Tài liệu hướng dẫn bài tập Công nghệ gene (Tài liệu lưu hành nội bộ)

(GV Trương Kim Phượng soạn – Năm 2023)

Phần 1. Một số công thức tính trọng lượng phân tử
1. Trọng lượng phân tử nucleic acid (g/mol)
Nucleotide (NTP) Trọng lượng phân tử (g/mol)
ATP 507,2
CTP 483,2
GTP 523,2
UTP 484,2
Trọng lượng phân tử trung bình của ribonuleotide triphosphat: Average MW = 499,5

Nucleotide (NMP) Trọng lượng phân tử (g/mol)

AMP 347,2
CMP 323,2
GMP 363,2
UMP 324,2
Trọng lượng phân tử trung bình của ribonuleotide triphosphat: Average MW = 399,5

Nucleotide (dNTP) Trọng lượng phân tử (g/mol)

dATP 491,2
dCTP 476,2
dGTP 507,2
dTTP 482,2
Trọng lượng phân tử trung bình của ribonuleotide triphosphat: Average MW = 487,5

Nucleotide (dNTP) Trọng lượng phân tử (g/mol)

dAMP 331,2
dCMP 307,2
dGMP 347,2
dTMP 322,2
Trọng lượng phân tử trung bình của ribonuleotide triphosphat: Average MW = 327

1
 2. Cách tính trọng lượng phân tử DNA:
2.1. Nguyên tắc:
Molecular weight (MW): Trọng lượng phân tử (g hoặc gram)
Trọng lượng trung bình của 1 cặp nucleotide (base pair) trên phân tử DNA mạch đơn:
1 base pair = 6,60×102 Dalton = 660 Dalton
 1 mole của một loại nucleotide có trọng lượng là 330 gram
 1 mole cặp nucleotide (base pair) có trọng lượng là 660 gram
 Trọng lượng trung bình của một loại nucleotide: 330 pg/pmol
 Trọng lượng trung bình của một cặp nucleotide (base pair): 660 pg/pmol
Áp dụng hằng số Avogadro: 1 mole phân tử = 6,022x1023 phân tử
 Số lượng phân tử nucleotide có trong 1 gram DNA:
mol/g x molecules/mol = molecules/ g

N: số lượng nucleotide của phân tử DNA;

330 pg/pmol là trọng lượng phân tử trung bình của một nucleotide.
2.2. Cách tính trọng lượng phân tử nucleic acid theo giá trị trọng lượng của từng loại nucleic
acid
Công thức tính trọng lượng phân tử (gram/mole):
= (251 x nA) + (245 x nT) + (267 x nG) + (230 x nC) + (61 x (N-1)) + (54 x N)+(17 x (N - 1)) + 2
Chú thích:
nA = số lượng của base A; nT = số lượng của base T; nG = số lượng của base G; nC = số lượng của
base C;
N = Tổng số nucleotide có trong chuỗi trình tự/phân tử DNA
(61 x (n-1)): tổng trọng lượng của tất cả gốc phosphate

2
(54 x N): tổng trọng lượng của tất cả gốc 0H (phân tử nước, thông thường có 3 phân tử H-OH trên 1
phân tử nucleotide
(17 x (N - 1)): tổng trọng lượng NH3+ (ammonium cation) gắn với gốc phosphate

3. Chuyển đổi các giá trị đo lường DNA

Số mole trung
Trọng lượng trung bình
Số nucleotide “Median weight” (μg) bình
của phân tử DNA (μg)
(nmol)
5 1650 33 20.0
10 3300 33 10.0
15 4950 33 6.7
20 6600 33 5.0
25 8250 33 4.0
30 9900 33 3.3

4. Chuyển đổi đơn vị kilobase (kilo base)  kiloDalton (kDa)

Phân
Trọng lượng (đơn vị: kb <-> dalton)
tử

10 kb = 6,60×106 Dalton
ds DNA 10.000 base pairs = 6,60×106 Dalton
1 base pair = 6,60×102 Dalton
10 kb = 3,30×106 Dalton
ss DNA Trọng lượng phân tử trung bình của một dNMP = 330
Dalton
10 kb = 3,45×106 Dalton
RNA Trọng lượng phân tử trung bình của một NMP =345 Dalton
10k Dalton = 273 Base RNA

5. Chuyển đổi giá trị OD260 và nồng độ nucleic acid

Chỉ số OD => Nồng độ

Phân
(1 OD260 nm hoặc 1 đơn vị
tử
A260)
ds DNA 1 OD260 nm = 50 μg/ml
ss DNA 1 OD260 nm = 33 μg/ml
RNA 1 OD260 nm = 40 μg/ml
6. Trọng lượng phân tử protein

