Tema 5: FÀRMACS D’ORIGEN HUMÀ

Veurem com podem aprofitar proteïnes humanes perquè actuin com a fàrmacs i tractar malalties.
Veurem diferents tipus de proteïnes, algunes permeten suplir mancances del nostre cos, o podem
aprofitar la seva propietat biològica per tractar malalties infeccioses. Veurem de manera general
diferents tipus de proteïnes humanes amb activitat terapèutica, clonant una proteïna, i també veurem
estratègies perquè aquestes proteïnes tinguin una activitat terapèutica superior.

Citocines o citoquines:
Són molècules senyalitzadores, igual que les hormones. S’uneixen a receptors específics i fan que la
cèl·lula hi reaccioni. Són un conjunt molt ample de molècules diferents. A diferència de les hormones,
les cèl·lules que les secreten no són glàndules, i tenen una capacitat de tenir activitat a unes
concentracions molt més baixes que les hormones. Dins les citoquine s’hi inclouen molts tipus de
molècules:
● Interleucines: O interleuquines. Participen en el desenvolupament i diferenciació de les
cèl·lules de la sang, bàsicament limfòcits i cèl·lules hematopoètiques. Les diferents
interleuquines les coneixem amb un IL i un número, per exemple IL11, i moltes d’elles són
fàrmacs, sobretot per a tractaments de càncer o tractaments després de la quimioteràpia,
permeten estimular diferents cèl·lules.
● Factors estimuladors de colònies cel·lulars: Participen en la proliferació de cèl·lules
hematopoètiques. Per exemple, l’eritropoetina indueix l’eritropoesi (fabricació de nous
eritròcits). Es fa com a tractament per l’anèmia. S’ha utilitzat com a dopatge.
● Interferons: Són citoquines implicades en la defensa, preparen a altres cèl·lules per a l’atac o
invasió d’un virus. Són missatgers de cèl·lules
infectades cap a altres cèl·lules, per evitar que les
cèl·lules veïnes siguini infectades. Quan un virus infecta
una cèl·lula genera la síntesi d’una proteïna secretada,
els interferons. Són secretats i són capaços de
senyalitzar a les cèl·lules veïnes, de forma paracrina.
Actuen regulant l’expressió de diferents gens, implicats
en mecanismes que eviten la infecció. Hi ha fàrmacs
contra virus, com el de l’hepatitis, i fins i tot per a
tractaments contra el càncer.
● Factors de creixement: Intervenen en el creixement i proliferació cel·lular, de manera general.
Per exemple, el factor de creixement de queratinòcits (KGF), s’utilitza per a estimular el
creixement de l’epiteli intestinal, utilitzat per tractaments després de la quimioteràpia.

Proteïnes relacionades en la coagulació:

Veurem tres tipus de proteïnes diferents. La coagulació és el procés que evita que quan hi ha un
trencament en un vas sanguini ens dessagnem. El procés té lloc gràcies a dues coses: les plaquetes
(despreniments petits de cèl·lules), gràcies a diferents vies, s’adhereixen a les parets del tub i de les
c`+el·ules de la sang, formant el primer coàgul. Aquest primer coàgul és tou i delicat, i fàcil
d'arrencar. Les plaquetes a més fan una vasoconstricció. S’activen els factors de concentració, que
activen una proteasa que activa la trombina. El fibrinogen (proteïna soluble en sang), quan és
hidrolitzada per una proteasa anomenada trombina passa a anomenar-se fibrina, i s’activa. La fibrina
és un adhesiu que agrega sobre el coàgul. El que fa és establir nous llaços entre plaquetes i eritròcits,
per formar un coàgul més important. Els factors de coagulació són activats per dues cascades de
senyalització diferents, que s’activen quan hi ha un petit dany. A través de cascades de proteòlisi fem
un coàgul de plaquetes i fibrines, que és molt més fort que el primari. Nosaltres veurem tres proteïnes
implicades en la coagulació:

