Biomolekuláris szerkezet és dinamika

tömegspektrometria, infravörös spektroszkópia, röntgendiffrakció,

számítógépes szimuláció

Balog Erika
Cary and Michael Huang (http://htwins.net)
 Tömegspektrometria
- a minta atomjai és molekulái tömegeinek eloszlását mérő analitikai módszer. A megmért spektrum a minta elemi (izotóp) ujjlenyomata.

Detektálás Eredmény: “Vonal” diagram

Lépések: Faraday
kollektorok
1. Ionizáció
Relatív
2. Tömeg azonosítás gyakoriság
3. Detektálás (relatív
mennyiség
meghatározás)

áram
mágnes
erősítők
Tömeg-töltés arány

Ionforrás JEL
nyaláb fókuszálás A spektrumot szerkezeti adatbázissal vetjük össze.
iongyorsító
elektroncsapda
iontaszító
gáz befúvó m = ion tömeg
ionizáló filamentum q = ion töltése
 Biológiai mintáknál alkalmazott ionizációs módszerek
Elektrospray ionizáció MALDI: “matrix-assisted laser desorption/ionization”

Komplex minta
Tömeg- Minta-mátrix keverék
spektrométer

MALDI lemez
Molekulaionok
Ionizáció

Deszorpció

(1) cseppekre bontás,

(2) oldószer párolgás → kisebb csepp → - a lézersugárzást a mátrix atomjai (molekulái) abszorbeálják.
nagyobb felületi töltés,
- nagy molekulák vizsgálatához ideális.
(3) Coulomb taszítás → felrobbannak a
cseppek → ionizált gyorsíto molekulák.
 Tömeganalízis módszerei 1.
Mágneses módszer

Az elhajlás a tömeg-töltés aránytól

(m/q) függ: kisebb tömegű
részecskék kisebb sugarú pályán.

mágnes

Ionforrás

𝐹⃗ 𝑞 𝐸 𝑣⃗ 𝐵 𝐹⃗ 𝐹⃗
E=elektromos térerősség, vxB=sebesség és
mágneses indukció vektoriális szorzata
𝑚𝑣
𝑞𝑣𝐵
𝑟

𝑚 𝑣
𝑟 melyből a részecskére jellemző m/q meghatározható
𝑞 𝐵

m/q helyett általában az m/z-t használnák, ahol z=q/e (dimenzió nélküli szám).
 Tömeganalízis módszerei 2.
“Time-of-flight” (repülési idő)
Gyorsítás (elektromos tér, U)

Repülési pálya (d)

Ionizáció
Mintabevitel Könnyű ionok

Iondetektor
Nehéz ionok

Vákuumkamra Időmérés (t)

1 1 𝑑
𝑞𝑈 𝑚𝑣 𝑚
2 2 𝑡

𝑑 𝑚 𝑚
𝑡 𝑘 melyből a részecskére jellemző m/q meghatározható
2𝑈 𝑞 𝑞
 Tömegspektrometriás alkalmazások

1. Fehérje analitika (proteomika) 3. Valós idejű szövetanalízis (“onkokés”)

emésztés
sejtek vagy szövet fehérje keverék 1DE
peptidekre

peptid
keverék
ion-peptid
peptid szétválasztás
folyadék kromatográfiával “electrospray”
ionizáció)
semleges gáz
Normál colon Normál máj

jel
detektálás
ion-peptid
(prekurzor ion) Tumoros colon
tömeg analizátor Metasztatikus máj
ütköztetéses fragmentáció tömeg analizátor

peptid szekvencia
relatív frekvencia (%)

relatív frekvencia (%)

MS spektrum MS/MS spektrum

2. Diagnosztikai szűrővizsgálatok:
Anyagcserebetegségek (1 csepp vérből)
pl. phenylketonuria (PKU)
 Infravörös (IR) spektroszkópia
- molekulák rezgőmozgásait méri.

Rezgés (vibráció): periodikus mozgás a kovalens kötés mentén

Forgás (rotáció): periodikus mozgás a kovalens kötésre illesztett tengely körül

Rezgőmozgás a
háromatomos metilén
csoportban (-CH2-):

Aszimmetrikus nyúlás Szimmetrikus nyúlás Torziós rezgés (ollózás)

Molekula energiája: Born-Oppenheimer - közelítés:

~100x ~100x
Energiák skálázódása: Ee > Ev > Er
• Energia állapotok egymástól függetlenek (csatolás elhanyagolható). ~3x10-19 J (~2 eV) > ~3x10-21 J > ~3x10-23 J
• Állapotok energianívói kvantáltak.
• Átmenetek “energiacsomag” (kvantum) elnyelésével/kibocsátásával UV/látható > közép IR > távoli IR
járnak.
• Energiaszintek közötti különbségek nagyságrendje különbözik.
 Molekuláris rezgések
(lásd: Rezonancia gyakorlat)

Molekula: rugóval összekötött tömeg

1 𝐷 ∆𝐸
𝑓
• kétatomos molekula (pl. CO) 2𝜋 𝑚 ℎ
• tömegek (m1, m2): atommagok
(me<<mmag) atommagok
közötti távolság
• rugó: kovalens kötés 𝑚 𝑚
• r0: egyensúlyi atommagok közötti ahol: 𝑚
𝑚 𝑚
távolság
• D: rugóállandó
• kölcsönhatási energia
távolságfüggése: parabola E=Dx2/2
𝑐 𝑚
𝜆 2𝜋
𝑓 𝐷

