CYTOFIZJOLOGIA

BEZ SPÓJNIKÓW

Na podstawie książki „Seminaria z cytofizjologii” Jerzego Kawiaka

i Macieja Zabla oraz notatek z zajęć
 BŁONY BIOLOGICZNE I TRANSPORT PRZEZ BŁONY

• Funkcje błon komórkowych:

◦ Wykorzystanie procesów wewnątrz komórki do wytwarzania energii
i jej gromadzenia.
◦ Tworzenie magazynów jonów i innych substancji.
◦ Transport cząsteczek w określonych kierunkach wewnątrz komórki.
• W błonach komórkowych na jedną cząstkę białka przypada kilkadziesiąt
cząstek lipidów (oparte na rdzeniu z glicerolu – glicerofosfolipidy,
zawierają sfingozynę, sfingolipidy i sterole).
• Lipidy są amfipatyczne (hydrofobowy ogon i hydrofilna głowa). Część
hydrofilna cholesterolu to grupa -OH, a dla glikosfingolipidów to 20-30
reszt cukrowcowych.
• Podczas formowania dwuwarstwy w wodzie jej elementy są
stabilizowane wiązaniami wodorowymi i siłami van der Waalsa, warstwa
lipidów od strony środowiska jest określana jako E (exoplasmic),
a od strony cytoplazmy P (protoplasmic).
• Błony są płynne, wyróżnia się ruchy:
◦ W obrębie tej samej cząsteczki – wokół wiązania -H2C-CH2-.
◦ Całych cząstek:
▪ rotacyjne (dyfuzja rotacyjna)
▪ lateralne (na boki, dyfuzja lateralna)
▪ międzywarstwowe (flip-flop).
• Szybkość zależy od wielkości części hydrofilnej i waha się:
◦ Od μsek i msek dla cholesterolu, diacyloglicerolu i ceramidu.
◦ Godzin dla fosfolipidów.
◦ Do wielu dni dla glikosfingolipidów.
• Wpływ ma także temperatura lipidów. W odpowiednio wysokiej
temperaturze lipidy wykonują wszystkie wymienione ruchy a błona jest
w stanie ciekłym nieuporządkowanym ld (liquid distorted), obniżenie
temperatury spowoduje że fragmenty lipidów nie będą miały energii na
obrót wokół wiązania -H2C-CH2-, łańcuchy glicerofosfolipidów
i fosfolipidów będą nieruchome i ściśle upakowane. Znikają wszystkie
pozostałe formy ruchu, a błona jest w stanie stałym uporządkowanym
so (solid ordered). W stanie ld jest 1000 razy bardziej płynna niż so.
• Łańcuchy węglowe kwasów tłuszczowych mają zwykle 14-24 atomów
węgla. Długołańcuchowe nasycone reszty kwasów tłuszczowych
zmniejszają płynność błony, nienasycone, krótkie mają odwrotny wpływ.

1
 • Cholesterol zmniejsza płynność, ale utrudnia upakowanie długich reszt
formując fragmenty znajdujące się w stanie płynnym uporządkowanym
lo (liquid ordered). Domeny te bogate w sfingolipidy i cholesterol
unoszą się w błonie niczym tratwy.
• Na szybkość i charakter ruchów białek i lipidów ma wpływ cytoszkielet,
ogranicza on ruch i sprzyja powstawaniu domen.

Asymetria błon komórkowych

• Asymetria międzywarstwowa to niejednakowy rozkład lipidów
w warstwach E i P.
Lipidy % całkowity % w warstwie E % w warstwie P
Cholesterol 23 50 50
Fosfatydyloinozytol 1 - 100
Fosfatydyloetanoloamina 18 20 80
Fosfatydylocholina 17 80 20
Fosfatydyloseryna 7 - 100
Sfingomielina 18 90 10
Glikolipdy 3 100 -
• Pierwszym powodem jest działanie białek:
Flopaza Białka P, oporności wielolekowej. Transportują z P do E (mało
swoisty, wymaga energii).
Flipaza (flipaza aminofosfolipidów lub translokaza aminofosfolipidów)
transportuje specyficznie fosfatydyloetanoloaminę
i fosfatydyloserynę z E do P. Wymaga energii.
Skramblaza Białko mieszające lipidy obu warstw, nie wymaga energii, jest
aktywowana wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+
oraz procesem apoptozy.
• Drugim powodem jest lokalizacja glikosfingolipidów podczas ich
syntezy w aparacie Golgiego. Ich hydrofilne reszty cukrowcowe
utrudniają transport na stronę P, a podczas fuzji z błoną wnętrze
pęcherzyków transportowych tworzy zewnętrzną jej warstwę.
• Asymetria lateralna to występowanie różnorodnych domen błonowych.

2
Domeny błonowe
• Fragment różniący się właściwościami. Czynnikami domenotwórczymi
są ograniczenia swobody ruchu lipidów np.:
◦ Połączenia zamykające dzielące błonę na warstwę apikalną
i bazolateralną (duże, kilka μm domeny istniejące przez całe życie
komórki).
◦ Miejsca adhezji między komórką, a macierzą międzykomórkową.
◦ Miejsca oddziaływania z cytoszkieletem.
• Powstają też przez oddziaływanie między swoistymi białkami i lipidami
(kaweolina, kawina) dając kaweole, oraz w miejscu oddziaływań między
lipidami prowadzącymi do powstania nanotratw (wielkość <10 nm, czas
trwania <0,1 ms).
• Ważną funkcją mikrodomen błonowych jest przekazywanie sygnałów.

Biosynteza lipidów błonowych

• Glicerofosfolipidy i fosfosfingolipidy nazywa się wspólnie fosfolipidami.
Ich wspólną strukturą jest kwas fosfatydowy (rdzeń z glicerolu, dwie
grupy -OH estryfikowane resztami kwasów tłuszczowych, a trzecia
ortofosforowym).
• Biosynteza glicerofosfolipidów:
1. Reakcja cytydynotrifosforanu (CTP) z kwasem fosfatydowym→
CDP-diacyloglicerol.
2. CDP-diacyloglicerol może reagować z seryną→ fosfatydyloseryna,
lub z inozytolem→ fosfatydyloinozytol.
• Fosfatydydyloetanolamina i fosfatydylocholina powstają w wyniku
modyfikacji fosfatydyloseryny lub jako produkt przeniesienia reszt
etanoloaminy, CDP-etanoloaminy lub CDP-choliny na diacyloglicerol.
Miejscem ich syntezy jest warstwa P ER, skąd przenoszone są przez
nieswoiste flopazy do E.
• Biosynteza sfingolipidów zaczyna się w warstwie P ER syntezą
ceramidu (acylowana kwasem tłuszczowym sfingozyna), jest on
transportowany jako składnik pęcherzyków błonowych, a także przez
białko transportujące ceramid CERT. W warstwie P aparatu Golgiego
może ulec glikozylacji, albo przedostać się na zasadzie flip-flop do
warstwy E gdzie staje się substratem syntaz sfingomieliny. Syntazy
sfingomieliny przenoszą resztę fosfatydylocholiny na ceramid i tworzą
diacyloglicerol i sfingomielinę.
• Synteza własnego cholesterolu rozpoczyna się od kondensacji dwóch
cząsteczek acetylo-CoA. W syntezę jest zaangażowane 12 białek
enzymatycznych, proces kontrolują czynniki transkrypcyjne SREBP,
wiążące się z nimi białka SCAP i białka Inisgs. Synteza odbywa się ER.

3
 • Egzogenny cholesterol jest pobierany ze środowiska związany z LDL
w procesie zależnej od receptora endocytozy. Komórki mogą także
pobierać sfingolipidy i glicerosfingolipidy.
• Lipidy błonowe są transportowane wewnątrz jako:
◦ Składniki pęcherzyków (transport pęcherzykowy).
◦ Związane z białkami przenoszącymi lipidy przez cytoplazmę.
◦ Przez miejsca kontaktu błonowego (występują najczęściej między
błonami ER oddalonymi od nich o 30 nm błonami mitochondriów
lub aparatu Golgiego) następuje przeniesienie lipidów z błony do
błony. W tym procesie są zaangażowane białka.

Glikosfingolipidy
• Glikolipidy warstwy E, oddzielają komórkę od otoczenia, stabilizują
błonę komórkową, są receptorami niektórych hormonów i toksyn
bakteryjnych, w błonie erytrocytów określają grupy A, B i H.
• Antygeny A, B i H są obecne na powierzchni komórek z wyjątkiem
neuronów, a w osoczu obecne są przeciwciała przeciw nim.
• Biosynteza:
1. Przeniesienie cząsteczki glukozy na ceramid po stronie P aparatu
Golgiego.
2. Powstały glukozyloceramid jest przemieszczany do ER
i z powrotem do warstwy E aparatu, gdzie znajdują się
glikozylotransferazy.
3. Wydłużają one łańcuch cukrowcowy, tworząc bardziej złożony
glikosfingolipid.
4. Glikosfingolipdy wędrują wraz z innymi elementami błony w formie
pęcherzyków do błony plazmatycznej z którą się zlewają.
• Innym źródłem jest środowisko otaczające komórki (zwykle pobierają
bardzo mało z wyjątkiem nowotworów np.: czerniaka).

Fosfolipazy
A1 Odcina resztę kwasu tłuszczowego z pierwszej pozycji.
A2 Odcina resztę kwasu tłuszczowego z drugiej pozycji (np. z kwasu
arachidonowego C20 powstają eikozanoidy).
B Odcina reszty kwasu tłuszczowego z pozycji pierwszej i drugiej.
C Hydroliza wiązania pomiędzy resztą kwasu ortofosforowego
a glicerolem, uwalniając diacylglycerol (DAG).
D Katalizuje hydrolizę wiązania pomiędzy resztą kwasu ortofosforowego
a podstawnikiem z pozycji trzeciej uwalniając kwas fosfatydowy.

4
 • Kwas arachidonowy może być przekształcony w:
◦ Prostaglandyny – przez cyklooksygenazę (COX), następuje
hydroperoksydacja na C11 i cyklizacja łańcucha. Istnieją dwie
formy COX – 1 (konstytutywna, chronią błonę wyściełającą
żołądek, skurcze mięśni gładkich i macicy), 2 (indukowana – stany
zapalne, przyczynia się do powstawania obrzęków, bólu i gorączki).
Jej inhibitorem są niesterydowe leki przeciwzapalne np. aspiryna.
◦ Leukotrieny – przez 5-lipoksygenazę, następuje karboksylacja. Są
mediatorami stanu zapalnego w reakcjach alergicznych. Leki
antyleukotrienowe są stosowane w leczeniu chorób alergicznych
i astmy.
▪ LTB4 – reguluje funkcję neutro- i eozynofilii.
▪ LTC4, LTD4 – powoduje kurczenie mięśni dróg oddechowych
i przewodu pokarmowego, zwiększa przepuszczalność naczyń
włosowatych.
▪ LTE4 – pobudza skurcz mięśni oskrzeli i jelit.
• Eikozanoidy o dużym znaczeniu w układzie krążenia:
◦ Tromboksan (TX2A) – powoduje agregację płytek i skurcz naczyń.
◦ Prostacyklina – hamuje agregację płytek, działa rozkurczowo na
naczynia, obniża ciśnienie.

Cechy dwuwarstwy
• Jest odkształcalna, elastyczna, przepuszczalna dla małych cząstek (H2O,
CO2), nieprzepuszczalna dla jonów i dużych cząstek (nukleotydy,
peptydy). W zależności od temperatury będzie występować w stanie ld
lub so.
• Umożliwia wybiórczy transport substancji.

Białka błonowe
• Ze względu na sposób związania dzieli się je na integralne
i powierzchowne.

Białka integralne
• Zazwyczaj tworzą kompleksy z białkami powierzchniowymi spełniające
określone funkcje.
• Występują po obu stronach błony, niektóre przebijają dwuwarstwę
wielokrotnie. Bezpośrednio wiążą się z hydrofobowym wnętrzem
dwuwarstwy i nie można ich wyizolować bez naruszenia struktury
(stosuje się detergenty i rozpuszczalniki organiczne).
• Dzieli się je na:
◦ Politopowe (transbłonowe) – przechodzące przez błonę.
◦ Monotopowe – zanurzone w jednej warstwie.
5
Białka powierzchowne
• Są związane z błoną wiązaniami jonowymi (często Ca2+), wodorowymi
i oddziaływaniami hydrofobowymi, a także przez fragmenty lipidowe
budujące błonę (białka związane przez resztę
glikozylofosfatydyloinozytolu – warstwa E, palmitynowego,
mirystynowego, fragmentu izoprenowego, cholesterolu – warstwa P).
• W procesie przekazywania informacji przez błonę lipidy warstwy P
mogą tworzyć fragmenty wiążące określone białka cytoplazmatyczne
stające się przejściowo białkami powierzchniowymi błony.
• Można je uwolnić z błon środkami chelatującymi i wysokimi
stężeniami soli.

Wbudowywanie białek do błon w procesie kotranslacji

• Początkowy odcinek N-końca łańcucha polipeptydowego syntezowany
na rybosomie składa się z około 20 reszt aminokwasów, jest
hydrofobowy i nazywany sygnałowym, po związaniu w cytoplazmie
nukleoproteiny SRP może wnikać do dwuwarstwy lipidowej błony,
gdzie zostaje otoczony receptorami tworzącymi kanał w dwuwarstwie.
Przez niego mogą przesuwać dalsze odcinki łańcucha (także hydrofilne
domeny). Wynika z tego że translacja zachodzi równocześnie
z translokacją – kotranslacja.
• Odcinek sygnałowy zostaje potem odcięty przez proteazę. Kotranslacja
kończy się syntezą drugiej domeny hydrofobowej służącej do
zakotwiczenia łańcucha w błonie (takich domen może być kilka).

Wbudowywanie białek przez fałdowanie łańcucha polipeptydowego

• Hipoteza zakłada że białka przeznaczone do wbudowania w błonę
w kontakcie z dwuwarstwą przyjmują konformację umożliwiającą
translokację (np.: oksydaza cytochromowa, dehydrogenaza 3-fosforanu
glicerolu, cytochrom b5, transferaza galaktozylowa). Wymienione białka
są dobrze rozpuszczalne w wodzie bez detergentu i mogą spontanicznie
wbudowywać się w błony – fałdowanie łańcuchów zależne od błony.
• Są dowody potwierdzające obie hipotezy
◦ Glikforyna i białka antygenów zgodności tkankowej mają N-koniec
na powierzchni komórki co świadczy o kotranslacji.
◦ Inne białka na powierzchni mają C-koniec – przemieszczenie przez
fałdowanie.

Białka z kotwiczką lipidową (GPI)

• Białka GPI (GPIAP) – wiążą się z warstwą E błony plazmatycznej przez
resztę glikozylofosfatydyloinozytolową (GPI). GPI jest syntezowany
w ER.

6
 • Początkowo białka te są syntezowane w ER jako transbłonowe, następnie
w ER przy C-końcu następuje połączenie z resztą GPI w reakcjach
katalizowanych przez kompleks trans-amidazowy (proteoliza
C-końcowego sygnałowego fragmentu białka i synteza wiązania
amidowego pomiędzy cz. białka a resztą GPI). W ER białka są sortowane
i przenoszone do aparatu Golgiego w pęcherzykach COPII.
• W aparacie Golgiego reszta lipidowa białek GPI ulega modyfikacji –
zastąpienie reszt nienasyconych długołańcuchowymi resztami
nasyconymi.
• W aparacie Golgiego białka GPI są sortowane i przenoszone jako tratwy
transportem pęcherzykowym do warstwy apikalnej komórek nabłonka.
Sortowanie do warstwy apikalnej może być związane z ich
N-glikozylacją i aktywnością gelatyny 3.
• Są one zaangażowane w przekazywanie sygnałów przez błonę,
sortowanie białek i tworzenie mikrodomen błon komórkowych.
• Ich usunięcie prowadzi do śmierci w życiu płodowym. Brak w błonie
erytrocytów białek CD55 i CD59 prowadzi do napadowej nocnej
hemoglobinurii.

Acylacja białek
• Potranslacyjna modyfikacja polegająca na kowalencyjnym przyłączeniu
do białka cząsteczki kwasu tłuszczowego zazwyczaj:
◦ 14-węglowego kwasu mirystynowego (mirystylacja) – katalizowana
przez N-mirystoilotransferazę (przenosi resztę kwasu
mirystynowego z mirystylo-CoA na końcową grupę NH2 białka
z utworzeniem wiązania amidowego, które jest trwałe, nie ulega
hydrolizie i zwiększa hydrofobowość cząsteczki, ale nie wystarcza
by związało się z błoną (potrzebna druga reszta np.: kwasu
palmitynowego).
◦ 16-węglowego kwasu palmitynowego (palmitylacja) – przeniesienie
kwasu palmitynowego z palmityno-CoA na grupę sulfhydrylową
reszty cysteiny z wytworzeniem wiązania tioestrowego. Jest
katalizowana przez palmitoilotransferazy za których syntezę
odpowiada 25 genów. Enzymy te są białkami transbłonowymi, różne
ich izoformy występują w różnych organellach. Jest odwracalną
metodą modyfikacji, usuwanie reszt katalizują tioestrazy.
Odwracalna palmitylacja np.: H-Ras i N-Ras decyduje o ich
wymianie między aparatem Golgiego a warstwą P błony
plazmatycznej. Sprzyja ona występowaniu acylowanych białek we
frakcji tratw lipidowych.

7
Prenylacja białek
• Potranslacyjna metoda obróbki polegająca na przyłączeniu
hydrofobowego izoprenowego fragmentu do grup sulfhydrylowych
reszt cysteiny w C-końcu białka z utworzeniem wiązania tioeterowego.
• Reakcje syntezują 3 znajdujące się w cytoplazmie transferazy
prenylowe.
Farnezylo- Przenosi 15-węglowy element farnezylu z difosfofarnezylu
transferaza (FT) na resztę cysteiny fragmentu białka C-a1-a2-X (C-reszta
cysteiny, a1-2 alifatyczne reszty aminokwasowe, X reszta
aminokwasowa od której zależy czy białko ulegnie
farnezylacji czy geranylogeranylacji
w reakcji katalizowanej przez geranylogeranylotransferazę I
(GGT-I)).
Geranylogera- Przenosi zwykle dwie cząsteczki genarylogenarylu na
nylotransferaza resztę cysteiny na C końcowym fragmencie białek Rab.
II (GGT-II, GGT-II nie rozpoznaje bezpośrednio białek Rab, a w reakcji
GGT-Rab) prenylacji zaangażowane jest biało REP (rab escort protein).
Są dwa modele współdziałania białek Rab, REP i GGT-II.
1. Nowo syntezowane białko Rab wiąże się z REP
i kompleks jest rozpoznawany przez transferazę GGT-II
związaną z difosforanem geranylogeranylu, po prenylacji
transferaza odłącza się, a REP pozostaje związane z Rab
z przyłączoną resztą geranylogeranylową.
2. REP tworzy kompleks z transferazą GGT-II związaną
z difosforanem geranylogeranylu, rozpoznający, wiążący
i prenylujący białko Rab. Następnie kompleks uwalnia
GGT-II, a reszta jak wyżej.
• Prenylowane białka wiążą się z warstwą P ER, gdzie swoista proteaza
odcina fragment -a1-a2-X odsłaniając grupę karboksylową cysteiny
ulegającą enzymatycznej metylacji. Mogą one w transporcie
pęcherzykowym lub pośrednio przez aparat Golgiego (może tam zajść
dodatkowa palmitylacja) trafić do błony.
• Prenylacja jest nieodwracalna. Ok 2% proteonu ssaków jest
prenylowane. Prenylacja jest niezbędna do aktywności białek Ras,
Rho/Rac i Rab.
• Białka Ras przekazują sygnały z receptorów błony plazmatycznej do
jądra warunkując wzrost i różnicowanie. Łatwo ulegają mutacji.

8
Błona erytrocytu i szkielet błony
• Szkieletem błony nazywamy białka leżące pod błoną połączone
z białkami integralnymi.
• Głównymi białkami są białka integralne.
◦ Glikoforyna zbudowana jest z 131 aminokwasów, a w dwuwarstwie
lipidowej mocuje ją jeden odcinek α-helisy utworzonej przez 23
aminokwasy. Jej część powierzchniowa ma liczne reszty
cukrowcowe stanowiące połowę jej masy.
◦ Białko 3 prążka to kanał dla anionów (HCO3-, Cl-). Dwie cząsteczki
(dimer) tworzą kanał, Jest ono większe od glikoforyny
i zakotwiczone w błonie 14 odcinkami α-helis, N- i C-koniec
łańcucha wypadają na powierzchni cytoplazmatycznej. Jest ono
glikoproteiną, a jej łańcuchy cukrowcowe są głównym nośnikiem
układu ABH (struktury antygenowe identyczne jak
w glikosfingolipidach).

Białka powierzchniowe związane z białkami integralnymi

• Największy udział ma spektryna, występująca w błonie jako tetramer
utworzony przez łańcuchy 220 i 240 kD. Spektryny tworzą dimery i
mają długość 100 nm, biegną równolegle do powierzchni błony tworząc
sieć. Jest ona w regularnych odstępach przymocowana do prążka 3 za
pomocą ankiryny. W regularnych odstępach przyłączają się do niej
białko prążka 4.1 (połączone z glikoforyną) i F-aktyna.
• U ludzi z defektem genetycznym zła budowa spektryny powoduje
zmianę kształtu erytrocytu (pojkilocytoza), często są eliptyczne
(eliptocytoza) i łatwo ulegają hemolizie.
• Wiele komórek neurony, limfocyty mają w warstwie korowej fodryny –
odpowiednik spektryn.

Białko integralne leukocytów – CD45

• Inaczej określane GP180, T200 lub wspólny antygen leukocytów. Jest
zamocowane jednym odcinkiem α-helisy, a odcinek powierzchowny ma
liczne grupy cukrowcowe. Różna długość powierzchniowego odcinka
jest przyczyną występowania izoform białka.
• Jest ono białkową fosfatazą tyrozynową, miejsce aktywne znajduje się
w ewolucyjnie konserwatywnej domenie cytoplazmatycznej, jest tam
także obecne miejsce wiązania fodryny, z którą tworzy szkielet
uzupełniony mikrofilamentami aktynowymi. Taki kompleks zwiększa
aktywność enzymu i przekazuje niektóre sygnały aktywacji leukocytów.
• Jego ekspresja jest niższa w komórkach chłoniaków (wykorzystuje się to
do odróżnienia chorych komórek metodą cytometrii przepływowej).

9
Glikokaliks
• Warstwa oligosacharydów związana z glikolipidami i białkami
integralnymi.
• Chroni on komórkę i uczestniczy w oddziaływaniu między komórkami
(np.: leukocyty z komórkami śródbłonka). Interakcja rozpoczyna się od
adhezji komórek do śródbłonka, na którego powierzchni znajdują się
selektyny (E i P) które wiążą swoiste oligosacharydy i leukocyty zostają
zatrzymane. Selektyny L leukocytów z kolei oddziałują
z oligosacharydymi śródbłonka.

Transport przez błony biologiczne

• Białka i kwasy nukleinowe w komórce mają sumaryczny ładunek
ujemny (zależy of grup fosforanowych i karboksylowych), w komórce
znajdują się także aniony CHO3- i Cl- i fosforanowe.
Wewnątrzkomórkowy ładunek jest równoważony jonami K+, które
przenikają bezpośrednio przez dwuwarstwę. Jednak utrzymanie
równowagi jonowej jest ważne dla życia komórki.
• Przez błonę komórkową mogą przenikać selektywnie cząsteczki
niezjonizowane (np.: glukoza).

Transport prosty
• Nie wymaga nośników i obejmuje małe cząstki np.: woda (może być
ułatwiony akwaporynami), mocznik, etanol, CO2, O2 i NO. Podobnie
dyfundują substancje rozpuszczalne w lipidach.
• Białka błonowe nie biorą w nim udziału.

Transport ułatwiony z białkami przekaźnikowymi

• Służy do przenoszenia aminokwasów, cukrów, nukleozydów i jonów, nie
wymaga on nakładu energii z zewnątrz.
• Cząsteczki przenikają przez błonę zgodnie z gradientem stężenia, a jony
z potencjałem elektrycznym.
• Wyróżnia się dwie grupy białek biorących udział w dyfuzji ułatwionej:
Białka Wiążą swoiście określone cząsteczki, następnie zmieniają
przenośnikowe konformację i przenoszą cząsteczkę na przeciwną stronę błony.
Białka Tworzą w dwuwarstwie pory umożliwiające wolną dyfuzję
tworzące cząsteczek o odpowiednich gabarytach i ładunku. Część z nich
kanały może być zamknięta i otwierana zmianą potencjału lub
ligandem.

10
Przykład transportu ułatwionego
• Kinetykę transportu można prześledzić na przykładzie L-Leu
wnikającej do komórek raka wysiękowego Ehrlicha. Zależy on od
różnicy stężeń po obu stronach błony komórkowej i jest zgodny
z gradientem.
• Stężenie L-Leu w komórce jest niskie (aminokwas jest włączany
w procesie metabolicznym).
• Zwiększenie stężenia w otoczeniu powoduje wzrost szybkości transportu
(mmol/min). Nie jest to zależność prostoliniowa, lecz krzywa wysycenia.
Maksymalna szybkość nie może przekroczyć stanu gdy wszystkie
przenośniki są aktywne (Vmax). Vmax wyznacza się kreśląc prostą
Lineavera-Burka. Można z niej odczytać stałą Km określającą
powinowactwo przenośnika do L-Leu. Ten transport jest stereoswoisty
(nasilony dla L-Leu, słaby dla D-Leu).

Transport glukozy
• Są dwa rodzaje białek transportujących glukozę przez błonę komórkową:
◦ GLUT – wysycalny, stereoswoisty i dwukierunkowy.
◦ SGLT1 – jelitowy kotransporter 2Na+/glukoza, wykorzystuje
gradient do aktywnego transportu glukozy i galaktozy w jelicie
i reabsorbcji glukozy w nefronie.
• Większość komórek ma w błonie białko integralne z rodziny GLUT
transportujące D-glukozę. Jej stężenie w osoczu (0,1g/100ml) jest
wyższe niż wewnątrz komórki (wewnątrz jest natychmiast
fosforylowana). Transport glukozy może się odbywać w stronę
przeciwną (np.: z hepatocytów do osocza podczas głodzenia).
GLUT1 Znajduje się on w błonie erytrocytu, który całą energię czerpie
z glikolizy. Ma masę 55kD i jeden łańcuch N-oligosacharydowy od
strony środowiska mocowany w dwuwarstwie 12 α-helisami. Każda
składa się z 21 aminokwasów, które układają się hydrofobowymi
resztami do warstwy lipidowej tworząc 7 wewnętrznych domen
przenośnika, a 5 domen hydrofilnych domen tworzy kanał do
wiązania glukozy.
GLUT4 Jedno z białek biorących udział w transporcie heksoz zależnym od
insuliny. W komórkach mięśniowych i tłuszczowych pod jej
wpływem następuje szybkie przemieszczanie GLUT4 z endosomów
do błony komórkowej, 30-40 krotne zwiększenie ich liczby powoduje
gwałtowne przyspieszenie transportu. W komórkach tłuszczowych
skutkuje ono dodatkowo zwiększeniem powinowactwa do
przenośników glukozy indukowane insuliną.

11
GLUT2 Znajduje się w nerkach i wątrobie. Transport podstawowy.
GLUT3 Znajduje się w większości tkanek. Główny transport w neuronach.
Transport podstawowy.
GLUT5 Jelito cienkie, jądra. Transportuje fruktozę.
• W komórkach kanalików nerkowych proksymalnych przenośnik glukozy
jest usytuowany w boczno-podstawnej powierzchni, bierze on udział
w transporcie zwrotnym z moczu pierwotnego do krwi.
• W komórkach nowotworowych jest większa liczba transporterów GLUT.
• W cukrzycy I typu (wieku młodzieńczego) brak wydzielania insuliny
przez komórki β wysp prowadzi do większego stężenia glukozy
w osoczu i skutkuje to cukromoczem. W starszym wieku może pojawić
się cukrzyca II (oporna na insulinę), prowadzi ona do zmniejszenia
przemieszczenia GLUT4 na powierzchnię komórki lub mniejszą
aktywację przenośnika.

Transport adenozyny i deoksyadenozyny

• Nukleozydy deoksypuryn wnikają do komórki przez układ transportujący
przez który trafia do komórki także 2-chlorodeoksyadenozyna
(2CdA, kaldribina) stosowana w leczeniu białaczek. W komórce
nukleozydy są stosowane do syntezy DNA po fosforylacji do
5'-monofosforanu, a następnie trifosforanu z udziałem kinazy
deoksycytydyny (dCK). Wbudowana do komórek nowotworowych
kladribina uruchamia mechanizmy reparacji DNA, która nie jest możliwa
i kończy się apoptozą.
• Nukleozydy puryn mają białka wspomagające transport ułatwiony,
poznane na podstawie Trypanosoma brucei. Białko ma 10 α-helis
zakotwiczających je w błonie. Poznano 2 podobne transportery:
◦ P1 – przenosi adenozynę i inozynę do komórki.
◦ P2 – przenosi adenozynę, adeninę, dipirydamol i tlenek melarsenu
(wykorzystywany w leczeniu zakażeń Trypanosoma, blokujący
transport adenozyny).

Białka tworzące kanały jonowe

• Występują jako otwarte pory w dwuwarstwie lipidowej przez które
przenikają jony o odpowiedniej wielkości i ładunku. Białka tworzące
kanały jonowe należą do jednej rodziny.
Kanał Na+ Buduje go jeden łańcuch polipeptydowy z 4 powtarzającymi się
domenami (każda jest podobna do podjednostki kanału K+).
Kanał Ca2+ Podobny do kanału Na+.

12
Kanał K+ Utworzony przez cztery zasocjowane identyczne łańcuchy
białkowe. Każdy z nich jest zamocowany w błonie 6 α-helisami,
a od strony cytoplazmy mają N- i C-koniec. Transbłonowa α-helisa
oznaczona jako 4 zawiera dodatnio naładowane reszty
aminokwasowe tworzące czujnik otwierający kanał.