● Factors de coagulació: Activen la trombina, permetent que es facin fibrines. Fins fa poc
s’obtenien de donants de sang, i de mica en mica s’ha anat obtenint de manera recombinant.
Els recombinants tenen unes mesures de seguretat més elevades (molta gent va contraure el
virus de la SIDA amb les naturals). Els principals són el factor VIII i factor IX, i permeten
paliar les hemofílies de tipus A i tipus B. Aquesta malaltia fa que un determinat factor de la
cascada de senyalització tingui una activitat menor. L’eficiència de coagulació és molt
inferior. Administrem el que de forma natural no poden aconseguir per tal de que tinguem
prous d’aquests factors.
● Agents trombolítics: Quan es forma un coàgul podrem tenir un tap en un vas, impedint que
circuli la sang i podent necrosant un teixit. Són proteïnes que dissolen el coàgul. La proteasa
plasmina degrada la fibrina, desfent el coàgul. El plasminògen és secretat per l’epiteli al
voltant on hi ha el coàgul, juntament amb el seu activator (tPA). Quan interaccionen s’activa a
plasmina i degrada el coàgul. El tPA és un dels principals fàrmacs biotecnològics, ja que la
major causa de mort són causades per coàguls, com ara les malaltie coronàries.
● Agents anticoagulants: Impedeixen la coagulació. Si una persona té tendència a patir coàguls
se’ls administren agents anticoagulants. L’antitrombina és un exemple d’aquest fàrmac,
inhibeix la trombina, i no permet la formació de la fibrina.

Enzims terapèutics:
Podem utilitzar enzims humans per a curar malalties.
● Asparaginasa: Converteix l’asparagina en àcid aspàrtic. Es fa servir pel tractament d’algun
tipus de càncer, en els que l’asparagina és un aminoàcid essencial (les cèl·lules tumorals no
poden fabricar asparagina i l’obtenen de la sang). Si subministrem asparaginasa convertim
l’asparagina de la sang en àcid aspàrtic. Les cèl·lules del tumor no el poden utilitzar, i el
creixement del tumor es veu molt limitat. Això és possible per alguns tipus de tumors, però no
per a tots.
● DNasa: Degraden el DNA. Per exemple, contra la fibrosi quística, on hi ha una bomba de Na
K que no funciona. Aquí hi ha molt més moc, on hi poden créixer bacteris. Aquests bacteris
són eliminats per macròfags, que els llisen. Els macròfags es moren, alliberant a l’exterior
DNA, que és molt viscós, més que el moc. La barreja de DNA i moc forma una substància
molt viscosa. La gent amb fibrosi quística té moltes dificultats per a respirar. Per tractar-ho
s’utilitzen DNases, que s’inhalen i degraden el DNA. El moc queda molt és fluid i és més
fàcil d’eliminar.
Teràpies de substitució enzimàtica: Administrem l’enzim que el nostre cos no és capaç de produir. Es
pot fer per teràpia gènica, o administrar directament l’enzim. Això es pot fer amb enzims que sabem
que podran arribar de manera eficaç al lloc d’acció. Es fa per a malalties metabòliques, com la
malaltia de Pompe i la malaltia de Fabry. Per aquestes malalties falten dos enzims, que actuen al
lisosoma. Si aquests enzims no funcionen, els lisosims no poden ser degradats, i queden dins la
cèl·lula. Aquestes cèl·lules van perdent funcionalitat. Els lisosims degraden oligosacàrids units a
fosfolípids de membrana, s’han de reciclar. Si els lisosims no són degradats la cèl·lula perd la
funcionalitat.

Hormones:
Són molècules senyalitzadores secretades per glàndules específiques. Tractarem amb hormones
perquè moltes vegades no som capaços de secretar-les amb prou quantitat per a fer l’efecte.
● Somatropina: És l’hormona del creixement. La gent que no la pot fabricar en prou quantitat
tenen un creixement lent i són molt baixos. Per exemple, Messi va ser tractat amb aquesta
hormona.
● Insulina: La diabetis de tipus I és deguda a que les cèl3lule sno són capaces de sintetitzar
l’hormona per un procés autoimmunitari. Els diabètics de tipus I són tractats amb insulina.

