Lumineszcencia

• Molekula energiája
Lumineszcencia •
•
Spinállapotok
Lumineszcencia típusai
Alapok, tulajdonságok • Lumineszcencia átmenetei
• A lumineszcencia paraméterei
• A lumineszcencia mérése
• Polarizáció, anizotrópia
• Alkalmazások, néhány specialitás

Atomszerkezet Molekulaszerkezet
A testek a hőmérsékleti sugárzáson felül képesek fényt kibocsátani - lumineszcencia

Molekula: kovalens kötéssel

összekapcsolt atomok
Növekvő energiájú
pályák Legegyszerűbb eset: kétatomos
molekula (pl., hidrogénmolekula)
(“gerjesztett” állapotok)
magasabb energiájú

A molekulák vibrációs és rotációs mozgásokat végeznek!

Vibráció: kovalens kötés mentén történő periodikus mozgás
Rotáció: kovalens kötés tengelye körüli periodikus mozgás

Fotonemisszió:
E=hf

Példák a vibrációs
mozgásra háromatomos
(metilén) csoportban
Vonalas emissziós spektrum (-CH2-):
Aszimmetrikus nyúlás Szimmetrikus nyúlás Ollózás
 Energia állapotok
Molekula energiája ábrázolása
Born-Oppenheimer - közelítés: Jabłoński-féle termséma: Alexander Jabłoński

E total = E e + E v + E r
egy molekula elektronállapotait, és a közöttük (1898-1980)
végbemenő átmeneteket (nyilakkal) mutatja

Max Born J. Robert Oppenheimer

(1882-1970) (1904-1967)

Vibrációs energiaszintek
Fontos megjegyzések: (vékony vonalak)
Energia állapotok egymástól függetlenek (csatolás elhanyagolható)
Első gerjesztett
Állapotok energianívói kvantáltak
állapot
Átmenetek energia “csomag” elnyelésével/kibocsátásával járnak
Elektron
Energiaszintek közötti különbségek nagyságrendje különbözik: energiaszintek
~100x ~100x (vastag
Ee > Ev > Er vonalak)

~3x10-19 J (~2 eV) > ~3x10-21 J > ~3x10-23 J

Alapállapot

Spinállapotok Lumineszcencia
Pauli-elv:
• Minden kvantumállapotot csak egyetlen elektron tölthet be.
Wolfgang Pauli
• Egy atomon belül nem létezhet két olyan elektron, amelynek mind a négy
(1900-1958) kvantumszáma megegyezik.
betöltött alhéj: spin párosítás
(ellentétes spinű elektronok párosodnak)
Gerjesztett állapotból
fényemisszióval járó relaxáció
Szingulett és triplett állapotok:
az eredő spinállapothoz rendelt mágneses momentum orientációinak száma (mágneses térben) =
2S+1 = 1 (szingulett) vagy 3 (triplett). (S = eredő spin, pl. betöltött alhéj esetén (+1/2)+(-1/2) = 0) A hőmérsékleti sugárzáson felül
S: szingulett állapot: ellentétes spinű párosított elektronok, eredő spin (S) = 0, orientációk kibocsátott sugárzás
száma (2S+1) = 1.
T: triplett állapot: a molekulában azonos spinállapotú elektronok vannak, eredő spin = 1 (pl. “Hideg fény”
(+1/2)+(+1/2) = 1), orientációk száma (2S+1 = 2+1) = 3.

gerjesztett energianívó
Fluoreszcencia és foszforeszcencia
alap energianívó

Szingulett Gerjesztett Gerjesztett

alapállapot szingulett állapot triplett állapot
 A lumineszcencia
egyszerűsített lépései A lumineszcencia típusai
(Atomi rendszer!)

Gerjesztés Biolumineszcencia
Abszorpció Gerjesztés módja szerint Lumineszcencia típusa
(magasabb energiaszintre lépés)
abszorpció fotolumineszcencia

kémiai reakció kemilumineszcencia, biolumineszcencia

termikusan aktivált ion-rekombináció termolumineszcencia

töltés injekció elektrolumineszcencia

nagyenergiájú radioaktív sugárzás radiolumineszcencia

súrlódás tribolumineszcencia

hanghullámok szonolumineszcencia

Gerjesztett állapot szerint Lumineszcencia típusa

Emisszió De-excitáció első gerjesztett szingulett állapot fluoreszencia

(relaxáció az alapállapotba)
legalsó (gerjesztet) triplett állapot foszforeszcencia Szentjánosbogár

A lumineszcencia
folyamatai Kasha-szabály
Jablonski diagram (termséma) Belső konverzió:
Belső
konverzió
sugárzásmentes átmenet Fotonemisszió (fluoreszcencia vagy
elektron energia-
Vibrációs állapotok között (pl.
foszforeszcencia) a legalacsonyabb
relaxáció S2→S1) gerjesztett elektron-energiaállapot (S1, S2
T1) legalacsonyabb vibrációs szintjéről
“Intersystem Vibrációs relaxáció: egy
crossing” adott elektron történő átmenet során lép fel.
energiaállapoton belüli
de-excitációs folyamat
Energia

“Intersystem crossing”:
S1
rendszerek közötti,
spinátfordulással járó
átmenet (pl. S1 →T1)

Michael Kasha (1920-)

Gerjesztés Fluoreszcencia Foszforeszcencia Amerikai fizikus S0
Az átmenetek sebessége A lumineszcencia
(időskálája) tulajdonságai I.
Lumineszcencia spektrumok
Fluoreszcencia