Transport aktywny
• Transport przeciw gradientowi stężeń. Wyróżnia się 3 mechanizmy
◦ Translokacja grupowa obserwowana u niektórych bakterii.
◦ Transport aktywny pierwotny (dochodzi w nim do utworzenia
nowych wiązań kowalencyjnych w białku przenośnika). Energia jest
zużywana do zmiany konformacyjnej białka przenośnika.
◦ Transport aktywny wtórny – jest w nim aktywnie transportowany
substrat pierwszy – Na+, który tworzy gradient potencjału
elektrochemicznego warunkujący transport innego substratu.
• Swoisty transport jednego rodzaju cząstek nazywa się uniportem,
czasem transport cząsteczek jest od siebie uzależniony (kotransprort)
i odbywa się w tym samym kierunku (symport) albo w przeciwnych
(antyport).
• Wymiennik jonowy – układ w którym wymieniane są jony przez błonę
z udziałem białka błonowego (np.: Na+/H+, co reguluje pH wewnątrz
komórki). W sarkolemie mięśnia sercowego znajduje się wymiennik
3Na+/Ca2+, transport 3 ładunków do komórki generuje prąd którego
pomiar jest miarą wymiany. W czasie depolaryzacji następuje zmiana
kierunku wymiany, pobudzenie powoduje zwiększenie uwalniania Ca2+
do cytoplazmy aktywuje ich uwalnianie z SER i skurcz.

Transport aktywny pierwotny – pompa Na+/K+

• Stężenie Na+ poza komórka jest 14,5 razy większe niż wewnątrz
(10 mM), wewnątrzkomórkowe stężenie K+ wynosi 140 mM i jest 28
razy większe niż poza komórką.
• Za utrzymanie gradientu stężeń odpowiada pompa sodowa, transport
wiąże się ze zmianą konformacji białka (pompy).
1. Na+ są wiązane w miejscach o dużym powinowactwie od strony
cytoplazmy co aktywuje hydrolizę ATP i fosforylację pompy.
2. Przesuwa to miejsce wiązania jonów ku zewnątrzkomórkowej
stronie błony i zmniejsza powinowactwo dla Na+, a te są uwalnianie.
3. Pojawienie się miejsc wiążących K+, hydroliza grupy fosforanowej
białka i zmiana konformacji (miejsce wiązania K+ trafia do wnętrza
komórki).
4. Zmniejszenie powinowactwa dla K+ i ich uwolnienie.

13
 • Pompa zużywa 25 % zasobów ATP komórki i umożliwia przenoszenie
sygnałów elektrycznych, wtórny transport substancji i utrzymanie
równowagi osmotycznej (jon sodu wiążę więcej cząsteczek wody niż
potasu).
• ATP-aza Na+/K+ jest zbudowana z 3 podjednostek oznaczonych:
α 113 kD, ma sekwencję aminokwasów bardzo podobną u różnych gatunków
(duża zachowawczość ewolucyjna). Znajduje się w niej sekwencja
aminokwasów zawierająca Asp372 ważną dla wiązania Mg2+ ATP. Jest ona
zakotwiczona w dwuwarstwie 10 α-helisami.
β 35 kD, jest zakotwiczona jedną α-helisą (ma 3 mostki dwusiarczkowe na
powierzchni komórki, które są ważne dla aktywności ATP-azy).
δ 10 kD
• Glikozydy nasercowe wiążą się z wszystkimi 3 podjednostkami.

Aktywny transport Ca2+

• Pompa Ca2+, ATP-aza Ca2+ jest strukturalnie podobna do pompy Na+/K+.
Usuwa ona jony z cytoplazmy, ich stężenie (0,1 μm) jest 10000 razy
niższe niż poza komórką.
• Uważa się że w kardiomiocytach pompa Ca2+ wbudowana w sarkolemę
ma większe znaczenie dla skurczu niż ta w SER (ta tylko magazynuje
i jest uzależniona od stężenia Ca2+ w otoczeniu). Otwarcie kanałów
w błonach sarkoplazmatycznych (receptorów rianodynowych) powoduje
wzrost stężenia w cytoplazmie i skurcz. W spoczynku stężenie wynosi
0,1 μM, podczas pobudzenia 1 μM.

Aktywny transport H+
• Pompy są strukturalnie odmienne od ww. pomp, transportują H+ do
lizosomów i endosomów co aktywuje zawarte tam proenzymy.
• Inny typ pompy protonowej występuje w wewnętrznej błonie
mitochondriów (protony przemieszczają się zgodnie z gradientem co
prowadzi do produkcji ATP).

Endocytoza
• Pobieranie do komórki substancji otoczonych błoną.
◦ Fagocytoza – pobieranie stałych cząstek (bakterie, komórki
w apoptozie, fragmenty rozpadłych komórek). Bardzo aktywnie
przeprowadzają ją neutrofile i makrofagi. Odbywa się przez
otoczenie wypustkami cząstki zaadsorbowanej na powierzchni
komórki, do powstałej wakuoli dołączają się lizosomy tworząc
fagolizosomy.

14
 ◦ Pinocytoza – pobranie substancji rozpuszczonych w płynie
otaczającym komórkę. Pęcherzyki powstają podobnie jak
w fagocytozie i mają 140-250 nm. W komórkach śródbłonka
i miocytach gładkich obserwuje się transport tranzytowy
(pęcherzyki 65-120 nm przechodzą przez komórkę bez
wykorzystania zawartości).

Kaweole
• Zagłębienia błony komórkowej o średnicy 50-100 nm. Są jedną z form
tratw lipidowych.
• Ich występowanie zależy od kaweolin i kawin oraz zawartości
cholesterolu i sfingolipidów w błonie. Tratwy lipidowe zawierają dużo
cholesterolu i sfingolipidów i stanowią struktury słabo rozpuszczalne
w detergentach. Umożliwia to ich izolowane wraz z zawartymi tam
białkami.
• Wyróżnia się izoformy kaweolin:
◦ Kaweolina 3 – występuje w komórkach mięśni szkieletowych,
sercowych i gładkich.
◦ Kaweolina 1 – występuje głównie w komórkach tłuszczowych,
nabłonka, śródbłonka i fibroblastach.
◦ Kaweolina 2.
• Są one integralnymi białkami wiążącymi cholesterol. Mają kształt spinki
do włosów, C- i N- koniec są skierowane do cytoplazmy. W ich obrębie
można odróżnić hydrofobową domenę kotwiczącą, domenę
oligomeryzacji i domenę stanowiącą rusztowanie.
• Biorą udział w transporcie tranzytowym, utrzymaniu równowagi
cholesterolu i przekazywaniu sygnałów w komórce.
• Zidentyfikowano w nich receptory – białka wiążące białka G, receptory
kinaz tyrozynowych, białka z rodziny kinaz tyrozynowych Src, białka
kaskady Ras MAPK i syntazy NO. Mogą one oddziaływać bezpośrednio
z domeną rusztowania kaweoliny 3 i 1 (często polega to na zatrzymaniu
cząsteczki receptora do momentu dotarcia sygnału lub jego
wzmocnienie). Biorą udział w regulowaniu metabolizmu komórkowego.
• Niektóre receptory pobrane drogą endocytozy (np.: EGF-R) są
depolimeryzowane w lizosomach razem z czynnikiem wzrostowym, inne
(np.: receptor insuliny i LDL) częściowo powracają na powierzchnię
komórki, a inne (np.: α2-makroglobulina) powracają prawie wszystkie.
• Niektóre ligandy (np.: lektyna konkanawalina A wiązana przez D
mannozowe reszty wielocukrów) powodują nasiloną endocytozę,
zawierające lektynę wakuole długo pozostają w komórce co prowadzi do
zablokowania krążenia błon i zwiększa biogenezę w komórce.

15
 • W kaweolach adipocytów znajdują się receptory insuliny, ich
traktowanie insuliną w in vitro powoduje gromadzenie GLUT4 co
sugeruje związek kaweoli z regulacją metabolizmu energetycznego.
Insulina wywołuje odpowiedzi metaboliczne i proliferacyjne. Jej
związanie z receptorem (IR) powoduje fosforylacje receptora który wiążę
i substrat receptora insuliny (IRS), a ten fosforylowany aktywuje kinazę
PI3 powodującą przemieszczenie GLUT4 do błony komórkowej gdzie
jest przytrzymywany kaweoliną-1.

Fuzja błon
• Zachodzi podczas endocytozy, wydzielania, krążenia błon, zapłodnienia,
łączenia mioblastów podczas miogenezy, tworzenia komórek
wielojądrzastych i wnikania do komórek niektórych wirusów.
• Podczas fuzji zachodzi do wymieszania zawartości i integralnych białek
błonowych na drodze dyfuzji.
• Wiele wirusów ma w otoczce białka warunkujące wnikanie do komórki
np.: hemaglutynina (grypa) i białko F (Sendai). Zwierają one
w łańcuchu polipeptydowym peptydy fuzji – domeny z 16-26
aminokwasów hydrofobowych mogące tworzyć α-helisę której
powierzchnia zewnętrzna jest hydrofobowa, a wewnętrzna może wiązać
protony.
• Wirus jest początkowo zatrzymywany na powierzchni by zostać
zendocytowanym. W niskim pH endosomu domeny α-helis wiążą H+
i agregują co prowadzi do fuzji błony endosomu i otoczki wirusa którego
zawartość jest uwalniania do komórki.
• Białka zawierające peptydy fuzji są wykorzystywane do celowego
łączenia się komórek, gdy komórki mają różny genom otrzymuje się
hybrydy mające różne jądra komórkowe – heterokariony. Wykorzystuje
się do badań, oraz umożliwia otrzymanie przeciwciał monoklonalnych
wykorzystywanych do celów diagnostycznych i leczniczych (musi być
ich dużo by wiązały się stale z tym samym epitopem białka).
• Limfocyt B zdolny do wytworzenia przeciwciał dzieli się i jego małe
klony wytwarzają przeciwciała monoklonalne. Chcąc otrzymać duży
klon należy zmienić go w komórkę nowotworową przez jego fuzję ze
szpiczakiem i otrzymać komórkę hybrydoma. Wytwarzającą
immunoglobuliny w dużej ilości (np.: anty-CD20 stosowane w leczeniu
chłoniaków i białaczek B-komórkowych).

Oporność wielolekowa
• MDR – mało swoista oporność na działanie antybiotyków
i cytostatyków, będąca przyczyną niepowodzeń w leczeniu schorzeń
bakteryjnych i nowotworowych warunkowana obecności białek.

16
P-glikoproteina Integralne białko błonowe, fosfoglikoproteina o masie 170 kD.
Działa jak pompa zależna od ATP transportująca toksyny na
zewnątrz. Wiele komórek nowotworowych prezentuje jej
nadmierną ekspresję. W łańcuchu polipeptydowym znajduje
się zespół 6 α-helis przecinających dwuwarstwę,
a w cytoplazmie dwa miejsca wiążące ATP (motyw ABC).
Podstawowa struktura łańcucha polipeptydowego jest
podwojona.
MRP Ma masę 190 kD, tworzą je 3 zespoły po 6 α-helis, jest ono
(multidrug w błonie stosunkowo stabilne, czas połowiczny wynosi 20 h.
resistance duży procent syntezowanego białka jest degradowany już
associated w RER. Te znajdujące się w ER i aparacie Golgiego jest
protein) pewno magazynem. Jego nadekspresja pojawia się szybko
w nowotworach nawet przy niskim stężeniu leku.
• MDR chroni komórkę przed toksycznymi lipofilnymi kationami, ale jest
głównym problemem chemioterapii. W większości przypadków
chemioterapię stosuje się dla przedłużenia życia albo paliatywnie.
• Nowotwory takie jak rak sutka, jajnika, chłoniaki nie-Hodkinga
i białaczki początkowo dobrze odpowiadają na chemioterapię, ale potem
stają się odporne na leki, dlatego prowadzi się badania nad lekami
wybiórczymi.
• Rak niedrobnokomórkowy płuca, jelita grubego, żołądka, nerki, trzustki
od początku są odporne na chemiczne leczenie.

17
 CYTOSZKIELET

• System wewnątrzkomórkowych włókienek białkowych

charakterystyczny dla organizmów eukariotycznych, składa się
z mikrotubul, mikrofilamentów i filamentów pośrednich.
• Funkcje:
◦ Warunkuje on kształt i organizację komórki.
◦ Umożliwia skurcz, ruch i podziały.
◦ Uczestniczy w wewnątrzkomórkowym transporcie.
◦ Współtworzy połączenia międzykomórkowe, utrzymuje integralność
tkanki i odpowiada za ruchy morfogenetyczne.

Mikrotubule
• Mają długość 25 nm i kanał wewnętrzny o średnicy 15 nm.
• Są zbudowane z podjednostek – tubuliny, każda jest dimerem dwóch
globularnych białek – tubuliny α i β, łączą się one ze sobą tworząc
protofilamenty o spolaryzowanej budowie. Koniec na którym znajduje
się tubulina α to biegun minus (rośnie wolniej), a gdzie β plus (rośnie
szybciej).
• Mikrotubula powstaje z połączenia 13 protofilamentów. W komórce nie
powstają poszczególne protofilamenty, ale pierścienie utworzone z 13
cząsteczek tubuliny. Wszystkie protofilamenty wzrastają jednocześnie
powodując wydłużanie.
Blokowanie polimeryzacji Tworzenie agergatów Stabilizacja
tubuliny zamiast mikrotubul mikrotubul
Kolcemid, nokodazol, Winkrystyna, winblastyna, Taksol
kolchicyna (w dużym benomyl, podofilotokosyna
stężeniu powoduje rozpad). (depolimeryzacja)
• Powstawanie mikrotubul in vivo:
1. Rozpoczyna się w centrum nukleacji ze względu na niskie stężenie
tubuliny w komórce. Najważniejszym centrum (MTOC –
microtubules organizing center) jest centrosom (zbudowany
z amorficznej macierzy zawierającej dwie centriole).
2. Na jego powierzchni tubulina γ tworzy pierścienie, do których
przyłącza się tubulina α (biegun minus, końcem wolnym jest plus).

18
 • Dynamiczna niestabilność mikrotubul – dimer tubuliny z GTP
przyłącza kolejne dimery i mikrotubula rośnie, jednak w dimerach
wewnątrz mikrotubuli zachodzi hydroliza GTP do GDP. Jeśli dojdzie do
hydrolizy na końcu, przed dołączeniem kolejnego dimeru, kolejne
dimery zaczną się odłączać i mikrotubula się skróci.
• W roztworach tubuliny mikrotubule powstają samoistnie.
• Za stabilność odpowiadają białka dodatkowe – towarzyszące
mikrotubulom, oczapkowujące (MAP – microtubules associated
proteins), znajdują się one w błonie organelli i błonie komórkowej.
• Mikrotubule wzrastają ciągle z centrosomu i jeśli nie dojdą do MAP
w strukturze komórkowej następuje ich hydroliza.
• Podział czynnościowy MAP:
◦ Stabilizujące – łączą się z bocznymi powierzchniami w miejscu
acetylacji lub fosforylacji tubuliny α (tau, MAP2, kateniny).
◦ Oczapkowujące – łączące koniec plus z strukturami komórkowymi
(z rodziny KAR).
◦ Motoryczne (kinezyna, dyneina, dynamina, KAR3, NCD).
• Kontrola stabilności mikrotubul jest większa w komórkach dzielących się
i wyspecjalizowanych.
• Przykładem MAP jest tau, w chorobie Alzheimera jest syntezowane tzw.
duże białko tau dezorganizujące mikrotubule.

Białka motoryczne
• Są specjalnym typem MAP, zalicza się do nich kinezyny i dyneiny
przypominające budową miozynę.
• Są zbudowane z identycznych białek zawierających odcinki lekkie
i ciężkie. Tworzą główki (łączą się z tubuliną i wykazują aktywność
ATP-azy) i mają wspólny ogonek.
• Hydroliza ATP w główkach cząsteczki zachodzi naprzemiennie
i prowadzi do kroczenia (kinezyna do bieguna plus, dyneina do bieguna
minus) i przemieszczania przyłączonych organelli (kilkadziesiąt cm na
dobę).
• Decydują o rozmieszczeniu organelli. Po wprowadzeniu kolchicyny do
komórki ER skupia się w środku komórki, a aparat Golgiego rozpada się
na rozproszone pęcherzyki.
• Aparat Golgiego wiąże się z dyneiną przyciągającą jego elementy do
centrum, a ER z kinezyną rozciągającą ją.

Struktury zbudowane z mikrotubul

• Frakcje mikrotubul:
◦ Labilne – ulegają ciągłej przebudowie (polimeryzują
i depolimeryzują).
19
 ◦ Trwałe – zmieniają się znacznie wolniej lub wcale (centriole,
rzęski, witki).
Centriole Krótkie walce, ich ściana jest zbudowana z 9 tripletów.
W komórce występuje zazwyczaj jedna para położona
w okolicy jądra.
Aksonema Rdzeń rzęsek i witek, zbudowana z 9 dubletów mikrotubul
(wystających z tripletów ciałek podstawowych) i jednej
połączonej pary. Porusza się dzięki specyficznej dyneinie
aksonemy (rzęskowej), jej główka łączy się z jednym
dubletem, a ogon z kolejnym. Podczas ruchu dyneiny nie
następuje przesuwanie dubletów względem siebie lecz
zginanie rzęsek (każdy cykl trwa 0,1-0,2 s), podobnie
zbudowane są witki plemników.
Wrzeciono W interfazie dochodzi do replikacji centrioli, w profazie do
kariokinetyczne przemieszczania ku biegunom (towarzyszy temu rozpad
mikrotubul cytoplazmatyczych). Z zdepolimeryzowanej
tubuliny powstaje wrzeciono kariokinetyczne. Wyróżnia się
mikrotubule, którym MAP zapewniają czasową stabilność:
Kinetochorowe Utrzymują chromosomy w płytce
metafazalnej.
Astralne Łączą centrosomy z białkami kory (ustala
właściwą pozycję całego wrzeciona)
Biegunowe Łączą się ze sobą i stabilizują cały układ.
• Mechanizm transportu chromatyd nie jest znany, prawdopodobnie
zachodzi dzięki kompleksowi białek dyneina, dynaktyna dołączonemu
do kinetochoru i uwalniającego kolejne GDP-tubuliny – skraca to
mikrotubule kinetochorowe i przybliża chromosom do centrosomu.
• Zespół nieruchomych rzęsek (Kartagenera) – zła budowa aksonemy
(brak ramion dyneinowych, mikrotubul centralnych, przesunięcie
mikrotubul obwodowych) uniemożliwia poruszanie rzęsek lub wici.
Objawia się częstym zapaleniem oskrzeli i nieruchomymi plemnikami.
• Zespół Bardeta-Biedla (mutacja genu BBS) – nieprawidłowość
w transporcie białek wewnątrz rzęsek (zaburzenia budowy ciałek
podstawnych i rzęsek). Powoduje zmiany wielonarządowe (dystrofia
siatkówki, wielotrobielowatość nerek, przewlekłe zapalenia oskrzeli,
brak rozwoju ogonków plemników).

20
Filamenty pośrednie (protofibryle)
• Ich średnica wynosi 10 nm (zawsze taka sama, na przekroju
8 tetramerów). Są stabilne, odporne na rozciąganie oraz działanie
związków chemicznych, nadają komórce wytrzymałość mechaniczną.
• W niektórych tkankach (mięśnie, naskórek) łączą się pośrednio między
komórkami zapewniając dużą wytrzymałość mechaniczną.
• Składają się z białek włókienkowych (monomerów). Jego najdłuższa,
środkowa część ma charakter α-helisy, na końcu N głowa, a na C-końcu
ogon. Przez nawinięcie środkowych fragmentów tworzą dimery
(superhelisę) z głowami na jednym końcu (jest to regulowane
fosforylacją i defosforylacją monomerów)→ dwa dimery łączą się bok
do boku tworząc tetramer→ przeciwbieżne połączenie tetramerów→
połączenie się tetramerów koniec od końca (powstanie
protofialementu)→połączenie ich bok do boku (powstanie protofibryli)
• Ponieważ odcinki środkowe białek budujących filamenty mają podobną
budowę co wiąże się z podobną wytrzymałością i grubością. Końcówki
globularne służą do połączeń z innymi i nadają pewną swoistość
(znacznie się różnią).
• Białka budujące filamenty pośrednie:
Homodimery Filamenty cytokeratynowe, wimentynowe, neurofilamanty.
Heterodimery Łączą się z innymi białkami np.: desmina, GFAP (łączą się
z wimentyną i zalicza się je do filamentów
wimentynopodobnych).
• W obrębie cyto-, neurokeratyn i lamin jądrowych występują podtypy
białek łączące się w dimery z innymi podtypami.
• Swoistość filamentów pośrednich jest wykorzystywana przez
cytohistopatologów, pozwala na określenie pochodzenia komórek
nowotworowych.
• Funkcje:
◦ Łączą się w pęczki i sieci przyczepione do błony komórkowej,
otoczki jądrowej i dzięki białkom towarzyszącym filamentów
pośrednich (IFAP np.: syneminie i skeleminie w mięśniach
szkieletowych, filagrynie w nabłonku) łączą się z innymi
składnikami cytoszkieletu.
◦ Zapewniają wytrzymałość mechaniczną. W nabłonkach
pokrywających łączą się z innymi białkami (np. desmoplakinami)
tworząc połączenia międzykomórkowe (są nazywane
tonofilamentami).

21
 • Zwykłe pęcherzowe oddzielanie się naskórka jest warunkowane
genetycznym defektem filamentów keratynowych wywołanych mutacją
genów keratyny 5 i 14, wrodzona rybia łuska geny keratyny 1 i 10,
a rogowiec stóp i dłoni genu keratyny 9.
• W pęcherzycy zwykłej tworzą się pęcherze na skutek działania
autoprzeciwciał IgG przeciw desmogleinie 3.
• W pemifigoidzie pęcherzowym powstają podnabłonkowe pęcherze na
skutek działania autoprzeciwciał IgG przeciw białkom
hemidesmosomów (plektynie, integrynie α6β4 i lamininie 5).
• Laminopatie są wywołanie defektem lamin jądrowych np.: dystrofie
mięśniowe, lipidowe i neuropatie (Charcota-Marie'a-Tootha 2B1 –
zaburzenia ruchowo czuciowe kończyn górnych i typu 1 – wywołana
mutacją genu koneksyny 23 w komórkach Schwanna i uszkodzeniami
mieliny).

Mikrofilamenty (aktynowe)
• Zbudowane są z aktyny (jedno z najobficiej występujących białek
komórkowych – w mięśniach 20%, w innych 5%).
• Odpowiadają za ruch komórek lub jej fragmentów, kurczenie się
i przemieszczanie organelli, nadają kształt komórkom i mocują je do
komórek i błon podstawnych.
• Mają średnicę 7 nm, mogą być:
◦ Niestabilne – pojawiają się okresowo np.: pierścienie kurczliwe
(pojawiają się po kariokinezie) i włókienka naprężeniowe
(umożliwiają przyczepienie się do podłoża np.: fibroblastom) oraz
lameliopodia i filopodia.
◦ Tworzyć stabilne struktury komórkowe występujące w większości
komórek (np.: w ich korze), lub komórkach wyspecjalizowanych
(mikrokosmki, miofilamenty).
• Są polimerami aktyny G (42kD). Izoformy aktyny:
α Jest charakterystyczna dla mięśni (wyróżnia się podtypy swoiste dla
odpowiednich ich typów).
β Występuje w cytoplazmie większości komórek.
γ Występuje w mięśniach gładkich trzewi.
• Aktyna G polimeryzuje tworząc wydłużoną aktynę F, której dwie nici
owijają się wokół siebie tworząc filament. Cząsteczki aktyny są
spolaryzowane, ułożone zawsze w tym samym kierunku co warunkuje
spolaryzowanie filamentu (wyróżnia się koniec plus i minus).

22
 • Aktyna G polimeryzuje wyłącznie związana z ATP. W in vitro taka
aktyna może się przyłączać do filamentu, a kolejna przyłączona
cząsteczka powoduje hydrolizę ATP do ADP. Te cząsteczki mogą łatwo
depolimeryzować, ale dodanie substancji egzogennych może zmieniać
ten proces (głównie toksyny z grzybów).
Cytochlazyna Łączy się z aktyną G i blokuje polimeryzację.
latrunkulina
Faloidyna Cykliczny polipeptyd z muchomora sromotnikowego, łączy się
z aktyną F i stabilizuje filamenty. Znakowana fluorochromem
jest wykorzystywana do lokalizacji filamentów aktynowych.
• Za ich stabilizację odpowiadają białka wiążące aktynę (ABP). Cząsteczki
aktyny G są dobudowywane na końcu plus i usuwane na minus –
dynamiczna stabilność.
• Połowa aktyny G występuje w połączeniu z:
◦ Białkami wiążącymi monomer (np.: tymozyna β4)
zapobiegającymi polimeryzacji.
◦ Ułatwiającymi polimeryzację w aktynę F (np.: profilina).
◦ Decydują o organizacji w pęczki lub sieci (np.: fimbryna,
α-aktynina).
• W pęczkach są ułożone równolegle i przeciwbieżnie, obecna między
nimi miozyna II przesuwa je i powoduje ruch lub skurcz komórki.
• Czasem filamenty w pęczku są spolaryzowane w jednym kierunku np.
w mikrokosmkach i filopodiach, albo ułożone w sieci nadając
cytoplazmie charakter żelu. W obecności Ca2+ gelsolina zrywa wiązania
krzyżowe i skraca filamenty aktynowe powodując zmianę żelu w zol
(np.: w kolbce synaptycznej co ułatwia fuzję pęcherzyków).
• Czasem podczas ruchu komórki lub przyłączania się do innych struktur
filamenty aktynowe mogą dzięki kompleksowi białek Arp2/3 tworzyć
odgałęzienia boczne (przyczepia się do istniejącego filamentu
powodując wzrost kolejnego). Wymagają one do aktywacji białek WASP
(Wiskott-Aldrich syndrom proteins, należące do rodziny kontraktyny)
istotnych np.: w przemieszczaniu limfocytów, mutacja powoduje
upośledzenie limfocytów T i B i uporczywe infekcje dróg oddechowych
i skóry (zespół Wiskotta-Aldricha).
• Białka wiążące aktynę:
◦ Tropomiozyna – stabilizuje filamenty.
◦ Winkulina, α-aktynina – wiązanie filamentów.
◦ Spektryna I i II – wiązania krzyżowe do błony komórkowej.
◦ Miozyna II – przesuwanie filamentów w mięśniach.
◦ Miozyna I i V – przemieszcza struktury błoniaste po filamentach.

23
 ◦ Dystrofina – białko kory komórki w mięśniach szkieletowych.
◦ Kaldesmon – wiąże aktynę i blokuje kontakt z miozyną.

Kora komórki
• Duże skupisko filamentów aktynowych pod plazmolemmą.
• W korze erytrocytów prócz aktyny występują białka wiążące się
pośrednio z aktyną i błoną komórkową, nadające komórce kształt
i elastyczność (spektryna i aktyna połączone białkiem 4.1 prążka,
glikoforyną, ankiryną i białkiem 3 prążka). W innych komórkach
występują podobna struktura z izoformami białek.
• W wielu komórkach spektryna II i ezryna łączą pęczki filamentów
aktynowych wytwarzając siateczkę graniczną, łączącą się połączeniami
typu zwierającego. W komórkach mięśni zamiast spektryny występuje
dystrofina, a w płytkach krwi filamina, w neurocytach fodryna łączy
się dodatkowo z neurotubulami, neurofilamentami, pęcherzykami
synaptycznymi (umożliwia to egzocytozę) i organellami.

Mikrokosmki
• Niewielkie palczaste wypustki cytoplazmy zwiększające powierzchnię
chłonną. W jelicie cienkim i kanalikach proksymalnych nefronu można je
obserwować przez mikroskop jako rąbek szczoteczkowy.
• Mają średnicę 80 nm i długość ok. 1 μm, a za stabilizację odpowiada
rdzeń z 20-30 filamentów aktynowych z ABP.

Białka motoryczne
Miozyna II Zbudowana z dwóch głów połączonych z ogonem. Głowa jest
(mięśniowa) zbudowana z części globularnej łańcucha ciężkiego miozyny
i przyłączonych dwóch łańcuchów lekkich, jest miejscem
wiązania aktyny i ATP. Ogon to superhelisa z połączonych
dwóch łańcuchów ciężkich. Cząsteczka ma długość 150 nm.
Głowa ma zdolność hydrolizy ATP co powoduje zmianę
położenia głów i kroczenie. W mięśniach szkieletowych
polimeryzuje tworząc filamenty grube. Odpowiada za
przemieszczanie filamentów względem siebie.
Miozyna I Składa się z głowy i krótkiego ogona (20-70 nm), jej głowa
(niemięśniowa) ma podobną budowę we wszystkich izoformach, a ogon różni
się znacznie zależnie od izoformy i łączy się z strukturami
obłonionymi komórki, odpowiada za transport organelli.
Miozyna V Ma dwie głowy i ogon będący superhelisą, jego końcowa
część nie polimeryzuje lecz wiążę się z białkami w błonach
pęcherzyków.

24
 • Miozyna Va łączy się z białkiem Rab27a błon melanosomów, mutacja
genu tego białka wywołuje zespół Griscelliego objawiający się
częściowym albinizmem, siwiejącymi włosami, zaburzeniami
neurologicznymi i niedoborami immunologiczymi.

Aparat kurczliwy mięśni

• W mięśniach poprzecznie prążkowanych stanowią go miofibryle
tworzące pęczki biegnące równolegle do osi długiej włókna wypełniając
całą komórkę. Mają średnicę 1-2 μm, ich jednostką strukturalną są
sarkomery (odcinek zawarty między dwiema liniami Z). W skład
sarkomeru wchodzi linia Z, pół prążka I, prążek A, pół prążka I i linia Z.
W mikroskopie elektronowym w prążku A można zaobserwować
przejaśnienie – prążek H, a w nim linie M.
• Miofilament cienki (aktynowy) – ma długość 1 μm. Jest zbudowany z:
Aktyny F Dwie skręcone cząsteczki tworzą rdzeń miofilamentu.
Tropomiozyny Jej fibryle nawijają się na aktynowy rdzeń.
Troponina Globularne białko zbudowane z 3 jednostek: C (połączenie
z jonami wapnia powoduje że podjednostki T i I zmieniają
położenie tropomiozyny na aktynie).
• Miofilament gruby (miozynowy) – ma długość ok. 1,5 μm. Zbudowany
jest z miozyny i białka C które ją spaja. Jego rdzeń składa się
z skręconych filamentów ciężkich miozyny, a głowy wystają na zewnątrz
rdzenia (każda ma miejsce wiązania aktyny i ATP). Głowy miozyny
w miofilamencie znajdują się tylko na jego końcach.
• Miofilamenty cienkie znajdują się w prążkach I i A, są zakotwiczone
w linii Z (dzięki α-aktyninie i winkulinie), a grube tylko w A.
Miofilamenty grube są połączone z linią Z za pomocą tityny.
W mięśniach obecne są filamenty pośrednie desminowe utrzymujące
spoistość miofibryli i ułożeniu względem siebie (są za to odpowiedzialne
IFAP – synamina i skelemina). Oplatają one całą miofibrylę,
a dodatkowo na wysokości linii Z tworzą gęstą sieć. Jej filamenty
przyczepiają się za pomocą IFAP ankyryny i paraneminy do błony
komórkowej.
• W korze włókna mięśniowego znajduje się też dystrofina, jej brak
uniemożliwia przyczepienie się włókienek desminowych do sarkolemy
i wywołuje dystrofię mięśniową Duchenne'a (u mężczyzn występuje
1:4000, ew. u kobiet z zespołem Turnera), polegającą na degeneracji
i martwicy włókien mięśniowych i zastąpieniu ich tkanką tłuszczową lub
łączną włóknistą. Kończy się śmiercią koło 20 roku życia.
• Za synchronizację skurczu odpowiada triada mięśniowa (kanalik T i dwie
cysterny brzeżne).