La insulina és una proteïna que ha de madurar. Té un pèptid senyal que li permet entrar al reticle
endoplasmàtic. L’endopeptidasa degrada el pèptid senyal, i es plega, formant la preproinsulina. Una
proteasa, en el moment que se secreta, fa dos talls, alliberant un segment intern. Les dues cadenes
queden unides per enllaços disulfur. La proteïna és petita, i d’estructura quaternària, són dues cadenes.
Per a produir-la industrialment es pot fer de dues maneres: produir la pre-insulina i després trencar-la
amb la proteasa, o fer una proteïna de fusió amb la beta-galactosidasa per a unir-la a una
cromatografia d’afinitat. Quan les tenim purificades amb una proteasa eliminem els dominis de
galactosidasa i plegar els dos pèptids per separat.

Abans de l’any 82 les insulines eren d’origen animal, i la teràpia de la diabetis era limitada a uns anys,
després hi havia rebuig i no funcionava. L’any 82 es va produir insulina humana en E. coli. Per a
saltar-se la patent es va dissenyar un altre procés a partir de S. cerevisiae. L’any 90 es va fer de la
segona forma descrita. Aquestes tres patents són patents de procés, s’ha patentat la manera de produir
la insulina. Més endavant es van fer nous productes amb patents de formulació. Es posen altres coses
als medicaments que donen noves propietats. Per exemple, Exubera és insulina que s’administra per
inhalació.
Característiques farmacocinètiques:
Podem aconseguir fàrmacs biotecnològics més eficients.
Contres:
● Són petites: de pesos moleculars menors als 60 kDA i s’excreten fàcilment per l’orina, cosa
que en baixa la vida mitja.
● Diana de les proteases: Les protesases les ataquen i disminueix la vida mitja.
● Càrrega positiva: La majoria tenen càrrega positiva a pH fisiològic. Això és un problema
perquè la membrana basal del glomèrul (membrana que filtra la sang a l’orina) interacciona
més amb les càrregues positives, s’excreten més.
● Administració parenteral: La majoria no es pot administrar per via oral (el pH de l’estòmac i
les proteases les desnaturalitzarien). La via parenteral dificulta l’automedicació.
● Es distribueixen per la via limfàtica: No hi ha capil·lars per a distribuir-ho, s’envia cap al
sistema circulatori.
● El volum de distribució és petit: La majoria no poden entrar a dins les cèl·lules, i es queden a
l’espai extracel·lular. El volum ocupat per les cèl·lules no els és accessible i tenen un volum
de distribució petit.
● Són macromolècules: Poden ser reconegudes pel sistema immunitari, a no ser que siguin
100% humanes. També es poden desnaturalitzar i perdre la seva funció.

Estratègies per augmentar la vida mitja:

Un dels principals problemes és que tenen una vida mitja limitada, pel que nosaltres mirarem de
modificar-les per augmentar-la. Podem utilitzar diferents estratègies, com ara augmentar la mida,
dotar la proteïna de càrrega negativa, facilitar la unió a proteïnes del sèrum, modificar la velocitat
d’absorció, eliminar elements que condicionin la vida mitja, o la humanització.

● Augment de la mida:
Normalment afegirem estructures inerts que augmentin molt el volum. La manera més
senzilla és la PEGilació. En aquesta afegim polietilenglicol a la proteïna. És una molècula que
pot ser molt llarga i que repeteix O, C, C, O. És molt hidrofílica i molt gran. L’unirem en
funció dels grups químics de la proteïna, vigilant sempre que no es desactivi la proteïna. És un
polímer poc immunogènic, no carregat elèctricament, hidrofílic (augmenta la solubilitat del
fàrmac i el podrem posar a més concentració) i dificulta l’arribada de les proteases a la
proteïna, augmentant la vida mitja. Però té alguns desavantatges: és poc metabolitzat i es pot
acumular al cos, presenta alguns efectes secundaris com a conseqüència (s’han vist un gran
nombre de vacuoles al ronyó), i el procés de purificació és més car, ja que podem tenir
diferents residus de PEG. Aquests inconvenients han portat a buscar noves molècules que els
evitin.

