Якісні реакції на білки і амінокислоти

Присутність білку в біологічних зразках або розчинах можна виявити

за допомогою кольорових реакцій, які зумовлені наявністю пептидних
зв’язків або специфічних груп амінокислот.
За допомогою кольорових реакцій можна порівняти амінокислотний
склад глобулярних і фабрілярних білків. За результатами кольорових реакцій
заповнити таблицю.
Назва Чим Колір, Сирова Желатин
реакції зумовлена вид тка (+/-)
(+/-)
1. Біуретова Присутність синьо- + -
пептидних
фіолетовий
зв'язків

2. Нінгідринова Присутність синьо- + +

амінокислот з
фіолетовий
вільною аміно-
групою

3. Ксантопротеїнова Наявність помаранчевий + -

ароматичних
амінокислот

4. Адамкевича Присутність червоно- + -

триптофану
фіолетовий
5. Ерліха Присутність помаранчевий + -
гістидину

6. Сакагучі Присутність червоний + +

аргініну

7. Фоля Наявність чорний + -

сірковмісних
амінокислот

Зробити висновок про амінокислотний стан досліджуваних білків та їх

можливої харчової цінності.
Як приклад глобулярних білків можуть бути використані білки
сироватки крові. Представником фібрилярних білків є колаген, продукт
часткового гідролізу якого – желатин – в даній роботи порівнюється з
глобулярними білками сироватки.
Робота 1. Біуретова реакція
Зумовлена присутністю в пептидах і білках пептидних угрупувань, які
в лужному середовищі утворюють із сірчаною міддю пофарбовані в синьо-
фіолетовий колір комплекси.
Хід роботи. Взяти 2 пробірки, в одну налити 0,5 мл розчину сироватки
крові, в другу – 0,5 мл розчину желатину. В кожну пробірку додати по 3–4
краплі 10 % розчину NaOH та 1–2 краплі 1 % розчину CuSO4 і перемішати.
Робота 2. Нингідринова реакція
Зумовлена присутністю вільної а-аміногрупи у всіх білках, пептидах та
а-амінокислотах. При нагріванні з нингідрином ці речовини окислюються з
утворенням СО2, NH3 і відповідних альдегідів. Нингідрин при цьому
відновлюється і конденсується з NH3 і надлишком гідратованої кетоформи,
утворюючи комплекс синьо-фіолетового кольору.
Хід роботи. В 2 пробірки внести по 0,5 мл сироватки крові або
желатину, додати по 5 крапель 0,5 % розчину нингідрину, перемішати і
нагріти до кипіння.
Робота 3. Ксантопротеїнова реакція
Зумовлена наявність у більшості білків ароматичних амінокислот, які
при нагріванні з азотною кислотою зазнають нітрування. Утворені
нітропохідні амінокислот пофарбовані в жовтий, а в лужному середовищі – в
оранжевий колір.
Хід роботи. В 2 пробірки внести по 0,5 мл сироватки крові або
желатину. Додати по 0,5 мл концентрованої HNO3 і обережно (!) нагріти. У
випадку появи жовтого забарвлення охолодити суміш і додати 30 % розчин
NaOH по краплях до появи оранжевого забарвлення.
Робота 4. Реакція Адамкевича на триптофан
 Триптофан в кислому середовищі взаємодіє з альдегідами, даючи
пофарбовані продукти конденсації. Льодова оцтова кислота може служить як
джерело гліоксилової кислоти, необхідної для цієї реакції.
Хід роботи. В 2 пробірки внести по 0,5 мл сироватки крові або
желатину. Додати в кожну по 0,5 мл концентрованої оцтової кислоти, злегка
нагріти. Після охолодження по стінці підшарувати 1 мл концентрованої
H2SO4 до появи червоно-фіолетового кільця.
Робота 5. Реакція Ерліха на гістидин
При змішування розчинів 1 (сульфанілова кислота в HCl) та 2 (NaNO 2у
воді) один з одним і з аміаком утворюється діазобензолсульфонова кислота,
яка дає оранжеве забарвлення з гістидином.
Хід роботи. В 2 пробірки внести по 0,5 мл си рогатки крові або
желатину. Додати по 0,5 мл реактиву 1, по 1–2 краплі реактиву 2 та NH 4OH
або (NaOH) до лужної реакції.
Робота 6. Реакція Сакагучі на аргінін
В присутності лугу гуанідонове угрупування аргініну окислюється
гіпобромітом або гіпохлоридом. Далі окислений аргінін, об’єднавшись з а-
нафтолом, дає продукт, забарвлений в червоний колір.
Хід роботи. Внести в 2 пробірки по 0,5 мл сироватки крові або
желатину, додати по 0,5 мл 10 % розчину NaOH, по 5 крапель 0,1 % розчину
а-нафтолу в спирті і по 1 – 5 крапель розчину гіпоброміту.
Робота 7. Реакція Фоля на сірковміщуючі амінокислоти
Цистин, цистеїн, метіонін при нагріванні з концентрованими
розчинами лугів руйнуються з утворенням сульфідів. при додаванні ацетату
свинцю утворюється сірчаний свинець (сульфід свинцю), який випадає в осад
чорного кольору.
Особливо багаті на цистеїн фібрілярні білки, що входять до складу
волосся і нігтів.
Хід роботи. Взяти 3 пробірки: в одну внести 5 крапель сироватки крові,
в другу – 5 крапель желатину, в третю – налити 0,5 мл води і опустити
шматочок нігтя або волосся. Додати в кожну по 10 крапель 30 % розчину
NaOH і по 1 краплі 5 % розчину (CH 3COO)2Pb. Нагріту до кипіння і
кип’ятити 1–2 хвилин.