3
 Chỉ số OD => Nồng độ
Phân
Trọng lượng (đơn vị: 1 amino acid <-> dalton) (1 OD280 nm hoặc 1 đơn vị
tử
A280)

Trọng lượng phân tử trung bình cuả một amino acid = 110 1 OD280 nm = 1,67 mg/ml
Protein
Dalton (1 mg/ml = 0,6 OD280 nm )

7. Chuyển đổi đơn vị đo lường protein: giá trị nồng độ Molar  giá trị trọng lượng
100 pmol of 100 kDa protein molecule = 10 μg
100 pmol of 50 kDa protein molecule = 5 μg
100 pmol of 10 kDa protein molecule = 1 μg
100 pmol of 1 kDa protein molecule = 100 ng
8. Hệ số tắt của deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) ở pH = 7.0 (áp dụng trong kỹ thuật đo
mật độ quang ở bước sóng 260 nm)
Hệ số tắt
Nucleotide (dNTP) Bước sóng hấp thụ tối đa [Molar Extinction
Coefficient :ε 260 (×10-3)]
dATP 259 15,200
dCTP 271 9,300 hoặc 7,4
dGTP 253 13,700 hoặc 11,5
dTTP 267 9,600 hoặc 8,3

9. Hệ số tắt của ribonucleoside triphosphate (NTP) ở pH = 7.0 (áp dụng trong kỹ thuật đo mật độ
quang ở bước sóng 260 nm)
Hệ số tắt
Nucleotide (NTP) Bước sóng hấp thụ tối đa [Molar Extinction
Coefficient :ε 260 (×10-3)]
ATP 259 15,200
CTP 271 9,000
GTP 253 13,700
UTP 267 10,000

10. Chuyển đổi các giá trị đo lường DNA

Số mole trung
Trọng lượng trung bình
Số nucleotide “Median weight” (μg) bình
của phân tử DNA (μg)
(nmol)
5 1650 33 20,0
10 3300 33 10,0
15 4950 33 6,7
4
 20 6600 33 5,0
25 8250 33 4,0
30 9900 33 3,3

11. Cách tính trọng lượng phân tử DNA dựa vào hệ số tắt (Extinction coefficient) của các loại base
(nucleotide) khác nhau:
Công thức tính trọng lượng phân tử (g):

𝟑𝟑𝟎 𝐃𝐚𝐥𝐭𝐨𝐧 𝐱 𝐍
Trọng lượng phân tử (g) = = …. (g)
(𝟏𝟓,𝟐 𝐱 𝐧𝐀) + (𝟖,𝟑 𝐱 𝐧𝐓) + (𝟏𝟏,𝟓 𝐱 𝐧𝐆) + (𝟕,𝟒 𝐱 𝐧𝐂)

𝟑𝟑𝟎 𝐃𝐚𝐥𝐭𝐨𝐧 𝐱 𝐍
“Molar” phân tử ((g/mol) = [(𝟏𝟓,𝟐 = …. (g)
𝐱 𝐧𝐀)+ (𝟖,𝟑 𝐱 𝐧𝐓)+ (𝟏𝟏,𝟓 𝐱 𝐧𝐆)+ (𝟕,𝟒 𝐱 𝐧𝐂)]𝐱𝟑𝟑𝟎 𝐃𝐚𝐥𝐭𝐨𝐧 𝐱 𝐍

𝟏
Molar” phân tử ((g/mol) = [(𝟏𝟓,𝟐 = …. (g)
𝐱 𝐧𝐀)+ (𝟖,𝟑 𝐱 𝐧𝐓)+ (𝟏𝟏,𝟓 𝐱 𝐧𝐆)+ (𝟕,𝟒 𝐱 𝐧𝐂)]𝐱𝟑𝟑𝟎 𝐃𝐚𝐥𝐭𝐨𝐧 𝐱 𝐍

12. Dạng bài tập chuyển đổi đơn vị đo lường của phân tử DNA
Hướng dẫn giải bài tập:

1 g DNA pmol DNA Molecular weight

20 bp oligonucleotide 75 5 x 1013
1000 bp DNA 1,52 (1,515) 9,1 x 1011
pUC 19 DNA (2686
bp)
pBR322 DNA (4363
bp)
Lambda (48502 bp)

1 pmol DNA mg DNA

20 bp oligonucleotide
1000 bp DNA 0,66
pUC 19 DNA (2686
bp)
pBR322 DNA (4363
bp)
Lambda (48502 bp)

1 pmol protein DNA

10000 Da 270 bp
300000 Da
100000 Da

5
Đối với DNA mạch đôi:
Chuyển đổi g DNA => pmol DNA

𝐩𝐦𝐨𝐥 𝟏𝟎𝟔 𝐩𝐠 𝟏
…. g DNA x × × = ….. pmol DNA
𝟔𝟔𝟎 𝐩𝐠 𝟏 𝐠 𝐍

Chuyển đổi pmol DNA => g DNA

𝟔𝟔𝟎 𝐩𝐠 𝟏 𝐠
…. pmol DNA x × × 𝐍 = ….. g DNA
𝐩𝐦𝐨𝐥 𝟏𝟎𝟔 𝐩𝐠

Đối với DNA mạch đơn:

Chuyển đổi g DNA => pmol DNA
𝐩𝐦𝐨𝐥 𝟏𝟎𝟔 𝐩𝐠 𝟏
…. g DNA x × × = ….. pmol DNA
𝟑𝟑𝟎 𝐩𝐠 𝟏 𝐠 𝐍

Chuyển đổi pmol DNA => g DNA

𝟑𝟑𝟎 𝐩𝐠 𝟏 𝐠
…. pmol DNA x × × 𝐍 = ….. g DNA
𝐩𝐦𝐨𝐥 𝟏𝟎𝟔 𝐩𝐠

Chú thích:
N: số lượng nucleotide của phân tử DNA;
330 pg/pmol là trọng lượng phân tử trung bình của một nucleotide.
Gợi ý
1 µg of 1.000 bp DNA = 1,52pmol(3.03 pmol of ends)
1 µg of pBR322 DNA = 0,36pmol DNA
1 µg FX174 DNA (5.386bp) = 0,28 pmol
1 µg lambda phage DNA (48.502bp) = 0,03 pmol
1 µg M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0,21 pmol
1 µg pBR322 DNA (4.361bp) = 0,35 pmol
1 µg pUC18/19 DNA (2.686bp) = 0,57 pmol

1 pmol of 1,000 bp DNA = 0,66 µg

1 pmol of pBR322 DNA = 2,8 µg
1 pmol M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 4,78 µg
1 pmol SV40 DNA (5.243bp) = 3,46 µg
1 pmol pUC18/19 DNA (2.686bp) = 1,77 µg
1 pmol pBR322 DNA (4.361bp) = 2,88 µg
1 pmol lambda phage DNA (48.502bp) = 32,01 µg
1 pmol FX174 DNA (5.386bp) = 3,55 µg

13. Chuyển đổi Protein  DNA

6
Trọng lượng phân tử trung bình của một cặp nucleotide trên phân tử DNA mạch đôi (bp) = 600
Daltons
Trọng lượng phân tử trung bình của một nucleotide trên phân tử DNA mạch đơn = 330 Daltons
Trọng lượng phân tử trung bình của một nucleotide trên phân tử RNA = 334 Daltons

1 kb DNA mã hóa 333 amino acid = 37 kDalton (kDa) protein

270 bp DNA = 10 kDalton (kDa) protein
9 amino acids = 1 kDa protein molecule
810 bp DNA = 30 kDa protein molecule
1350 bp DNA = 50 kDa protein molecule
2,7 kb DNA = 100 kDa protein molecule
1 kb RNA = 37 kDa protein molecule

7
Phần 2. So sánh sự khác biệt giữa tách chiết DNA và tách chiết RNA
Chỉ số/Yêu cầu Tách chiết DNA Tách chiết RNA
pH 8 4-4,7
Do DNA bị biến tính trong điều Do trong môi trường kiềm, RNA dễ bị
kiện acid. thủy phân, do 2′ OH trong đường ribose

Yêu cầu về độ tinh sạch DNA tinh sạch, không nhiễm RNA tinh sạch, không nhiễm
protein/tạp chất và RNA protein/tạp chất và dNA
Các bước chính trong 1. Ly giải tế bào
quy trình tách chiết 2. Biến tính và loại bỏ protein
3. Thu tủa DNA

Một số đặc điểm của Đều áp dụng phương pháp hóa học và/hoặc lý học (cơ học):
quá trình tách chiết - Enzyme (proteinase K); SDS;
- Nghiền, vortex, …
Nguồn mẫu:
-Tế bào vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn
-Virus
- Mẫu mô/tế bào động vật, thực vật, con người (mẫu mô, mẫu máu,…)
Đảm bảo DNA hoặc RNA tinh sạch; nguyên vẹn cấu trúc

Guanidinium thiocyanate được sử dụng làm chất

Có thể sử dụng isopropanol, ethanol để thu tủa nucleic acid (DNA, RNA)
Xử lý bằng DEPC Không xử lý Tất cả các mẫu nước và dung dịch hóa
chất, và dụng cụ (đầu tuýp) đều phải
xử lý bằng DEPC
Điều kiện bảo quản -20 °C -80 °C