La XTENilació i la PASilació és la unió del fàrmac a una cua de proteïna que imita el PEG.
És un pèptid gran repetit, no un polímer. La XTEN repeteix un pèptid amb Ala, Glu, Gly, Ser
i Pro, i la PAS Pro, Ala i Ser.
 Tots dos es desenvolupen de forma estesa, no fan estructures secundàries, de manera que
recorda al PEG. Així augmentem molt el tamany de la proteïna.
Al ser una proteïna presenta molts menys efectes secundaris i es metabolitza bé. La producció
és molt més fàcil, només hem de modificar el gen. És poc immunogènic. Els aminoàcids són
hidrofílics. Si afegim aminoàcids atraiem a les proteases a aquesta estructura i no a la part
funcional, pel que protegeix a la proteïna. No cal controlar la mida, ja que totes tenen la
mateixa mida, determinada pel gen. S’ha introduit al final de la seqüència de XTEN i PAS
seqüències que portin noves propietats al fàrmac, com ara un lligand per a un determinat
receptor, de manera que s’uneixi millor a una diana.

● Canvi de càrrega de la proteïna: Sialiació:

La saliació és glicosilar la proteïna amb un polisacàrid ric en àcid siàlic. Normalment les
proteïnes són glicosilades al reticle endoplasmàtic perquè tenen una senyal de N-glicosilació o
O-glicosilació. En funció del tipus cel·lular que fem servir per a glicosilar una proteïna l’arbre
de glúcids canviarà. Per exemple, les cèl·lules CHO fan sucres molt rics en àcid siàlic. L’àcid
siàlic és una unitat d’oligosacàrid que és àcida, té tendència a perdre el protó i tenir càrrega
negativa, pel que donem càrrega negativa addicional. A més, afegint àcid siàlic també
augmentem el volum hidrodinàmic.

La sialiació es fa seleccionant cèl·lules que tinguin tendència a sialilar i unim a la proteïna

una diana de sialiació perquè es glicòlisi aquesta zona. Per exemple, la diana de sialiació per a
les cèl·lules CHO és NX S/T. Aquesta diana no es pot trobar a qualsevol lloc, ho hem de fer
sobre llaços de la proteïna i no sobre estructures secundàries, pel que cal conèixer l’estructura
de la proteïna.

Quan fem una sialiació podem augmentar el temps de vida mig, però també pot disminuir
l’activitat. Caldrà comprovar in vivo si funciona adequadament, i ens quedarem amb
l’estructura més òptima.

● Unió a proteïnes del sèrum:

De forma natural hi ha proteïnes que tenen una vida mitja molt llarga. Aquests són per
exemple l’albúmina o les immunoglobulines G. Aquestes tenen una vida mitja més llarga
perquè tenen un receptor Fc neonatal. Algunes proteïnes poden unir-se a aquests receptors,
com ara les immunoglobulines que entren a la placenta, s’uneixen al Fc neonatal. El teixit
reticuloendotelial permet unir aquestes proteïnes (albúmina i immunoglobulines) fa que
l’eliminació sigui molt més baixa, i tenen una vida mitja molt més gran.
Albúmina i immunoglobulines s’uneixen al Fc nenoatal. El que podem fer nosaltres és unir el
nostre fàrmac a albúmina o immunoglobulines. Com que aquestes tindran una vida mitja més
gran el nostre fàrmac també. Això ho podem fer a partir de unió covalent química, fent una
proteïna de fusió o fent un etiquetatge amb un albuminoid (unim un segment petit, amb un
pèptid que permeti unir-nos a l’albúmina). L’albúmina és un transportador d’àcids grassos,
transporta molècules apolars. L’albuminoid és un pèptid petit que simula un àcid gras. Així
enganyem a l’albúmina i s’hi uneix. De manera indirecta fem que la durada del fàrmac
augmenti.
 El GLP-1 i GLP-2 són fàrmacs molt petits. S’han unit a albúmina per tal d’augmentar la vida
mitja.

● Modificació de la velocitat d’absorció:

Per exemple, en la insulina. Els nivells de glucosa en sang no es mantenen estable al llarg del
dia, hi ha pujades i baixades degudes a la ingesta i la producció d’insulina. La insulina té pics
i valls, però mai arriba a 0, sempre tenim uns nivells basals. Per tant, necessitem una insulina
que s’alliberi molt ràpid i que s’elimini ràpid en els moments de la digestió i una insulina que
s’alliberi de forma lenta i que ens permetin aquests nivells basals.
Per augmentar la vida mitja de la insulina podem canviar la formulació. A altes
concentracions les insulines s’agrupen formant hexàmers. Aquests s’alliberen de forma més
lenta i tenen més durada en sang. Inicialment s’alliberava la insulina en forma d’hexàmers.
Per afavorir la formació d’hexàmers es feia amb alta concentració, amb molècules que
estabilitzen els hexàmers com el zinc o protamines. Això són les noves patents de formulació
de insulina introduïdes abans.
Moltes insulines funcionen d’aquesta manera, però tenen un problema: No podem barrejar
dues insulines diferents en una mateixa injecció, pel que no podrem tenir insulina que doni un
nivell basal i pics a la vegada. Hauríem de fer variants de la insulina que de manera intrínseca
fossin d’absorció ràpida o d’absorció lenta, modificant la seqüència de la proteïna.

● Variants d’insulina:
Són mutants d’insulina que presenten propietats farmacocinètiques diferents. Però no podrem
canviar qualsevol residu: la insulina és una hormona, no té centre actiu. S’uneix a un receptor
que activarà vies. Hem de mirar, doncs, quins residus són importants perquè la insulina
s’uenixi al receptor, i aquests no els podrem tocar. Només podrem tocar els extrems. Podem
fer una insulina que s’absorbeixi ràpidament evitant que es formin els hexàmers. Per això
caldrà mirar l’estructura de l’hexàmer i mirar com es formen, i canviar els residus, de manera
que no encaixin bé les molècules per formar l’hexàmer.
Anàlegs d’absorció ràpida: Introduint una càrrega negativa addicional aconseguim que ens
baixin les interaccions entre les diferents insulines, evitant la formació d’hexàmers. Només
amb això en farem prou. A la imatge cada color representa un canvi provocat en un fàrmac
diferent. Tindrem menys formació d’hexàmers i més monòmers, que s’absorbiran de manera
més ràpida.

Anàlegs d’acció lenta: També ens interessen insulines lentes, tindrem dues estratègies
diferents:
- Glargine: Canviem el punt isoelèctric de la hormona, el passem de 5 a 7. Si el tenim a
5 tindrem càrregues negatives al medi (estarà a pH7). Tindrem certa repulsió,
l’hexàmer serà més estable i es formarà.
 - Detemir: Uneix químicament una molècula alifàtica a la insulina, de manera que
creem un albuminoid. Unim la proteïna a l’albúmina.

Podem posar les dues variants d’insulina. Així tindríem sempre els nivells baixos d’insulina, i
quan es fa un àpat es pot ingerir la d’acció ràpida.

● Eliminació d’elements que condiconen la vida mitja:

També es modifica l’activitat. Per exemple, el tPA activa el PLG perquè es converteixi en
plasmina. La plasmina desfà coàguls. Aquest tPA s’administra quan hi ha un ictus o infart. El
tPA és un enzim perillós, ja que si s’administra constantment provocaria hemofília. El tPA té
llocs de glicosilació que ajuden a que el fetge capti la proteïna i l’elimini, fa que s’elimini més
ràpidament. També té dos dominis d’eliminació hepàtica i dos dominis d’interacció amb la
fibrina (permeten que el tPA estigui unit al coàgul i captar el PLG). El tPA té un inhibidor que
l’inhibeix, i això permet que només actui quan calgui.

Per eliminar elements que condicionen la vida mitja d’aquest fàrmac hi ha dues estratègies:

Es modifica la interacció del tPA amb l’inhibidor. Tindrem més activitat, perquè tot el tPA
sigui actiu. Aquest fàrmac permet eliminar coàguls en situacions d’ictus. Augmentarem la
vida mitja modificant les dianes de glicosilació.
 Un altre exemple produeix el tPA en E. coli, que no glicosila. Si no tenim glicosilació tindrem
un enzim amb una vida mitja major. Dels 5 dominis que tenia eliminem a més els que
afavorien la seva eliminació. Com que eliminem els dos dominis d’interacció la vida mitja
augmenta, però tenim una mica menys d’interacció per la fibrina, ens n’hem carregat un.
Això, però, és un avantatge, ja que si el tPA té molta afinitat per la fibrina s’hi quedarà
enganxat. Si en té menys podrà viatjar més cap al centre del coàgul i actuar allà.

