Professional Documents
Culture Documents
نتالي السلوم
1
من المتعضيات الدقيقة المرجعية Reference organismأو Biologicalالمناسبة الختبار فعالية
عمليات التعقيم (وهي غالبا بذيرات الجراثيم)( :للحفظ وهامة)
العصوية القزمة
العصوية الرقيقة العصويات الدهينية األليفة للحرارة
Bacillus pumilus
: Bacillus subtilis Bacillus stearothermophilus:
:
مالحظات:
في كل طرق التعقيم يكون المشعر الحيوي من البذيرات الجرثومية (التي يمكن أن تكون بذيرات هوائية
أو الهوائية )3لكن معظمها تكون بذيرات هوائية ،ولكن يشذ عن هذه القاعدة طريقة التعقيم بالـ UV
حيث أن المشعر الحيوي لها هو األبواغ الفطرية وتحديدا فطور الرشاشيات السوداء Aspergillus
nigerبسبب شدة مقاومتها لألشعة فوق البنفسجية.
نتذكر:
ملوثة بأبواغ الفطور وال سبيل لتعقيمها سوى الـ UVعندها تكاد تكون عملية التعقيم
إذا كان لدينا مادة ّ
مستحيلة ،ألن األبواغ الفطرية هي األكثر مقاومة ل الـ .UV
نعقمها بالحرارة.
إذا كانت هناك إمكانية
نحولها
نقوم بفردها بشكل طبقة رقيقة ونضعها تحت الـ UVلفترة طويلة
(ال UVال تؤثر على تركيب المادة الكيميائي) ،ثم نقوم باختبار
العقامة وإذا اجتازته نقوم باستعمالها
هي منحنيات تعبر عن الـ M.Oالقادر على الحياة بعد القيام بعملية المعالجة. ُمنحنيات
البُقيا:
تربط بين تعداد الجراثيم (على 3محور العينات) ،وزمن التعقيم أو جرعة العامل
المعقّم المستخدم في القضاء عليها (على محور السينات).
ليكن لدينا معلق جرثومي طبقنا عليه مادة مطهرة فالجراثيم التي بقيت موجودة في المعلق نعبر عنها
باستخدام منحنيات البقيا.
أو الشكل اإلعاشي. إما شكل مقاوم نتيجة غياب الشروط المالئمة للحياة.
هذا المنحني يمثل السلوك الذي تتبعه الجراثيم عند تعرضها لعامل مضاد لها خالل فترة زمنية محددة:
إن السلوك الطبيعي للعضيّات الدقيقة تجاه العامل المستخدم في القضاء عليها ليس التناقص الطردي ،أي أن
العضيات ال تتناقص بشكل طردي بزيادة الزمن أو الجرعة (يعني ال تنقص العضيات بمقدار 1 log
cycleفي الساعة األولى ونفس المقدار في الساعة الثانية وهكذا ،)...بل يتخذ التناقص نموذجين نشرحهما
فيما يلي:
في المثالين التاليين لدينا أنبوبان حاويان على وسط مغ ٍذ يحمل كمية معينة من الجراثيم القادرة على تشكيل
بذيرات ،يُعقّمان بنفس العامل وبنفس الشروط (ولتكن هذه الشروط في درجة حرارة ثابتة أو درجة إشعاع
ثابتة)
4
المثال (:)1
لنفرض أن الوسط الجرثومي في هذا المثال تم تحضيره بشكل طازج أي يحتوي على كمية وفيرة من
سي Exponential المواد المغذية ،الجراثيم في هذه الحالة ستكون في طور االنقسام والتزايد األ ّ
phaseولن تكون بحاجة لتشكيل بذيرات.
عند تعريض هذا األنبوب مباشرة لدرجة حرارة الثابتة يحصل بالبداية تناقص بعدد الجراثيم الموجودة،
وهذا التناقص يكون بشكل طردي مع الزمن( 4أول دقيقة يموت 100ثم يزيد وهكذا ،)...وبعد مرور
ألن جزء من األشكال اإلعاشية الموجودة في الشكل ستقوم بتشكيل فترة يتوقف العدد عن التناقص َّ
بذيرات 5sporesنتيجة التعرض للحرارة.
بعد أن تموت جميع األشكال اإلعاشية تبقى البذيرات التي تكون مقاومة لدرجة الحرارة الثابتة ،لذلك
تمر فترة طويلة قبل أن تعود األعداد للتناقص مجددا ويكون هذا التناقص بطيء جدا.
السبب الذي يفسر مرور فترة من الزمن ال يحدث فيها تناقص بالبذيرات هو أن فعالية عملية التعقيم
بالحرارة العالية على البذيرات ضعيفة جدا (كما سنجد الحقا) ،فالبذيرات تحتاج إلى ما ال يقل عن - 3
4ساعات في حالة التعقيم بالحرارة العالية حتى يبدأ عددها بالتناقص.