25
 • Kanaliki T to rurkowate wpuklenia sarkolemy występujące na granicy
prążka A i I. W ich sąsiedztwie biegną cysterny brzeżne
(wyspecjalizowana SER otaczająca każdą miofibrylę) mające zdolność
gromadzenia jonów Ca2+ i ich uwalniania przez kanały wapniowe
otwierane depolaryzacją błon kanalików T.

Mechanizm skurczu mięśnia szkieletowego

1. Uwolniona na płytce motorycznej acetylocholina powoduje
depolaryzację sarkolemmy (razem z błoną kanalików T).
2. Depolaryzacja ich błony powoduje otwarcie kanałów cystern brzeżnych
co prowadzi do 1000-krotnego (od 10-8 do 10-5M) wzrostu stężenia jonów
wapnia w cytoplazmie.
3. Jony łączą się z troponiną ta przemieszcza tropomiozynę i odsłonięte
zostają miejsca wiążące miozynę na aktynie.
4. Obie głowy miozyny rozkładają ATP, i kroczą po aktynie.
5. Miofilamenty cienkie wchodzą między grube i sarkomer skraca się
o 30 % (zanika prążek I i H).
6. Po depolaryzacji zachodzi samoczynna repolaryzacja, kanały wapniowe
zamykają się, dzięki ułożeniu desminy zostaje przywrócone pierwotne
położenie miofilamentów.

Mechanizm skurczu mięśnia sercowego

• Komórki łączą się za pomocą wstawek, które zapewniają odpowiednie
połączenie czynnościowe i mechaniczne. Wstawkę tworzą desmosomy
łączące filamenty desminowe, sfery zawierające łączące filamenty
aktynowe komórek i połączenia neksus.
• Niskie stężenie wapnia jest utrzymywane przez biało błonowe
wymiennik Na+/Ca2+, depolaryzacja powoduje zmianę kierunku
transportu. Takie działanie jest wykorzystywane przez glikozydy
nasercowe (digoksygeniny, strofantyny), które hamują pompę Na+/K+
i zwiększają stężenie Na+ w komórce.

Mięśnie gładkie
• Tworzą je niewielkie wrzecionowate komórki bez miofibryli
(miofilamenty tworzą sieć).
• Miofilamenty cienkie są zbudowane z aktyny i tropomiozyny, a zamiast
troponiny w cytoplazmie znajduje się kalmodulina.
• Znajduje się kaldesmon wiążący się z aktyną.
• Miofilamenty grube są zbudowane z miozyny II, są krótkie
i rozmieszczone nieregularnie.
• Zamiast triad jest znajduje się skomplikowany układ SER.

26
• Aby nastąpił skurcz musi nastąpić fosforylacja głów miozyny przez
kinazę miozynową (powoduje to zmianę konformacji głów miozyny)
i musi być usunięty kaldesmon. Zachodzi to w wyniku wzrostu
wewnątrzkomórkowego cAMP i Ca2+ pod wpływem impulsacji układu
sympatycznego i parasympatycznego oraz hormonów (skurcz powoduje
adrenalina, noradrenalina, angiotensyna, serotonina i oksytocyna). NO
wywołuje rozkurcz poprzez zwiększenie stężenia cGMP skutkujące
spadkiem stężenia Ca2+.
• Posiadają ciałka gęste (w cytoplazmie) i płytki mocujące (przyłączone
do sarkolemy). Są one zbudowane z α-aktyniny i przyczepiają się do
nich filamenty aktynowe i pośrednie.

27
 WYBRANE PROCESY CYTOPLAZMATYCZNE

• Komórka eukariotyczna jest podzielona błonami na przedziały,

kompartmenty i organelle błoniaste (SER, RER, aparat Golgiego,
endosomy, lizosomy).
• Mitochondria i peroksysomy, mimo że są obłonione to biorą mniejszy
udział w przepływie błon.
• Organelle szlaku wydzielniczego oraz otoczka jądrowa powstały przez
inwaginację błony komórkowej w procesie ewolucji, a mitochondria
pochodzą z symbiotycznych prokariontów. Jądro komórkowe jest
oddzielnym przedziałem – jego zawartość jest topologicznie tożsama
z cytoplazmą z którą miesza się podczas mitozy.
• Mitochondria i ER nie mogą powstawać de novo. Do powstania
mitochondriów jest potrzebne mtDNA, ER wymaga odpowiednich białek
błonowych nie mogących przybrać właściwej formy bez
preformowanych błon i białek opiekuńczych. Pozostałe organelle
powstają z ER.
• SER jest głównym obszarem produkcji lipidów, a RER syntezuje białka
błon, rezydujące w świetle przedziałów błoniastych szlaku
i te przeznaczone na eksport.
• Błony z zawartością przedostają się z RER przez sieć cis aparatu
Golgiego do aparatu Golgiego. Sam aparat składa się z kilkudziesięciu
diktiosomów (stos cystern, pęcherzyków i tubuli).
• Za organizację przestrzenną aparatu Golgiego odpowiadają mikrotubule.
Zachodzi w nim glikozylacja białek i sortowanie.
• Białka opuszczają aparat przez obszar trans, część z nich tworzy ziarna
wydzielnicze ulegające egzocytozie w procesie wydzielania
regulowanego, część ulega wydzielaniu konstytutywnemu, a część
łączy się z endosomami i lizosomami.
• Na każdym etapie jest możliwość przepływu wstecznego.

Adresowanie białek w komórce

• Duże białka i kwasy nukleinowe nie są w stanie przekroczyć błon
między przedziałami. Powoduje to istnienie przedziałów z białkami
osadniczymi (rezydentnymi), specjalizujących się w pełnieniu
określonej funkcji.
• Poza nielicznymi białkami mitochondrialnymi wszystkie białka
komórkowe powstają w cytosolu, żeby go opuścić muszą posiadać
specyficzną sekwencję sygnałową.

28
 • Sekwencja obejmuje zazwyczaj 15-60 reszt aminokwasowych
i występuje zazwyczaj na końcu aminowym łańcucha polipeptydowego.
Po dotarciu do przedziału docelowego jest usuwana przez specyficzną
peptydazę sygnałową. Sekwencja może występować w innych
okolicach białka i mieć charakter motywów strukturalnych.
• Transport można podzielić na:
Przezbłonowy Obejmuje import i eksport białek między cytosolem, a ER,
peryksosomami i mitochondriami.
Pęcherzykowy Obejmuje pozostałe przedziały komórkowe szlaku
wydzielniczego, ze względu na brak w nich białek
transportowych.
Bramkowany Zachodzi między jądrem a cytoplazmą (w czasie interfazy
wyłącznie przez pory jądrowe).
• Wymieszanie zawartości jądra z cytoplazmą podczas mitozy jest
specyficzne wyłącznie dla jądra i nie dotyczy innych przedziałów.
• Białka przeznaczone dla organelli szlaku wydzielniczego posiadają
peptyd sygnałowy warunkujący kotranslacyjne przemieszczenie się
białka do światła lub w obręb błony ER.
• Białka przeznaczone dla jądra, peroksysomów i mitochondriów są
syntezowane do końca w cytosolu, następnie ulegają transportowi
potranslacyjnemu.

Translokacja białek do ER
• Jeśli wyłaniający się z cytoplazmatycznego rybosomu N-końcowy
odcinek łańcucha zawiera sekwencję sygnałową dla ER to wiąże się ona
z cząstką rozpoznającą sygnał (SRP – signal recognition particle). Nie
jest ona ściśle określona, zawiera z reguły w pobliżu końca aminowego
grupę 7-20 aminokwasów hydrofobowych.
• SRP składa się z 6 białek i małej cząsteczki RNA. Blokuje ona
wydłużanie łańcucha polipeptydowego do czasu zakotwiczenia
kompleksu SRP z rybosomem w ER. Hydroliza GTP przez jedną
z podjednostek SRP zapewnia energię potrzebną do przekazania
kompleksu wraz z sekwencją do translokonu (kompleks białek
kanałowych warunkujący przemieszczanie powstającego łańcucha do
wnętrza siateczki), równocześnie zachodzi uwolnienie SRP do cytosolu.
• Kanał translokonu bez przyłączonego rybosomu jest zamknięty.
Przyłączenie rybosomu tworzy szczelne dla wody i jonów połączenie
między rybosomem, a translokonem. Peptyd sygnałowy oddziałuje
z hydrofobowymi częściami translokonu powodując otwarcie kanału.

29
 • Od stron ER przyłącza się białko opiekuńcze BiP (binding-protein), które
dostarcza energii do przeciągnięcia polipeptydu przez translokon przez
hydrolizę ATP. Peptydaza sygnałowa w świetlne ER odcina peptyd
sygnałowy.
• Translokacja jest bardziej złożona dla białek ulegających wbudowaniu
w błonę ER. W czasie ich syntezy dochodzi do wielokrotnego otwierania
i zamykania ścian bocznych kanału translokonu co umożliwia
przechodzenie części hydrofobowych do warstwy fosfolipidów.
• W czasie syntezy odcinków cytoplazmatycznych białek błonowych
rybosom odłącza się od translokonu ulegającego przejściowo
zamknięciu, następnie musi się on ponownie przyłączyć.
• Sekwencje sygnałowe z wnętrza łańcucha polipeptydowego umożliwiają
powstanie białek mających kilka domen cytoplazmatycznych
rozdzielonych domenami przezbłonowymi.

Sortowanie białek organelli błoniastych

• Białka występujące w błonach i świetle organelli szlaku wydzielniczego
przechodzą drogą transportu pęcherzykowego z RER (trafiają tam
kontranslacyjnie przez kompleks translokonu).
• Pęcherzyki transportowe swoiście rozpoznają przedział docelowy
i odróżniają go od innych. W wypadku braku dodatkowych sekwencji
sortujących białka są transportowane z ER szlakiem wydzielania
konstytutywnego przez sieć cis, trans aparatu Golgiego i pęcherzykami
wydzielniczymi na powierzchnię komórki.
• Specyficzne sekwencje sortujące zapewniają obecność w każdym
z przedziałów szlaku wydzielniczego białek rezydentnych, jeśli trafią
one do następnego działu to są rozpoznawane i zwracane drogą
transportu wstecznego. Czasem białka mogą rezydować w przedziałach
bez sekwencji adresowej, pod warunkiem że są specyficzne z białkiem
takową posiadająca (np. kompleksy enzymatyczne).
• Nie wszystkie białka części trans trafią na szlak wydzielania
konstytutywnego, część gromadzi się w ziarnach wydzielniczych
i uczestniczy w wydzielaniu regulowanym (gromadzenie specyficznej
wydzieliny do czasu sekrecji).
• Niektóre białka nie są wydzielane na zewnątrz komórki lecz przedostają
do sieci trans i następnie do endosomów. Odmienne losy białek w sieci
trans również należą od specyficznych sygnałów.
• Endosomy wczesne są położone bliżej błony komórkowej –
endocytowany materiał dociera do nich wcześniej niż do położonych
głębiej endosomów późnych. Wędrując wzdłuż mikrotubul w głąb
komórki wytwarzając wgłębienia przekształcające się w pęcherzyki
zawierające białka przeznaczone do degradacji.

30
 • Sortowanie białek błonowych do wewnętrznych pęcherzyków zależy od
ubikwitynacji ich domen cytoplazmatycznych. Powstałe ciała
wielopęcherzykowe ulegają następnie fuzji z innymi pęcherzykami
przekształcając się w endosomy późne, w których panują warunki
sprzyjające dysocjacji endocytowanych białek od receptorów
ulegających recyrukulacji. Z endosomów późnych białka trafiają do
lizosomów.
• Do endosomów wczesnych i późnych nieustannie trafiają pęcherzyki
z sieci trans zawierające nieaktywne enzymy lizosomalne ulegające
akumulacji i aktywacji w endosomach późnych.
• W elementach przejściowych SER powstają pęcherzyki transportujące
do sieci cis białka osadnicze ER, po ich rozpoznaniu dzięki sekwencji
KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) następuje transport zwrotny do ER przez
odmienną populację pęcherzyków transportujących. Pozostałe białka
ulegają transportowi pęcherzykowemu do następnych cystern aparatu
Golgiego.
• W poprzek aparatu Golgiego odbywa się nieustanny transport
pęcherzyków (wsteczny i w kierunku wydzielniczym). Na każdym jego
odcinku znajdują się specyficzne enzymy osadniczne warunkujące
zachodzenie wielu reakcji biochemicznych (modyfikacja i przyłączanie
reszt oligosacharydowych). Takim oligosacharydem jest reszta
mannozo-6-fosforanu (M6P), białka, które go zawierają są wiązane
w sieci trans przez specjalne receptory transbłonowe M6P, kompleksy
są transportowane do endosomów, a obniżenie pH w ich świetle
prowadzi do dysocjacji białek od receptorów, a te recyrkulują do sieci
trans. Receptory M6P zapewniają adresowanie do lizosomów licznych
hydrolaz.
• Wrodzony brak enzymu fosforylującego mannozę w sieci cis prowadzi
do choroby komórek z ciałkami inkluzyjnymi – w fibroblastach
enzymy hydrolityczne nie trafiają do lizosomów lecz do przestrzeni
międzykomórkowej wydzielaniem konstytutywnym. Niestrawione
substraty pojawiają się w obrębie cytoplazmy jako ciałka inkluzyjne,
a pacjenci umierają w dzieciństwie z powodu licznych wad
rozwojowych.
• Substraty hydrolaz dostają się do lizosomów kilkoma szlakami.
Endocytoza może być niespecyficzna (pinocytoza) lub zależna od
receptorów, gdy dotyczy dużych cząstek (ciałka apoptyczne, fragmenty
erytrocytów, bakterie) określa się ją fagocytozą.

Transport pęcherzykowy
• Przepływowi w jedną stronę towarzyszy przepływ wsteczny
zapewniający równowagę błon.

31
 • Błony poszczególnych organelli i powstających z nich pęcherzyków
różnią się zawartością lipidów fosfatydyloinozytolowych, które mogą
ulegać szybkim przemianom wskutek fosforylacji i defosforylacji reszt
3', 4', i 5' inozotylu dokonywanych przez kinazy i fosfatazy rezydujące
w poszczególnych przedziałach.
• Błona pęcherzyku początkowo ma charakter przedziału macierzystego,
a po fuzji z przedziałem docelowym fosfoinozytydy obecne w błonie
zostają przekształcone w formę odpowiednią dla przedziału docelowego.
• Różnorodne białka oddziałujące z pęcherzykami, błonami macierzystymi
i docelowymi rozpoznają określone fosfoinozytydy co zapewnia
specyficzność wiązania.
• Pęcherzyki powstają przez inwaginację błon wskutek działania
cytoplazmatycznego płaszcza białkowego oddziałującego ze
specyficznymi białkami adaptorowymi i receptorami. Znane są
3 rodzaje płaszczów białkowych.
Klatrynowy Endocytoza zależna od receptorów i wydzielanie regulowane.
COP typu I Transport wsteczny z aparatu Golgiego do ER oraz między
cysternami aparatu Golgiego.
COP typu II Transport z ER do aparatu Golgiego.
• Formowanie pęcherzyków transportowych COPI i II zależy od białek
z rodziny p24 – przezbłonowe, agregujące w hetero-oligomery, ich
domeny cytoplazmatyczne są bardzo podobne i umożliwiają łączenie
białek koatomerów i montaż płaszcza białkowego.
• Domeny luminalne białek p24 noszące miano GOLD (GOLgi
Dynamics) zapewniają rekrutację odmiennych białek ulegających
transportowi.
• Domeny śródbłonowe białek p24 rekrutują niektóre rodzaje lipidów
(np.: sfingomieliny), adresowanie do odpowiedniego przedziału
docelowego zapewniają komplementarny system złożony z białek
SNARE i Rab.
• Pęcherzyk transportowy powstaje przez pączkowanie z przedziału
macierzystego, ulega transportowi, cumowaniu dokowaniu i fuzji
z przedziałem docelowym.
1. Pączkowanie jest indukowane przez białka płaszcza odkładające się
w obszarach błony gdzie obecne są białka adaptorowe (oddziałują
z lipidami fosfoinozytolowymi i receptorami wiążącymi ligandy
które będą zawarte w świetle przyszłego pęcherzyka.
2. Odkładanie białek płaszcza jest inicjowane przez specyficzne
GTP-azy powiązane z GTP jak np.: Arf.
3. Polimeryzacja białek płaszcza dostarcza siły potrzebnej do
odkształcenia błony i wytworzenia wgłębienia odkrytego.
32
 4. Wgłębienie przekształca się w pęcherzyk wskutek aktywności białek
(np.: dynamina wiążąca się z fosfoinozytydami błony), które
wykształcają pierścień wokół szyjki łączącej powstający pęcherzyk
z błoną macierzystą.
5. Dynamina prowadzi do zwężenia pierścienia wskutek hydrolizy
GTP zależnej od Arf i defosforylacji fosfoinozytydów.
6. Białka płaszcza ulegają ponownemu wykorzystaniu przy tworzeniu
nowych pęcherzyków.
• Pęcherzyki są transportowane (często mikrotubulami) i muszą zostać
rozpoznane w odpowiednim przedziale docelowym co zapewniają
GTP-azy Rab.
• W ludzkich komórkach występuje 60 rodzajów Rab znakujących
przedziały:
◦ Rab2 – błony sieci cis aparatu Golgiego.
◦ Rab3A – ziarenka wydzielnicze.
◦ Rab8 – wczesne endosomy.
• W formie aktywnej (związanej z GTP) Rab wiążą się z jednej strony
z fosfolipidami błon, a z drugiej z cytoplazmatycznymi białkami
efektorowymi uczestniczącymi w transporcie pęcherzyków (np.: białka
motorowe).
• Innym typem Rab są białka cumujące tworzące włókienka mające do
200 nm i sięgające od błony docelowej w głąb cytoplazmy, ich
powiązanie z białkami cumującymi rozpoczyna ten proces, wskutek
zbliżania się do błony docelowej zaczyna się proces dokowania, jest on
wyjątkowo swoisty i uczestniczą w nim białka SNARE, na powierzchni
pęcherzyków znajduje się pojedynczy helikalny łańcuch polipeptydowy
v-SNARE (vescile), a na powierzchni przedziałów docelowych
t-SNARE (target), składający się z 2-3 helikalnych łańcuchów.
• U człowieka występuje ok. 35 białek SNARE charakterystycznych dla
odpowiednich przedziałów, dopasowanie odpowiednich v- i t-SNARE
powoduje splecenie domen helikalnych w stabilną potrójną lub
poczwórną helisę, energia wyzwalana w czasie splatania zbliża
pęcherzyk do błon, fuzja następuje gdy odległość między nimi zmniejsza
się do 1,5 nm.
• Interakcja SNARE wystarcza do fuzji, jednak proces jest regulowany
oddziaływaniem z innymi białkami np.: Rab – umożliwia to
przyspieszenie lub zahamowanie do czasu otrzymania odpowiedniego
sygnału (np. Ca2+). Ma to znaczenie przy przekazywaniu sygnału przez
synapsy lub w czasie degranulacji mastocytów.
• Po zespoleniu białka ulegają ponownemu wykorzystaniu.

33
 • Toksyny produkowane przez pałeczki tężca i jadu kiełbasianego dostają
się do neuronów gdzie powodują proteolizę SNARE w terminalach
synaptycznych, co blokuje transmisję synaptyczną (na poziomie błony
presynaptycznej).

Sortowanie białek w komórkach spolaryzowanych

• Powierzchnia szczytowa i podstawno-boczna są oddzielone od siebie
połączeniami zamykającymi, dlatego mają one różny skład białkowy
i lipidowy warunkujący inne funkcje.
• Błona szczytowa jest wzbogacona w glikosfingolipidy, chroniące ją
przed uszkodzeniem enzymami trawiennymi lub czynnikami
zewnętrznymi.
• Komórki spolaryzowane posiadają dwa przedziały endosomów
wczesnych uczestniczące w recyklingu błony odpowiednich powierzchni
i jeden endosomów późnych.
• Sortowanie makrocząstek na właściwe powierzchnie komórki odbywa
się w obrębie sieci trans, białka błonowe przeznaczone na powierzchnię
szczytową są związane z GPI zakotwiczającymi je w błonie. Białka GPI
gromadzą się w regionach błony trans aparatu Golgiego wzbogaconej
glikosfingolipidami i cholesterolem, określonych tratwami lipidowymi,
występują w nich także lektyny wiążące białka luminalne zawierające
swoiste reszty oligosacharydów.
• Tratwy lipidowe ulegają egzocytozie na powierzchnię komórki, gdzie
uczestniczą w transporcie do niej. W obrębie tratw powstają jamki
zawierające skupienia receptorów związanych przez ligand (np.: kwas
foliowy) ułatwiające transport.
• Białka przeznaczone dla części podstawno-bocznej zawierają słabo
poznane motywy strukturalne w części cytoplazmatycznej.
• Pęcherzyki przeznaczone na powierzchnię podstawno-boczną
i szczytową zawierają odmienne zestawy białek Rab oraz v-SNARE.
Odmienne białka t-SNARE znajdują się w błonach docelowych.
• Istnieją systemy białek odpowiadające za przeniesienie białek
znajdujących się na niewłaściwej powierzchni drogą transcytozy.

Import białek do peroksysomów

• Odbywa się w nich β-oksydacja kwasów tłuszczowych oraz
detoksykacja metabolitów i ksenobiotyków przez utlenianie (50%
etanolu wprowadzonego do organizmu utlenia się w dużych
peroksysomach hepatocytów).
• Peroksysomy są otoczone pojedynczą błoną, powstają przez podział
innych peroksysomów lub de novo z ER.

34
 • Białka peroksymalne są importowane z cytosolu, większość ma
C-końcową peroksymalną sekwencję sygnałową 1 (PTS1 – peroximal
targeting sequence 1) składającą się z 3 aminokwasów (seryny, lizyny
i leucyny). PTS1 wiąże się z peroksyną 5 w błonie peroksymalnej.
• Niektóre białka posiadają zmienna N-końcową sekwencję PTS2
rozpoznawaną przez peroksynę 7.
• Peroksyny 5 i 7 tworzą wraz z innymi rodzajami kompleks
makromolekularny translokujący białka do macierzy peroksysomów
z użyciem energii z hydrolizy ATP.
• Białka importowane do peroksysomów są w pełni sfałdowane.
• Mutacje genów peroksyn prowadzą do wad wrodzonych:
◦ Zespołu Zellwegera – spowodowany mutacją genu peroksyny 2,
noworodki mają ciężkie wady mózgu, drobnoguzkową marskość
wątroby i niewydolność nerek. Zdjęcia z mikroskopu elektronowego
ukazują peroksysomy pozbawione macierzy.
◦ Zespołu Refsuma – zapalenie siatkówki, neuropatia nerwów
obwodowych, ataksja móżdżkowa.
◦ Adrenoleukodystrofii
◦ Chondrodysplazji

Import białek do mitochondriów

• 5% białek powstaje na obszarze macierzy, pozostałe są importowane.
Zewnętrzna błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla dla białek,
a przepuszczalna dla wody i jonów. Wewnętrzna jest dodatkowo
nieprzepuszczalna dla jonów.
• Białka mitochondrialne syntezowane w cytosolu jako białka
prekursorowe posiadające mitochondrialną sekwencję sygnałową – MTS
(mitochondrial targeting sequence). Aminoterminalna MTS tworzy
α-helisę w obrębie której aminokwasy zasadowe ustawiają się po jednej
stronie, a niepolarne po drugiej. Powstające białka są utrzymywane
w stanie niesfałdowanym przez białka opiekuńcze (min. czynnik
stymulujący import do mitochondriów (MSF – mitochondrial import
stymulating factor) rozpoznający MTS.
• Transport importowanych białek przez zewnętrzną błonę
mitochondrialną zapewnia kompleks kanałowy TOM.
1. Po związaniu cytosolowe białka opiekuńcze ulegają oddzieleniu,
a niesfałdowane białko mitochondrialne jest przekazywane do TOM.

35
 2. Zbliżenie się białka kanałowego TOM zewnętrznej błony do
podobnego błony wewnętrznej – TIM (transport across inner
membrane) co powoduje zbliżenie obu błon, z kanałami TIM od
strony matrix związane jest białko opiekuńcze dostarczające energii
przez hydrolizę ATP oraz peptydaza sygnałowa. Jeden ze
składników kanału TIM ma hydrofobową helisę ulegającą
wbudowaniu w zewnętrzna błonę mitochondrialną co sprzyja
zbliżeniu obu błon.
3. Początkowy odcinek białka dostaje się do macierzy wskutek
przejścia dodatnio naładowanej MTS zgodnie z gradientem
(ujemna macierz, dodatnia przestrzeń międzybłonowa).
4. Pozostała część łańcucha jest przeciągana do macierzy
mitochondrialnej dzięki energii z hydrolizy ATP.
5. Mitochondrialna peptydaza sygnałowa odcina helisę MTS.
6. Umieszczenie importowanego białka w matrix, część białek musi
ulec transportowi do przestrzeni międzybłonowej lub zakotwiczeniu
w wewnętrznej błonie. Takie białka zawierają dodatkowe sekwencje
sortujące, w procesach reeksportu do przestrzeni międzybłonowej
biorą udział dodatkowe białka kanałowe.
• Poza klasycznym szlakiem część białek związana z metabolizmem
lipidów dostaje się do mitochondriów wraz z lipidami SER. Transport
odbywa się z udziałem błon MAM (mitochondrion-associates ER-like
membranes).
• Hiperoksaluria typu I – jest recesywną chorobą uwarunkowaną
błędnym adresowaniem aminotransferazy alaninowo-glioksalowej
(AGT), będącej dimerycznym enzymem peroksysomów hepatocytów
uczestniczącym w metabolizmie kwasu szczawiowego. Wskutek
pojedynczej mutacji trafia błędnie do mitochondriów – powoduje
to w pierwszym roku życia powstawanie szczawianowych kamieni
nerkowych oraz wapnienie miąższu nerek. Pacjenci cierpią na napady
kolki nerkowej, krwiomocz i przed 20 rokiem życia nerki stają się
niewydolne.

Transport jądrowo-cytoplazmatyczny
• Wymiana między jądrem, a cytoplazmą sięga miliona cząsteczek na
minutę. Nasilenie ruchu odzwierciedla ilość porów jądrowych
(przeciętna zawiera 3-5 tys.).
• Bramkę między cytoplazmą a jądrem tworzą kompleksy pora jądrowego
– NPC (nuclear pore complex) zbudowane z 30 różnych nukleoporyn.
Układają się one w oktagonalny kompleks o masie 125 MDa,
zakotwiczony w błonie otoczki jądrowej.

36
• NPC ulegają rozpadowi podczas mitozy i są rekonstruowane na początku
interfazy. W komórkach zróżnicowanych terminalnie są one strukturami
statycznymi. Nukleoporyny nie ulegają wymianie co może doprowadzić
do uszkodzenia (procesy oksydacyjne), rozszczelnienia i upośledzenia
transportu (przyczyna starzenia komórek nie ulegających mitozie).
• NPC pozwalają na swobodny przepływ wody, metabolitów, jonów,
i cząstek o masie poniżej 60 kDa. Dla większych cząstek transport jest
możliwy wyłącznie gdy posiadają sekwencje sygnałowe np.: NLS
(nuclear localization signal). Jest ona dość zmienna, ma zasadowe reszty
aminokwasowe (argininy, lizyny).
• Białka ulegające reekosportowi z jądra do cytoplazmy posiadają
jądrowy sygnał eksportowy (NES – nuclear export signal) zbudowany
z sekwencji białka bogatej w leucynę.
• Gdy białka dotrą do jądra rozdzielają się między jąderka, ciałka jądrowe,
matrix i nukleoplazmę.
• Jąderkowe sekwencje sygnałowe (NOS – nucleolar targeting signal) są
dłuższe od NLS.
• Import i eksport odbywa się przez wiązanie białka zwierającego NLS lub
NES z odpowiednimi receptorami translokacji wzdłuż 200 nm drogi
przez NPC i uwolnienie na końcu. Często towarzyszy temu białko
adaptorowe pośredniczące w oddziaływaniu receptora z białkiem
transportowym.
• Cytoplazmatyczne importyny rozpoznają i wiążą NLS, a kompleks
oddziałuje z sekwencjami FG (duża zawartość reszt fenyloalaniny
i glicyny) na włókienkach cytoplazmatycznych NPC. Podobne sekwencje
FG występują na powierzchni nukleoporyny. Kompleks przyłącza się
i odłącza od sekwencji FG przesuwając się do wnętrza jądra
komórkowego gdzie ulega dysocjacji.
• Podobnie wygląda transport białek z NES do cytoplazmy, które są
rozpoznawane przez eksportyny, tworzącymi z nimi kompleks.
• Importyny i eksportyny są zwane łącznie karioferynami (jądrowe białka
przenośnikowe).
• Energię do transportu przez NPC dostarcza GTP-aza Ran, występująca
w dwóch różnych konformacjach zależnie czy złączona jest z GTP lub
GDP.
• Hydroliza zmieniająca Ran-GTP w Ran-GDP następuje w cytosolu,
a dysocjacja GDP i przyłączenie GTP w jądrze.
• Przyłączenie Ran-GTP do kompleksu importyny z białkiem powoduje
dysocjację, a przyłączenie do eksportyny stymuluje powstawanie
kompleksu.