ВИСНОВОК:

Сироватка крові містить більше амінокислот з вільною α-аміно-групою

(позитивний результат у реакції Нінгідринова), що свідчить про наявність більше
глобулярних білків. Желатин показав відсутність більшості реакцій, крім реакції
Нінгідринова і Сакагучі, що може свідчити про меншу різноманітність амінокислот
в порівнянні з сироваткою крові.

Біуретова реакція показує наявність пептидних зв'язків, Нінгідринова -

амінокислот з вільними аміно-групами, а Ксантопротеїнова - ароматичних
амінокислот, що може бути важливим для захисту від оксидативного стресу.
Реакції Адамкевича та Ерліха вказують на наявність конкретних амінокислот,
таких як триптофан і гістидин, які можуть мати особливу функцію, таку як каталіз
реакцій. Сакагучі реакція може показати присутність аргініну, що важливо для
біологічних процесів. Фоля реакція вказує на сірковмісні амінокислоти, які важливі
для стабілізації білкової структури. Розуміння цих аспектів може допомогти в
раціональному виборі харчових продуктів для забезпечення необхідної кількості
білків та підтримки здоров'я.
Правильне чергування жорстких пептидних і гнучких ординарних зв’язків у
білковому ланцюзі дозволяє йому укладатися в спіральну структуру, яка
стабілізується зв'язками водню між пептидними групами (вторинна структура).
Якщо молекула білка утворює неперервну спіраль, то цей білок вважається
фібрілярним. Фібрилярні білки, такі як колаген, характеризуються тим, що вони
утворюють довгі волокнисті структури. Вони мають дуже специфічну структуру, що
дозволяє їм виконувати свої структурні функції. Витягнуті радикали відкриті по
довжині білка і можуть взаємодіяти з водою. Це обмежує їхній амінокислотний
склад, щоб вони могли ефективно утворювати свої структури. Фібрилярні білки
важливі для структурних компонентів тканин, таких як шкіра, хрящі, кістки та інші.
Аморфні, неспіралізовані ділянки в молекулі можуть призвести до подальшого
згортання поліпептидного ланцюга в просторі за рахунок взаємодії
амінокислотних радикалів (третинна структура). Такі білки відносяться до
глобулярних. Характер взаємодії між амінокислотними радикалами залежить від
їх хімічної природи і може бути водневим, електростатичним, Ван-дер-Ваальсовим,
гідрофобним або ковалентним зв'язком.

У результаті поліпептидний ланцюг згортається у складну, але добре визначену

просторову структуру. Міжмолекулярні взаємодії між окремими поліпептидними
ланцюгами можуть призводити до утворення олігомерів з четвертинною
структурою відповідно до умов стабільності. Роз'єднання таких білків на
субодиниці відбувається без втрати їхніх властивостей.

