Đánh giá tác dụng kháng viêm in vitro của các dịch chiết từ một số loài chi

Pouzolzia

1. Thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide trên tế bào RAW264.7
1.1. Nguyên liệu
Cặn chiết tổng và phân đoạn
TT Tên mẫu n-
Tổng Ethyl acetate (EtOAc) Nước (W)
hexane
1 Pouzolzia zeylanica PZ PZH PZE PZW
2 Pouzolzia hirta PH PHH PHE PHW
3 Pouzolzia pentandra PP PPH PPE PPW

1.2. Vật liệu, hóa chất

Tế bào RAW264.7 cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection,
Manassas, VA, USA).
Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), Griess reagent, LPS
(lipopolysacharide) được mua từ nguồn Sigma-Aldrich (nay là Merck KGaA, Darmstadt,
CHLB Đức) Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).
- Được thử nghiệm tại Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất
thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
1.3. Tiến hành
Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37oC, 5%
CO2, 10% FBS. Sau đó dịch tế bào được chuyển lên giếng phiến 96 với mật độ 2,5 x
105 tế bào/giếng. Tế bào được kích thích với 2 µL LPS (0,1 mg/mL) trong 24 giờ và
bổ sung thuốc/chất thử các nồng độ khác nhau. Cardamonin được sử dụng làm đối
chứng (+). Dịch huyền phù của tế bào được ủ với thuốc thử Griess, NaNO2 ở các nồng
độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn. Đo hỗ hợp phản ứng ở  = 570 nm.
Tỷ lệ ức chế sản sinh NO (%) được xác định theo công thức:
%UC =([XTB]mẫu - [XTB]LPS)/([XTB]ĐC - [XTB]LPS) x100

1
 Trong đó: [XTB] là nồng độ NO trung bình tính dựa trên đường chuẩn NaNO2.
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được
bổ sung dung dịch MTT (0,5 mg/mL trong PBS), ủ 4 giờ trong tủ ấm 5% CO2 ở 37oC.
Sản phẩm chuyển hóa dạng tinh thể formazan được hòa tan trong dimethyl sulfoxide
(DMSO, Sigma-Aldrich) và đo mật độ quang ở λ = 540/720nm trên thiết bị Infinite
F50 (Tecan, Männedorf, Thụy Sỹ).
Tỷ lệ sống sót của tế bào CS% (Cell survival) tính theo % so với đối chứng:
Tỷ lệ ức chế tế bào (%) = [(OD[mẫu]/OD[đối chứng (-)]) x 100] ± 𝜎
Độ lệch chuẩn được tính theo công thức:

3. Kết quả thực nghiệm

Thử hoạt tính kháng viêm in vitro của các cặn chiết thu nhận từ các thực vật
chi Pouzolzia được đánh giá thông qua sự ức chế sinh ra NO kích thích bởi LPS trên
đại thực bào RAW 264.7. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các cặn chiết được
trình bày tại bảng 1.
Bảng 1. Kết quả thử khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7
Tỷ lệ ức chế sản sinh Tỷ lệ tế bào sống sót
Tên mẫu IC50
NO (%) (%)
Đối chứng (-) 100,00 ± 0,8 102,32 ± 0,5
Đối chứng (+) 46,54 ± 0,9 85,34 ± 0,6
2,35 µM
[Cardamonin] 88,02 ± 1,1 70,34 ± 0,31
LPS 0,00 ± 0,4 -
Cặn PZ 78,23 ± 0,4 80,23 ± 0,5 15,24 µg/mL
Cặn PH 60,78 ± 0,8 67,89 ± 0,6 64,26 µg/mL
Cặn PP 71,12 ± 0,7 83,35 ± 0,4 26,93 µg/mL
Cặn PZH 80,43 ± 1,2 62,4 ± 0,6 12,08 µg/mL
Cặn PZE 66,43 ± 0,9 77,43 ± 1,2 38,43 µg/mL
Cặn PZW 37,63 ± 1,0 69,34 ± 0,9 >100,00 µg/mL
Cặn PHH 55,81 ± 1,6 82,56 ± 1,4 72,98 µg/mL
Cặn PHE 59,35 ± 0,5 60,65 ± 1,5 70,15 µg/mL

2
Cặn PHW 21,71 ± 0,5 72,34 ± 1,8 >100,00 µg/mL
Cặn PPH 57,66 ± 0,6 77,43 ± 1,3 59,84 µg/mL
Cặn PPE 73,87 ± 1,3 67,43 ± 0,4 20,19 µg/mL
Cặn PPW 42,26 ± 1,5 66,54 ± 1,4 97,28 µg/mL

Kết quả ở bảng 1 cho thấy, các cặn chiết đều thể hiện hoạt tính ức chế đại thực
bào RAW 264.7 sản sinh NO ở các khoảng nồng độ khảo sát (p < 0,05) với LPS đối
chứng (-), đối chứng (+) là cardamonin 0,3 µM. Cặn tổng PZ ở nồng độ 100 µg/ml có
khả năng ức chế sản sinh NO mạnh và không gây độc cho cho tế bào với IC50 là 15,24
µg/ml. Cặn PZH biểu hiện hoạt tính kháng viêm tốt với IC50 là 12,08 µg/ml. Như vậy,
hoạt tính kháng viêm của cây Pouzolzia zeylanica tập chung chủ yếu ở phân đoạn ít
phân cực. Các loài Pouzolzia hirta và Pouzolzia pentandra đang hoàn thiện kết quả
nghiên cứu.

Tài liệu tham khảo

1. Dirsch V M, Stuppner H, and Vollmar A M (1998) The Griess assay: suitable for
a bio-guided fractionation of anti-inflammatory plant extracts? Planta Med, 64:
423-426.
2. Griess P (1879) Bemerkungen zu der abhandlung der H,H, Weselsky und Benedikt
“Ueber einige azoverbindungen”, Chem Ber, 12: 426-428.
3. Jiang K, Chen L, Wang S, Wang Y, Li Y & Gao K (2015) Anti-
inflammatoryterpenoids from the leaves and twigs of Dysoxylum gotadhora, J Nat
Prod, 78: 1037–1044.
4. Joung E-J, Lee M-S, Choi J-W, et al, (2012) Anti-inflammatory effects of
phlorofucofuroeckol B-rich ethyl acetate fraction obtained from Myagropsis
myagroides on lipopolysaccharide-stimulated RAW 264,7 cells and mouse edema,
Intern Immunopharm, 14: 471-480.
5. Sowndhararajan K, Santhanam R, Hong S, Jhoo J-W & Kim S (2016) Suppressive
effects of acetone extract from the stem bark of three Acacia species on nitric oxide
production in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264,7 macrophage cells, Asian
Pac J Trop Biomed, 6: 658-664.

3
4