8
Phần 3. Một số thắc mắc
1. CTAB
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) buffer
- CTAB còn được gọi là hexadecyltrimethylammonium bromide
- CTAB là một chất tẩy cation tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách và loại bỏ thành phần
polysaccharide, tạp chất (polyvinylpyrrolidone) và khử hoạt tính của polyphenol có trong tế bào thực
vật.
- CTAB được sử dụng trong quy trình tách chiết tế bào thực vật
2. Guanidinium thyocyanate
- Guanidinium thiocyanate hoặc guanidinium isothiocyanate (Guanidine thiocyanate, guanidine
isothiocyanate), viết tắt là GTC hoặc GITS. Công thức hóa học của GITS là C2H6N4S có khối lượng
phân tử 118,16 g/mol.
- Guanidinium thiocyanate là một hợp chất hóa học được sử dụng làm chất biến tính protein nói chung,
là một tác nhân muối chaotropic;
- Dung dịch guanidinium thiocyanate–phenol ở dạng dung dịch TRIzol, TriFast hoặc TRI
- Guanidinium thyocyanate phá vỡ các tế bào, làm biến tính protein và ức chế các nuclease, nhờ đó ổn
định DNA, RNA và protein.
- Điều quan trọng là phải biết, trước khi sử dụng, rằng Guanidine thiocyanate là một hóa chất nguy
hiểm. Nó có thể gây hại cho nhân viên phòng thí nghiệm khi hít phải hoặc tiếp xúc với da nên phải cẩn
thận khi xử lý.
3. Beta-mercaptoethanol (ß-ME)
- Beta-mercaptoethanol (ß-ME) là một chất khử RNAase, bằng cách phá vỡ liên kết disulfide và sự
cuộn gấp quan trọng cho chức năng của enzyme.
- Beta-mercaptoethanol có thể được sử dụng kết hợp với Guanidinium isothiocyanate (GITC) để ức chế
hoàn toàn Rnase

9
Phần 4. Một số dạng bài tập
Phần 4.3. Enzym cắt giới hạn
Lý thuyết: Restriction enzym (RE) là Restriction endonuclease, là enzyme nhận biết trình tự “đối xứng
đảo chiều - panlindrome” trên trình tự mạch đôi DNA, cắt trình tự DNA tại vị trí ở trong vùng
trình tự nhận biết hoặc ở gần vị trí nhận biết.
Trình tự nhận biết của enzym cắt giới hạn gồm 4 hoặc 6 nucleotide trên mỗi mạch.
Ví dụ: Enzyme EcoRI là một dạng RE cắt so le (đầu dính) và tạo thành các sản phẩm cắt giới hạn
ở dạng “sticky end” với vị trí nhận biết là :
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
EcoRI cắt trình tự mạch đôi DNA tại liên kết phosphodiester giữa G và A trên cả hai mạch, tạo
thành:
5'…………G 3' và 5'AATTC…………. 3'
3'…………CTTAA 5’ 3'G…………. 5'

Enzyme HindIII là một dạng RE cắt so le (đầu dính) và tạo thành các sản phẩm cắt giới hạn ở dạng
“sticky end” với vị trí nhận biết là :
5' AAGCTT 3'
3' TTCGAA 5'
HindIII cắt trình tự mạch đôi DNA tại liên kết phosphodiester giữa A và A trên cả hai mạch, tạo
thành:
5'…………A 3' và 5'AGCTT…………. 3'
3'…………TTCGA 5’ 3'A…………. 5'

10
Bài tập 4.3.1
Thí nghiệm: sử dụng 12 unit (đơn vị) enzym cắt giới hạn để xử lý 6 g DNA bộ gene người. Biết rằng:
- Enzym cắt giới hạn HindIII ở nồng độ 2500 unit/ml.
- DNA bộ gene người ở nồng độ 320 g/ml.
Hãy xác định thể tích dịch DNA bộ gene người và enzyme HindIII được sử dụng trong một thí nghiệm
nêu trên?
Hướng dẫn giải:
(1). Tổng thể tích của phản ứng cắt giới hạn thông thường ở trong khoảng 20-100 l.
Do đó, số liệu thể tích dịch DNA bộ gene người và enzyme HindIII được biểu thị ở dạng đơn vị là l =>
sẽ chuyển đổi đơn vị và tính nồng độ của DNA bộ gene người và nồng độ enzyme lần lượt thành: g/l
và unit/l.
(2) Dạng bài tập này tập trung áp dụng theo công thức tính tam suất,
Cách xác định thể tích DNA bộ gene người có chứa 6 g DNA như sau:

• Do 1 ml = 1000 l, nồng độ DNA bộ gene người theo đề bài là:

trong 1000 l có chứa 320 g
…….. ?...... l có chứa 6 g
Thể tích DNA bộ gene người có chứa 6 g DNA:
𝟔 𝐠 𝐱 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝐥
= = 𝟏𝟖, 𝟕𝟓 𝐥
𝟑𝟐𝟎 𝐠
 Trong phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn HindIII, lượng (thể tích) DNA bộ gene người được sử
dụng là 𝟏𝟖, 𝟕𝟓 𝐥
Cách xác định thể tích enzym cắt giới hạn:

• Do 1 ml = 1000 l, nồng độ enzyme cắt giới hạn theo đề bài là:
trong 1000 l có chứa 2500 đơn vị hoạt tính của enzyme (unit)
…….. ?...... l có chứa 12 đơn vị hoạt tính của enzyme (unit) để đưa vào phản ứng cắt.
Thể tích enzyme cắt giới hạn với 12 đơn vị hoạt tính của enzyme (unit) cần để xử lý 6 g
DNA bộ gene người:
𝟏𝟐 𝐮𝐧𝐢𝐭 𝐱 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝐥
= = 𝟒, 𝟖 𝐥
𝟐𝟓𝟎𝟎 𝐮𝐧𝐢𝐭
 Trong phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn HindIII, lượng (thể tích) enzyme được sử dụng là 𝟒, 𝟖 𝐥

11
Bài tập 4.3.2
Hãy xác định chiều dài trung bình của các đoạn sản phẩm cắt giới hạn được tạo thành của phản ứng
xử lý DNA bộ gene của thực khuẩn thể (bacteriophage)  bằng enzym HindIII.
Biết rằng bộ gene của thực khuẩn thể (bacteriophage)  có chiều dài khoảng 48.502 bp.
Hướng dẫn giải:
Trên một trình tự DNA mạch đôi của bộ gene bất kỳ, cơ hội xuất hiện của một trong bốn loại nucleotide
A, T, C, G là như nhau và bằng ¼,
=> Số lượng (Tần số) vị trí nhận biết ngẫu nhiên của một enzym cắt giới hạn được xác định trong
khoảng: (1/4) đến N/(1/4)n, trong đó, n : số lượng cặp base có trong trình tự nhận biết của mỗi
enzym cắt giới hạn; N là chiều dài của đoạn DNA bộ gene
Vì vậy, với enzyme HindIII có trình tự nhận biết gồm 6 cặp nucleotide ( 6 bp), số lượng vị trí nhận biết
có thể là
= (1/4)n = (1/4)6 = 1/4096
Có nghĩa là trên một trình tự DNA mạch đôi ngẫu nhiên, enzyme HindIII có thể có vị trí nhận biết và cắt
các đoạn phân tử có chiều dài là 4096 bp
Bộ gene của thực khuẩn thể (bacteriophage)  có chiều dài khoảng 48.502 bp
Số lượng vị trí của enzyme HindIII có trên DNA bộ gene của :
= 48.502/ [(1/4)6] = 48.502/4096 = 12 vị trí
Gợi ý: trong thực tế, sau khi xử lý bằng enzyme HindIII, bộ gene của thực khuẩn thể (bacteriophage) 
có chiều dài khoảng 48.502 bp được cắt thành các đoạn DNA có chiều dài khoảng 125 bp cho đến
23.000 bp.

12
Bài tập 4.3.3
Trong một phản ứng PCR, lượng DNA bản mẫu (DNA template) cần được sử dụng: 20 nanogram của
DNA từ ống mẫu DNA bộ gene người có nồng độ 0,2 mg/ml.
Hãy xác định thể tích (l) dịch DNA bộ gene người được chuyển vào một phản ứng PCR.
(Tổng thể tích phản ứng PCR: 50 l)
Hướng dẫn giải:
Bước 1: chuyển đổi hệ số/đơn vị mg/ml => ng/l
1 mg = 103 g = 106 ng
1 ml = 103 l
 1 mg/1 ml  106 ng/103 l  103 ng/l
Bước 2: Chuyển đổi nồng độ DNA bộ gene người: mg/ml => ng/l
0,2 mg/ml  0,2x103 ng/l = 200 ng/l
Từ đó, có thể hiểu rằng dịch DNA bộ gene người có nồng độ 0,2 mg/ml (200 ng/l):
- Nếu cần 200 ng DNA sẽ phải sử dụng (hút) 1 l dịch DNA bộ gene người
- Nếu cần 20 ng DNA sẽ phải sử dụng (hút) ? l dịch DNA bộ gene người
 Thể tích dịch DNA bộ gene người chứa 20 ng DNA được chuyển vào một phản ứng PCR:
𝟐𝟎 𝐧𝐠 × 𝟏 𝐥 𝟐𝟎 𝐧𝐠 × 𝟏 𝐥
= = = 𝟎, 𝟏 𝐥
𝟐𝟎𝟎 𝐧𝐠 𝟐𝟎 × 𝟏𝟎 𝐧𝐠
Do đó, thể tích dịch DNA bộ gene người đưa vào phản ứng PCR là 𝟎, 𝟏 𝐥
❖ Trong thực tế, nếu phòng thí nghiệm không có micropippete phù hợp để hút thể tích dung dịch
0,1 𝐥, khi đó, có thể tiến hành pha loãng với hệ số pha loãng phù hợp: d =2, d=3,…. d =10 để có
thể hút được dịch DNA với thể tích phù hợp có chứa đủ 20 ng DNA và phù hợp với tổng thể tích
phản ứng PCR.
Ví dụ: hút 1 𝐥 𝐃𝐍𝐀 bộ gene người (200 ng/l) pha loãng với 19 𝐥 nước cất hai lần => hệ số pha
loãng d = (1+19)/2 = 20, có nghĩa dịch DNA đã được pha loãng để giảm nồng độ 20 lần => nồng
độ DNA sau khi pha loãng: [(200 ng/l)/20]= 10 ng/l.
 Thể tích DNA bộ gene người có chứa 20 ng DNA (dịch DNA đã pha loãng) để đưa vào phản ứng
PCR:
𝟐𝟎 𝐧𝐠 × 𝟏 𝐥
= = 𝟐 𝐥
𝟏𝟎 𝐧𝐠