37
 • Mechanikę eksportu i importu wykorzystują niektóre wirusy np.: HIV, po
dostaniu się do cytoplazmy jego RNA ulega odwrotnej transkrypcji do
DNA nazywanego prowirusem, które by dostać się do jądra wymaga
rozpadu otoczki jądrowej (mitozy). Zaraża on także nieulegające mitozie
makrofagi, komórki dendrytyczne, spoczynkowe limfocyty T i neurony
gdyż jego białko Vpr zapewnia import prowirusa – adaptor wiążący
prowirusa z importyną. Po dostaniu się do jądra prowirus integruje się
z genomem gospodarza i rozpoczyna się transkrypcja wirusowego RNA,
jego część zostaje pocięta i wyeksportowana jak mRNA, a część zostaje
by ulec upakowaniu w wiriony za co odpowiada białko Rev – adaptor
pomiędzy niepociętym RNA i eksportynami.

Krople lipidowe
• Jest do nich wyłapywany nadmiar kwasów tłuszczowych i steroli,
stanowią one źródło energii i budulca do tworzenia nowych błon
i syntezy horomonów steroidowych. Prócz adipocytów dużo kropli
lipidowych jest w komórkach gruczołu mlekowego, kory nadnerczy,
enterocytach i hepatocytach.
• Są dynamicznymi organellami, powstają w obrębie SER gdzie obecne są
esterazy kwasów tłuszczowych i cholesterolu, nie są one jednak
otoczone błoną. Ich rdzeń stanowią obojętne tłuszcze otoczone
pojedynczą warstwą fosfolipidów (przeważa fosfatydylocholina), ich
grupy polarne są skierowane do cytosolu gdzie oddziałują z białkami, a
ładunek odpycha od innych kropli lipidowych zapobiegając zlaniu.
• Gdy występuje nadmiar kwasów tłuszczowych krople ulegają szybkiemu
wzrostowi, dzięki esterazom związanym z ich powierzchnią. Gdy jest
zapotrzebowanie na energię aktywowane zostają powierzchniowe lipazy,
lub fagocytowane są mniejsze krople lipidowe.
• Ich rozmiar jest kontrolowany przez rodzinę białek PAT (adipophilin and
tail-interacting protein) do których należą:
◦ Adipofilina – uczestniczy we wczesnych etapach powstawania
i wzrostu kropli.
◦ Perilipina – przyłącza się do większych kropli.
• Białka PAT kontrolują aktywność związanych z kroplą lipaz i estreraz
oraz oddziałują z elementami szkieletu.
• Ich niedobór charakteryzuje stany niedożywienia, kacheksji
i lipodystrofii, a nadmierne odżywianie do hipertrofii i hiperplazji białej
tkanki tłuszczowej, przekroczenie zdolności adipocytów do gromadzenia
tłuszczu powoduje jego odkładanie w innych komórkach (hepatocyty-
stłuszczenie wątroby, nawet marskość, kardiomiocyty – niewydolność
mięśnia, makrofagi błony wewnętrznej tt. wieńcowych – uwolnienie
mediatorów zapalnych i wytworzenie niestabilnej płytki miażdżycowej).

38
Białka opiekuńcze
• Ok. 10% białek przybiera konformację odmienną od pożądanej
zwłaszcza gdy jest termodynamicznie korzystniejsza co prowadzi do
utraty właściwości lub niepożądanych funkcji. By tego uniknąć istnieją
białka opiekuńcze (chaperone) będące ATP-azami posiadającymi
wysokie powinowactwo do hydrofobowych odcinków łańcuchów
polipeptydowych co powoduje ich prawidłowe sfałdowanie (chowają się
do białka lub oddziałują z lipidami).
• Występują zarówno w cytosolu, w jądrze i w organellach błoniastych.
• Należą do dwóch głównych rodzin:
Hsp60 Tworzą kompleksy w kształcie pustego cylindra, składającego się
z wielu podjednostek, w jego wnętrzu źle sfałdowane białka ulegają
zmianom konformacji.
Hsp70 Działają jako monomery, wiążą się z odcinkami hydrofobowymi
nowo syntezowanych polipeptydów, oraz eksponowanymi po
denaturacji.
• Hsp oznacza biało szoku cieplnego (heat shock protein, wzmożoną
ekspresję wykryto w komórkach poddanych działaniu temperatury).
• Ulegają one ekspresji pod wpływem zbyt wysokiej i niskiej temperatury,
obecności jonów metali ciężkich, zmian osmolarności, promieniowania
jonizującego czy ekspresji zmutowanych lub wirusowych białek.
• Wykazują dużą odporność na czynniki denaturujące.
• Potrafią się wiązać z zdenaturowanymi i rozfałdowanymi białkami
przywracając im prawidłową konformację.
• Energia na rozplątanie nieprawidłowej konformacji pochodzi z hydrolizy
ATP zachodzącej pod ich wpływem.
• Gdy konformacji nie da się przywrócić białka ulegają zależnej od nich
ubikwitynacji.
• Nieprawidłowo sfałdowane białka mają tendencję do agregowania
(oddziaływanie elementów hydrofobowych) i wytrącają się z cytosolu
jako nierozpuszczalne ciałka inkluzyjne – agresomy co prowadzi często
do apoptozy komórki.
• Ich inną funkcją jest utrzymanie łańcucha w stanie niesfałdowanym.
• Priony – cząsteczki białka o nieznanej funkcji występujące w OUN,
mogą występować w dwóch konformacjach:
◦ Prawidłowej
◦ Scrapie – ma właściwość wiązania się z prawidłowymi
cząsteczkami białka prionowego i zamiany w scrapie (jak białka
opiekuńcze). Wywołuje ona postępującą gąbczastą degenerację
mózgu prowadzącą do zgonu (choroba Creutzfeldta-Jakoba).

39
Ubikwitynacja białek
• Pełni rolę etykiet adresowych. Podobną rolę pełnią białka SUMO (small
ubiquitin-like modifier).
• Przyłączenie jednej cząsteczki to monoubikwitynacja, a przyłączenie
złożonego łańcucha poliubikwitynacja. Przyłączenie kilku jej
cząsteczek w kilku miejscach polipeptydu to multiubikwitynacja.
• Ubikwityna to 76-aminokwasowy polipeptyd łączący się kowalencyjnie
z substratem wiązaniem izopeptydowym między resztą karboksylową
ostatniej glicyny ubikwityny, a resztą epsilon-aminową lizyny
substratów.
• Ubikwityna ma 7 reszt lizyny mogących ulegać ubikwitynacji tworząc
łańcuchy składające się z kilku-kilkunastu jej cząsteczek.
• Wymaga ona enzymów:
◦ Aktywujący ubikwitynę (E1) przez hydrolizę ATP
◦ Koniugujący ubikwitynę (E2)
◦ Ligaza ubikwityny (E3)
• System jest hierarchiczny i wymaga dwóch E1, kilkanaście E2
i kilkaset E3, które rozpoznają sekwencje strukturalne w obrębie
substratów często zależne od fosforylacji.
• Poliubikwitynacja łańcuchami łączonymi przez lizynę 48 prowadzi do
degradacji białek, lizyną 63 – uczestniczy w endocytozie, naprawie DNA
i przekazywaniu sygnałów związanych z procesami zapalnymi.
• Przyłączenie SUMO-1 powoduje redystrybucję z cytoplazmy do porów
jądrowych lub centrosomów.
• Enzymy deubikwitynujące robią co mają w nazwie.

Proteasomy
• Organelle występujące we wszystkich zbadanych komórkach
eukariotycznych i niektórych bakteriach. Mają wiele aktywności
proteolitycznych przez obecność 3 miejsc aktywnych skierowanych do
środka cylindra. Występują w dwóch postaciach:
Proteasomy Mają masę ok. 700 kDa. Zbudowane są z czterech pierścieni
20S ułożonych na kształt cylindra, każdy z nich składa się
(rdzeniowe) z 7 cząsteczek białka (podjednostek proteasomów). Degradują
jedynie krótkie peptydy i nieliczne niesfałdowane białka.
Proteasomy Powstają przez połączenie 20S z aktywatorem PA700
26S (czapeczka 19S). Degradują poliubikwitynowane sfałdowane
białka. PA700 umożliwia związanie znakowanego łańcucha,
rozwinięcie otworzenie kanału i wprowadzenie łańcucha do
środka, odłączenie poliubikwityny, i podział jej na monomery.
Energię dostarcza PA700 mające właściwości ATP-azy.

40
 • Ich główną rolą jest degradacja większości białek komórkowych,
rozpoznawanie i usuwanie tych które uległy denaturacji, oraz tych które
przybrały złą konformację. Mogą one pochodzić z cytoplazmy, jądra
i ER (ERAD), do tej kategorii zalicza się defektywne produkty
rybosomalne (DRiP – defectibe ribosomal products) – błędnie
zakończone, lub sfałdowane białka rozpoznane jeszcze z rybosomem.
• Rozkładają białka do peptydów o długości 8-15 aminokwasów,
a te ulegają dalszej degradacji zależnej od endo- i egozpetydaz
plazmatycznych.
• Stanowią ważne źródło peptydów ulegających importowi do ER przez
transporter TAP (transporter for antigen processing), na miejscu łączą się
z cząsteczkami MHC klasy I, a następnie ulegają egzocytozie
i prezentacji. System ten umożliwia prezentację peptydów pochodzących
z białek wirusowych, ponieważ proteasomy degradują DRiP z białek
wirusowych umożliwia to wczesne rozpoznanie przez układ
immunologiczny komórki zakażonej. Interferon gamma indukuje
ekspresję odmiennych podjednostek katalitycznych proteasomu
umożliwiając produkcję odmiennego repertuaru peptydów, proteasomy
z takimi podjednostkami to immunoproteasomy.
• Występują w jądrze komórkowym i cytoplazmie (skupiają się wokół
centrioli, tworząc centrum proteolityczne). Nie występują w świetle
organelli błoniastych.
• Centrum proteolityczne nie jest widoczne w zdrowych komórkach, ale
w warunkach upośledzonej proteolizy lub dużej ilości zdenaturowanych
białek tworzą się tam agregaty (agresomy), odpowiadają ciałkom
wtrętowym obserwowanym np. w chorobach Alzheimera i Parkinsona.
• Utworzone agresomy mogą być usunięte tylko drogą autofagocytozy.
• Jedną z ich kluczowych ról jest degradacja cyklin i innych regulatorów
cyklu komórkowego. Ich inhibitory są stosowane w leczeniu szpiczaka
mnogiego i innych nowotworów, hamują także odczyn zapalny przez
zapobieganie aktywacji czynnika NFκB.

Degeneracja związana z siateczką śródplazmatyczną (ERAD)

• RER ma system kontrolujący jakość wykrywający nadmiar
nieprawidłowych białek, ulegają one transportowi zwrotnemu do
cytoplazmy przez kompleks translokonu, a energię dostarcza duża
heksameryczna ATP-aza – białko zawierające walozynę (VCP – valosin
containing protein), które rekrutuje enzymy kaskady ubikwitynacji
i proteasomy 26S doprowadzając do degeneracji białek z ER.
• VCP pełni rolę białka opiekuńczego zapobiegając agregacji
transportowanych białek w cytosolu. Cały ten proces określa się ERAD
(ER-associated degradation).

41
 • Mutacja genu CFTR wywołuje mukowiscydozę. CFTR jest
transbłonowym białkiem kanałowym dla Cl-. Mukowiscydoza występuje
w 1:3000 urodzeń. W 80% polega na delecji 3 nukleotydów kodujących
fenyloalaninę 508 łańcucha polipeptydowego co prowadzi do
odmiennego fałdowania. Zmutowane białko CFTR jest w pełni sprawne,
ale ulega ERAD i nie dociera do nabłonka co powoduje zaburzenia
wydzielania wody i elektrolitów i zalegania gęstej wydzieliny w płucach
i trzustce, częste infekcje prowadzą do zgonu w 30-40 roku życia.
• HIV potrafi wykorzystać ERAD do usunięcia z ER prawidłowych białek
MHC klasy I i CD4 zapobiegając ich ekspresji na powierzchni komórki,
co odbywa się za pomocą oddziaływania białka Vpu wirusa
z cytoplazmatycznymi częściami MHC i CD4 co powoduje ich
ubikwitynację i degradację.

Odpowiedź rozfałdowanych białek (UPR)

• Prowadzi do niej przeładowanie ER nieprawidłowo sfałdowanymi
białkami z powodu zablokowania ERAD, nadmiernej syntezy
zmutowanych białek, infekcji wirusowej, lub innych czynników
uszkadzających. Inaczej UPR (unfolded protein response).
• W warunkach prawidłowych w ER występuje nadmiar BiP (fałdują
białka) które przyłącza się do luminalnych domen 3 białek efektorowych:
IRE1, PERK i ATF6. W kompleksie z BiP utrzymywane są
w nieaktywnej monomerycznej postaci, gdy pojawi się nadmiar
rozfałdowanych białek BiP odłącza się od nich, co umożliwia
dimeryzację białek efektorowych i ich następczą aktywację.
PERK Kinaza fosforylująca czynnik inicjacji translacji białek eIF2α, blokuje
syntezę większości nowych łańcuchów polipeptydowych.
IRE1 Endonukleaza wycinająca intron z mRNA dla czynnika
transkrypcyjnego XBP1, co umożliwia powstanie aktywnego czynnika
XBP1 indukującego wybiórczą transkrypcję genów dla czynników
przeciwdziałających nieprawidłowemu fałdowaniu białek (np.: BiP).
ATF6 Zdimerowane ulega transportowi do aparatu Golgiego, gdzie następuje
jego częściowa proteoliza uwalniająca domenę cytoplazmatyczną
posiadającą NLS. Aktywny fragment ATF6 dostaje się do jądra
i wspomaga działanie czynnika XBP1.
• Gdy synteza większości białek jest zablokowana mRNA ma specjalną
sekwencję umożliwiającą translację mimo fosforylacji eIF2α.
• Przedłużająca się odpowiedź UPR uruchamia apoptozę.

42
• W początkowym okresie cukrzycy typu II komórki β wysp ulegają
nadmiernej stymulacji do syntezy insuliny co prowadzi do przeładowania
ER i UPR, przedłużające się UPR prowadzi do apoptozy, zwiększając
obciążenie na produkcje insuliny co nasila apoptozę – powoduje to
spadek produkcji insuliny endogennej.

43
 ORGANIZACJA I FUNKCJONOWANIE JĄDRA KOMÓRKOWEGO

• Przedział komórki eukariotycznej gdzie zgromadzone jest 99% genomu

(reszta to mtDNA). Kontroluje ono najważniejsze funkcje: replikację
DNA i transkrypcję.
• Jego wielkość, kształt i organizacja materiału genetycznego jest zależna
od stanu czynnościowego i typu komórki:
◦ W młodych proliferujących komórkach znajdują się duże koliste
jądra z wyraźnym jąderkiem i rozproszoną chromatyną.
◦ Jądra komórek dojrzałych mają mniej regularne kształty, starym,
o małej aktywności metabolicznej towarzyszy kondensacja
(karyopyknosis) lub fragmentacja (karyorhexis) chromatyny
(są one także spostrzegane w stanach chorobowych).
◦ Zmienia się w poszczególnych fazach cyklu komórkowego (kuliste,
niewielkie jądra G1 przechodząc w G2 zwiększają rozmiary i tracą
regularność kształtu).
• Ich średnica mieści się w przedziale 3,5-20 µm.
• Występuje we wszystkich komórkach człowieka prócz dojrzałych
erytrocytów i komórek warstwy rogowej naskórka.
• Większość komórek ma jedno jądro (monokariocyty), czasem dwa
(bikariocyty np.: hepatocyty) lub wiele (polikariocyty np.: osteoklasty).
• Wprowadzenie do badań ultrastruktury jądra takich jak kontrastowanie
z EDTA, autoradiografia wysokorozdzielcza, rozpraszanie chromatyny
by uwidocznić procesy transkrypcyjne, metod ultracytochemicznych,
hybrydyzacji in situ, cytomerii przepływowej, umożliwiło lokalizację
procesów replikacji, transkrypcji, dojrzewania i transportu różnych
typów RNA w przestrzeni interchromatynowej.
• W strukturze jądra interfazalnego można wyróżnić domeny którym są
przypisywane określone funkcje.

Otoczka jądrowa
• Dynamiczna, asymetryczna struktura, zanika w późnej profazie
rozpadając się na pęcherzyki. Ulega odtworzeniu z pomocą ER
w telofazie.
• Wymiana jądrowo-cytoplazmatyczna odbywa się z udziałem porów
jądrowych z udziałem jądrowych kompleksów porowych (NPC).
• W jej obrębie wyróżnia się:
◦ Wewnętrzną błonę jądrową
◦ Zewnętrzną błonę jądrową (cytoplazmatyczną)

44
 ◦ Przestrzeń okołojądrową (perynuklearną) między obiema błonami
(40 nm).
◦ Pory jądrowe
◦ Blaszkę jądrową (laminę) przylegającą do wewnętrznej powierzchni
błony, wchodzi w skład macierzy jądrowej.
• Na błonie zewnętrznej znajdują się rybosomy i jest związana z RER.
• Skład białkowy po obu stronach jest inny.
• Wybiórczo i aktywnie uczestniczy w transporcie RNA do cytoplazmy,
w przeciwnym kierunku są przenoszone białka strukturalne
i czynnościowe (enzymy, czynniki transkrypcyjne, niskocząsteczkowe
RNA).

Jądrowy kompleks porowy

• Jest osadzony w porze jądrowym, ma średnicę 120-150 nm.
• Ich liczba zależy od wieku, aktywności i typu komórki. Przeciętnie jest
ich 10-20 porów/mm2 (dla hepatocytu to 3000-7000, a w otoczce
komórek o wysokiej aktywności może ich być 50 mln).
• Każdy jest oktagonalną strukturą białkową, tworzą go 3 współosiowo
położone pierścienie:
◦ Pierścień cytoplazmatyczny (zewnętrzny) od strony blaszki
zewnętrznej otoczki jądrowej.
◦ Pierścień jądrowy (wewnętrzny) od strony nukleoplazmy.
◦ Kompleks 8 promieniście wpuklających się do kanału segmentów
(zrąb podstawny, przypomina szprychy koła) tworząc kompleks
kanału centralnego.
• Kompleks porowy jest zakotwiczony w otoczce przez jedną
z 4 podjednostek z których jest zbudowana każda ze szprych. Ułożenie
sąsiednich szprych warunkuje że pomiędzy nimi, a błoną otoczki
powstaje 8 kanałów peryferycznych (obwodowych) o średnicy 10 nm,
są one pewno miejscem dyfuzji jonów i cząsteczek niewielkiej średnicy.
• W pierścieniu cytoplazmatycznym jest zakotwiczone 8 filamentów
białkowych długości 100 nm, podobne są zakotwiczone w wewnętrznym
i skierowane do pierścienia końcowego, tworząc strukturę średnicy 30-50
nm (koszyk).
• W jego strukturze zidentyfikowano kilkadziesiąt nukleoporyn,
odgrywających rolę w przekaźnictwie jądrowo-cytoplazmatycznym.
• Jego kanał centralny zawiera czasem kompleks kanału centralnego
(transporter, czop, ziarnistość centralna), zmiana jego struktury sugeruje
że reprezentuje on transporterową molekułę (kargo) przechodzącą przez
jądrowy kompleks porowy.

45
Blaszka jądrowa
• Stała struktura grubości 10-100 nm przylega do nukleoplazmatycznej
powierzchni otoczki jądrowej.
• Składa się z sieci delikatnych włókienek białkowych, które są
zbudowane lamin stanowiących 25-50% białek otoczki. Wyróżnia się
3 rodzaje lamin (A, B, C). Ze względu na duże podobieństwo
aminokwasowe oraz strukturalne do filamentów pośrednich są zaliczane
do białek szkieletu jądra (nuclear matrix).
• Jej białka stanowią zrąb otoczki jądrowej i porowatego kompleksu
jądrowego, nadając jądru odpowiedni kształt.
• Laminy są zaangażowane w proces fragmentacji i odbudowy otoczki
podczas podziału mitotycznego.
• Uczestniczy w organizacji chromatyny.

Wymiana jądrowo-cytoplazmatyczna
• Kanały peryferyczne jądrowych kompleksów porowych umożliwiają
przemieszczanie jonów, metabolitów i protein poniżej 40 kDa
w wyniku nieselektywnej dyfuzji.
• Transport przez kanał centralny ma charakter aktywny, służy do
transportu cząsteczek o charakterze RNP, polimeraz i lamin.
• Większe cząsteczki protein wymagają specjalnego przenośnika. Proteiny
pokonujące kanały jądrowe posiadają sekwencje sygnałowe NLS i NES.
• NLS występuje w dwóch postaciach, podstawowe są rozpoznawane
przez importynęα, przenoszącą przez białko zawierające podstawowy
typ NLS w połączeniu z importynąβ1.
• Rodzina białek importynyβ1 może rozpoznawać NLS i transportować je
przez kompleks porowy samodzielnie.
• Kompleks podczas transportu wchodzi w chwilową interakcję z
nukleoporynami FG (zawierają powtórzenia fenyloalanina-glicyna).
W obrębie jądra związanie Ran-GTP z importynąβ1 prowadzi do zmian
konformacyjnych – od importyny odłącza się białko.
• Zmiana konformacji GTP/GDP wpływa na siłę interakcji białka
z transportowanym kompleksem.
• Wymiana z jądra do cytoplazmy (głównie cząsteczki RNP –
RNA + białko) także odbywa się przez kompleks porowy, z udziałem
sekwencji NES (bogatej w leucynę). Jest ona rozpoznawana przez
CRM1/eksportynę 1.
• Czynnik CRM1 (z rodziny importyn) wiążąc Ran-GTP tworzy
z białkiem trójczłonowy kompleks, który po przejściu przez NPC
uwalnia białko w wyniku konwersji Ran-GTP do Ran-GDP.
• Niektóre proteiny z rodziny importynβ uczestniczą w transporcie w obu
kierunkach.

46
Macierz jądrowa (matrix, nukleoszkielet, szkielet jądrowy NM)
• Pozachromatynowa struktura powstała po trawieniu jądra komórkowego
buforami o wysokiej sile jonowej, niejonowymi detergentami
i nukleazami.
• Jej strukturę tworzą 3 elementy odpowiadające określonym domenom
jądra:
◦ Blaszka jądrowa z NPC – pozostałość otoczki jądrowej.
◦ Jąderka resztkowe
◦ Włóknisto-ziarnista sieć pozająderkowa znajdująca się
w przestrzeni interchromatynowej – tworzy tzw. macierz
wewnętrzną (internal matrix)
• Jej ultrastruktura i skład chemiczny zależą od zastosowanej procedury
ekstrakcji jąder komórkowych.
• W jej skład wchodzi 98% białek i niewielkie ilości kwasów
nukleinowych i fosfolipidów.
• Tworzą ją włókienka o średnicy 3-5 nm, składające się z białek matryn.
• Wśród niehistonowych białek macierzy wyizolowano laminy, białka
Ag-NOR, aktynę i białka nukleoprotein jądrowych.
• Poza włóknami – matrycyną jej strukturę tworzą gęste elektronowo
ziarna o średnicy 15 nm – są one kojarzone ze składnikiem ziarnistym
jąderka co sugeruje udział macierzy jądrowej w wymianie jądrowo-
cytoplazmatycznej.
• Bierze udział w metabolizmie jądra. Funkcje (hipotetyczne):
◦ Organizacja strukturalna jądra i chromatyny.
◦ Z jej filamentami są związane wieloenzymatyczne kompleksy
replikacyjne.
◦ Uczestniczy w regulacji ekspresji genów.
◦ Bierze udział w transkrypcji i dojrzewaniu pre-rRNA i hnRNA
i transporcie prekursorów rybosomów do cytoplazmy.
◦ Wiąże hormony steroidowe i karcynogeny.
◦ Bierze udział w wirogenezie, fosforyluje białka wirusowe.

Budowa i struktura kwasów nukleinowych

DNA
• Jest polimerem (polinukleotydem), a jego monomerami są
deoksyrybonukleotydy. Każdy z nich składa się z cukru deoksyrybozy,
zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego.
◦ Puryny: adenina (A), guanina (G)
◦ Pirymidyny: cytozyna (C) i tymina (T)

47
 • Deoksyroboza łączy się grupami hydroksylowymi 5' i 3' z grupami
fosforanowymi tworząc szkielet cukrowo-fosforanowy.
• Nukleozyd to zasada połączona z deoksyrybozą, a dodatkowo z grupą
fosforanową to nukleotyd.
• Nukleotydy łącząc się wiązaniami kowalencyjnymi tworzą łańcuchy.
• Reguła komplementarności A-T, G-C.
• Połączenia prowadzą do najkorzystniejszej energetycznie formy helisy.

Formy przestrzenne DNA

• Obydwa łańcuchy DNA biegnąc w przeciwnych kierunkach wykazują
odwrotną polarność określaną końcami 3' i 5'.
• Jeśli jeden łańcuch ma polarność 3'→5' to komplementarny ma 5'→3'.
• Oba łańcuchy są skręcone w dwuniciową helisę (zasady wewnątrz,
szkielet cukrowo-fosforanowy na zewnątrz).
• Reguła komplementarności wymusza proporcję nukleotydów, z której
wynika, że A do T i G do C = 1:1 – reguła Chargaffa.
• Stosunek A+T do C+G jest stały dla gatunku i dla człowieka wynosi
1,4:1.
• Średnica helisy wynosi 2 nm. W dwóch łańcuchach skręconych zgodnie
z ruchem wskazówek zegara na jeden skręt przypada 10 nukleotydów,
odległość między nimi wynosi 0,34 nm co daje skok spirali 3,4 nm.
• U człowieka DNA zawiera 5,6 x 109 polinukleotydów, odpowiada to
długości łańcucha 1,74 m.
• Można wyróżnić 4 poziomy organizacji przestrzennej DNA
◦ Pierwszorzędowa – kolejność nukleotydów
◦ Drugorzędowa – dwa połączone wiązaniami wodorowymi łańcuchy
◦ Trzeciorzędowa – ułożenie przestrzenne helisy (do jej zaburzenia
dochodzi podczas denaturacji).

Plastyczność DNA
• Może ona występować w formie kolistej, liniowej, a u niektórych
wirusów w formie jednoniciowej.
• Podwójna helisa może występować w formach przestrzennych:
A Rzadko występująca, prawoskrętna alternatywa B o największej średnicy
i najmniejszym skoku uzwojenia.
B Najbardziej rozpowszechniona, prawoskrętna, ma rowek większy
i mniejszy. Jest typowa dla roztworów fizjologicznych.
Z Lewoskrętna, jej szkielet ma zygzakowaty kształt. Występuje gdy
nukleotydy purynowe i pirymidynowe występują w łańcuchu
naprzemiennie. Ma mniejszą średnicę od B i tylko jeden rowek.

48
Skład i struktura RNA
• Cukrem jest ryboza, tymina jest zastąpiona uracylem. Występuje
w formie jednoniciowej pofałdowanej cząsteczki (czasem dwuniciowe).

Replikacja DNA
• Wieloetapowy proces wieloenzymatyczny skutkujący powieleniem
cząsteczek DNA w fazie S cyklu.
• Odwzorowaniu ulega każdy z łańcuchów helisy.
• Jest katalizowana przez aparat replikacyjny (enzymy rozplatające,
białka stabilizujące jednoniciowy DNA, polimerazy DNA).
• Na każdym z łańcuchów z szybkością 50 nukleotydów/s są montowane
komplementarne łańcuchy potomne.

Początek replikacji
• Rozpoczyna się z udziałem białek inicjujących replikację w miejscu
inicjacji – ori (origin). Określone sekwencje dwuniciowego DNA są
rozpoznawane przez białka inicjujące i oddzielające oba łańcuchy
(helikazy). Następnie białka wiążące jednoniciowy DNA (SSB – single
strand binding) stabilizują pojedyncze łańcuchy DNA tworząc widoczne
w ME widełki replikacyjne.

Widełki replikacyjne
• W każdym miejscu rozpoczynającym replikację znajduje się para
przeciwstawnie ułożonych widełek replikacyjnych, w ich obrębie
replikacja zachodzi dwukierunkowo.
• Polimeryzację katalizuje polimeraza DNA, łańcuch zawsze powstaje
w kierunku 5'→3', a kolejność polimeryzacji wyznacza sekwencja
nukleotydów matrycowego DNA.
• Źródłem energii jest hydroliza ATP.

Przebieg replikacji
• Do rozpoczęcia jest potrzebny jest enzym – prymaza polimeryzujący na
matrycy 9-10 nukleotydowy starter (primer).
• Po utworzeniu startera polimeraza przyłącza w kierunku 5'→3'
nukleotydy.
• Na łańcuchu w kierunku 5'→3' synteza odbywa się ciągle, a łańcuch
potomny nosi nazwę nici wiodącej (leading strand), drugi łańcuch jest
syntezowany w postaci 100-300 pnt – fragmentów Okazaki. Jest on
nazywany nicią opóźnioną (lagging strand).
• Do rozpoczęcia syntezy w miejscu ori nici wiodącej potrzebny jest jeden
stater. Polimeryzacja nici opóźnionej wymaga wielu fragmentów
starterów.

49
 • Fragmenty Okazaki są łączone kowalencyjnie z udziałem białek
enzymatycznych. Najpierw usuwają starter i za pomocą nukleazy
wymieniają go na DNA, potem polimeraza naprawcza DNA łączy
poszczególne deoksyrybonukleotydy, następnie ligaza łączy fragmenty.
• Wydłużanie łańcucha potomnego DNA odbywa się w ścisłym
powiązaniu z przesuwaniem aparatu replikacyjnego wzdłuż DNA.
• Proces korygowania błędów przez polimerazę nazywa się
redagowaniem. Replikacja jest bardzo precyzyjna i błąd trafia się raz na
107 nukleotydów. W czasie redagowania polimeraza przyłącza nowy
nukleotyd tylko w wypadku poprawnego sparowania poprzedniego
nukleotydu. Aktywność nukleoazowa polimerazy ujawnia się tylko
w wypadku źle sparowanych poprzedzających nukleotydów.

Współpraca białek aparatu replikacyjnego

• Ważną rolę odgrywa ruchoma obręcz umożliwiająca ślizgowe ruchy
polimerazy wzdłuż łańcucha DNA, zabezpiecza ona ścisłe połączenie
polimerazy z matrycą tworząc pierścień.
• Na nici opóźnionej białko ruchomej obręczy po syntezie każdego
fragmentu Okazaki jest uwalniane od DNA.