إن هذه الحالة يمكن تمثيلها بيانيا على الشكل بمنحني البقيا ( Cحالة الشكل اإلعاشي) ،ونالحظ فيه أن
المنحني يبدأ بتناقص سريع في أعداد الجراثيم خالل زمن قليل نسبيا حتى الوصول إلى مرحلة يصبح
فيها التناقص بطيء جدا وربما يصبح العدد في حالة ثبات وال يعود للنقصان
المثال (:)2
ليكن لدينا نفس المعلق السابق ولكنه ليس طازجا أي تُرك لفترة طويلة حتى تغيّرت الشروط المالئمة
سيتحول قسم كبير من
ّ للنمو (نفاذ المواد المغذية ،تغيّر درجة الحموضة ،)...وكما نعلم في هذه الشروط
الجراثيم إلى بذيرات ،ففي هذه الحالة لدينا مبدئيا عدد كبير من البذيرات ضمن الوسط قبل إجراء عملية
التعقيم.
بدرجة الحرارة الثابتة الحظ َّ
أن البذيرات تبقى مدة ال تستجيب ولكن بعد مرور فترة على التعرض
يحصل تناقص تدريجي ُمتناسب مع الزمن.
هذه الحالة يمكن تمثيلها بيانيا على الشكل بمنحني البقيا ( Bحالة البذيرات) ،ونالحظ فيه أن تناقص
المتعضيات الدقيقة يكون بطيئا بداية ثم يحدث التناقص بشكل سريع.
مالحظة :الجراثيم القادرة على تشكيل بذيرات هي نوعين من الجراثيم إيجابية الغرام
العصوية حصرا وهما:
العصويات Bacillusوالمطثيات Clostridia
وبينهما تفاوت أيضا في المقاومة فالعصويات أكثر مقاومة من المطثيات ،لذلك سنجد أن
أكثر المشعرات الحيوية تكون من بذيرات العصويات.
مصطلحات التعقيم
Sterility
Inactivation Z- D-
assuran
)Factor (IF value value
ce
مفهوم D-value
ُعرف على أنه الزمن الالزم لدرجة
نصادفه بكثرة في حال استعمال طرق التعقيم بالحرارة أو األشعة ،وي ّ
حرارة ثابتة أو لجرعة إشعاع ثابتة إلنقاص عدد الجراثيم في معلق جرثومي معلوم النوع بمقدار 90%
من العدد البدئي أو إنقاص لوغاريتم عدد المتعضيات الدقيقة الحية بمقدار .1 log cycleمثال106 :
تصبح .105
تذ ّكر :لما نقول نقص عدد الجراثيم %99هذا يعني أن عدد الجراثيم نقص 2 log cycleيعني نعتبر كل
أن المادة المطهرة تُنقص المحتوى الجرثومي 5 log cycleهذا يعني
9تساوي ،1 log cycleفإذا قلنا ّ
أنها تنقص 5( 99.999تسعات).
لدينا 1000خلية جرثومية وتم إنقاصها 99%سيبقى لدينا 10خاليا.
لندرس قيمة الـ D-valueعلى منحنيات البُقيا الثالثة المذكورة 9سابقا:
نالحظ على المنحني Bأن الـ D-valueالالزمة إلنقاص عدد الجراثيم من 106إلى 105مرتفعة
نسبيا ،بخالف تلك الالزمة إلنقاص نفس العدد على المنحني Cوالتي نالحظ أنها قصيرة جدا.
بينما نالحظ في المنحني Aالموضح في الرسم المجاور أن الـ D-valueالالزمة للقضاء على الجراثيم
هي ذاتها سواء أكان العدد البدئي للجراثيم صغيرا أم كبيرا وهذا غير دقيق وغير موجود ،مع ذلك يمكن
قبولها 11كمؤشر ألننا ال نتعامل مع معطيات رياضية وإنما مع أنظمة حيوية.
نالحظ أننا حسبنا الـ D-valueباالعتماد على الخط المثالي .A
7
يمكن حساب قيمة D-valueحسب العالقة( :غير هامة)
U
=D
log N0 − log Nu
Z-value
وضمان العقامة
هاااام • إعطاء قيمة عددية الحتمال أن يكون الشكل ال ُمعقّم غير عقيم.