Осадження білків

В даній лабораторній роботі досліджується дія декількох груп

осаджувачів білків.
Робота 1. Осадження білків мінеральними кислотами
В 3 пробірки внести по 0,5 мл розчину білка (сироватки крові або
яєчного білка, розведеного водою у співвідношенні 1 : 20) і додати по 1–2
краплі наступних концентрованих розчинів кислот: H2SO4, HCl, HNO3.
Перемішати.
Робота 2. Осадження білка органічними сполуками
В 2 пробірки внести по 0,5 мл розчину білка і додати в одну 0,5 мл
спирту, в другу – стільки ж ацетону. Перемішати.
Робота 3. Осадження білка органічними кислотами
 В 2 пробірки внести по 0,5 мл розчину білка і додати в одну 0,5 мл
10 % розчину трихлороцтової, а в іншу – 0,5 мл сульфосаліцилової кислот.
Перемішати.
Робота 4. Осадження білка
В 2 пробірки внести по 0,5 мл розчину білка і додати по 5 крапель 1 %
розчину оцтової кислоти ( в кислому середовищі взаємодія білка з
алкалоїдними реактивами протікає більш активно). Потім додати в одну 5–7
крапель пікринової кислоти, в другу – 5–7 крапель таніну. Перемішати.
Робота 5. Осадження білка солями важких металів
В 2 пробірки внести по 0,5 мл розчину білка і додати по 1–2 краплі
розчину CuSO4, (CH3COO)2 Pb. Перемішати.Робота 6. Осадження білків
солями лужних, лужноземельних металів і амонію
В пробірку внести п. 0,5 мл розчину білка і додати 0,5 мл насиченого
розчину (NH4)2SO4. Перемішати.
Для перевірки оборотності осадження необхідно додати в пробірку 2
мл дистильованої води для зниження концентрації осаджувача.
Вид осаджувачів Реактив Осад Оборотність
(колір, вид) (+/-)
Мінеральні кислоти H2SO4 білий плотний -
HCl
HNO3
Органічні кислоти Трихлороцтова к-та білий плотний -
Сульфосаліцилова к-та
Алкалоїдні реактиви Пікринова к-та жовтий, -
Танін кремовий
Солі важких металів CuSO4 блакитний, -
(CH3COO)2Pb сіруватий
Органічні Спирт білий легкий +
розчинники Ацетон
Солі лужних, (NH4)2SO4 білий -
лужноземельних
металів і амонію
ВИСНОВОК:

У ході лабораторної роботи було вивчено дію різних осаджувачів на білки, що

присутні у розчинах. За отриманими результатами можна зробити наступні
висновки про характер осадження білків:

Мінеральні кислоти (H2SO4, HCl, HNO3) спричиняють незворотнє осадження білків

у вигляді білого плотного осаду. Це означає, що білки, осаджені мінеральними
кислотами, не можуть бути розчинені або відновлені до первісного стану, що
свідчить про їхню денатурацію.Органічні кислоти (трихлороцтова кислота,
сульфосаліцилова кислота) також спричиняють незворотнє осадження білків у
вигляді білого плотного осаду.Алкалоїдні реактиви (пікринова кислота, танін)
викликають осадження білків у вигляді жовтого або кремового осаду. Осадження
цих білків також є незворотнім.Органічні розчинники (спирт, ацетон) викликають
зворотне осадження білків у вигляді білого легкого осаду.Солі важких металів
(CuSO4, (CH3COO)2Pb) призводять до незворотнього осадження білків у вигляді
блакитного або сіруватого осаду.Солі лужних, лужноземельних металів і амонію
((NH4)2SO4) викликають зворотне осадження білків у вигляді білого осаду за
умови висолювання.

Таким чином, механізм осадження білків може бути різним в залежності від
використаного осаджувача. Деякі осаджувачі можуть призводити до денатурації
білків, що викликає незворотнє осадження, тоді як інші можуть викликати
зворотне осадження шляхом зміни умов експерименту, наприклад, шляхом
висолювання. Знання про такі механізми осадження допомагає в розумінні
поведінки білків у різних умовах та може мати практичне значення в біологічних
дослідженнях