Với thể tích 𝟐 𝐥 DNA bộ gene người có chứa 20 ng DNA phù hợp để chuyển vào phản ứng PCR
(tổng thể tích phản ứng PCR = 𝟓𝟎 𝐥), phần còn lại trong phản ứng PCR: Master Mix (Taq
polymerase, dNTPs, buffer, MgCl2), mồi xuôi (Forwar primer, F), mồi ngược (Reverse primer:
R), nước cất hai lần vô trùng.

13
Bài tập 4.3.4
Một phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn Escherichia coli (E.coli), số lượng
bản sao (copies) của bộ gene vi khuẩn E.coli bản mẫu (DNA template) là 300 bản sao.
Nếu phản ứng PCR được trải qua 30 chu kỳ, hãy xác định “tổng số lượng” bản sao (copies) của
trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn Escherichia coli được tạo thành?
Hướng dẫn giải:
Tổng số lượng bản sao (copies) của bộ gene vi khuẩn E.coli được tạo thành từ phản ứng PCR
gồm 30 chu kỳ:
= 300 x 230 = ….. bản sao (copies) của trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn Escherichia coli

14
Bài tập 4.3.5
Một phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene exon 26 gene ApoB (334 bp) trên DNA bộ gene người.
Lượng DNA bộ gene người được đưa vào phản ứng là 2 nanogram (ng).
Hãy xác định lượng DNA sản phẩm PCR (bản sao được khuếch đại) được tạo thành từ phản
ứng PCR gồm 30 chu kỳ
Hướng dẫn giải:
Bước 1: chuyển đổi lượng DNA bộ gene người: 2 ng => số lượng bản sao bản mẫu (DNA template) của
DNA bộ gene người đưa vào phản ứng PCR:
- Bộ gene người đơn bội chứa 3 x 109 bp DNA
=> 1 bản sao bản mẫu (DNA template) chứa 3 x 109 bp DNA
Lưu ý: Áp dụng hằng số Avagadro và trọng lượng phân tử trung bình của 1 cặp nucleotide
(base pair): 660 pg/pmol
Áp dụng hằng số Avogadro: 1 mole phân tử = 6,022 x 1023 phân tử
1 bản sao bản mẫu (DNA template) chứa 3 x 109 bp DNA = 1 phân tử bản sao ( 1 copy)
Từ đó, có thể chuyển đổi 2 nanogram (ng) thành số ượng bản sao bản mẫu (DNA template) của
DNA bộ gene:
- 2 ng = 2 x 103 pg ; 1 gram (g) = 1012 pg
660 pg – 1 pmol
2 x 103 pg - X pmol
1 mole phân tử = 6,022 x 1023 bp (phân tử)
1 x 1012 pmol = 6,022 x 1023 bp (phân tử)
X pmol = Y phân tử
3 x 109 bp DNA = 1 phân tử bản sao ( 1 copy)
𝟑 𝐱 𝟏𝟎𝟗 𝐛𝐩 𝐃𝐍𝐀 𝟔𝟔𝟎 𝐩𝐠 𝟏 𝐱 𝟏𝟎𝟏𝟐 𝐩𝐦𝐨𝐥 𝐛𝐩 𝟏 𝐱 𝟏𝟎𝟏𝟐 𝐩𝐠 𝟑,𝟑 𝐩𝐠
 × × × =
𝟏 𝒄𝒐𝒑𝒚 𝟏 𝐱 𝟏𝟎𝟏𝟐 𝐩𝐦𝐨𝐥 𝐛𝐩 𝟔,𝟎𝟐𝟐 𝐱 𝟏𝟎𝟐𝟑 𝐛𝐩 𝟏𝐠 𝐜𝐨𝐩𝐲