Naprawa DNA
• Zapewnia stabilność DNA i integralność genomu. Wierność
i powtarzalność jest możliwa dzięki mechanizmowi korektroskiemu
związanemu z polimerazą DNA.
• Błędy replikacji mają najczęściej charakter przejściowy gdyż są szybko
korygowane przez różne systemy naprawy DNA. Jeśli nie zostaną
usunięte mogą prowadzić do mutacji, a te do śmierci komórki.
• Większość błędów sekwencji DNA powstaje w czasie replikacji.
Uszkodzenia mogą też być wywołane przez czynniki fizyczne
i chemiczne obecne w otaczającym środowisku. Możliwość powstawania
i utrwalenia zmian w DNA jest warunkiem tworzenia zmienności
genetycznej.

Mechanizm naprawy DNA

• Pierwszym zabezpieczeniem jest aparat replikacyjny komórki – dzięki
niemu błędy 1 na 107 nukleotydów są w 99% korygowane – po replikacji
1 błąd na 109 nukleotydów.
• Występuje ponad 70 genów których produkty uczestniczą w naprawie
DNA.

50
Naprawa przez bezpośrednią rewersję uszkodzenia
• W czasie trwania integralność łańcucha zostaje zachowana.
• Odbywa się z udziałem:
◦ Metylotransferazy – katalizuje przeniesienie grup alkilowych
z zasad azotowych na cysteinę (wewnętrzny akceptor) – jej
najwyższą aktywność stwierdzono w wątrobie, a najniższą
w komórkach prekursorowych szpiku. Jej ekspresja zmniejsza się
w komórkach nowotworowych.
◦ Fotoliazy DNA – usuwają dimery pirymidynowe i rozszczepiają
fotoprodukty pirymidynowe z utworzeniem zasad wchodzących
w ich skład.

Naprawa rzez wycinanie zasad azotowych

• W pierwszym etapie następuje hydroliza wiązania glikozydowego przez
glikozylazy DNA – grupa kilkunastu enzymów różniących się
swoistością substratową. W wyniku ich działania powstaje w DNA wolne
miejsce – miejsce AP (acceptor place). Następnie endonukleazy AP
hydrolizujące wiązanie 5'-fosfodiestrowe między nukleotydem po stronie
5' uszkodzenia a deoksyrybozą już pozbawioną zasady, przecinają
łańcuch, powstały ubytek jest wypełniany przez polimerazy, a ligazy
łączą potem nić w jeden łańcuch.

Naprawa przez wycinanie nukleotydów

• Po rozpoznaniu uszkodzenia zależna od ATP endonukleaza nacina DNA
po obu stronach uszkodzenia (odbywa się to z kompleksem białek
pomocniczych).
• Helikazy rozwijają nić DNA wraz z ATP. Endonukleazy trawią nić
w miejscach zetknięcia z podwójną helisą (najpierw po stronie 3')
i 30 nukleotydowa sekwencja wraz z częścią białek pomocniczych
zostaje odłączona.
• Następnie kompleks replikacyjny składający się z polimeraz DNA
połączonych z PCNA i czynnikiem replikacyjnym C (RFC –
replication factor C) jako kofaktorami reakcji syntezuje nić DNA.
• Obydwa kofaktory biorą udział w inicjacji syntezy.
• Po wypełnieniu powstałej przerwy końce są łączone przez ligazę DNA.
• Jest to szlak podstawowy usuwający większość uszkodzeń.
• Szybkość zależy od stopnia zaburzenia drugorzędowej struktury DNA.
• Większe zniekształcenia helisy wywołane UV są usuwane szybciej niż
niewielkie zaburzenia struktury drugorzędowej.
• Z niewydolnością systemu jest związana zwiększona zachorowalność na
nowotwory i zaburzenia wzrostu, opóźnienie rozwoju umysłowego,
postępujące zwyrodnienie układu nerwowego i zmiany skórne.

51
 • U chorych na xeroderma pigmentosum rak skóry występuje 1000 razy
częściej. W tym schorzeniu stwierdzaj się defekt genu jednej z helikaz.
W komórkach eksponowanych na światło następuje nagromadzenie
dimerów pirymidynowych (zmiany występują tylko u osób narażonych
na promieniowanie).
• Alternatywną drogą naprawy przez wycinanie jest szlak związany
z transkrypcją, uczestniczy on w naprawie uszkodzeń blokujących
syntezę mRNA przeprowadzaną przez Pol II RNA. Mechanizm nie jest
wyjaśniony, ale uczestniczą w nich białka CSA i CSB zmieniające
konfigurację przestrzenną chromatyny i ułatwiające dostęp czynnikom
naprawczym. Z defektem ich genów jest związany zespół Cockayne'a
(CS) w którym występują zaburzenia transkrypcji i brak preferencyjnej
naprawy transkrybowanego DNA. Charakteryzuje się karłowatym
wzrostem, niedorozwojem umysłowym, postępującym zwyrodnieniem
układu nerwowego, uszkodzeniem narządu wzroku i słuchu,
małogłowiem, obniżeniem odporności, przyspieszeniem procesu
starzenia,

Naprawa błędnie sparowanych zasad

• Uczestniczy w usuwaniu błędów aparatu replikacyjnego nie
skorygowanych przez polimerazy DNA. Usuwa też złe sparowania
powstałe w wyniku rekombinacji i działania związków chemicznych
(błędy te nie usunięte mogą skutkować powstaniem mutacji
punktowych).
• Mutacje genów tego systemu są związane z występowaniem raka jelita
grubego (jeśli u osoby która odziedziczyła gen nastąpi uszkodzenie
drugiej kopii to powstaje duże ryzyko transformacji nowotworowej).
• Źle sparowane zasady zaburzają geometrię helisy i są rozpoznawane
przez białka naprawiające co skutkuje przecięciem fragmentu nowo
powstałej nici, lukę wypełnia polimeraza i ligaza DNA.
• Przykładem mutacji punktowej jest niedokrwistość
sierpowatokrwinkowa (drepanocytoza). Zmiana w genie hemoglobiny
jednej adeniny na uracyl sprawia że w łańcuchu kwas glutaminowy
zostaje zastąpiony waliną, co zmienia właściwości fizykochemiczne
cząsteczki hemogloiny HbS która łatwiej podlega krystalizacji. Powstałe
agregaty krwinkowe utrudniają przepływ przez narządy, co wywołuje
bladość powłok (zawały), owrzodzenia podudzi, zmiany kostne
i neurologiczne, uszkodzenia serca i nerek oraz skłonność do zakażeń.

Naprawa przez rekombinację

• Uczestniczy w naprawie pęknięć dwuniciowych (ich następstwem mogą
być aberracje chromosomowe).

52
 • Jest ona związana w komórkach eukariotycznych z fazą cyklu. Istnieją 3
szlaki:
Rekombinacja Dominuje w późnej fazie S i G2. Do odtworzenia struktury
homologiczna chromosomu wykorzystuje jego nieuszkodzony homolog.
Po pęknięciu obu nici jedna jest trawiona przez
egzonukleazy do wytworzenia odcinka jednoniciowego
z wolnym końcem 3'. W następnym etapie jest on łączony
z prawidłowym chromosomem homologicznym służącym
jako matryca dla odtwarzanej sieci.
Dopasowanie Białka naprawcze wykorzystują sekwencje powtórzone
pojedynczych w sąsiedztwie pęknięcia do dopasowania i połączenia dwóch
nici DNA fragmentów DNA. Nici odcinków niehomologicznych
między pęknięciami są przemieszczane poza helisę,
a następnie usuwane co decyduje o stosunkowo dużej
wierności.
Rekombinacja Dominuje w fazie G1 i wczesnej S. Odbywa się z udziałem
niehomologiczna kinazy białkowej zależnej od DNA (DNA-PK)
przyłączającej się do końca dwunicowego DNA, jedna
z dwóch podjednostek o właściwościach zależnej od ATP
helikazy zapewnia orientację przestrzenną nici podczas
procesu ligacji, a druga przeprowadza fosforylację białek
uczestniczących w naprawie pęknięcia DNA.

Organizacja strukturalna chromatyny

• Cząsteczka DNA występuje w połączeniu z histonami, białkami
niehistonowymi tworząc włókno deoksyrybonukleinowe (DNP).
• Kompleks DNA z białkami tworzy złożoną strukturę chromosomów
metafazowych, a także w chromatynie jądra interfazalnego.
• Połączenie DNA z białkami decyduje o właściwościach
konformacyjnych chromatyny i stopniu upakowania DNA
w chromosomach.
• Białka stanowią połowę masy chromatyny.
• Poziom kondensacji zmienia się w fazach cyklu komórkowego
(najbardziej skondensowane w metafazie, rozwinięte włókna DNP
w interfazie).
• Jej zmiany konformacyjne są związane z aktywnością matrycową.
• W czasie przygotowania do mitozy następuje stopniowa kondensacja
włókna nukleohistonowego.

53
Skład chromatyny
• Większość białek stanowią histony, są one zasadowe o masie 10-23
kDa. Zwierają dużo dodatnio naładowanych aminokwasów – lizyny
i argininy (stanowią 20-30 %) i nieznaczne ilości cystyny i cysteiny.
• Dodatnie ładunki umożliwiają silne, kowalencyjne wiązanie z ujemnie
naładowanymi resztami kwasu fosforowego.
• Różna zawartość lizyny i argininy oraz proporcje aminokwasów
kwaśnych i zasadowych pozwoliły wyróżnić 5 klas histonów.
H2A H2B Histony rdzeniowe, występują w chromatynie w podobnych
H3 H4 ilościach.
H1 Ma największą masę (23 kDa), i cechuje się różnorodnością
sekwencji u różnych gatunków jak i w obrębie tego samego
gatunku. Nie wchodzi w skład nukleosomu. Można go najłatwiej
wyizolować z chromatyny. Jest on położony po tej samej stronie
nukleosomu, gdzie DNA rozpoczyna nawijanie na rdzeń histonowy
i opuszcza nukleosom. Łącząc się z 10 parami DNA wchodzącego
i 10 wychodzącego z nukleosomu chroni 20 par nukleotydów
i cząstkę rdzeniową przed strawieniem nukleazą. Struktura
chromatyny zawierająca cząstkę rdzeniową, H1 i chronione 20 pnt
to chromatosom.
• Histony nie wykazują swoistości gatunkowej, określony organizm ma
zazwyczaj kilka różniących się histonów określonej klasy zależnie od
tkanki.
• Grupa białek niehistonowych obejmuje polipeptydy specyficzne dla
tkanki, gatunku, stanu czynnościowego jądra. Można wśród nich
wyróżnić także białka enzymatyczne (związane z metabolizmem
i syntezą kwasów nukleinowych), modyfikujące białka jądrowe
i regulatorowe, oraz strukturalne.
• Acetylowanie (aktywowane) i deacetylowanie (wyciszane) reszt
lizynowych białek histonowych sprawia że DNA staje się bardziej lub
mniej dostępne.
• Inną metodą modyfikacji jest metylacja – wycisza geny na całe życie
i jest dziedziczna, metylowana jest cytozyna. Jej przykładem są ciałka
Barra – nieaktywne chromosomy X u kobiet. W nowotworach
obserwuje się hipermetylację supresorów i hipometylację onkogenów.

Włókno nukleosomowe (nukleofilament)

• Trawienie preparatów swoistymi nukleazami mikrokokowymi
hydrolizującymi wiązania fosfodiestrowe doprowadziło do
wyizolowania fragmentów (200 polinukleotydów) DNA związanych
z białkami i odcinków DNA pozbawionych białka.

54
 • Zwane też włóknem 10 nm, stanowi 2 poziom organizacji chromatyny.
• Metodą łagodnej izolacji w ME można uwidocznić podstawową strukturę
chromatyny przypominającą sznur korali.
• „Koraliki” związane z DNA nawiniętym na nie prawie dwukrotnie to
kompleksy DNA i histonów – nukleosomy.
• Krótkie trawienie swoistymi nukleazami oddziela fragment helisy
między poszczególnymi nukleosomami ukazując DNA łącznikowy.
• Nukleosom zawiera dwuniciowy DNA o długości 200 p.z. tworzący
w postaci lewoskrętnej helisy 2 zwoje wokół oktameru histonów H2A,
H2B, H3 i H4.
• Przy dalszym trawieniu otrzymuje się krótszy silniej połączony
z oktamerem fragment nukleosomu tworzący razem z nimi rdzeń
nukleosomu. Ma on wysoce konserwatywny charakter, a łącznikowy
DNA jest tkankowo swoisty.
• Nukleosom przyjmuje kształt spłaszczonego klinowato dysku
o wysokości 5,7 nm i średnicy 11 nm. Składa się na niego tetramer
z histonów H3 i H4 oraz 2 dimery histonów H2A i H2B, na nie jest
nawinięte superhelikalne DNA typu B tworząc 1,75 zwoju średnicy 11
nm (80 par polinukleotydów).
• Jedno nawinięcie powoduje 7-krotne skrócenie DNA.
• Nukleosomy uczestniczą w transkrypcji i replikacji, zmienia się wtedy
ich struktura przestrzenna.

DNA łącznikowy
• Grube odcinki podwójnego łańcucha DNA o grubości 1,5 nm i długości
20-95 polinukleotydów. Jego długość jest swoista dla różnych
organizmów typów komórek.

Solenoid (włókno 30 nm)

• Znajduje się zarówno w jądrach interfazalnych jak i w chromosomach.
• Powstaje w wyniku superspiralizacji nukleofilamentu.
• Włókno jest w nim zwinięte lewoskrętnie, na jeden obrót przypada 6-8
nukleosomów.
• Skok spirali i średnica wewnętrznego otworu wynosu 10 nm.
• Kluczową rolę w zwiększeniu upakowania odgrywa H1 umożliwiający
zwinięcie chromatyny.
• Spłaszczone powierzchnie nukleosomów układają się równolegle do osi
długiej solenoidu.
• Powoduje 7 krotne pozorne skrócenie – stopień skrócenia w porównaniu
z włóknem nukleosomowym wynosi 40.

55
 • W warunkach doświadczalnych zamiast cylindrycznych solenoidów
można uzyskać globularne superkoraliki (superbeads) składające się z 12
ciasno upakowanych nukleosomów.

Pętle włókien chromatynowych (domeny)

• Pętle solenoidu tworzą struktury wyższego rzędu – domeny poprzez
zakotwiczenie w białkowym rusztowaniu matrix (białka NHP) lub
blaszce jądrowej.
• Zawierają 60-100 tys. polinukleotydów, ich długość wynosi 0,5 µm. Ich
obecność zwiększa współczynnik upakowania do ok. 1700.
• Najbardziej skondensowaną formę chromatyny prezentuje chromosom
interfazowy w którym przy zachowanej strukturze włókna 30 nm
współczynnik upakowania wynosi ok. 10000.

Strefa interchromatyny (IS)

• Przestrzeń między skupieniami chromatyny.
• Ograniczona otoczką nukleoplazma tworzy wyraźnie oddzielony
przedział. Początkowo uważana za strukturę amorficzną. Prócz jąderek
można wyróżnić PG, PF, IG, IF i NB.

Ziarna perychromatny (PG)

• Najwyraźniejsza struktura sfery perychromatynowej, stanowią domenę
jądra związaną z transkrypcją i formowaniem mRNA. Prawdopodobnie
reprezentują formę transportową pozająderkowego mRNA.
• Są regularne, kuliste, mają wysoką gęstość elektronową i średnicę 40-50
nm. Zlokalizowane są w strefie brzeżnej skupień chromatyny
skondensowanej.
• Najczęściej spotykane pojedynczo (z wyjątkiem warunków
eksperymentalnych – po zahamowaniu transportu mRNA gromadzą się
w jądrze).
• Po częściowym rozproszeniu chromatyny można dostrzec że PG jest
połączone z chromatyną cienkim rybonukleinowym włóknem.
• W pozająderkowych kompleksach transkrypcyjnych (po rozproszeniu
chromatyny) PG są widoczne na końcach transkryptów.
• Po rutynowym kontrastowaniu preparatów mają wyraźne „halo” co
pozwala je odróżnić od otaczającej chromatyny.
• Składają się z cienkich włókien utworzonych przez rybonukleoproteidy,
a ich związek z niskocząsteczkowymi RNA (U6snRNA) pozwala na
domysły że biorą udział w składaniu mRNA.

56
Włókna perychormatyny (PF)
• Są zlokalizowane w strefie brzeżnej chromatyny skondensowanej
w postaci dobrze kontrastującej na tle prześwietlonej w barwieniu
preferencyjnym z EDTA chromatyny.
• Są nieregularnie zwinięte i mają średnice 3-4 nm. Zwierają heterogenny
jądrowy RNA będący prekursorem mRNA (pre-mRNA).
• Po stymulacji transkrypcji pozająderkowego RNA tworzy się wyraźna
sfera zagęszczenia PF w postaci otoczki między chromatyną
skondensowaną a przestrzenią interchromatynową.
• Zablokowanie transkrypcji hnRNA powoduje zanikanie PF
w przestrzeni okołochromatynowej. Strefa brzeżna między chromatyną
skondensowaną, a przestrzenią interchromatynową a jąderkiem jest więc
najbardziej czynną domeną jądra.
• Synteza pozająderkowego, heterogennego RNA zawartego we włóknach
perychromatyny jest ściśle skorelowana z szerokością strefy zagęszczeń
odpowiadającej nagromadzeniu PF.
• Zastosowanie autoradiografiografii na poziomie ME oraz rozproszenia
chromatyny do uwidocznienia kompleksów transkrypcyjnych pozwoliło
ustalić że PF reprezentują cząsteczki RNP przyczepione do matrycy
DNA w przebiegu transkrypcji (odpowiadają pozająderkowym
kompleksom transkrypcyjnym).

Ultrastruktura pozająderkowych kompleksów transkrypcyjnych.

• Ich morfologia to obrazy genów hnRNA podczas pracy. Różni się ona
od aktywnych genów jąderkowych (rDNA), w przeciwieństwie do nich
rozmieszczenie RNP (transkrytpów) przyczepionych do osi DNA jest
nieregularne, nie mają charakterystycznej wzrastającej długości co nie
pozwala na określenie kierunku transkrypcji. U podstawy transkryptów
widoczne są cząsteczki Pol II Ena, a obecne na ich końcach granule
odpowiadają wielkością PG i reprezentują prawdopodobnie zwiniętą
formę transportową pre-mRNA.

Włókna interchromatyny (IF)

• Wykryte najpóźniej ze wszystkich struktur RNP przestrzeni
interchromatynowej.
• Mogą być uwidocznione w kontrastowaniu preferencyjnym EDTA oraz
po zastosowaniu autoradiografii wysokorozdzielczej.
• Reprezentują morfologiczny wykładnik transportu PF
w nukleoplazmie i korespondują z izolowanymi cząsteczkami hnRNP
w czasie ich migracji w przestrzeni interchromatynowej.

57
Ziarna interchromatyny (IG)
• Stały składnik przestrzeni interchromatynowej.
• Występują w postaci nieregularnych skupień o średnicy 20-25 nm.
• Są zbudowane z delikatnie skręconych włókienek i połączone między
sobą włóknami – przypominają luźną sieć.
• Występuje tendencja do skupiania się w IG w komórkach
nowotworowych i traktowanych karcynogenami oraz zakażonych
wirusami.
• Ich położenie zmienia się podczas kondensacji i dekondensacji
chromatyny.
• Ich funkcja jest niewyjaśniona, prawdopodobnie zawierają RNA
o powolnym metabolizmie i niskocząsteczkowe RNA (sn-RNA).
• Obecność w IG białek (rybocharyny) obecnych w składnikach jąderka
wskazuje na związek metaboliczny.
• Prawdopodobnie biorą też udział w tworzeniu architektury przestrzeni
interchromatynowej.

Ciałka jądrowe
• Niejednolita grupa struktur o różnej ultrastrukturze i nieznanej funkcji.
Ich wielkość waha się od 0,2 do kilku µm. Zazwyczaj tworzy je
delikatna fibrylarna otoczka i ziarnisty rdzeń. Wyróżnia się 5 typów
morfologicznych.
• Odrębną grupę stanowią ciałka zwinięte (CB, coiled bodies) w których
wykryto proteiny antygenu Sm, fibrylarynę, p80, kolilinę, topoizomerazę
I DNA i składniki spliceosomów (zwierają pakiet małych jądrowych
RNA (U1,U2, U4, U5/6) biorących udział w składaniu mRNA).
• Prawdopodobnie są związane z magazynowaniem, degradacją
i transportem pre-mRNA i pre-rRNA.

Jąderko
• Nieobłonione struktury jądra o sferycznym kształcie. Zajmują
zasadniczą część nukleoplazmy zwłaszcza w komórkach syntezujących
duże ilości białka. Może ich być 1-5.
• Są wysoko dynamicznymi strukturami zmieniającymi się w cyklu
komórkowym – zanikają w czasie profazy i odtwarzają w telofazie
w miejscu przewężenia wtórnego – okolicy jąderkotwórczej (NOR).
• Liczba NOR i ich lokalizacja w chromosomie jest swoista gatunkowo.
• U człowieka NOR związane są z 5 parami chromosomów
akrocentrycznych (3 z grupy D – 13,14,15 oraz 2 z G – 21, 22).
• Jest miejscem biogenezy rybosomów. Jest w nim przechowywana
nukleolina (reguluje transkrypcję), fibrylaryna (tworzy snRNP),
telomeraza, nukleostemina (dezaktywuje p53).
58
Składniki jąderka
Ośrodki Interfazalne odpowiedniki NOR, są centralnie ulokowane
włókniste (FC w jąderku, stworzone z luźnego materiału włókienkowego
– fibrillar o niewielkiej gęstości elektronowej i otoczone składnikami
centers) DFC. Są w nich geny kodujące rRNA.
Gęsty składnik Utworzony z włókien o średnicy 4-5 nm i długości
włóknisty dochodzącej do 50 nm. Fibryle są często upakowane w pasma
(DFC – dense otaczające FC co sugeruje związek. Zawiera 45S pre-rRNA.
fibrillar
component)
Składnik Tworzą go ziarna średnicy 15-20 nm w postaci pól
ziarnisty (GC wymieszanych z DFC. Większe powiększenia ujawniają ich
– granular włóknistą naturę. Zawierają 28S pre-rRNA.
component) Synteza pre-rRNA odbywa się między chromatyną
wewnętrzjąderkową a DFC jąderka. Migracje syntezowanego
de novo pre-rRNA ze strefy DFC do GC wskazuje że DFC jest
prekursorem granul jąderkowych. Transformacja DFC w GC
odzwierciedla proces dojrzewania pre-rRNA.
Chromatyna (NAC – nucleolar associated chromatine)
związana z
jąderkiem
Wakuole (NV – nucleolar vacuoles)
jąderkowe

Typy strukturalno-czynnościowe jąderek

Jąderka uformowane w Aktywne transkrypcyjnie. Struktury RNP tworzą
nukleolonemę (jąderka gąbczastą strukturę, spostrzegane w większości
gąbczaste) komórek syntezujących jąderkowy RNA.
Jąderka zwarte Cechują się jednolitym ciasnym ułożeniem włókien
i ziaren jąderkowych najczęściej wymieszanych.
Są aktywne transkrypcyjnie i najłatwiej uwidocznić
je w jądrach młodych szybko rosnących komórek.
Jąderka zwarte z Morfologiczny wyraz zahamowania syntezy rRNA
segregacją składników wywołanej różnymi czynnnikami chemicznymi
i fizycznymi. Poszczególne składniki RNP tworzą
wyraźnie oddzielone od siebie sfery.

59
Jąderka pierścieniowate Charakteryzują się obwodowym rozmieszczeniem
RNP, tylko nieliczne są widoczne w centrum.
Reprezentują zahamowanie syntezy RNA, lub jej
bardzo wolny przebieg, stan ten jest odwracalny.
Mikrojąderka (jąderka Morfologiczne odzwierciedlenie zahamowania
resztkowe) syntezy RNA. Najczęściej są widoczne w starych
i degenerujących komórkach.
• Związek struktury i funkcji jąderka podkreślają charakterystyczne
zmiany morfologii widoczne w patologii jądra np.: segregacja jąderkowa
i degranulacja wywołane zahamowaniem transkrypcji lub dojrzewania
rRNA.
• Zaburzenia metabolizmu rRNA są wywołane przez różnorodne czynniki
fizyczne i chemiczne np.: promieniowanie jonizujące, aktynomycynę D,
szok hipertoniczny i niektóre leki.

Odczytywanie informacji genetycznej

• Ekspresja odbywa się dwuetapowo:
1. Transkrypcja – przepisanie sekwencji na informacyjny RNA
(mRNA).
2. Translacja – przepisanie mRNA na sekwencję aminokwasów.

Transkrypcja
• Enzymatyczna synteza RNA na matrycy DNA. Przeprowadzają ją
polimerazy RNA
Pol I Zlokalizowana w jąderku, uczestniczy w transkrypcji sekwencji dla
rRNA.
Pol II Zlokalizowana w nukleoplazmie, syntezuje pre-mRNA i snRNA
niezbędne do usunięcia intronów z pierwotnych transkryptów.
Pol III Zlokalizowana w nukleoplazmie, uczestniczy w transkrypcji
pre-tRNA i 5 sRNA.
• Prócz polimeraz uczestniczy w niej wiele białek pomocniczych, w jej
wyniku powstają transkrypty – długie łańcuchy RNA, podlegają one
często modyfikacjom w procesie dojrzewania (processing).
ETAP Wiązanie Pol przez matrycę, do prawidłowego przebiegu procesu
I wiązania są potrzebne czynniki transkrypcyjne (TF, transcription
factor). Stanowią one dużą grupę czynników białkowych przypisanych
do określonej polimerazy i odpowiednio oznaczonych (A, B, C, D).
W pierwotnym transkrypcie pre-mRNA znajduje się tzw. czapeczka
utworzona przez GTP.

60
ETAP Inicjacja transkrypcji w miejscu startu transkrypcji (TSS –
II transcriptional starter site) przylegającego do obszaru regulatorowego
zwanego promotorem będącego sekwencją od kilkudziesięciu do
ok. 200 nukleotydów zawierająca sekwencję TATA. Rdzeń promotora
zawiera miejsca wiązania elementów odpowiadających za transkrypcje.
Wyspecjalizowane czynniki transkrypcyjne ulokowane koło TATA
indukują wytworzenie kompleksu preinicjacyjnego (PIC – preinitiation
complex). W regulacji transkrypcji uczestniczą regiony regulacyjne
nasilające ten proces – wzmacniacze (enhancers) i osłabiające –
wyciszacze (silencer). Aktywacja sekwencji wzmacniacza przemieszcza
w okolicę rdzenia promotora uruchamiając transkrypcję.
ETAP Proces elongacji, pomiędzy nukleotydami powstają wiązania
III fosfodiestrowe.
ETAP Zakończenie transkrypcji, sygnałem do tego jest sekwencja AAUAAA
IV odczytywana przez polimerazę, 10 – 30 nukleotydów za nimi
w kierunku końca 3' znajduje się miejsce poliadenylacji – przyłączenia
sekwencji poli A.

Dojrzewanie RNA – splicing RNA

• Nowo syntezowane RNA jest nazywane heterogennym (hnRNA –
heterogenous RNA) w czasie transportu w nukleoplazmie podlega wielu
modyfikacjom.
• Pierwotna cząsteczka pre-mRNA jest wierną kopią DNA, zawiera eksony
i introny.
• W procesie dojrzewania (splicing) z pierwotnego trankryptu są usuwane
introny. Odpowiadają za to białka i niskocząsteczkowe RNA pod
wspólną nazwą spliceosomu. Znajduje on odpowiednie miejsce cięcia
łańcucha pre-mRNA i wycina introny.
• Kompleks małych jądrowych RNP (U1, U2, U4/U6 snRNP) rozpoznaje
i zbliża do siebie introny tworząc „lasso”, by je zdegradować.
• W czasie dojrzewania hnRNA zachodzą modyfikacje obu końców
pre-mRNA. Modyfikacja końca 5' jest procesem kończącym się
przyłączeniem metylowanego oligonukleotydu zwanego kapturkiem
lub czapeczką z charakterystyczną obecnością 7-metyloguanozyny.
• Na końcu 3' odbywa się poliadenylacja (przyłączenie 50-250 reszt
adenylowych), sygnałem do tego jest obecność sekwencji AAUAA
w regionie końcowym.

61
Redagowanie RNA
• Jeden z mechanizmów regulacji ekspresji genów.
• Niektóre transkrypty mogą podlegać procesowi redagowania, zwiększa
to lub zmniejsza liczbę nukleotydów.
• Proces postępuje od końca 3' do 5', w jego wyniku mogą powstać nowe
ramki odczytu.
• Uczestniczą w nim korygujące sekwencje RNA (guide RNA, gRNA).

Biogeneza rybosomów
• W jąderku odbywa się transkrypcja prekursorów rRNA, ich
dojrzewanie jest związane z obróbką pierwotnych transkryptów,
tworzenie RNA jąderkowych i pierwsze etapy transportu rybosomów do
cytoplazmy.
• O dużym zapotrzebowaniu świadczy liczba kopii genów kodujących
rRNA w jądrze – nawet 10000 kopii (hepatocyty – 100). Od chwili
wykrycia strukturalnej ciągłości między chromatyną
wewnątrzjąderkową, a ośrodkami włóknistymi obecność rDNA jest
w nich dobrze udokumentowana. Organizacja genów kodujących rRNA
jest dobrze poznana.

Struktura rDNA
• Wspólna jednostka transkrypcyjna rDNA zawiera 3 rodzaje sekwencji
nukleotydowych:
◦ Transkrybowane i obecne w dojrzałym rRNA.
◦ Nietranskrybowane (NTS – non transcribed spacers) rozdzielające
poszczególne jednostki transkrypcyjne w tandemach.
◦ Transkrybowane i obecne w pierwotnym transkrypcie, zostają
wycięte podczas wstępnej obróbki w procesie dojrzewania –
wewnętrzne sekwencje transkrybowane (ITS – internal transcribed
spacers) i zewnętrzne sekwencje transkrybowane (ETS).
• Sekwencje kodujące rRNA oraz ITS i ETS tworzą jednostkę
transkrypcyjną, w obrębie NTS są zlokalizowane sekwencje regulujące
rDNA.
• Synteza pre-rRNA odbywa się między chromatyną wewnątrzjąderkową,
a DFC jąderka. Gęsty składnik jąderka zawiera 45S pre-rRNA
o długości 14 kz. Z analizy cytochemicznej DFC wynika że
prekursorowa cząsteczka rRNA odpowiada jednostce transkrypcyjnej
uwidocznionej po rozproszeniu chromatyny.
• W GC jest zawarty transkrypt 28S pre-rRNA. Składnik DFC i GC
jąderka reprezentują więc kolejne stadia tworzenia prerybosomów
odzwierciadlając w transformacji DFC w GC – proces dojrzewania pre-
rRNA.

