą diagnostyczną
- wymaga więc potwierdzenia inna techniką
- Brak możliwości wykrycia translokacji zrównoważonej i inwersji
- Umożliwia wykrycie delecji i duplikacji
- Umożliwia wykrycie delecji, duplikacji pojedynczych eksonów,
submikroskopowych aberracji chromosomowych
 - Nie wykrywa aberracji znajdujących się poza regionami reprezentowanymi
przez zastosowane zestawy sond. W technice tej stosuje się wiele par sond
- Sondy zawierają, oprócz sekwencji docelowych komplementarnych do badanej
sekwencji (sekwencje ulegające hybrydyzacji), również sekwencje starterowe, a jedna
sonda z każdej pary dodatkowo unikatową sekwencję wstawki
- W technice tej stosuje się wiele par sond
- Sondy zawierają, oprócz sekwencji docelowych komplementarnych do badanej
sekwencji (sekwencje ulegające hybrydyzacji), również sekwencje starterowe, a jedna
sonda z każdej pary dodatkowo unikatową sekwencję wstawki.

Porównując MLPA do FISH

- w MLPA badane są bardzo krótkie sekwencje (50-70 nt), co umożliwia
wykrycie częstych aberracji obejmujących pojedynczy gen, które są zbyt małe, aby
można je było wykryć metodą FISH
- MLPA jest szeroko wykorzystywana w diagnostyce niepełnosprawności
intelektualnej o nieznanej etiologii, diagnostyce aneuploidii czy badaniach
nowotworów - zarówno delecji i duplikacji krytycznych obszarów, jak i badaniu
poziomu metylacji.

* SNP (Single Nucleotide Polymorphism, polimorfizm pojedynczego nukleotydu)

- pozwala na stwierdzenie uniparentalnej disomii (obecności dwóch kopii
danego fragmentu genomu od jednego rodzica, przy braku kopii od drugiego rodzica),
co może być przyczyną takich zespołów genetycznych jak zespół Pradera-Willego,
Angelmana, Silvera-Russella czy Beckwitha –Wiedemanna.

* Mikromacierze
— płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w regularnych pozycjach
mikroskopowej wielkości polami zawierającymi różniące się od siebie sekwencją
fragmenty DNA
- Fragmenty te są sondami, które wykrywają przez hybrydyzację
komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA.
- Rodzaje: mikromacierze oligonukleotydowe, mikromacierze cDNA.

* Wynik badania cytogenetycznego powinien obejmować:

– dane ogólne: zleceniodawcy i badanego, wskazanie do badania,
– dane techniczne: badany materiał, np. krew, szpik itd., informację
o zastosowanych technikach hodowli i barwieniach, liczbę widocznych metafaz w
preparatach, liczbę ocenionych metafaz,
– wynik badania w formie zapisu kariotypu,
– komentarz diagnostyczny z uwagami

Aby diagnosta-genetyk mógł zinterpretować wynik, w uzyskanych preparatach musi

znaleźć co najmniej 20 zdatnych do oceny metafaz. W przypadku stwierdzenia
występowania nieprawidłowości jakościowych lub ilościowych w konkretnym
zestawie chromosomów należy je potwierdzić w innych informatywnych płytkach
metafazowych (czyli płytkach zawierających kompletny, prawidłowo wybarwiony
zestaw chromosomów)
* Zespół kociego krzyku (cri du chat syndrome)

- Delecja terminalna krótkich ramion chromosomu 5 pary.

- 46,XX,del(5)(p15) i 46,XY,del(5)(p15)
- Objawy:
- Charakterystyczny płacz dziecka
- Małogłowie – nieprawidłowe wymiary czaszki
- Mikrognacja – nieprawidłowo mała żuchwa
- Zmarszczka nakątna – pionowy fałd skóry pokrywający obydwa
przynosowe kąty oka
- Okrągła, asymetryczna twarz
- Płaska i szeroka nasada nosa
- Hiperteloryzm oczny – szeroko rozstawione oczy
- Mała, cofnięta bródka
- Nisko osadzone, dysplastczne małżowiny uszne

Dysmorfie w obrębie głowy

* Małogłowie = mikrocefalia
- Nienaturalnie małe wymiary czaszki

* Mikrognacja – nieprawidłowo mała żuchwa

* Zmarszczka nakątna (epicanthus)

– pionowy fałd skóry pokrywający obydwa przynosowe kąty oka

* Hiperteloryzm oczny – szeroko rozstawione oczy

* Dysplastyczne małżowiny uszne

* Brachycefalia – krótkogłowie, w wyniku przedwczesnego zarośnięcia szwu

strzałkowego

Różne typy spłaszczenia główki u niemowląt.

• Plagiocefalia (skośnogłowie)
– główka jest spłaszczona z
jednej strony i przypomina
równoległobok.
• Brachycefalia
– spłaszczenie tylnej części
główki
• Dolichocefalia (długogłowość)
– główka dziecka jest wąska
i spłaszczona z obu stron, a
kości czaszki są wyraźnie
wydłużone