 3,3 pg DNA có trong 1 bản sao (copy) của DNA bộ gene người chứa
 2 nanogram (ng) thành số ượng bản sao bản mẫu (DNA template) của DNA bộ gene:

2 ng = 2. 103 pg: ? bản sao (copy) DNA

𝟐𝐱 𝟏𝟎𝟑 𝐩𝐠 𝐱 𝟏 𝐛ả𝐧 𝐬𝐚𝐨
= = 600 bản sao (copies) của DNA bản mẫu (DNA bộ gene người được
𝟑,𝟑 𝐩𝐠
đưa vào phản ứng PCR)
Bước 2 : Xác định số lượng bản sao trình tự exon 26 gene ApoB được tạo thành từ từ phản ứng PCR
gồm 30 chu kỳ:
Biết rằng phản ứng PCR với 2 ng DNA bộ gene người – tương ứng với 600 bản sao (copies) của
DNA bản mẫu (DNA bộ gene người được đưa vào phản ứng PCR) => Khi đó, theo lý thuyết có 600
bản sao (copies) của trình tự exon 26 gene ApoB. Nếu tiến hành phản ứng PCR với 30 chu kỳ, số lượng
bản sao trình tự exon 26 gene ApoB được tạo thành: 600 x 230 = 644.248.694.400 bản sao

15
Bài tập 4.3.6
Một phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene exon 26 gene ApoB (334 bp) trên DNA bộ gene người.
Hãy xác định số lượng bản sao (copies) DNA sản phẩm PCR được tạo thành từ phản ứng PCR,
biết rằng tổng lượng DNA sản phẩm PCR là 100 ng
Chuyển đổi lượng DNA sản phẩm PCR: 100 ng => số lượng bản sao trình tự gene exon 26 gene ApoB (334
bp) được tạo thành trong phản ứng PCR:
- Trình tự c -1 bản sao DNA exon 26 gene ApoB: 334 bp
Lưu ý: Áp dụng hằng số Avagadro và trọng lượng phân tử trung bình của 1 cặp nucleotide
(base pair): 660 pg/pmol
Áp dụng hằng số Avogadro: 1 mole phân tử = 6,022 x 1023 phân tử
- Từ đó, có thể chuyển đổi 100 nanogram (ng) thành số lượng bản sao DNA exon 26 gene ApoB
- 100 ng = 100 x 103 pg ; 1 gram (g) = 1012 pg
660 pg – 1 pmol
103 pg - X pmol
1 mole phân tử = 6,022 x 1023 bp (phân tử)
1 x 1012 pmol = 6,022 x 1023 bp (phân tử)
X pmol = Y phân tử
3 x 109 bp DNA = 1 phân tử bản sao ( 1 copy)
𝟑𝟑𝟒 𝐛𝐩 𝐃𝐍𝐀 𝟔𝟔𝟎 𝐩𝐠 𝟏 𝐱 𝟏𝟎𝟏𝟐 𝐩𝐦𝐨𝐥 𝐛𝐩 𝟏 𝐱 𝟏𝟎𝟏𝟐 𝐩𝐠 𝟑,𝟔𝟔 ×𝟏𝟎−𝟕 𝐩𝐠
 × × × =
𝟏 𝒄𝒐𝒑𝒚 𝟏 𝐱 𝟏𝟎𝟏𝟐 𝐩𝐦𝐨𝐥 𝐛𝐩 𝟔,𝟎𝟐𝟐 𝐱 𝟏𝟎𝟐𝟑 𝐛𝐩 𝟏𝐠 𝟏 𝐜𝐨𝐩𝐲

 Số lượng bản sao (copies) DNA sản phẩm PCR khuếch đại DNA exon 26 gene ApoB có trong 100 ng
sản phẩm PCR:
100 ng = 100 x 103 pg
𝟏 𝒄𝒐𝒑𝒚
= 100 x 103 pg × = X bản sao (copies)
𝟑,𝟔𝟔 ×𝟏𝟎−𝟕 𝐩𝐠

16
Bài tập 4.3.7
Một phản ứng PCR với cặp mồi như sau:

Trình tự mồi (5’-3’)

Mồi xuôi GCATAACGTCGCAAGACCAAAGA
Mồi ngược GTCAATTGCTGCGGTTATTAACCA

Hãy xác định nhiệt độ nóng chảy của từng mồi (oligonucleotide) nêu trên?