62
Morfologia aktywnych genów rybosomowych
• Ze względu na wygląd kompleksy transkrypcyjne reprezentujące
aktywne geny nazwano choinkami (christmas tree-like). Są one:
◦ Często ułożone tandemowo i przedzielone sekwencjami
nieprzepisywanymi.
◦ Ich osią jest włókno DNA często pokryte prostopadłymi
włókienkami, reprezentującymi transkrypty.
◦ U podstawowy każdego transkryptu jest widoczna cząsteczka Pol I
RNA.
◦ Transkrypty mają wzrastającą długość w kierunku transkrypcji.
◦ Koniec wolny każdego transkryptu tworzą granule końcowe
(terminal knob) reprezentujące świeżo powstały transkrypt.
• Kompleks transkrypcyjny obejmuje fragment DNA z przyczepionym
świeżo powstałym transkryptem w postaci fibryli oraz znajdujące się
u ich podstawy cząsteczki POL I RNA.
• Jednostki transkrypcyjne zawierają zarówno sekwencje nieobecne
w dojrzałym rRNA, jak i w nim występujące (18 S rRNA, 5,8 sRNA i 28
sRNA).
• Po transkrypcji w czasie dojrzewania cząsteczka 45 S łączy się
z białkami rybosomowymi tworząc kompleks RNP z którego podczas
modyfikacji potranskrypcyjnych powstają podjednostki rybosomów. Po
przejściu przez NPC tworzą rybosomy.

miRNA
• Jednoniciowa cząsteczka RNA od długości 21-23 nukleotydów.
• Powstawanie:
1. Z pierwotnego transkryptu miRNA (prekursorem jest shRNA) enzym
odcinka każdą spinkę.
2. Enzym Dicer odcina ze spinki pętle i jednoniciowe końce tak ze
powstaje odcinek dwuniciowy.
3. Jedna z nici dwuniciowego RNA jest degradowana a pozostała tworzy
kompleks miRNA z białkami.
• Przez łączenie się mRNA (musi mieć min. sześciozasadową sekwencję
komplementarną) blokuje translację, jeśli jest całkowicie
komplementarna to następuje degradacja.

siRNA
• Dwuniciowe RNA o długości 21-23 nukleotydów. Prekursorem jest
długie dsRNA. Po związaniu całkowicie komplementarnego mRNA
następuje jego degradacja.
• Wiąże się z kompleksem rybonukleazy RISC, a ten z komplementarną
do siRNA mRNA co powoduje degradację.

63
 KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA

Informatory pierwotne (first messangers, I rzędu)

• Czynniki fizyczne i chemiczne docierające do komórki. W przypadku
czynników fizycznych informacja jest najczęściej określoną ilością
promieniowania świetlnego, termicznego, fal radiowych lub
dźwiękowych. Dla czynników chemicznych budowa cząstek i ich
konformacja koduje informację (ich przykładem są.: hormony,
neuroprzekaźniki, cytokiny, cząsteczki adhezji międzykomórkowej,
eikozanoidy, witaminy i składniki macierzy pozakomórkowej).

Sposób rozpowszechniania informacji

• Komunikacja endokrynowa – dostępna dla wielu różnych komórek
organizmu, odbywa się za pośrednictwem krążenia. Każda komórka
może odebrać informację pod warunkiem że posiada specyficzne
receptory. W ten sposób są rozpowszechniane hormony, neurohormony
i niektóre witaminy. Przekaźniki są zazwyczaj wydzielane przez
gruczoły dokrewne. Informacja wymaga odpowiedniego zabezpieczenia
przed środowiskiem (np.: proteolizą), za co odpowiadają białka
transportujące (albuminy i globuliny osoczowe).
• Działanie miejscowe – zadanie cytokin, eikozanoidów i innych
mediatorów lokalnych. Zdolność do ich wytwarzania ma wiele
komórek określonych tkanek. Zasięg ich działania zależy od gradientu
stężeń w tkance. W stanach patologicznych mogą przedostawać się do
krwiobiegu i wywierać efekty ogólnoustrojowe.
• Przekaźnictwo synaptyczne – informator jest wydzielany do szczeliny
synaptycznej i dociera do ściśle określonego miejsca w błonie komórki
docelowej. Informatorami są neurotransmitery, cytokiny, cząsteczki
adhezyjne i czynniki cytotoksyczne (synapsy immunologiczne).
• Połączenia metaboliczne – najbardziej wybiórczy sposób komunikacji.
Przykładem są synapsy elektryczne i połączenia neksus. Informacja jest
przekazywana przez kanał (konekson) utworzony wspólnie przez
koneksyny komórek, informatorem są jony lub metabolity.

Pochodzenie informatora a komunikacja

Parakrynowe Bliska komórka Wydzielanie rozpuszczalnego informatora
docierającego do komórki docelowej za
Autokrynowe Ta sama
pośrednictwem osocza lub płynu
komórka
tkankowego.

64
Jukstatrynowe Informator pierwotny jest związany z błoną komórki
(contact przekazującej sygnał, a odbiór odbywa się przez bezpośredni
dependent kontakt z komórką docelową. Dotyczy cząsteczek adhezji
signaling) międzykomórkowej i niektórych cytokin (TNF, EGF,
hedgehog, mogą występować też w formie rozpuszczalnej).
• Komórki mogą także odbierać informację ze środowiska wewnętrznego
i zewnętrznego organizmu, a ich źródłem są nierozpuszczalne składniki
substancji międzykomórkowej: kolagen, laminina, fibronektyna itp.
Komórki rozpoznają składniki macierzy za pomocą integryn (cząsteczki
adhezyjne).

Receptory
• Ich obecność jest niezbędna do otrzymania informacji niesionej przez
informator pierwotny.
• Budowa jest ściśle związana z typem odbieranej informacji. Najczęściej
są nimi glikoproteiny i polipeptydy, a czasem oligosacharydy
i glikolipidy. Mogą być zbudowane z pojedynczych cząstek lub
złożonych kompleksów.
• Receptory dla informatorów fizycznych muszą mieć domeny zdolne do
zmiany konformacji pod ich wpływem (opsyna w fotoreceptorach,
kanały bramkowane napięciem).
• Dla czynników mechanicznych funkcję receptorów pełnią odkształcające
się elementy cytoszkieletu, a dla chemicznych odbiór polega na
bezpośrednim związaniu z receptorem.

Ligandy
• Czynniki zdolne do wiązania się do określonych receptorów w wyniku
oddziaływań elektrostatycznych, jonowych, wodorowych lub sił wan
der Waalsa (odpowiadają za stabilność kompleksu). O swoistości i sile
wiązania decyduje oddziaływanie przestrzenne cząsteczek. Czasem
wiązanie liganda do receptora ma charakter stopniowego dopasowywania
się obu cząsteczek w wyniku zmian konformacyjnych.
• Te o dużej masie których nie da się bezpośrednio przetransportować do
wnętrza komórki wymagają receptorów w błonie zewnętrznej komórki –
receptory błonowe, warunkiem ich zakotwiczenia jest obecność
transbłonowej domeny hydrofobowej, lub kowalencyjne wiązanie
z fosfolipidami błonowymi.
• Mogące przenikać przez błonę lub te które są w niej produkowane
oddziałują z receptorami wewnątrzkomórkowymi. Część z nich to
receptory jądrowe.

65
 • Podobieństwo pod względem budowy, lokalizacji i funkcji receptorów
wskazuje na wspólne pochodzenie i pozwala na przypisanie do rodzin.
• Istnienie odmiennych receptorów aktywowanych przez ten sam ligand
świadczy o konwergencji (receptor nikotynowy i muskarynowy dla
acetylocholiny).
• Tworzenie kompleksu receptor-ligand jest opisywane wskaźnikami:
◦ Kinetyka wiązania
◦ Stała dysocjacji (powinowactwa, Kd) – opisuje siłę wiązania
ligandu i stabilność kompleksu. Zależy od stosunku ilościowego
cząstek, ich budowy i stopnia dopasowania, pH, siły jonowej
i temperatury. Na jej podstawie wyróżnia się receptory o wysokim
i niskim powinowactwie.
• Związanie ligandu lub odbiór informacji zawartej w informatorze
pierwotnym prowadzi zazwyczaj do zmiany w strukturze receptora –
zmienia on konformację lub oligomeryzuje, co prowadzi do jego
aktywacji będącej warunkiem transdukcji informacji do wnętrza
komórki.

Agoniści i antagoniści
• Ligandy zdolne do aktywowania swojego receptora to agoniści,
a te które go wiążą ale nie aktywują antagoniści.
• W zależności od stopnia powinowactwa konkurują oni o miejsce
wiązania na receptorze – antagoniści kompetycyjni, swoiście blokują
receptory przez co mogą modulować zależne od receptorów reakcje
komórkowe.
• Często miejsce wiązania antagonisty jest odmienne od miejsca wiązania
agonisty, a efekt jest związany ze zmianą powinowactwa do agonisty.
• Na wiązanie ligandów mogą też mieć wpływ czynniki aktywujące.
• Ranitydyna jest lekiem hamującym nadmierne wydzielanie kwasu
solnego, propanolol (β-bloker) jest stosowany w leczeniu nadciśnienia
tętniczego. Oba związki są anatgonistami odpowiednio histaminy
i adrenaliny.

Klasyfikacja receptorów
• Można je podzielić na dwie zasadnicze grupy
Jonotropowe Indukują zmianę polaryzacji błony zmianą przepuszczalności.
Metabotropowe Indukują zmianę funkcji białek strukturalnych (skurcz
komórki), zmianę aktywności enzymów w komórce (zmiana
produkcji substancji, lub losu komórki), zmianę aktywności
genów przez zmianę TF.

66
Receptory jonotropowe
• Po przyłączeniu ligandu zmieniają konformację i umożliwiają swobodny
przepływ jonów. Czas od pobudzenia do efektu liczy się
w milisekundach.
• Odpowiadają za przewodnictwo synaptyczne. Są zbudowane z kilku
podjednostek tworzących heterooligomeryczne kompleksy (ściany
kanału transbłonowego).
• Typowe są jonotropowe receptory dla acetylocholiny (nikotynowy),
GABA (GABAA), kwasu glutaminowego (NMDA, AMPA, kainowe).
• Związanie agonisty przez jedną lub kilka podjednostek (dla
nikotynowego dwie α), prowadzi do zmiany konformacji i przepływu K+,
Na+ i w mniejszym stopniu Ca2+.
• Kanały tworzą też purynergiczne receptory P2x i P2z (pod wpływem
wysokich milimolarnych stężeń ATP formują nieselektywne megakanały
umożliwiające wypływ substancji). Ich aktywacja skutkuje utratą
metabolitów, zaburzeniami funkcji i śmiercią.

Kanały wapniowe
• Osobna klasa receptorów jonotropowych. Są zbudowane z jednego
łańcucha polipeptydowego którego domena transbłonowa tworzy
selektywny kanał wapniowy.
• Występują w błonach:
◦ Wewnętrznych – rianodynowe i zależne od IP3 (obecne w SER).
◦ Zewnętrznych – regulowane zmianą potencjału (voltage-gated
channels)
• Receptory rianodynowe (rianodyna – roślinny alkaloid, w niskim
stężeniu otwiera kanał, a w wysokim go zamyka). Znajduje się w SER
mięśni poprzecznie prążkowanych i jest aktywowany przez interakcję
z potencjałozależnym receptorem dihydropirydynowym (obecny
w błonie kanalików T). Te występujące w sercu są aktywowane samymi
jonami Ca2+ wnikającymi do cytoplazmy.
• Wapń jest kofaktorem i aktywatorem wielu enzymów (np.:ATP-azy),
warunkuje interakcje elementów cytoszkieletu, skurcz komórki i jest
aktywatorem kinaz i fosfataz białkowych.
• IP3 aktywujący swoiste receptory jest produktem rozpadu
fosfatydyloinozytolu katalizowanego przez fosfolipazy C. Są one silnie
hamowane przez etanol co skutkuje zaburzeniami koordynacji ruchowej.

67
Receptory metabotropowe
• Przebieg złożonych informacji komórkowych zależy od występowania
odpowiednich białek strukturalnych i regulatorowych oraz ich aktywacji,
przez to mechanizmy odbioru i przekazywania informacji muszą
wpływać na aktywację i inaktywację lub syntezę białek efektorowych.

Kinazy i fosfatazy białkowe

• Enzymy aktywowane przez informatory II rzędu produkowane przez
receptor.
• Procesy fosforylacji (kinazy) i defosforylacji (fosfatazy), odgrywają
najważniejszą rolę w organizacji metabolizmu komórki.
• Ze względu na swoistość substratową dzieli się je na serynowo-
treoninowe (zazwyczaj odpowiedzialne za aktywację/inaktywację
enzymów i TF) i tyrozynowe (związane z transdukcją przez błonę
komórkową). Fosforylacja tych reszt może spowodować zmianę
konformacji i doprowadzić do aktywacji lub inaktywacji białka
(defosforylacja – odwrotny efekt).
• Mogą wpływać bezpośrednio na aktywację przemian metabolicznych lub
pośrednio przez inicjację ekspresji genów.

Rola czynników transkrypcyjnych

• Określona reakcja biologiczna na informację wymaga czasem udziału
nowego białka, jego synteza wymaga aktywacji genu. Szczególną rolę
w transkrypcji odgrywają czynniki transkrypcyjne (TF) – białka zdolne
do rozpoznawania i wiązania sekwencji DNA zlokalizowanych
w promotorach. Ich związanie umożliwia aktywację polimerazy.
• Mogą być one ostatnimi strukturami docelowymi w szlaku
przekazywania informacji.

Informatory wtórne (second messenger, II rzędu)

• Są niezbędne do przekazywania sygnałów i aktywacji kinaz i fosfataz.
Różne ich rodziny są aktywowane przez różne informatory wtórne np.:
cykliczne nukleotydy, produkty przemian fosfolipidów, sfingolipidów
błonowych, jony wapnia.
• Powstają przez aktywację swoistych enzymów wskutek aktywacji,
receptorów i transdukcji sygnału przez błonę.

68
Typy receptorów związanych z aktywacją układów enzymatycznych

Receptory związane z transdukcją sygnału z udziałem heterotrimerycznego białka

G (G-protein coupled receptors)
• Typowe dla większości hormonów, neurohormonów,
neurotransmiterów i chemokin.
• Mają 7 domen transbłonowych – cząsteczka przechodzi przez błonę
tworząc pętle po zewnętrznej i wewnętrznej stronie błony – receptory
serpentynowe. Zewnętrzne pętle są miejscem wiązania ligandu, a pętla
cytoplazmatyczna między V i VI domeną transbłonową,
i cytoplazmatyczna C-końcowa domena tworzą miejsce wiązania
heterotrimerycznych białek G.
• Nazwa białek G pochodzi od zdolności wiązania i hydrolizy GTP do
GDP. Zalicza się do nich białka G związane z transdukcją sygnału przez
błonę, białka G rodziny Ras związane z transdukcją przez receptory dla
czynników wzrostu i białka G związane z cytoszkieletem i endo-,
egozcytozą (Rho, Rac, Rab – kaskada MAP).
• Są zbudowane z podjednostek α, β, γ kodowanych przez różne rodziny
genów. Tylko α ma zdolność wiązania i hydrolizy GTP.
• Wiążą się do cytoplazmatycznych domen receptorów po związaniu
agonisty. Po związaniu do receptora podjednostka α wiąże GTP
i dysocjuje od βγ. W tej postaci aktywuje swoisty enzym syntezujący
informator wtórny. Niektóre podjednostki α mogą bezpośrednio
aktywować kanały i wymienniki jonowe.
• Po aktywacji enzymu GTP jest hydrolizowany do GDP, α reasocjuje do
βγ i cały układ wraca do położenia wyjściowego.
• Istnieją 4 podrodziny podjednostek α.
Podrodzina Podjednostka Funkcja
αs αs Aktywacja cyklazy adenylanowej, pobudzają
produkcję cAMP.
α1/α0 α1 α0 Hamowanie cyklazy adenylanowej.
α1 Aktywacja fosfodiestrazy cGMP (cGMP→GMP)
αq αq Stymulacja fosfolipazy Cβ (PLCβ rozkłada
difosforan fosfatydyloinozotylu do
diacyloglicerolu (DAG) i trifosforanu inozotylu
(IP3).
α12 α12 Regulacja niektórych kanałów jonowych
i wymienników Na+/K+
• DG z udziałem jonów wapnia aktywuje kinazy C α, β i γ.

69
 • IP3 przez mobilizowanie Ca2+ przyczynia się do aktywacji kinaz i fosfataz
zależnych od wapnia i kalmoduliny.
• Różne podjednostki α aktywują także bezpośrednio fosfolipazę D i A2,
cyklazę guanylanową i kanały Na+/K+ i Ca2+ (aktywacja kanałów
prowadzi do szybkiej depolaryzacji, jednak wolniejszej niż w przypadku
receptorów jonotropowych).
• Podjednostki βγ również aktywują kanały jonowe i enzymy, biorą udział
w rekrutacji substratów dla enzymów syntezujących informatory wtórne.

Receptory związane z udziałem kinaz tyrozynowych

• Typowe receptory cytokin z grupy czynników wzrostu, neurotrofin,
interleukin, niektórych TNF i czynników hemopoetycznych.
• Przeniesienie sygnału przez błonę zachodzi dzięki kinazom
tyrozynowym, mechanizm transdukcji może polegać na tworzeniu
przekaźników wtórnych, lub bezpośrednio przez fosforylację
swoistych TF.
Receptorowe Związane z receptorami czynników wzrostu (EGF, FGF,
kinazy PDGF i insulinopodonych) i rodziną receptorów dla
tyrozynowe neurotrofin. Ich aktywacja następuje przez
homodimeryzację receptorów przez swoiste ligandy, co
skutkuje uaktywnieniem cytoplazmatycznej domeny
kinazowej i autofosforylacji receptora. Jest ona konieczna do
do rekrutowania aktywowanych przez kinazę substratów np.
enzymów odpowiedzialnych za syntezę informatorów
wtórnych (PLCγ, PI-3K, PLA2), kinaz tyrozynowych
z rodziny Src i tzw. białek adaptorowych (nie mają
właściwości enzymatyczych i służą do aktywacji innych
szlaków przewodzenia sygnałów, np.: związanych z białkami
RAS i aktywacją kaskad kinaz MAP – (mitogen-activated
protein kinase) związanych z aktywacją proliferacji lub
apoptozy.
Niereceptorowe Biorą udział w transdukcji sygnałów od receptorów
kinazy tyrozyno- niemających własnej aktywności kinazy tyrozynowej (dla
we z rodziny Src antygenu limfocytów T i B, dla fragmentów Fc przeciwciał).
(błonowe)
Niereceptorowe Aktywują je niemające aktywności kinazy tyrozynowej
kinazy tyrozy- receptory dla cytokin (hemapoetyn, interferonów, TNF i Il-1).
nowe Jak/Tyk W przekazywaniu sygnału nie uczestniczą informatory
(cytoplazma- wtórne, Jak/Tyk bezpośrednio fosforylują i aktywują TF.
tyczne)

70
Receptory związane z transdukcją sygnału związanego z udziałem kinaz
serynowo-treoninowych
• Są one receptorami dla cytokin z nadrodziny TGF β. Do tej nadrodziny
należą białka morfogenetyczne kości (BMP), inhibina, aktywina itp.
• Są zbudowane z dwóch podjednostek tworzących heterodimer po
związaniu ligandu. Domeny kinazy sernynowo-trenoniowej są
zlokalizowane w częściach cytoplazmatycznych obu podjednostek. Jej
substratami są TF z rodziny Smad, po ufosforylowaniu translokowane są
do jądra komórkowego i inicjują ekspresję genów.
• Mogą aktywować inne szlaki niż Smad.

Inne szlaki receptorowe związane z heterotrimerycznymi białkami G

i kinazami

Receptory związane z aktywacją proteaz wewnątrzkomórkowych

• Niektóre szlaki wymagają białek które są indukowane modyfikacją
proteolityczną, np. aktywacja apoptozy.
• Przykładem są indukujące apoptozę receptory z rodziny receptorów dla
TNF:
◦ Typu I dla TNF-α
◦ Fas/APO1 (CD95)
◦ DR4, DR5 dla czynnika TRAIL
◦ DR3 dla czynnika TWEAK
• Ich cechą charakterystyczną jest występowanie w części
cytoplazmatycznej tzw. domeny śmierci. Aktywowanie receptora przez
homotrimeryzację przez związanie homotrimeru ligandu prowadzi do
aktywacji przez nią białek adaptorowych TRADD i FADD tworzących
kompleks aktywujący kaskadę kaspaz (proteazy cysteinowe będące
efektorowymi enzymami aktywującymi apoptozę).

Szlaki związane z β-kateniną

• Wiąże się ona z wewnątrzplazmatyczną domeną E-kadheryny. Odgrywa
rolę w regulacji połączeń międzykomórkowych i białka transdukującego
i regulatora ekspresji genów w szlaku przekazywania przez białko WNT.
• Gdy brak WNT będącego ligandem receptora FRIZZLED występująca
w cytoplazmie wolna β-katenina jest wychwytywana przez kompleks
APC/Aksyna/ kinaza GSK i dochodzi do jej ubikwitynacji i degradacji.
• Związanie WNT z FRIZZLED powoduje zablokowanie kompleksu
APC/Aksyna/kinaza GSK, β-katenina gromadzi się w cytoplazmie, skąd
trafia do jądra gdzie wchodząc w interakcję z TF TCF/LEF reguluje
ekspresję.

71
 • Białko APC (adenomatous polyposis coli) będące inhibitorem
β-kateniny pełni rolę antyonkogenu, jego mutacje są przyczyną
polipowatości jelita grubego (nieleczona prowadzi do raka).

Receptory Toll-podobne (Toll-like receptors TLR).

• TLR stanowią ważny element odporności nieswoistej, rozpoznają
kluczowe składniki budowy większości wirusów i bakterii, a aktywacja
prowadzi do indukcji reakcji zapalnych i ułatwia indukcję swoistej
odpowiedzi odpornościowej.
• Związanie ligandu przez TLR→ rekrutacja i aktywacja białek
adaptorowych MyD88, TIRAP lub TRAM→ aktywują fosforylację
(przez IKK) i degradację inhibitora (IκB) czynnika transkrypcyjnego
NK-κB (przez kinazę serynowo-treoninową)→ uwolniony czynnik trafia
do jądra gdzie aktywuje ekspresję genów związanych z reakcją zapalną.
• Równolegle może być aktywowana fosforylacja TF IRF indukującego
ekspresję interferonu typu I i szlak kinaz MAP.

Receptory jądrowe
• Występują w cytoplazmie i jądrze komórkowym. Ich ligandami są
hydrofobowe, łatwo przenikające przez błonę czynniki takie jak:
hormony steroidowe, wit D3, kwas retinowy, hormony tarczycy
i niektóre pochodne nienasyconych kwasów tłuszczowych (eikozanoidy).
• Są peptydami o budowie typowych TF. Maja hydrofobową domenę
wiążącą ligand, domenę wiążącą DNA (palce cynkowe) i domenę
odpowiedzialną za dimeryzację.
• Po związaniu ligandu występującego w cytoplazmie homo-,
heterodimeryzują i są translokowane do jądra gdzie wiążą sekwencje
regulatorowe swoistych genów inicjując ich ekspresję. Receptor jest
jednocześnie czynnikiem transkrypcyjnym.
• Receptory jądrowe mogą dimeryzować nie tylko między sobą ale
również z innymi czynnikami transkrypcyjnymi (Jun i Fos – składniki
TF AP-1). Co zwiększa zakres ich aktywności biologicznej.

Regulacja funkcji receptorów

• W większości komórek sygnał trwa bardzo krótko, zaburzenia tego czasu
mogą doprowadzić do zaburzeń funkcji. Do mechanizmów regulujących
ten czas należą:
◦ Fosforylacja/defosforylacja receptorów.
◦ Blokowanie funkcji receptorów przez swoiste biała regulatorowe.
◦ Internalizacja i degradacja oraz złuszczanie z powierzchni komórek.

72
• Desensytyzacja receptorów/komórki – ich czasowe unieczynnienie
w wyniku degradacji lub złuszczenia. Dla aktywowanych receptorów
najszybciej odbywa się to przez fosforylację/defosforylację.
• Fosforylacja niektórych receptorów prowadzi do utraty powinowactwa
do swoistych ligandów i dysocjację kompleksu receptor-ligand lub
związanie białka hamującego dalsze przekazywanie sygnału.
• Przykładem jest fosforylacja receptorów związanych z białkami G
i aktywacja cyklazy adenylanowej (np. receptorów β-adrenergicznych).
Są one fosforylowane przez równolegle aktywowane swoiste zależne od
cAMP kinazy serynowo-treoninowe – kinazy β-ARK. Ufosforylowane
receptory są wiązane przez białko hamujące arestynę (arrestin)
i przekazywanie sygnału zostaje zablokowane.
• Receptory aktywowane fosforylacją (autofosforylacją) np.: czynników
wzrostu mogą być one defosforylowane przez swoiste, jednocześnie
aktywowane fosfatazy tyrozynowe co hamuje transdukcję.
• Internalizacja receptorów przez endocytozę jest wolniejszym
mechanizmem hamowania receptorów. Wiązanie ligandu jest
jednocześnie sygnałem do endocytozy w obrębie wgłębień odkrytych.
Utworzone endosomy – receptorosomy obniżają pH przez aktywność
pompy protonowej i następuje dysocjacja kompleksu receptor-ligand.
Potem mogą się one łączyć z lizosomami – receptory i ligandy zostają
zdegradowane.
• Czasem receptorosomy mogą transportować kompleks receptor-ligand do
organelli komórkowych lub na drugą stronę komórki, albo przenosić
informację do specyficznych obszarów cytoplazmy.
• Złuszczanie zachodzi pod wpływem proteaz powierzchniowych
związanych z zewnętrzną warstwą błony. Powoduje terminację
przekazywania sygnału i powstanie receptorów rozpuszczalnych
zachowujących zdolność wiązania ligandów przez co mogą
w kompetycyjny sposób ograniczać ich dostęp do receptorów
związanych z błoną komórkową.
• Przekazywanie sygnału może być kontrolowane przez naturalne ligandy
o właściwościach antagonistycznych które kompetycyjnie blokując
receptor zapobiegają jego aktywacji przez ligandy agonistów.
Przykładem takiego antagonisty jest antagonista receptora
interleukiny 1 (IL-1Ra), cytokina regulująca wpływ pozostałych
cytokin z tej rodziny (Il-1α i IL-1β) zwłaszcza w działaniu prozapalnym.

73
• Choroby związane z nieprawidłowym funkcjonowaniem układu odbioru
można podzielić na:
◦ Związane z niedostatecznym przewodzeniem sygnału – ich główną
przyczyną jest brak funkcjonalnego receptora lub innych
czynników odpowiedzialnych za transport przez błonę, nadmierna
aktywność czynników hamujących funkcję receptorów
przenoszących sygnał.
◦ Związane z nadmierną aktywacją mechanizmów przekazywania –
jego przyczyną może być nadekspresja receptorów, ich niewłaściwa
aktywacja lub nieprawidłowa desensyntyzacja.
• Najczęściej są spowodowane mutacjami, działaniem czynników
infekcyjnych, egzogennych czynników chemicznych lub zaburzeń
syntezy receptorów. Zakłócenia związane z mutacjami genów
kodujących kaskady reakcji (np.: proliferacji) są przyczyną chorób
nowotworowych. Najczęściej dotyczą one receptorów czynników
wzrostu powodując konstytutywną aktywację kinaz tyrozynowych, lub
mutację białka Ras prowadzące do utraty jego właściwości GTP-azowej
i jego ciągłej aktywności po związaniu z GTP. Innym przykładem są
liczne endokrynologiczne choroby (niedoczynność, nadczynność
gruczołu, brak reaktywności lub nadreaktywność na hormony). Często
obserwuje się w nich prócz utraty funkcjonalnych receptorów mutacje
genów podjednostek α białek G (Gαs, α1, α0 i αq) w obrębie regionu
odpowiedzialnego za wiązanie GTP (niezdolność do przekazania
sygnału) i za aktywność ATP-azy (konstytutywna aktywacja białka, brak
desensetyzacji i nadmierne jego przenoszenie).
• W układzie gdzie są stymulowane białka Gαi, α0 hamujące aktywność
cyklazy adenylanowej porównywalne mutacje dają odwrotny efekt.
• Białka Gαs są wrażliwe na toksynę cholery która je rybolyzuje
stabilizując wiązanie GTP. Białka Gαi, α0 są rybolyzowane przez toksynę
krztuśca, w obu przypadkach stężenie cAMP w komórce rośnie.
• Wrażliwość na określoną toksynę jest stałą klasyfikacji białek Gα.
• Zawarte w kawie i herbacie aklaloidy są inhibitorami fosfodiestrazy
cAMP, od której pośrednio zależy aktywność kinaz A, a te są związane
z min. metabolizmem glikogenu – nadużywanie tych napojów może mieć
wpływ na gospodarkę cukrowcową.
• Mutacje czynników stymulujących prowadzące do ich aktywacji mają
charakter dominujący, a mutacje inaktywujące recesywny. Geny
kontrolujące przekazywanie sygnałów zachowują się jak onkogeny
i antyonkogeny w procesie rozwoju choroby nowotworowej.

74
 CZĄSTECZKI ADHEZYJNE

• CAM – cell adhesion molecules.

• Grupa białek transbłonowych których podstawową funkcją jest
rozpoznawanie innych komórek lub cząsteczek międzykomórkowych
i tworzenie z nimi połączeń (trwałych lub przejściowych)

Selektyny
• Wiążą grupy cukrowe swoistych glikoprotein i mucyn błonowych
innych komórek.
• Mogą się szybko pojawiać lub znikać z błony ze względu na szybką
kontrolę ekspresji.
• Najczęściej tworzą przejściowe połączenia między komórkami różnego
typu (leukocyty/śródbłonek itp.).
• Są glikoproteinami zbudowanymi z C-końcowej domeny
wewnątrzkomórkowej, domeny wewnątrzbłonowej i ze zmiennej liczby
powtarzających się domen białkowych na zewnątrz komórki (każda
zbudowana 62 aminokwasów) – domeny EGF i CRD (domeny
rozpoznającej cukry – carbohydrate recognition domain, ma budowę
i właściwości podobne do lektyn i wiąże ligandy na powierzchni innych
komórek np.: ligand sialyl-Lewis-x, wiązanie jest zależne od Ca2+).
Najbardziej znane selektyny:
Występowanie Ważniejsze ligandy
L Leukocyty, CD34, niektóre IgCAM
E Komórki śródbłonka Sialyl-Lewis-x
P Płytki krwi Sialyl-Lewis-x

Integryny
• Heterodimeryczne glikoproteiny błonowe.
• Służą do tworzenia trwałych połączeń komórki z cząsteczkami
międzykomórkowymi i między komórkami.
• Są zbudowane z niekowalnecyjnie połączonych glikoproteinowych
podjednostek:
◦ α – wiąże kationy dwuwartościowe i wpływa na swoistość
rozpoznawania ligandu.
◦ β – wiąże ligand.