Estratègies per canviar la via d’administració:

S’ha modificat la seqüència de fàrmacs per eliminar algunes dianes de proteases gàstriques, per evitar
que aquestes proteases ens degradin la proteïna. Això és limitat, i no es pot fer en totes les proteïnes.
També s’han coadministrat fàrmacs amb tampons com citrats per impedir pHs àcids propis de
l’estòmac. A més, el citrat és un segrestador de calci. Moltes proteases necessiten calci per actuar,
també el protegim de la degradació per proteases. Moltes molècules grosses s’absorbeixen poc.
També s’ha administrat amb molècules permeabilitzants que augmentin l’absorció.

Estratègies per augmentar el volum de distribució:

El volum de distribució és el volum que augmenta el nostre fàrmac dins el nostre cos. Per
augmentar-lo podem fusionar el nostre fàrmac a penetretines o pèptids penetradors de tumors. Les
penetretines són repeticions d’aminoàcids que desestabilitzen les membranes cel·lulars i permeten el
pas de proteïnes. Els pèptids penetradors de tumors són captats per l’endoteli dels tumors i permeten
la seva penetració cap a dins el tumor. El fàrmac no quedarà al torrent sanguini, sinó que difondrà cap
a dins les cèl·lules. També podem fer una coadministració amb macròfags per travessar la membrana
hematoencefàlica. Els macròfags s’incuben amb altes concentracions de fàrmac, de manera que en
capti molt. Llavors s’alliberen, i els macròfags poden travessar la barrera hematoencefàlica. Alguns
macròfags alliberen allà substàncies que han captat prèviament, alliberant fàrmac.

Augment de l’especificitat:

Podem augmentar l’especificiat fent que el nostre fàrmac vagi sobretot la teixit malalt. Així evitarem
efectes secundaris, o seran molt menors. Aquesta és l’estratègia de la bala màgica. Aquesta consisteix
a posar a una molècula alguna cosa que li doni especificitat només afectarà a les cèl·lules
específiques.

La toxina diftèrica és un dímer, una amb activitat catalítica i l’altra amb activitat translocadora.
Aquestes dues subunitats es fusionen a un lligand, la interleucina 2. La toxina és captada per la
interleucina 2 i és captat per les cèl·lules que tenen els receptors de la interleucina 2, s’entren dins la
cèl·lula per l’activitat translocadora. Això provoca la mort de la cèl·lula. Podem fer que només sigui
tòxica per a les cèl·lules que presenten a la seva membrana grans
quantitats de receptors per la interleucina 2. Els limfomes tenen
molts receptors de interleucina 2 a la seva membrana cel·lular, pel
que pot ser una teràpia contra el càncer.
sistemes d’entrega de fàrmacs (DLS, Drug Delivary System):

Es forma una estructura que protegeix el fàrmac fins que és alliberat al teixit diana. Els més utilitzats
són els dendrímers i els liposomes.

- Dendrímers: Creen una esfera a les que hi ha el fàrmac al centre. Es poden unir
lligands per afegir que s’uneixi a la membrana cel·lular de les cèl·lules diana.

- Liposomes: Són estructures lipídiques que es poden fusionar amb un fàrmac. Es poden
modificar externament de manera que tinguin lligands per una cèl3lula diana. Es fusionen
amb la membrana i permeten l’alliberament del fàrmac a l’interior cel·lular.

Els DLS protegeixen el fàrmac contra les proteases. A més, disminueix l’excreció, ja que són
estructures molt més grans. Amb els liposomes s’afavoreix l’entrada del fàrmac dins la cèl·lula diana.
Podem donar selectivitat al fàrmac sense haver-lo de modificar, només afegint els lligands a
l’estructura que el protegeix. També permeten l’efecte Enhanced Permeabilization Retention Effect
(EPRE). En el cas dels tumors, com que estan molt vascularitzats i l’epiteli vascular no és del tot
correcte, aquestes estructures travessen amb molta més facilitat l’endoteli que no pas el sistema
vascular normal. Al sistema vascular normal queden retinguts degut al seu gran tamany. En un tumor
aquestes estructures poden difondre molt més fàcilment. Els sistemes DLS són molt atractius al
tractament de tumors, ja que permeten l’arribada al teixit tumoral.