1 1 𝐷
Az IR spektroszkópiában a hullámszámot (ν) használjuk: 𝜈
𝜆 2𝜋𝑐 𝑚
elektromágneses

sugárzás

Értékek a CO molekulára: mért hullámszám, 𝜈 =2143 cm-1

λ =4,67 µm, f=6,43x1013Hz (64,3 THz), D=1875 N/m
 Infravörös (IR) spektroszkópia - mérés
álló tükör

A fényút
Fourier Transform Infravörös mozgó
B fényút
fény-
Michaelson
interferométer
(FTIR) Spektroszkópia: tükör forrás
• hullámhossz kombinációt generálunk
(Michaelson interferométerrel) minta
• A hullámhossz-kombinációnál mért
intenzitásokat átszámoljuk a hullámhossz
függvényében megadott intenzitásokká.
detektor

“Ujjlenyomat” tartomány “Ujjlenyomat” tartomány

IR spektrum:
abszorbancia

• gazdag információ a molekuláris etanol

szerkezetről és a vibrációs propanol
tulajdonságról
• abszorbancia versus hullámszám
• transzmittancia versus hullámszám

hullámszám (cm-1) hullámszám (cm-1)

 IR spektroszkópiás alkalmazások
Lipid Fehérje Nukleinsav Szénhidrát

• kémiai azonosítás (pl. intermedier és végtermékek)

• Molekulaszerkezet azonosítása és igazolása
• Metabolitok keresése
• A fehérjékben mind a gerinc (amid rezgések), mind az
oldallánc (ligandum kötődés) viselkedése követhető (pl.,

abszorbancia (a.u.)
denaturáció, folding, aggregáció)
• Nukleinsavakban a bázisok, a cukor és a foszfát
komponensek egymástól függetlenül vizsgálhatók.
• Lipidekben a fázisátmenetek (pl., rendezett-rendezetlen)
vizsgálhatók.
• N.B.: vizes mintában, a víz elnyelése miatt, nehéz vizet
(D2O) használhatnak.
hullámszám (cm-1)

amid I
rezgés

molekula
Bőr fibroblasztok, képalkotás
FTIR mikroszkópia
1224 cm-1 hullámszámnál
 Röntgen diffrakció, krisztallográfia
Alapja: hullámelhajlás és interferencia
Hullámhosszal azonos nagyságrendű, vagy a
hullámhossznál kisebb méretű rés. Hullámok fázisban (φ=0): Ha φ=π :
+1 erősítés kioltás

összeg:
0
kölcsönható
hullámok:
-1

1D rács interferencia képe 2D rács interferencia képe

Rácsállandó (d) és hullámhossz fényintenzitás
(λ) összemérhetők k =+2
interferencia
k =+1 maximumok
(erősítés helyei
k =0
Interferencia maximum feltétele:
k =-1 maximumok
𝑑 𝑠𝑖𝑛𝛼 𝑘𝜆 (lásd: Mikroszkópia II gyakorlat) k =-2
között kioltás

𝜆
𝑑 𝑘 𝑘 0, 1, 2…
𝑠𝑖𝑛𝛼
Molekula térszerkezete
H dNaCl: 5.64 Å

~1 Å

Milyen sugárzáshoz kellene használni egy molekularácshoz?

λRtg: 0.01-10 nm = 0.1-100 Å

λ
Interferencia maximum feltétele:

2𝑑 𝑠𝑖𝑛𝜃 𝑘𝜆 𝑑 … bonyolultabb…


rtg-diffrakcióval kapott interferencia képből:
atomok térbeli koordinátái molekula térszerkezete
 Kristály
Kristály
Rtg-
nyaláb
Rtg sugárzás

Mérés

Elhajási interferencia mintázat

fázisok
finomítás

Elektron-sűrűség
térkép

illesztés

Molekula
szerkezet

3D szerkezet
Molekulaszerkezet meghatározása röntgen-krisztallográfiával

dsDNS Globuláris fehérje: Molekulakomplex:

mioglobin riboszóma

hélix dőlésszöge
bázisok közötti távolság
hélix menetemelkedése
~1200 atom

30S alegység: ~35000 atom,

50S alegység:~64000 atom

V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, A. E. Yonath

J.D. Watson és F. Crick M. F. Perutz, J. C. Kendrew Nobel díj 2009
Nobel-díj 1953 Nobel díj 1962
 Szerkezet - Funkció

Röntgen krisztallográfia: FTIR:

molekula 3D szerkezete – statikus kép kötések rezgései

Melyek a molekula
funkcionális
mozgásai? tömegközéppont

atomi koordináták rugóállandók

MolekulaDinamikai (MD) szimulácó

fehérjék belső mozgásait számolja
 Molekuláris dinamikai szimuláció
Cél:
- kísérleti adatokból kiindulva a makromolekulák belső mozgását feltérképezni, működését megérteni,
- atomi szintű értelmezést adni a kísérleti eredményeknek.

foszfoglicerát kináz (PGK)

RalF:
- légionárius betegséget (súlyos tüdőgyulladás) okozó vírus effektora.

Kísérlet:
- kristályszerkezet inaktív állapotban,
- membránhoz kötődve aktiválódik (narancssárgával jelölt aminosavak).

De: membrán felületéhez kötődő fehérjét nem lehet kristályosítani.

Aktív állapotban konformációját röntgen diffrakcióval nem lehet meghatározni.

Hogyan működik?

Számítógépes szimuláció
kísérlet – szimuláció komplementaritás