75
 • Najczęściej ligandami są kolagen, laminina, fibronektyna lub
cząsteczki IgCAM swoiste dla wielu typów komórek.
• Związanie ligandu powoduje przyłączenie do integryn elementów
cytoszkieletu przez białka łączące. Brak połączenia integryn z ligandami
może skutkować apoptozą.
• Większość wymaga aktywacji do połączenia z ligandem (połączenie
selektyn z ligandem aktywuje integryny łączące się z śródbłonkiem).
• Poznano 16 podjednostek α i 8 β. Mogą występować różne kombinacje
i znane są 22 heterodimery.
• Myszy ze znokautowanymi genami dla integryn cechują się
śmiertelnością w okresie płodowym lub znacznymi deformacjami
rozwojowymi.
• Nieprawidłowości budowy integryn lub ich uszkodzenie są przyczyną
chorób np.: pemfigoid – autoprzeciwciała uniemożliwiają wiązanie się
integryn z lamininą co utrudnia tworzenie hemidesmosomów
w naskórku i powoduje tworzenie pęcherzy, nadżerek skóry i zakażenia.
Trombastenia Glanzmana jest spowodowana wrodzoną mutacją
integryny α2bβ3 (glikoproteina płytkowa gpIIIa) która jest
odpowiedzialna za wiązanie z fibrynogenem – zaburza krzepliwość krwi
i wywołuje liczne krwawienia.

Kadheryny
• Rodzina glikoprotein błonowych tworzących homofilowe (z inną
kadheryną) połączenia międzykomórkowe.
• Są tkankowo swoiste, mają ciężar 120-140 kD i są zbudowane z domeny
wewnątrzkomórkowej, wewnątrzbłonowej i pięciu powtarzających się
domen zewnątrzkomórkowych (tworzą zależne od Ca2+ połączenie
homodimeryczne).
• Połączenia kadheryn sąsiednich komórek tworzą większe kompleksy
widoczne w mikroskopie elektronowym jako połączenia zwierające.
• Domena cytoplazmatyczna łączy się zawsze z kateninami,
a te z różnymi filamentami cytoszkieletu przez co dzieli się je na łączące
się z filamentami:
◦ Aktynowymi – kadheryny E, N.
◦ Pośrednimi – desmogleiny (składają się z 4 domen
zewnątrzkomórkowych, 2-6 cytoplazmatycznych
charakterystycznych tylko dla nich), desmokoliny (podobne do
typowych kadheryn).
• E-kadheryna bierze udział w procesie kompakcji.

76
Immunoglobuliny
• Grupa cząsteczek adhezyjnych zawierająca powtarzające się domeny
błonowe (IgCAM – immunoglobulin cell adhesion molecule).
• Znane jest 70 glikoprotein należących do tej grupy.
• Każda jest zbudowana z domeny wewnątrzkomórkowej,
wewnątrzbłonowej i zmiennej swoistej domeny zewnątrzkomórkowej
składającej się z jednej lub wielu pętli zbudowanych z 60-100
aminokwasów.
• Każda pętla powstaje przez połączenia disiarczkowe.
• Są stałymi lub długotrwałymi składnikami błon wielu komórek i tworzą
najczęściej trwałe homofilowe połączenia z identycznymi IgCAM lub
heterofilowe z innymi – powstaje ono dzięki bocznym połączeniom
domen zewnątrzkomórkowych i jest niezależne od kationów
dwuwartościowych.
• Niektóre IgCAM tworzą połączenia z integrynami.
• Ich najważniejszą funkcją jest tworzenie połączeń między komórkami
w układzie nerwowym. Biorą też udział we wzroście i ukierunkowaniu
aksonów, mielinizacji, i połączeniach leukocytów i płytek krwi do
śródbłonków oraz interakcji APC z limfocytami.
• Dzieli się ja na IgCAM swoiste dla układu nerwowego i IgCAM
systemowe.

Inne cząsteczki adhezyjne

• Część znanych CAM nie została scharakteryzowana lub nie dało się jej
zaliczyć do żadnej z wymienionych grup.
• PGP-1 (CD44) – ma silnie rozbudowaną część zewnatrzkomórkową, do
której są dołączone 4 GAG i domenę łączącą kwas hialuronowy,
występuje ona w błonie limfocytów, monocytów i komórek śródbłonka.
• Kolagen typu XVII – występuje w błonie komórek nabłonkowych, jest
zbudowany z jednego łańcucha, a jego C-koniec znajduje się
w cytoplazmie, wraz z intergrynami łączącymi lamininę buduje
hemidesmosomy.
• Dystroglikan – duża glikoproteina transbłonowa występująca
w błonach komórek mięśniowych, wraz z dystrofiną pośredniczy
w łączeniu filamentów aktynowych.
• Okludyna i klaudyna – białka budujące połączenia zamykające.
• Koneksyna – tworzy połączenia neksus.
• Syndekan – proteoglikan błonowy zawierający 3-6 GAG, łączy się
z wieloma składnikami ECM oraz selektynami i IgCAM.

77
Białka Kateniny – białka cytoplazmatyczne pośredniczące w łączeniu
połączone z kadheryn do filamentów aktynowych. Znane są 3 podjednostki
kadherynami α (łączy się z filamentami aktynowymi), β (łączą się
z cytoplazmatyczną domeną kadheryn, współdziała z kinazami
tyrozynowymi i receptorem EGF przez co odgrywa rolę
w tworzeniu połączeń międzykomórkowych), γ (łączy
z filamentami cytokeratynowymi w desmosomach, razem
z desmoplakiną i plektyną).
Białka Z filamentami aktynowymi łączą – α-aktynina, winkulina,
połączone z talina, tensyna, paksylina w mięśniach dodatkowo dystrofina.
integrynami Paksylina jest aktywowana w przypadku powstania połączenia
cząsteczka międzykomórkowa-integryna-filamenty aktynowe.
Przez aktywację kinazy tyrozynowej aktywuje Ras, a te kaskadę
kinaz aktywujących. Z filamentami pośrednimi integryny są
związane przez plakoglobiny.

78
 KOMUNIKACJA CD.

Transdukcja sygnału z udziałem receptorów jądrowych

• Odbywa się dla:
Steroidów Estrogen, testosteron, progesteron,
glukokortykosteroidy, mineralokortykoidy
Witaminy D Receptory kalcyferolu
Hormonów tarczycy β,α-trójjodotyroninowe
Retinoidów RARα, β, γ (retinoic acid receptor)
RXRα, β, γ
RZR (receptor „sierocy”)
PRAR (peroxisome proliferator Dla eikozanoidów i nienasyconych/utlenionych
activatory receptors) kwasów tłuszczowych. PRARα, β, γ

Przekazywanie sygnału przez receptory jądrowe

1. Przejście przez sygnału przez błonę.
2. Ligand wiąże dwie podjednostki receptora.
3. Kompleks receptor-ligand ulega translokacji do jądra, gdzie pełnie rolę
TF.

Przekazywanie sygnału dla estrogenu

• Wyróżnia się dwa receptory jądrowe dla estrogenu ERα, β. Po związaniu
ligandu hetero- lub homodimeryzują. Prócz cytoplazmatycznych ER
wyróżnia się również błonowe mER, które są sprzężone z białkami G,
ich aktywacja powoduje kaskadę sygnalizacyjną.
• Tamoxifen po wniknięciu do komórki blokuje receptory estrogenowe.
1. Przejście estrogenu przez błonę.
2. Związanie z receptorem ER w cytoplazmie, dimeryzacja kompleksu
i translokacja kompleksu do jądra.
3. Aktywacja transkrypcji genów (ER jest wiążącym geny czynnikiem
transkrypcyjnym).

Przekazywanie sygnału dla kwasu retinowego (RA)

1. Związanie all-trans-RA receptorami RAR, i 9-cisRA z RXR.
2. Heterodimeryzacja RAR i RXR (receptory jądrowe), mogą
heterodimeryzować z innymi TF np.: AP1.
3. Transkrypcja.

79
Przekazywanie sygnału dla receptorów PRAR
• Peroxisome proliferator-acitvated receptor gamma. Grupa receptorów
jądrowych działających jako TF.
• Ich funkcja jest modyfikowana przez koaktywatory i korepresory
białkowe.
• Tiazolidynediony działając na PRAR zmniejszają insulinooproność
w adipocytach, mięśniach szkieletowych i hepatocytach. Zmniejsza
insulinemię, zapotrzebowanie na insulinę endogenną, stężenie wolnych
kwasów tłuszczowych i glukozy we krwi.
1. Po związaniu ligandu heterodimeryzuje z RXR.
2. Transport do jądra i regulacja transkrypcji.

Przekazywanie sygnału z udziałem hormonów

Przekazywanie sygnału z udziałem receptorów dla hormonów i neuropeptydów

1. Ligand wiąże się z receptorem.
2. Aktywacja heterotrimerycznego białka G.
3. Wiązanie GTP przez jednostkę α, oddysocjowanie βγ (wolne βγ
również mogą aktywować enzymy i kanały jonowe).
4. Aktywacja enzymów syntezujących informator wtórny przez
podjednostkę α (cyklaza adenylanowa, guanylanowa, fosfolipaza Cβ)
lub bezpośrednia aktywacja kanału jonowego.
5. Synteza informatora wtórnego/otwarcie kanału odbywa się przez czas
uczynnienia właściwości GTP-azowej podjednostki α.
6. Hydroliza GTP do GDP.
7. Związana z GDP podjednostka α oddysocjowuje od enzymu lub kanału
i reasocjuje z βγ.
8. Informator wtórny aktywuje fosfatazy/kinazy białkowe.
Cyklaza adenylanowa cAMP Kinaza A (PKA)
Cyklaza guanylanowa cGMP Kinaza G (PKG)
Fosfolipaza Cβ (PLCβ) DAG Kinaza Cα, β, γ (PKCα, β, γ)
IP3 (uwalnia Ca2+ Kinaza/ fosfataza zależna od
z SER) Ca2+/kalmoduliny (CaMK)

Działanie acetylocholiny na serce

1. Acetylocholina uwalniana z włókien nerwowych wiąże się z receptorem
metabotropowym komórek m. sercowego.
2. Po związaniu białko G ulega aktywacji, podjednostka α ulega dysocjacji
od βγ.

80
 3. βγ wiąże się z cytozolową powierzchnią kanału K+ i powoduje jego
otwarcie – zmniejsza to aktywność mięśnia.
4. Gdy podjednostka α wyłączy swoją aktywność po przeprowadzeniu
hydrolizy związanego GTP, kanały K+ zamykają się, a kompleks βγ łączy
się z α.

Przekazywanie sygnału z udziałem cytokin

• Do cytokin (peptydowe cząsteczki o masie 8-50 kDa) zalicza się:
czynniki wzrostu (EGF, FGF, IGF-1, insulina), troficzne (NGF),
różnicowania (TGF-β, BMP), prozapalne (TNF, IL-1), hemopoetyczne,
proapoptyczne, inteferony, adipokiny, interleukiny (IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4), chemokiny.

Przekazywanie sygnału przez receptory dla cytokin wykorzystujące kinazy

tyrozynowe
1. Receptory dla czynników wzrostu są związane z receptorową kinazą
tyrozynową (RKT) będącą cytoplazmatyczną częścią receptora.
2. RKT autofosforyluje receptor co umożliwia interakcję z białkami
adaptorowymi związanymi z aktywacją szlaku białka Ras i kaskady
MAP kinazy, aktywacja enzymów PLCγ i PI-3K.
Recepto- Receptory dla EGF, FGF, PLCγ DAG Kinaza Cα, β, γ
rowe PDGF, czynniki (PKCα, β, γ)
kinazy insulinopodobne,
IP3 Kinaza/ fosfataza
tyrozyno- receptory dla neurotrofin.
(uwalnia zależna od
we
Ca2+ z Ca2+/kalmoduliny
Kinazy EGF, FGF, PDGF SER) (CaMK)
tyrozyno- i receptory dla antygenu
we z limfocytów T, immuno- PI-3K PIP3 Kinaza Cζ (PKCζ)
rodziny globulinowe limfocytów PLA2 Kwas Kinaza Cα, β, γ
Src B, dla fragmentów Fc arachido- (PKCα, β, γ)
immunoglobulin. nowy (AA)
Kinazy Receptory dla Czynniki transkrypcyjne Stat
Jak/Tyk hemopoetyn,
interferonów, TNF i IL-1
Kinazy TGF-β, BMP, inhibina Czynniki transkrypcyjne Smad
serynowo-
treoninowe

81
Przekazywanie sygnału przez receptory dla TGF-β
• Mutacja w białku receptora TGF-β lub białka Smad powoduje zespół
Loeysa-Dietza dziedziczony autosomalnie dominująco. Objawia się
tętniakami aorty i innych tętnic, hiperteloryzmem ocznym,
rozszczepieniem podniebienia albo języczka.
1. Po związaniu ligandu dwie podjednostki heterodimeryzują.
2. Cytoplazmatyczna domena heterodimeru ma aktywność kinazy
serynowo-treoninowej i bezpośrednio fosforyluje czynniki
transkrypcyjne Smad.
3. Ekspresja genów.

Przekazywanie sygnału dla antygenów i immunoglobulin

1. Receptor aktywuje z udziałem białka receptorowego kinazę Src,
a ta enzymy PLCγ i PI-3K.
2. Powstaje informator II rzedu, aktywuje kinazę/fosfatazę serynową.
3. Kinaza serynowa fosforyluje TF.

Przekazywanie sygnału przez proapoptotyczne receptory dla TNF-α, CD95L,

TRAIL, TWEAK.
1. Związanie ligandu.
2. Trimeryzacja receptora, występujące w cytoplazmatycznej części
domeny śmierci (DD) inicjują wiązanie białek adaptorowych TRADD,
FADD.
3. FADD wiąże prokaspazę 8.
4. Autoproteolityczna aktywacja, powstanie aktywnej kaspazy 8.
5. Apoptoza.

Receptory dla insuliny

• Są aktywowane przez insulinę, IGF-I i IGF-II.
• IGF-I może być wiązany przez receptor dla insuliny, a także przez
swoisty IGF1R przy czym IGF1R wiąże znacznie większość ilość.
• Heterodimery zbudowane jest z dwóch podjednostek α i dwóch β.
• Transbłonowe podjednostki β mają aktywność kinazy tyrozynowej.
1. Związanie insuliny, prowadzi do fosforylacji białka IRS-1 (insulin
receptor substance-1), może też nastąpić rekrutacja GRB2 i aktywacja
szlaku Ras.
2. IRS-1 aktywuje PI-3K.
3. Powstanie PIP3 (PTEN może zamienić go w PIP2).
4. Związanie PIP3 z kinazą białkową Akt.
5. PCAkt fosforyluje białka odpowiedzialne za zwiększenie syntezy
glikogenu i rekrutację GLUT4.

82
 • Mutacja genu kodującego receptor insulinowy powoduje zespół
Rabsona-Mendenhalla, objawami są ciężka insulinooporność,
zaburzenia rozwojowe (wadliwy kształt głowy, twarzy i paznokci)
i rogowacenie ciemne.

Przekazywanie sygnału dla EGF

1. Związanie z błonowym receptorem EGFR.
2. Zmiana nieaktywnego monomeru w aktywny homodimer.
3. Dimer ma aktywność kinazy tyrozynowej, następuje autofosforylacja
i aktywacja szlaku Ras (kaskada kinaz MAP) monomeryczne białko
G→ RAF→ MEK→ ERK (rodzaj kinazy MAP)→ transkrypcja, lub
PI-3K→ PIP3→ Akt→ kinaza mTOR→ transkrypcja.
• EGF odgrywa rolę w patogenezie raka piersi.
• PTEN może przekształcać PIP3 w PIP2, jego nieprawidłowe działanie
może spowodować różnego typu nowotwory.
• Trastuzumab (herceptyna) wiąże się z z domeną pozakomórkową
receptora HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). Powoduje
zatrzymanie cyklu w G1. Uważa się że hamuje białko Akt.

Przekazywanie sygnału dla interleukin

1. Związanie IL z niereceptorową kinazą JAK.
2. Fosforylacja czynnika transkrypcyjnego STAT i transport do jądra.
3. Aktywacja transkrypcji.

Przekazywanie sygnału dla TGFβ/BMP

1. Związanie TGFβ z dimerycznym receptorem TGFβ I typu powoduje
związanie dimerycznego receptora TGFβ II typu i utworzenie
kompleksu. Mają one aktywność kinazy serynowo-treoninowej.
2. Fosforylacja SMAD (2,3 przez związanie TGFβ, białka Nodal
i niektórych GDF, a BMP, część GDF i AMH 1,5,9)
3. Fosforylowany SMAD tafia do jądra i powoduje transkrypcję.

Przekazywanie sygnału z udziałem tlenku azotu

• NO wiąże się z rozpuszczalną cyklazą guanylanową (sGC – soluble
guanylyl cyclase). Składa się z jednej podjednostki α i jednej β.
1. Uwolnienie NO przez śródbłonek lub nerw.
2. Aktywacja sGC i powstanie cGMP.
3. cGMP aktywuje kinazę G (PKG).
4. Fosforylacja białka, zmniejszenie stężenia Ca2+ i rozkurcz mięśnia
gładkiego.

83
Przekazywanie sygnału z udziałem TLR (toll-like receptor)
1. Związanie ligandu przez TLR.
TLR1 Lipoproteiny, lipoarabinomannan, lipopolisacharydy, PGN, zymosan,
glikolipidy
TLR4 Taxol, hsp60, fibronektyna, lipopolisacharydy
TLR5 Flagellina
TLR9 CpG DNA
2. Rekrutacja i aktywacja białek adaptorowych MyD88, TIRAP lub
TRAM, które aktywują fosforylację i degradację IκB przez IKK.
3. NK-κB trafia do jądra i następuje ekspresja genów związana z reakcją
zapalną.

Przekazywanie z udziałem NOTCH

• Oddziaływanie jukstatrynowe, indukuje polaryzację grzbietowo-brzuszna
i przednio-tylną zarodka.
1. Związanie białka delta z receptorem NOTCH.
2. Wewnętrzna domena NOTCH jest TF i migruje do jądra.

84
 CYKL KOMÓRKOWY

• Człowiek składa się z ponad 100 bilionów komórek, w ciągu życia ilość
cykli komórkowych wynosi 1016, a w ciągu sekundy dzieli się 10
komórek.
• Proliferacja (rozrost, hiperplazja) – zwiększenie liczby komórek przez
podziały.
• Powstałe po podziale komórki są mniejsze ale ich w czasie życia
następuje ich wzrost zwany przerostem lub hipertrofią. Niektóre
komórki znajdujące się poza cyklem mogą ulegać temu procesowi co
prowadzi do patologicznej hipertrofii np.: serca.
• Akrecja – przyrost istoty międzykomórkowej wytwarzanej przez
komórki.
• Dwoma najważniejszymi procesami cyklu jest podwojenie ilości genomu
(DNA) i odtworzenie epigenomu oraz rozdzielenie ich równo między
potomne komórki.

Faza G1
• Rozpoczyna się po ukończeniu mitozy, trwa od kilu do kilkunastu
godzin.
• Polega na syntezie RNA i białek strukturalnych, cyklin (białka
regulatorowe cyklu) i enzymów napędzających cykl – kinazy białkowe,
w tym zależne od cyklin (CDK).
• By ulec podziałowi komórki muszą sforsować punkt restrykcyjny (R) –
przezwyciężyć inhibitor CKI-p16 (inhibitor CDK wiązany przez
CDK4/6) i zgromadzić zestaw białek regulatorowych i enzymatycznych
potrzebnych do przeprowadzenia komórki przez G1: cyklina D1/CDK4,
D2/CDK4, D3/CDK6 (CDK fazy G1).
• Zazwyczaj CDK4/6 jest związane z p16 (inhibitor) niepozwalającym na
wiązanie z cyklinami D. Cyklina D jest obecna w komórce tylko pod
wpływem mitogenu lub w komórkach nowotworowych. Po otrzymaniu
sygnału cyklina D1 jest produkowana w nadmiarze i wypiera
kompetycyjnie p16 z CDK4/6→ związanie cyklin z CDK→ związanie
CDK z ATP→ kinaza CAK (CDK activating kinase) fosforyluje
treoninę CDK w pozycji 16→ aktywacja CDK→ kompleksy cyklina
D/CDK4/6 fosforylują i unieczynniają białko RB kompleksu
RB/E2F→ aktywacja TF E2F→ transkrypcja cyklin E, A i polimerazy
DNA→ przejście G1→ S napędzane kompleksem cyklina E/CDK2.

85
 • Białko RB jest zakodowane w chromosomie 13 i jest defosforylowane
po mitozie.
• Flawopirydol hamuje CDK4,6,7,9 (aktywujące polimerazy II-mRNA)
i blokuje ABC.
• Punkt R odpowiada za kontrolę prawidłowości struktury DNA.
Uszkodzenia DNA powodują zatrzymanie cyklu z udziałem kinazy
Chk2 (chceckpoit kinase 2) hamującej fosfatazę CDC25 zatrzymującą
komórkę w G1. Jej mutacje powodują 2-3 wzrost szansy na raka
gruczołu mlekowego (delecja w pozycji 1100). Inne mutacje prowadzą
do mięsaków i guzów mózgu.
• W organizmie dorosłym wiele komórek opuszcza G1 przed osiągnięciem
R, wchodzą do G0 (stan spoczynkowy), a pod wpływem cytokin mogą
wrócić do cyklu. Z G1 mogą wchodzić też na drogę różnicowania,
starzenia lub śmierci samobójczej.
• Cykl centrosomowy – regulowany przez cykliny A i E podział centrioli
i centrosomów w G1 i S (para centrioli podwaja się w S).

Faza S
• Komórki osiągają ją po związaniu cyklin E i A z CDK2. Kompleks
(E, A/CDK2 – CDK fazy S, S-CDK), są transportowane do jądra
i przygotowują komórkę do programowanej syntezy DNA i replikacji
białek centromerów i epigenomu.

Podwojenie genomu
• Synteza DNA jest semikonserwatywna, rozpoczyna się równocześnie
w kilkunastu tysiącach miejsc – punkty startowe replikacji.
• DNA euchromatyny jest replikowany wcześniej niż heterochromatyny.
Replikacja zachodzi dwukierunkowo z prędkością 10-100 nukleotydów/s
– DNA jest replikowane 6-8 godzin.
• Replikacji ulega cały DNA jądrowy i większość mitochondrialnego.
• Replikony przeprowadzają syntezę DNA jądrowego, należą do macierzy
jądra. Składają się z helikazy i polimerazy DNA α, δ.
• Zreplikowane helisy tworzą dwie chromatydy siostrzane tworzące
rozproszony chromosom.
• Kohezyna-SA2 łączy centromery, a kohezyna-SA1 łączy, z udziałem
kompleksu PCNA (proliferating cell nuclear antigen) telomery.
• Zachodzi tylko raz w danym cyklu by uniknąć poli- aneuploidii.

86
Nieprogramowana synteza (reparacja DNA)
• Może zachodzić w fazach S, G1 i G2. Zachodzi jeśli w czasie syntezy
nastąpi błąd lub DNA jest uszkodzony, następuje wtedy uaktywnienie
punktów kontrolnych faz S/G1/G2.
• Mechanizm reparacji jest kontrolowany przez dwie nadrzędne kinazy
ATM (ataxia teleangiectasia mutated) i ATR (ataxia teleangiectasia and
Rad3 related) z udziałem białka motorowego helikazy i innych.
• ATM wyłącza cykl komórkowy z udziałem kinazy WEE w odpowiedzi
na pęknięcie obu nici, a ATR robi to przy zaburzeniach pracy widełek
replikacyjnych, lub pęknięciu jednej nici.
• Gdy reparacja nie jest możliwa następuje aktywacja białka p53
włączającego program śmierci komórki i niszcząc błędny DNA wraz
z komórką.
• Efektywność reparacji zależy od rodzaju, wieku i otoczenia komórki.
• Mechanizm reparacji jest używany do wycinania zmetylowanej cytozyny
i zastępowania jej niezmetylowaną co uaktywnia geny epigenetycznie
wyciszone.

Podwojenie i odtworzenie epigenomu

• Następuje w fazie S i częściowo G2 – hemimetylacja de novo cytozyny
na nowej nici DNA i utrzymanie miejsc metylacji na matczynej nici,
odtworzenie nukelosomów wraz z kodem histonowym.
• Przekazanie cech epigenetycznych określane jest jako book-marking
(pamięć komórkowa). Bierze w nim udział białko PCNA wiążące
enzymy potrzebne do metylacji/demetylacji DNA i modyfikacji
histonów. Prócz PCNA biorą w nim udział białka opiekuńcze:
◦ NAP-1 przemieszcza histony do jądra.
◦ CAF-1, HIRA – łączą i odłączają histony.

Faza G2
• Rozpoczyna się zakończeniem replikacji i trwa do wejścia w mitozę –
ok. 2-4 godziny, podczas tego czasu syntezowane są białka
regulatorowe i enzymatyczne oraz dodatkowa powierzchnia błony
komórkowej w postaci pęcherzyków.
• Przejście przez te fazę i osiągnięcie M zapewnia kompleks
cyklina B/CDK1 (inaczej MPF – M-phase promoting factor),
współdziałający z CDC25 i kinazą WEE. Ważną rolę w przejściu G2
w M odgrywają kinazy Polo (Plk), które:
◦ Aktywują kompleksy cyklina/CDK.
◦ Aktywują fosfatazy CDC25.
◦ Powodują dojrzewanie centrosomów.
◦ Biorą udział w tworzeniu wrzeciona podziałowego.
87
 ◦ Aktywują kompleks anafazowy (APC, kompleks promujący
anafazę).
◦ Biorą udział w wytwarzaniu pierścienia kurczliwego w cytokinezie.
• Uszkodzenie komórki (najczęściej przez UV lub stres oksydacyjny) jest
hamowane w punkcie kontrolnym G2 przez aktywację p53
(unieczynnia CDK1) i aktywacje kinazy Chk2 (unieczynnia fosfatazę
CDC25 i CDK1).
• Komórki nienormalnie małe, które nie zgromadziły wystarczającej
ilości makrocząsteczek są zatrzymywane w G2 do czasu osiągnięcia
pożądanego rozmiaru. Na obwodzie małej komórki kinazy POM1 są
ściśle upakowane co hamuje kinazę CDR2→ aktywacja kinazy WEE1→
hamowanie kinazy CDK1→ zatrzymanie przejścia G2 w M.
W mechanizmie działania punktu kontrolnego rolę odgrywa białko RB.

Faza M
• Mitoza trwa w komórkach ssaków zwykle 30-180 min. Składa się
z kariokinezy i cytokinezy, a procesom tym towarzyszy tworzenie
wrzeciona podziałowego, fragmentacja i rekonstrukcja otoczki jądrowej
i jąderka.

Profaza
• Pierwszą jej oznaką jest kondensacja chromatyny, ułatwia ona
precyzyjne rozdzielanie genomu i epigenomu do potomnych komórek.
Pojawiają się chromosomy mitotyczne, we wczesnej profazie mają
wygląd długich, cienkich nici, każdy składa się z 2 chromatyd
połączonych ściśle na całej długości.
• W późnej profazie centromer jest otoczony kompleksami białkowymi
tworzącymi kinetochor. Wiąże on mikrotubule kinetochorowe
wrzeciona podziałowego, a w anafazie przyczynia się do ściągania
chromatyd do biegunów komórki ponieważ zawiera kinezyny. Poza nimi
znajdują się białka uczestniczące w rozdzielaniu chromatyd w anafazie
oraz przy hamowaniu mitozy (punkt kontrolny wrzeciona podziałowego).
W przypadku braku przyłączenia jednego chromosomu do mikrotubuli
kinetochorowej następuje zahamowanie mitozy.
• Kondensacja chromatyny i chromosomów postępuje stopniowo aż do
wykształcenia chromosomów metafazowych.
• Kondensyny – kompleksy białkowe w kształcie litery V odpowiedzialne
za kondensację chromosomów. Mają aktywność ATP-azową i są
białkami motorowymi. Wiąże się z nukleosomami. Są fosforylowane na
początku profazy przez CDK1 kompleksu cyklina B/CDK1. Hydroliza
ATP powoduje zbliżanie lub oddalanie ich ramion, co skraca chromatynę.
• Zanika jąderko i powoduje to 90% spadek anabolizmu podczas mitozy.

88
 • Centrosomy przemieszczają się ku biegunom. Utworzone wrzeciono
podziałowe (dwubiegunowa struktura zbudowana z mikrotubuli
połączonych z MAP), jest miejscem gdzie od centrosomów odchodzą
mikrotubule kinetochorowe, ramienne, biegunowe i astralne.

Prometafaza
• Następuje rozerwanie i pofragmentowanie otoczki jądrowej, za
pomocą kompleksów białkowych dyneiny/dynaktyny/białka p150
związanych z otoczką.

Metafaza
• Następuje dalsza kondensacja chromosomów, do czasu gdy znajdą się
w płaszczyźnie równikowej (z góry przypomina gwiazdę (macierzystą),
z boku płytkę (równikową)).
• Składniki cytoplazmy przemieszczają się z prędkością 1 μm/min ku
biegunom komórki.

Anafaza
• Pod koniec metafazy chromatydy siostrzane są połączone kompleksami –
kohezynami zbudowanymi także z proteazy – separyny,
i unieczynniającego ją białka sekuryny.
• Na początku anafazy dochodzi do defosforylacji sekuryny przez
CDC25 i w takiej postaci jest trawiona w proteasomach z udziałem
kompleksu anafazowego APC (cyklosom) będącego ligazą ubikwityny
aktywowaną przez CDC20. Aktywna separyna trawi kohezyny
i następuje uwolnienie chromatyd (od tej chwili nazywanych
chromosomami) i ich przemieszczenie ku biegunom z prędkością 2,5
μm/min. Ruch odbywa się dzięki:
◦ Ślizganiu względem siebie mikrotubuli biegunowych z udziałem
kinezyny – oddalenie centrosomów.
◦ Ślizganie mikrotubuli astralnych względem sieci filamentów
aktynowych z udziałem dynein – przesuwanie chromosomów do
centrosomów.
◦ Ślizganie ramion chromosomów względem mikrotubuli ramiennych
z udziałem chromo-kinezyny – układanie w płytkę równikową.
◦ Ślizganie kinetochorów względem mikrotubuli kinetochorowych
z udziałem kinezyny i dyneiny cytoplazmatycznej – ruch
chromosomów do centrosomów.
• Punkt kontrolny wrzeciona podziałowego – jeśli któryś
z chromosomów nie przyłączy się do mikrotubuli kinetochorowej lub
jeśli istnieje inny defekt wrzeciona (zapobiega hipo-, poli- i aneuploidii).