Hướng dẫn giải:

Trình tự mồi (5’-3’) Số lượng nucleotide

A T C G
Mồi xuôi GCATAACGTCGCAAGACCAAAGA 10 2 6 5
Mồi ngược GTCAATTGCTGCGGTTATTAACCA 6 8 5 5

❖ Nếu áp dụng công thức xác định Tm: Tm = [2o x (A+T)] + [4 o x (G+C)]

Công thức này áp dụng: 2 độ (2o) cho mỗi nucleotide A hoặc T; 4 độ (2o) cho mỗi nucleotide C
hoặc G; công thức thường được áp dụng để tính nhanh nhiệt độ nóng chảy cho mồi/mẫu dò.

Trình tự mồi (5’-3’) Tm (0) Số lượng nucleotide

A T C G
Mồi xuôi GCATAACGTCGCAAGACCAAAGA 68 10 2 6 5
Mồi ngược GTCAATTGCTGCGGTTATTAACCA 68 6 8 5 5

❖ Nếu áp dụng công thức xác định Tm:

𝟓𝟎𝟎
Tm = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝐋

Trong đó: L = chiều dài (số nucleotide) của mỗi trình tự mồi/mẫu dò
log10[K+] = [giá trị ion muối] = [K+] + 4 [Mg2+]0,5

17
 Khi đó có thể áp dụng điều kiện chuẩn: 50 mM KCl = 50 x 10-3 M KCl = 0,05 M KCl (0,05 mol
KCl có trong 1000 ml).
log10[K+]= [K+] + 4 [Mg2+]0,5 = [[0,05] +4[0,0025]0,5 = 0,25
𝟎,𝟐𝟓
 [16,6 x (log10[K+])] = [16,6 x (log10[ ]
𝟏,𝟎+𝟎,𝟕 𝐱(𝟎,𝟐𝟓)

= 16,6 log (0,213) = -11,2

𝟓𝟎𝟎
 Tm = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝐋

Trình tự mồi (5’-3’) Tm (0) Số lượng nucleotide %GC

A T C G
Mồi xuôi GCATAACGTCGCAAGACCAAAGA …. 10 2 6 5 47,82
Mồi ngược GTCAATTGCTGCGGTTATTAACCA ….. 6 8 5 5 41,67

𝟓𝟎𝟎
 Tm mồi xuôi = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝟐𝟑
= 81,5 + (-11,2) + (0,41 x 47,82) – (500/23) = ….
0 0

𝟓𝟎𝟎
 Tm mồi ngược = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝟐𝟒
= 81,5 + (-11,2) + (0,41 x 41,67) – (500/23) = ….
0 0

❖ Nếu áp dụng công thức xác định Tm:

𝟔𝟕𝟓
Tm = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝐋
Trong đó: L = chiều dài (số nucleotide) của mỗi trình tự mồi/mẫu dò
và trong điều kiện chuẩn
50 mM KCl = 50 x 10-3 M KCl = 0,05 M KCl (0,05 mol KCl có trong 1000 ml).
log10[K+]= [K+] + 4 [Mg2+]0,5 = [[0,05] +4[0,0025]0,5 = 0,25
𝟎,𝟐𝟓
 [16,6 x (log10[K+])] = [16,6 x (log10[ ]
𝟏,𝟎+𝟎,𝟕 𝐱(𝟎,𝟐𝟓)

= 16,6 log (0,213) = -11,2

𝟔𝟕𝟓
 Tm = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝐋

Trình tự mồi (5’-3’) Tm (0) Số lượng nucleotide %GC

A T C G
Mồi xuôi GCATAACGTCGCAAGACCAAAGA …. 10 2 6 5 47,82
Mồi ngược GTCAATTGCTGCGGTTATTAACCA ….. 6 8 5 5 41,67

18
 𝟔𝟕𝟓
 Tm mồi xuôi = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝟐𝟑
= 81,50 + (-11,2) + (0,41 x 47,82) – (500/23) = …. 0

𝟔𝟕𝟓
 Tm mồi ngược = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝟐𝟒
= 81,5 + (-11,2) + (0,41 x 41,67) – (500/23) = ….
0 0

❖ Nếu áp dụng công thức xác định Tm rút gọn và trong điều kiện chuẩn (50 mM KCl)
𝟔𝟕𝟓
Tm = 59,9 +0,41 (%G+C) -( )
𝐋

Trình tự mồi (5’-3’) Tm (0) Số lượng nucleotide %GC

A T C G
Mồi xuôi GCATAACGTCGCAAGACCAAAGA …. 10 2 6 5 47,82
Mồi ngược GTCAATTGCTGCGGTTATTAACCA ….. 6 8 5 5 41,67

𝟔𝟕𝟓
 Tm mồi xuôi = 59,9 + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝟐𝟑
= 59,9 + [0,41 x (%G+C) = …. 0

𝟔𝟕𝟓
 Tm mồi ngược = 81,50 + [16,6 x (log10[K+])] + [0,41 x (% G+C) - ( )
𝟐𝟒
= 59,9 + [0,41 x (%G+C) = …. 0

19