Intenzitás (norm.)
fluoreszcencia foszforeszcencia gerjesztési spektrum Foszforeszcencia
10-9 s 10-6 - 10 s (emisszió 340 nm-nél) emissziós spektrum
gerjesztés (gerjesztés 295 nm-nél) • Sávos színkép
Fluoreszcencia
emissziós spektrum
(gerjesztés 295 nm-nél) • Gerjesztési és emissziós
spektrumok
tükörszimmetrikusak
10-15 s
• “Stokes shift”
alapállapot
gerjesztett állapot

relaxáció vibrációs
relaxáció
10-12 s

kioltás vagy belső konverzió George Stokes

energiatranszfer (hő) (1819-1903)
Triptofán spektrumai Hullámhossz (nm)

Fluoreszcens festékmolekulák: “fluorofórok”

Fluorofórok célzott bekötésével nem fluoreszkáló molekulák is vizsgálhatóvá válnak (“fluoreszcens jelölés”)

A lumineszcencia
tulajdonságai II. A fluoreszcencia mérése
Kvantumhatásfok Fluoreszcencia spektrométer
Φ= emittált fotonok száma ≤ 1 (“Steady-state” spektrofluoriméter)
abszorbeált fotonok száma
knr=nem sugárzásos átmenetek sebességi állandói
Gerjesztési hullámhossz Emissziós hullámhossz
változtatásával felvett változtatásával felvett
Küvetta (minta)
spektrum spektrum

A gerjesztett állapot élettartama Gerjesztési Emissziós

spektrum Gerjesztő spektrum
dN
( )
monokromátor
N=gerjesztett állapotú
= − k f + k nr ⋅ N molekulák száma
(λex változtatható)

dt t=idő
Xe-lámpa
Emissziós

N = N 0e ( f nr )
kf=fluoreszcencia sebességi
− k +k t állandó
monokromátor
(λem változtatható)

knr=nem-sugárzásos
1 átmenetek sebességi λem= konstans λex= konstans
τ= állandója
(emissziós (gerjesztési

k f + k nr
maximum) maximum)
τ=fluoreszcencia élettartam Fotodetektor
 A fény elektromágneses
hullám¨polarizálható Polarizáció, anizotrópia
•Térben tovaterjedő elektromágneses zavar. z
Jz
•Tranzverzális hullám.
•Ezért polarizálható.
Mágneses tér Fotoszelekció:
oszcillációja abszorpciós Vertikálisan random populációból az
vektor síkpolarizált elektromos vektorral
gerjesztő fény párhuzamos abszorpciós
vektorú festékmolekulák
kiválasztása
Jx
x Jy
V polarizációs
szűrő

Fluorofórokhoz rendelhető abszorpciós és H

Hul
lám emissziós vektor: megszabja a foton JV
hos
sz abszorpció és emisszió valószínűségét. y
JH
Abszorpció maximális, ha az absz. vektor és a Polarizáció:
Tova- fény elektromos térerővektora párhuzamos.
terjedés
iránya
Elektromos tér Abszorpció képessége függ cos2α-tól (α az
oszcillációja absz. vektor és a fény elektromos vektora • additív mennyiség
közötti szög). Anizotrópia: • nevezőben a teljes gerjesztő
intenzitás (JVHx=JVHy)

A fluoreszcencia orvosi- Két-foton

biológiai alkalmazásai fluoreszcencia
Fluoreszcencia mikroszkópia
GERJESZTETT
EXCITED STATE
DNS szekvenálás (lánc ÁLLAPOT
terminációs módszer) Emisszió Emisszió
λ=350 nm λ=700 nm
DNS festés (EtBr) Exc. Exc.

DNS microarray technológia

Immunfluoreszcencia Foton Foton
GROUND STATE
ALAPÁLLAPOT
Fluoreszcencia-aktivált sejt
válogatás (FACS) EGYFOTON KÉTFOTON
GERJESZTÉS (1P) GERJESZTÉS (2P)
Förster rezonancia energia
transzfer (FRET) Objektív lencse

“Fluorescence recovery after Minta 2P 1P

photoleaching” (FRAP)
Fókuszpont
Fluoreszcens fehérje-
konjugációs technikák Vesekéreg - tubuláris rendszer
(vörös: ér)
Agykérgi
piramissejtek
Kvantum pontok (quantm dots)
 Szuperfelbontású
mikroszkópia Összefoglalás
A feloldási problémát pozíciómeghatározási problémává alakítjuk
Feloldási probléma (Abbé-elv) Pozíciómeghatározási probléma “Sztochasztikus” adatgyűjtés egyedi fluorofórokról
(pontosság a fotonszámtól függ)
d

0.61λ • A molekulaszerkezet és energiaállapotok fontos szerepet

d=
n sinα játszanak a lumineszcenciában.
• A lumineszcencia molekuláris de-excitáció (relaxáció)
STORM: “stochastic optical reconstruction microscopy” melyet fénykibocsáts követ.
• A fluoreszcencia spektrumot a Stokes-féle eltolódás
jellemzi.

Mikrotubulusok Bekapcsolt fluorofórok 1 Bekapcsolt fluorofórok 2

• A kvantumhatásfok és fluoreszcencia élettartam fontos
lumineszcencia paraméterek.

Adatgyűjtési Mikrotubuláris
folyamat Bekapcsolt fluorofórok 3 Bekapcsolt fluorofórok 4 Pozíciókból számított kép rendszer