بالتعريف هو:
ملوثة
لنفرض أن لدينا منتج أو أداة ّ
وأردنا تعقيمها بالحرارة الجافة وكان
عدد الجراثيم البدئي ،102إذا أردنا
الوصول إلى ضمان العقامة المثالي
وهو 10-6أي احتمال وجود الجراثيم
هو واحد بالمليون (جزء واحد ملوث
من أصل 116جزء معقم
فما هو الزمن المطلوب للوصول إلى
هذا الضمان؟
نحن بحاجة لتعريض الشكل لدرجة حرارة ثابتة مدة زمنية ولحساب المدة الزمنية الكلية نحتاج:
.1أوال نحن بحاجة إلى إلى حساب زمن الـ ( D-valueإلنقاص عدد الجراثيم الكلّي بمقدار 1 log
cycleأي من 102إلى (101وعلى فرض كان الزمن الالزم إلنقاص هذا العدد من الجراثيم 2دقيقة
أي أن D-value = 2 min
12
.2نحتاج ل D-valueأخرى إلنقاص عدد الجراثيم من 101إلى 100
.3نحتاج لتعريض الشكل لمدة تعادل D-valueللمرة الثالثة لجعل احتمال إيجاد جراثيم في هدف التعقيم
هو ...10-1وهكذا حتى الوصول للرقم المطلوب وهو 10-6
.4إذا نحتاج لتعريض الشكل للحرارة الجافة لمدة تعادل 8 D-valueوبما أن الـ D-valueيبقى ذاته
في الحالة المثالية مهما كان العدد البدئي للجراثيم ونحن افترضنا أننا نتعامل مع حالة مثالية ووجدنا
بالتجربة في أول مرة أن قيمة ال D-valueتساوي 2دقيقة فيكون الزمن اإلجمالي الالزم للتعقيم هو
16= 2×8أي يجب تعريض الشكل للحرارة الجافة لمدة 16دقيقة كي نصل لضمان العقامة
مثال :ألجل الوصول لضمان العقامة من شكل يحوي 102 CFUنحتاج IF = 108
أي لكي نصل لحد العقامة يجب أن نستمر بتطبيق طريقة التعقيم لمدة تساوي 8 D-valueونأخذ قيمة الـ
D-valueللشكل األكثر مقاومة لطريقة التعقيم التي نريد استخدامها
لنفترض أن لدينا:
هو متحمل للحرارة لكن ال يتحمل الزمن الطويل ،لذلك نرفع الحرارة للدرجة لـ 134لمدة 3د
(وبالتالي برفع درجة الحرارة زاد IFوتنقص D valueوزاد مقدار االنخفاض بعدد الجراثيم
وبالتالي تقليل مدة تطبيق الحرارة
يجب زيادة مدة التطبيق. كلما زاد الحمل الجرثومي التفاعل كمي
مثال:
دورة التعقيم في الصاد الموصد تستمر لمدة 15 minعندما يكون الحمل الجرثومي تقريبا 104
،CFUولكن إذا كان الحمل الجرثومي أكثر من ذلك بكثير
كمية الطاقة التي يحصل عليها الجرثوم غير كافية للقضاء عليه
يمكننا اآلن أن نفهم بسهولة كيفية حساب المدة الالزمة إلجراء عمليات التعقيم المختلفة والواردة في
الجدول التالي:
13
Sterilization protocol Biological indicator D-value Log
)(BI If
Steam under pressure (121oC B. stearothermophilus 1.5 min 10
)for 15 min
)Dry heat (160oC for 2 hours )B. subtilis (var. niger Max 10 12
min
)Irradiation (25 kGy, 2.5 Mrad B. pumilus 3 kGy (0.3 8.3
)Mrad
نجد اننا إذا أردنا تطبيق الحرارة الرطبة لتعقيم أداة معينة فإن بروتوكول التعقيم ينص على أن تطبيق درجة
حرارة 121لمدة 15كافي للوصول لضمان العقامة ،طيب من أجت ال 15دقيقة؟؟ نضرب قيمة ال D-
valueللشكل األكثر مقاومة للحرارة الرطبة بقيمة ال log IFالخاص بها،
يعني 15 = 11 ×1.5دقيقة
الخالصة :كل هذه القواعد D-value، Z-value،IFهي نقاط عالم الهدف منها أن تشير إلى الطريق
السليم في العمل ولكن ليس بالضرورة أن تحقق الهدف المطلوب ونحصل على شكل عقيم ⟸ لذلك يوجد
ما يسمى باختبار عقامة.
مشعرات فيزيائية :مثل قياس درجة الحرارة الرطبة للتأكد من ثباتها على .121C
فنحن
لدينا في
مشعرات كيميائية :المشعرات الكيميائية وتستخدم للتأكد من وصول عامل التعقيم التعقيم
(البخار) لحجرة التعقيم بدرجة 121Cوبقاءه الزمن الكافي.
مشعرات حيوية :له الكلمة الفصل ويستخدم للحكم على طريقة التعقيم المتبعة وليس
العقامة.
مثال :عملية التعقيم لشكل ما تمت بالحرارة الرطبة وللتأكد من فعالية الطريقة نستخدم الـ Biological
indicatorوهو Bacillus stearothermophilusونعقم ،وبعد التعقيم نأخذ البذيرات ونزرعها فإذا
نمت ⟸ فإن الطريقة غير فعالة.
14
أي أن المشعر الحيوي يحكم على طريقة التعقيم وليس على العقامة (للحكم على العقامة نجري اختبار عقامة
على الشكل) .وال يحل أي مشعر محل اآلخر.
مثال :بالرجوع لجدول بروتوكوالت طرق التعقيم
في التعقيم بالحرارة الرطبة نالحظ أن الـ D-valueلبذيرات جراثيم المشعر الحيوي لهذه الطريقة وهو
Bacillus stearothermophilusفي الدرجة 121Cهو 1.5دقيقة ،وكما ذكرنا أن الـ IF
الالزم للوصول إلى ضمان العقامة المطلوب هو 10فيكون الزمن الالزم للتعقيم بالحرارة الرطبة:
t = D IF = 1.5 10 = 15 minutes
بنفس الطريقة نجد أن المشعر الحيوي للتعقيم بالحرارة الجافة هو بذيرات جراثيم العصوية الرقيقة
Bacillus subtilisوالتي ُحسب لها قيمة الـ D-valueفي درجة حرارة التعقيم (وهي )160C
فكانت 10دقائق على األكثر ،ووجد أن عامل التعطيل المطلوب في هذه الطريقة هو ،12فكان الزمن
الالزم للوصول إلى ضمان العقامة المطلوب:
t = D IF = 10 12 = 120 minutes = 2 hours
.13
وبنفس الطريقة السابقة تماما تم تحديد جرعة التعقيم باألشعة والتي تساوي تقريبا 25كيلوغراي
طرق التعقيم Sterilization Methods
طرق التعقيم المتبعة في الصيدلة من:
)aالكيميائية:
المعقمات الكيميائية :هي المواد الكيميائية التي تستعمل في عمليات التعقيم بشكلها السائل ،مثل:
• الغلوتار ألدهيد
باستثناء الفورم ألدهيد ,والماء • فوق أكسيد حمض الخل Per acetic acid
األكسجيني ليست معقمات
بشكلها السائل وإنما • هيبوكلوريت الصوديوم
مطهرات. • والبوفيدون اليودي.
)bفيزيائية:
.1الحرارة :وهي أبسط هذه الطرق ،حيث توجد بشكلين إما لوحدها (بغياب الماء) وتسمى التعقيم
بالحرارة الجافّة أو مع الماء وتسمى التعقيم بالحرارة الرطبة ،ولكل منها أشكال مختلفة سنستفيض
بشرحها الحقا.
16
الطور األول :طور التسخين Heating stage 14
ويتم فيها رفع درجة الحرارة وصوال للحد المطلوب ،وتكون 121°Cفي حالة الصاد الموصد
يختلف هذا الزمن حسب طريقة التسخين المتبعة واألدوات المستخدمة
الطور الثاني :طور الثبات Holding stage
هو الزمن الالزم والكافي إلنجاز عملية التعقيم ويبدأ عند الوصول لدرجة الحرارة المطلوبة (121
بالحرارة الرطبة) وعند بداية هذا الطور يتم بدء احتساب 15دقيقة في الصاد والموصد
وهو يطول أو يقصر حسب درجة الحرارة.
الطور الثالث :طور التبريد Cooling stage
ترك األجزاء المعقمة لتعود لدرجة حرارتها الطبيعية.
وعادة ما يتم البدء بحساب زمن دورة التعقيم ابتداء من لحظة الوصول إلى طور الثبات ،وهذا منطقي
ألن حساب معايير التعقيم تمت بناء على طور الثبات الذي تصل فيه درجة الحرارة لدرجة المطلوبة
للقضاء على المتعضية الدقيقة
عملية التعقيم بالحرارة مستهلكة للوقت بسبب ضياع وقت في طور التسخين وطور التبريد ،كما أن
التعقيم بالحرارة قد يحدث ضررا بالمنتج.
مثال :في حال تصنيع أمبوالت ،إذا كانت عملية التبريد سريعة نالحظ تكسر األمبوالت نتيجة انخفاض
الضغط الخارجي بشكل سريع
قلنا مرارا أن التفاعل بين الـ المتعضيات الدقيقة والعامل المعقم هو تفاعل كمي أي كلما زاد الحمل
الحيوي زادت كمية الطاقة الواجب إعطائها للقضاء على الجراثيم
ونحن أثناء التسخين نعطي الـ M.Oطاقة وكذلك أثناء التبريد نعطيه أيضا طاقة.
19