89
Telofaza
• Rozpoczyna się po dotarciu chromosomów do biegunów.
• Następuje odbudowa jąder rozpoczynająca się dekondensacją
chromosomów, stają się one one coraz cieńsze i dłuższe.
• Przywrócona zostaje transkrypcja DNA (w tym rDNA – odbudowa
jąderka).
• Defosforylacja nukleoliny i białka B23 jąderka i rozpad wrzeciona
podziałowego.
• Odtworzenie otoczki jądrowej z przetrwałych fragmentów
i defosforylacja lamin co prowadzi do odtworzenia blaszki jądrowej.
• Każdy zdekondensowany chromosom jest otaczany kompleksem białek
CTFT (CCCTC-binding factor) odpowiadają one za utrzymanie
archiktektury chromatyny interfazowej, izolację chromosomów od
czynników zmieniających stan epigenetyczny chromosomów i pobudzają
transkrypcję.

Cytokineza
• Rozpoczyna się pod koniec anafazy lub początku telofazy
wytworzeniem pierścienia kurczliwego. Składa się on głównie z aktyny
i ABP (głównie miozyna II). W jego tworzeniu bierze też udział kinaza
RHO (ROCK) fosforylująca i inaktywująca małe GTP-azy (białka
RHO) co zwiększa liczbę filamentów aktynowych i ich stabilizację.
• Kurczenie pierścienia prowadzi do powstania bruzdy podziałowej
i całkowitego rozdzielenia komórek. Mechanizmy skurczu pierścienia:
◦ ROCK fosforyluje i inaktywuje MLCP (fosfataza łańcuchów lekkich
miozyny)→ hamowanie defosforylacji MLCK→ uczulenie na
Ca2+→ ślizganie przy niezmiennym stężeniu jonów.
◦ ROCK fosforyluje łańcuchy lekkie miozyny II→ zwiększenie
aktywności ATP-azowej łańcuchów ciężkich miozyny II→ ślizganie.
• Skurcz prowadzi do powstania ciałka środowego – w tym momencie się
kończy.
• Po mikrotubulach transportowane są puste pęcherzyki cytoplazmatyczne
które potem się zlewają.

G0
• Wczesna faza G1. Zależnie od sygnałów lub lub stanu epigenetycznego
komórki mogą opuścić cykl i mieć różne losy:
◦ Włączyć program śmierci samobójczej i zginąć.
◦ Przeprogramować epigenom, przestać dzielić i zacząć się
różnicować.
◦ Zacząć proces starzenia.

90
 ◦ Wejść w stan spoczynkowy G0 w którym mogą być długi czas,
a potem pod wpływem sygnałów wrócić do cyklu komórkowego.
• Lub po sforsowaniu punktu restrykcyjnego mogą wchodzić w następny
cykl komórkowy (np.: komórki przedimplantacyjnych zarodków,
macierzyste, guzów złośliwych i komórki tkanek odnawiających się).
• Przejście G0→G1 odbywa się z udziałem białka RB. Kompleksem
napędzającym jest cyklina C/CDK3.
• Cyklina C łączy się CDK3→ fosforylacja RB→ uwolnienie E2F
z kompleksu RB/E2F→ transkrypcja cyklin/CDK fazy G1 i przejścia
G1 w S. Jest to poprzedzone modyfikacją stanu epigenetycznego
komórki.

Endoreduplikacja
• Polega na syntezie genomu i epigenomu, ale mitoza jest niepełna lub jej
brak, skutkuje to poliploidyzacją i/lub wytworzeniem dwujądrowych
komórek.
• Prosty niskoenergetyczny sposób powielenia liczny genów w komórce
z pominięciem reorganizacji cytoszkieletu, wytwarzania wrzeciona
podziałowego i dodatkowej syntezy błon.
• Występuje w trofoblaście, doczesnej, megakariocytach
i hepatocytach.

Regulacja cyklu komórkowego

• Jednym z głównych białek włączających/wyłączających cykl
komórkowy jest mTOR (mammalian target of rapamycin) i jej szlaki
sygnałowe. Jest ona kinazą występującą w kompleksie z białkami
mTORC1,2 (regulują metabolizm, stężenie substancji odżywczych
i zasoby energetyczne komórki). Jeśli warunki są sprzyjające mTORC
włącza inne szlaki sygnałowe prowadzące do rozpoczęcia
i przeprowadzenia cyklu komórkowego.
• Innym ważnym białkiem regulującym jest TF NFκB i jego szlaki
sygnałowe.
• Białka biorące udział w regulacji są kodowane przez geny cyklu
komórkowego, pobudzające – protoonkogeny (zmutowane są nazywane
onkogenami). Zazwyczaj określa się je 3 literami (np.: FOS, JUN, MAF,
SRC).
• Do produktów protoonkogenów należą: kinazy białkowe zależne od
cyklin (CDK), cykliny (aktywują kinazy), fosfatazy, białka
przekazujące sygnały, czynniki transkrypcji, białka receptorowe,
cytokiny.
• Proonkogeny komórkowe określa się literą c, a onkogeny wirusowe „v”.

91
 • Geny hamujące cykl komórkowy są określane supresorowymi. Kodują
one białko:
◦ RB (retinoblastoma) – wiąże się z TF E2F unieczynniając go,
fosforylacja powoduje uwolnienie TF.
◦ p53 – czynnik transkrypcji aktywujący setki genów których
produkty hamują cykl komórkowy, indukują śmierć komórki,
stabilizują genom przez włączanie mechanizmów naprawy DNA,
wprowadzają komórkę na drogę starzenia, wywołują autofagię.
W normalnych warunkach jest ono rozkładane w proteasomach po
poliubikwitynacji z udziałem MDM (ligaza ubikwityny). Jego
aktywację wywołuje uszkodzenie DNA, nieprawidłowa mitoza,
zakażanie wirusowe, stres oksydacyjny, niedotlenienie, zaburzenia
transkrypcji itp. Stanowi on barierę dla nowotworów. Mutacje TP53
kodującego p53 występują w 50% nowotworów złośliwych.
◦ Duże rodziny białek inhibitorów kodowane przez CIP/KIP
(hamujące w G1 i M, ale mogące też pobudzać cykl p21, p27 i p57)
i INK4a (hamujące w fazie G1 białka p15, p16, p18 i p19).
• Produkowane w cytoplazmie cykliny są transportowane do jąder, a z nich
do z powrotem do cytoplazmy.

Regulacja cyklu komórkowego z zewnątrz

• Sygnały są przenoszone przez cytokiny, hormony i cząsteczki istoty
międzykomórkowej na drodze auto-, para-, endo- i jukstatrynii.
• Szczególna rolę w przekazywaniu sygnałów przez cytoplazmę biorą
kinazy MAPERK (antygen-activated protein, extracellular-signal-
regulated kinases), zbudzają:
◦ Syntezę nukleotydów (fosforylacja CPS II→ zmiana
konformacji→ CPS II + PRPP→ wzrost syntezy nukleotydów→
włączenie cyklu).
◦ Syntezę białek (aktywacja MKN1→ fosforylacja ELF-4→
włączenie rybosomów→ synteza białka→ włączenie cyklu).
◦ Aktywują protoonkogeny i onkogeny
Fosforylacja TF→ wzrost aktywności TF→ Włączenie
cyklu
Fosforylacja histonu H3 i HMG-14→ rozluźnienie Wzrost
chromatyny→ transkrypcji
genów
Transkrypcja cykl. D1→ Inaktywacja białka
cyklu→
RB i uwolnienie
Powstawanie cykl. D1/CDK4→
E2F→

92
Rodzaje populacji komórkowych
• Pod wpływem czynników wewnętrznych i zewnętrznych komórki
organizmu tworzą 4 populacje. Wszystkie one podlegają starzeniu co
zmienia ich strukturę i ogranicza funkcję.
Komórek Zachowują zdolność do podziałów i różnicowania przez całe
macierzystych życie. Występują w niszach tkankowych jako macierzyste
komórki multipotentne hemocytopoezy, mezenchymatyczne,
śródbłonka, jelit, jądra, gruczołu mlekowego, wątroby
i nabłonka oddechowego.
Odnawiającą Komórki dzielą się nieustannie zastępując zużyte: nabłonki,
się szpik, kostny, komórki spermato- i oogenezy.
Spoczynkową Znajdują się w fazie G0 i dzielą się rzadko ale pod wpływem
sygnałów z zewnątrz wchodzą do G1 prowadząc do
regeneracji ubytków tkankowych: hepatocyty, komórki
trzustki, śródbłonka, nerek, miocyty, limfocyty i fibroblasty.
Komórek Nastąpiło w nich przeprogramowanie genomu, zróżnicowanie
niedzielących i utrata zdolności do podziałów: neurony, kardiomiocyty
się i komórki mięśni szkieletowych. Wprowadzenie odpowiednich
TF wprowadza je do cyklu komórkowego.

Cykl komórkowy a wirusy

• Większość wirusów zakażających ludzkie komórki uśmierca je jednak
retrowirusy lub bornawirusy (mają RNA), oraz adenowirusy, wirusy
polioma, brodawczaków i opryszczki (DNA) po wniknięciu
wbudowują część swojego genomu (RNA-wirusy wymagają odwrotnej
transkryptazy).
• Fragmenty DNA wirusowego wbudowane do DNA nazywane jest
endogennymi prowirusami (stanowią 8% ludzkiego genomu i są
przenoszone z pokolenia na pokolenie). Regulują one aktywność swoich
genów, ale także wpływają na aktywność protoonkogenów
(nadprodukcja ich RNA i białek).
• W patologii człowieka szczególną rolę odgrywają prowirusy
retrowirusów i wirusów polioma mających 1-2 wirusowe onkogeny
włączające niekiedy proces nowotworowy.
• Przykładem jest wirusowy onkogen v-src kodujący p60v-src będące kinazą
uruchamiającą kaskadę fosforylacji innych białek cyklu komórkowego
i prowadzi do nowotworzenia.

93
 • Przenoszone drogą płciową wirusy ludzkich brodawczaków (HPV)
hamują CKI – p21, p27, unieczynniają p53, rozszczepiają kompleks
RB/E2F i uczynniają geny kodujące cykliny A i E co pobudza cykl
komórkowy komórek nabłonkowych szyjki macicy wywołując dysplazję
przechodzącą w raka in situ, a w końcu inwazyjnego.
• DNA wirusa opryszczki 8 mięsaka Kaposiego (KSHV8) koduje
v-cyklinę, pobudza ona w CDK6, przechodzenie przez punkt R i rozwój
mięsaka Kaposiego towarzyszącego AIDS.
• Produkty onkogenów mogą prowadzić do chorób nienowotworowych
którym towarzyszą nowotwory złośliwe.
◦ W ataxia teleangiectasia onkogen atm prowadzi do powstania
różnych białaczek.
◦ W zespole Li-Fraumeni onkogen TP53 daje mięsaki i guzy gruczołu
sutkowego.
◦ Rodzinny siatkówczak (retinoblastoma) – onkogen Rb wywołuje
dodatkowo mięsaki kości.
◦ Onkogen INK4 kodujący p16 powoduje poza rodzinnym mięsakiem
złośliwe znamiona barwnikowe i raka trzustki.

Choroby proliferacyjne
• Choroby nowotworowe – charakteryzuje je łatwość przechodzenia
przez punkty kontrolne cyklu komórkowego szczególnie przez punkt
restrykcyjny. Białka receptorów, szlaków transdukcji sygnałów i białka
napędzające cykl komórkowy są produkowane w nadmiarze i często
w stanie permanentnej aktywacji. Produkty białkowe nieprawidłowych
genów supresorowych nie hamują cyklu – RB, TP53, INK4 i CIP/KIP.
• Choroby sercowo-naczyniowe – miażdżyca i restenoza mają przyczynę
w nadmiernej proliferacji miocytów gładkich. W miażdżycy mikrourazy
śródbłonka prowadzą do powstania przyściennych agregatów płytek krwi
wydzielających PDGF itp. co pobudza proliferację i powstanie guzków w
błonie wewnętrznej. Degenerują one i wapnieją co powoduje powstanie
pierwotnych płytek miażdżycowych.

94
 STARZENIE TKANEK

• Starzenie (senescentia) – postępujące z wiekiem zmiany strukturalne

tkanek, pogarszanie procesów funkcjonalnych i ograniczenie zdolności
adaptacyjnych do stresu metabolicznego. W niektórych narządach
wyjątkowo zaawansowane przejawiają się występowaniem chorób
towarzyszących starzeniu (degeneracyjne – Alzheimera, Parkinsona,
miażdżyca naczyń, cukrzyca typu 2, osteoporoza, reumatoidalne
zapalenie stawów oraz nowotwory).
• Komórki ulegające starzeniu wykazują ekspresję β-galaktozydazy,
o optimum aktywności przy pH 6 (młode przy pH 4,5).

Genom a starzenie
• Hipotetyczny program starzenia byłby częścią rozwoju genetycznego
organizmu i programowałby jego długość. Dowody na jego istnienie
pochodzą od badań robaków C. elegans (sztuczna mutacja genu daf2
(gen ponurego żniwiarza), którego produkt jest receptorem IGF1, a ten
unieczynnia przez fosforylację TF DAF16, jego produkty – białka szoku
termicznego i antyoksydanty chronią komórki przed starzeniem
i powodują dłuższe przebywanie w formie młodzieńczej).
• Nadekspresja genu klotho kodującego β-glukoronidazę hamuje objawy
starzenia u myszy. Białko to jest wykrywane we krwi i jego ilość
zmniejsza się z wiekiem.
• Wiele genów kodujących długość życia koduje biała białka reparacji
DNA np.: geny i białka BRCA1 (breast cancer type 1 susceptibility
protein), HELQ (helicase, Polq-like).
• BRCA1 tworzy z innymi białkami kompleks BASC otaczający
uszkodzone dsDNA i naprawiający uszkodzenie. HELQ to helikaza
biorąca udział w reparacji DNA, a jej mutacje zwiększają ryzyko raka
jajnika 2-krotnie.
• Wyłączenie genów kodujących ważne hormony również jest częścią
programu genetycznego starzenia, choć samo wyłączanie genów odbywa
się drogą epigenomu. W miarę upływu wieku receptory dla hormonu
wzrostu (GH) i insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF1) są
wyłączane w różnych komórkach co prowadzi do starczej sarko-
i osteopenii, oraz zaniku innych tkanek.

95
Mutacje a starzenie
• Dzieli się je na somatyczne (komórek somatycznych) i genetyczne
(plemniki i komórki jajowe).
• Komórki dzielą się tempie 10/s, a w ⅓ powstają mutacje DNA. Wyróżnia
się mutacje punktowe, insercje i delecje. Skutkują one powstaniem białka
z niezmienionym aminokwasem (milcząca), z innym aminokwasem
(zmiany sensu) i białka bez aminokwasu (nonsensowna).
• Poza błędami replikacji mutacje wywołują toksyny, promieniowanie
jonizujące, UV i wolne rodniki.
• Większość mutacji jest korygowana lub niszczone są całe komórki,
a pozostałe kumulują się (szczególnie w komórkach rzadko dzielących
się) i prowadzą do starzenia entropowego, chorób degeneracyjnych
i nowotworowych.
• Somatyczne mutacje mitochondrialnego DNA (mtDNA) powstają
wskutek bliskości źródeł wolnych rodników i braku histonów.
Kumulujące się mutacje uszkadzają mitochondria, zaburzają działanie
łańcucha oddechowego co powoduje zwiększoną produkcję wolnych
rodników, a te indukują śmierć programowaną komórek i zmiany starcze,
oraz spowalniają syntezę nukleotydów.
• Mitochondria starszych ssaków są większe i mniej wydolne. Ich
uszkodzenie powoduje wytworzenie wstecznego szlaku sygnałowego
mitochondrium-jądro co zmniejsza aktywność genów i powoduje
powstanie i rozwój zmian starczych i nowotworów.
• Stres oksydacyjny zwiększa ekspresję p16 (inhibitor CDK4,6)
i uruchamia szlak p16-pRB – indukowane przez stres przedwczesne
starzenie (SIPS – stress-induced premature senescence).

Telomery a starzenie
• Końce chromosomów zawierają powtarzające niekodujące sekwencje
(TTAGGG). Chronią one chromosomy przed enzymatycznym
rozkładem i fuzją końców. Brak telomerazy w większości komórek
powoduje ich skracanie po każdym podziale (telomery noworodka mają
długość 250000 p.z. a podczas każdego podziału komórka traci 50-200
p.z).
• Brak telomerów jest odbierany jako sygnał o uszkodzeniu chromosomu
i prowadzi do zahamowania cyklu (przez białko p53).
• Komórki zarodków preimplantacyjnych, macierzyste i nowotworowe
zachowują permanentną zdolność do podziałów, mają one czynną
telomerazę.
• Ludzkie komórki embrionalne po ok. 50 podziałach przestają się dzielić.
Stan gdy komórki tracą zdolność do podziałów określa się starzeniem
replikacyjnym (telomerowym).

96
Epigenom a starzenie
• DNA przeciętnej komórki zawiera kilkadziesiąt milionów reszt
cytozynowych występujących w parach CG. Mogą być one
metylowane co w obrębie promotora genu prowadzi do wyciszenia.
• CG występują szczególnie obficie w kilkudziesięciu tysiącach krótkich
odcinków – wysp CG szczególnie skoncentrowane w promotorach
ważnych genów, dlatego ich metylacja/demetylacja odpowiada za
aktywność genu.
• Innymi mechanizmami regulacji ekspresji genu są:
◦ Acetylacja/deacetylacja, metylacja/demetylacja, ubikwitynacja
i fosforylacja lizyny histonów H3 i H4 – zmiana kodu
histonowego.
◦ Blokowanie mRNA przez mikroRNA co hamuje translacje.
• Stan epigenomu jest przenoszony przez mitozy i określany jako pamięć
komórkowa (book-marking).
• Może być modyfikowany przez czynniki wewnętrzne i zewnętrzne
(dieta, patogeny, substancje toksyczne). Epigenom zmienia się
otrzymując piętna, co zmienia aktywność genów – dryft epigenomu.

Zmiana metylacji z wiekiem

• Od zapłodnienia do stadium blastocysty następuje wymazywanie
metylacji miejsc cytozynowych, podobny proces odbywa się
w spermatoo- i oogenezie, a po nim następuje odbudowa imprintingu
(wyciszenie alleli ok. 100 genów matczynych lub ojcowskich).
• W węźle zarodkowym blastocysty odbywa się odbudowa stanu
epigenetycznego w postaci metylacji cytozyny DNA – różnicowanie
komórkowe, jego apogeum przypada na okres okołoporodowy (81%
miejsc cytozynowych jest zmetylowanych). W życiu dochodzi do
postępującej hipometylacji – u 26 letnich 78%, a u starców 73%.
• U ludzi starzejących się jednocześnie z ogólną hipometylacją pojawia się
hipermetylacja wysp CG, dlatego ich komórki tracą zdolność do
ekspresji genów białka p53, PCG (reguluje biogenezę mitochondriów,
syntezę ATP i metabolizm, dysmutazy nadtlenkowej, syntazy NO,
lipooksygenazy itp.) transkrypcja genów białek napędzających cykl
komórkowy jest zablokowana.
• Manipulowanie donorami grup metylowych np.: S-adenylometnioną
(SAM) przyspiesza lub hamuje metylacje cytozyny.

97
Deacetylacja a starzenie
• W komórkach ludzkich występuje 7 rodzajów deacetylaz klasy III,
określanych sirtuinami (SIRT1-7) z rodziny białek HDAC, będących
czujnikami stanu energetycznego komórki. Ich działanie może być różne
i zależy od hydrofobowych składników ich substratów.
• SIRT deacetyluje H3 i H4 blokując dostęp czynników i koaktywatorów
transkrypcji do genów i inaktywując te geny.
• Substratami dla sirtuin są też p53, Rb, PCG i NFκB.
• Silnym aktywatorem SIRT1 i SIRT5 jest polifenol – resweratrol
znajdujący się czerwonym winie. SIRT1 zapobiega zapaleniu starczemu
i hamuje starzenie, hamuje przedwczesne starzenie komórek śródbłonka
traktowanych angiotensyną II. Zapobiega SIPS, zapaleniu płuc, POChP
i rozedmie.
• Bezpośrednim aktywatorem SIRT1 jest jest lamina A.
• Inhibitory sirtuityny np.: splitomycyna stosowane są w modyfikowaniu
starzenia w leczeniu chorób degeneracyjnych, nowotworach i otyłości.

MikroRNA a starzenie
• Reguluje negatywnie potranskrypcyjną ekspresję genów blokując
mRNA.
• Każdy rodzaj mikroRNA kontroluje ekspresję 100 genów. Spośród 600
rodzajów mikroRNA zbadanych w mózgu 15% zmienia swoją aktywność
w czasie starzenia.

Wolne rodniki
• Ok 2% tlenu zużywanego przez komórki ulega redukcji przez dodawanie
elektronów co prowadzi od powstania anionu nadtlenkowego, a z niego
rodnika hydroksylowego i nadtlenku wodoru.
• Ich niesparowane elektrony wchodzą łatwo w reakcje z białkami,
lipidami i kwasami nukleinowymi jąder, mitochondriów, błon itp.
skutkuje to karbonylacją białek i utlenianiem SH, peroksydacją
nienasyconych kwasów tłuszczowych błon, przerywanie pojedynczych
nici i helisy, zmiany par zasad i wymiany chromatyd oraz tworzenie
wiązań DNA-białka.
• Dziennie 200000 wolnych rodników oddziałuje na DNA jednej komórki
powodując jego uszkodzenia, ich stężenie zwiększa się z wiekiem i jest
2-3 razy większe u osób starych.
• Wolne rodniki w stężeniu subtoksycznym pełnią rolę informatorów,
kontrolują czynniki transkrypcji i transkrypcję oraz aktywność kinaz
i fosfataz. Działają także na białka bogate w cysteinę wytwarzając
wiązania S-S i zmieniając konformację i aktywność. Regulują metylację
cytozyny DNA modyfikując epigenom.

98
 • Antyoksydanty – neutralizują wolne rodniki należą do nich: dysmutaza
nadtlenkowa (SOD), katalaza, peroksydaza glutationu (GPx),
peroksyredoksyna 1 (PRX1), β-karoten, foliany, kwas moczowy,
witaminy A, C i E. Z wiekiem ich ilość zmniejsza się.

Glikacja
• Nieenzymatyczna glikozylacja – niekontrolowane wiązanie cukrów
(glukozy, fruktozy, deoksyrybozy, rybozy) z białkami, DNA i lipidami.
• Postępuje powoli upośledzając aktywność makrocząsteczek.
• Zewnętrzna – występuje poza organizmem człowieka, gdy produkty są
poddane działaniu wysokiej temperatury. Następuje rekacja Maillarda.
• Wewnętrzna – zachodzi powoli i spontanicznie w organizmie człowieka.
Cukry wiążą się z grupami aminowymi i tiolowymi argininy, lizyny
i cysteiny, z deoksyguanozyną i fosfolipidami.
• Zaczyna się od związania cukrów z grupami -NH2 i -SH wytwarzając
przejściowe produkty glikacji – zadadę Schiffa i produkt Amadoriego.
Produkt Amadoriego przekształca się w zaawansowane produkty
glikacji (AGE) będące w większości związkami
α, β-dikarbonylowymi (np.: metyloglioksal lub glioksal). Są one
naturalnie rozkładane przez glioksalazę 1, jej aktywność spada wraz
z wiekiem.
• AGE mogą występować w postaci dużych połączonych wiązaniami
krzyżowymi agregatów.
• Większość AGE białkowych zawiera strukturę arginina-lizyna-glukoza
(glukozepan). Tego typu wiązania krzyżowe występują 50-razy częściej
u osób 90-letnich niż inne typy wiązań krzyżowych u ludzi w średnim
wieku oraz 2 razy częściej u chorych na cukrzyce. Wiązania krzyżowe są
odporne na proteolizę.
• Głównym źródłem AGE jest glikacja wewnętrzna, nasila się ona od
35 r.ż.
• Na powierzchni wielu komórek znajdują się receptory dla AGE –
RAGE. Ich liczba wzrasta z wiekiem i w cukrzycy. Związanie AGE
prowadzi do:
◦ Endocytozy AGE i zalegania w komórkach lub trawienia
w lizosomach.
◦ Pobudzania aktywności NFκB i rozwoju zapalenia starczego.
• Narażone są na nią głównie białka długo żyjące – kolagen, krystalina
i białka błon podstawnych.

99
 • AGE kolagenu skóry powoduje utratę elastyczności i zwiotczenie co
prowadzi do pojawienia się zmarszczek i cellulitu. AGE krystaliny
powoduje zmętnienie soczewki i kataraktę. AGE błon podstawnych
pogarsza ukrwienie i funkcjonowanie nerki (nefropatia) itp. AGE tkanki
nerwowej mózgowia wytwarzają w Parkinsonie ciałka Lewy'ego
w neuronach istoty czarnej lub płytki β-amyloidu w chorobie
Alzheimera.
• Glikacja hemoglobiny powoduje wytworzenie glikacjowanej
hemoglobiny (HbA1c), określenie jej stężenia pozwala określić średnie
stężenie glukozy podczas ostatnich 8-12 tyg. ludzie bez cukrzycy mają
3,5-5,5% HbA1c.
• Glikacja DNA przez wiązanie cukrów z deoksyguanozyną powoduje
wzrost mutacji i reparacji tego związku. AGE DNA znaleziono u chorych
na nefropatię i w cukrzycy typu 2.
• Glikacja lipidów dotyczy białek i cholesterolu LDL. AGE-cholesterol
LDL-u zwiększa drastycznie utlenianie LDL zachodzące w ogniskach
miażdżycy. AGE-białka LDL-u znoszą powinowactwo LDL do jego
receptorów hamując endocytozę.

Uszkodzenia DNA
DNA Pojawiają się w nim 60 tys/dzień. Najczęściej są to pęknięcia
jądrowy pojedynczych nici (50 tys/dzień), depurynacja (10 tys/dzień), alkilacja
zasad (2 tys/dzień), deaminacja, wiązania krzyżowe i pęknięcie obu
nici DNA. Średnia liczba uszkodzeń na godzinę to 2,5 tys. większość
jest eliminowana przez reparację. Wiele genów regulujących długość
życia, starzenie i choroby mu towarzyszące kodują białka biorące
udział w reparacji DNA. Część uszkodzeń jest nierozpoznawana. W
komórkach dzielących się często niezreperowane uszkodzenia
prowadzą do ich śmierci, albo po kilku podziałach następuje
nowotworzenie. W komórkach niedzielących się kumulują się one z
wiekiem co prowadzi do upośledzenia funkcji.
mtDNA Uszkadzany 10-24 razy częściej niż jądrowy. Kolisty, koduje 13
białek i 24 rodzaje RNA. Jego uszkodzenia są słabo reparowane, nie
ma histonów.

Ograniczenie kaloryczne
• Ograniczenie zużycia kalorii jest ważnym czynnikiem powstrzymującym
starzenie i przedłużającym życie.
• Prowadzi do zmniejszenia wytwarzania wolnych rodników, reparacja jest
sprawniejsza, wiele enzymów zachowuje aktywność, a błony stają się
bardziej płynne, wydłuża to życie o 20%.

100
 • Odpowiada ze nie peroksyredoksyna 1 (Prx1) – antyoksydant
rozkładający H2O2. W miarę upływu wieku traci ona aktywność.
Sulfiredoksyna1 (Sxr1) redukuje cysteinę unieczynnionego Prx1
przywracając mu aktywność.

Zapalenia starcze (inflammaging)

• Ukształtowanie ewolucyjne, przewlekłe zapalenie o słabym nasileniu
utrzymujące u ludzi starzejących się. Charakteryzuje je przewaga
procesów uszkadzających nad reparacyjnymi.
• Na powierzchni i w cytoplazmie wielu komórek znajdują się czujniki –
receptory PRR (pattern recognition receptors), są one białkami
transbłonowymi lub rozpuszczalnymi w cytoplazmie. Rozpoznają
budowę cząsteczek patogenów PAMP (pathogen-associated molecular
pattern) wirusów, bakterii, grzybów itp. oraz własnych cząsteczek
zmienionych przez stres – SAMP (stress-associated molecular pattern)
i potrafią je rozróżnić od normalnych cząsteczek organizmu gospodarza.
• Najlepiej poznanymi PRR są transbłonowe TLR i cytoplazmatyczne
NLR i RLH.
• W obecności PAMP i SAMP NLPR1 tworzą kompleksy zwane
inflammasomami aktywującymi proteazę – kaspazę 1 prowadząc do
aktywacji cytokin prozapalnych IL1 i IL18, wydzielania interferonu γ,
a potem IL6, TNF-α i chemokin. Inflammasomy aktywują także
limfocyty NK.
• Cytokiny wyzwalają reakcje prozapalne komórek, a IL6 powoduje
wydzielanie białka C-reaktywnego (CRP) przez hepatocyty.
• CRP jest czynnikiem ryzyka w zawale serca i cukrzycy typu 2
wskazującym na zapalną proweniencję.
• Jest ono przestrojeniem odporności wrodzonej i nabytej. We wrodzonej
makrofagi mają z wiekiem mniejszą zdolność do fagocytozy i produkcji
MHC II, neutrofile mniej fagocytują i produkują mniej wolnych
rodników, komórki dendrytyczne mają mniejszą zdolność fagocytozy
komórek apoptotycznych i migracji, zmniejsza się cytotoksyczność NK.
• W odporności nabytej zmniejsza się liczba limfocytów T ponieważ
aktywność cyklooksygenaz wzrasta z wiekiem podobnie jak synteza
prostaglandyn hamujących ich proliferację. Następuje zanik grasicy,
a repertuar receptorów limfocytów T zmniejsza się drastycznie po 70 r.ż.
Wzrasta produkcja cytokin prozapalnych i spada produkcja IL2,
wzrasta liczba limfocytów T pamięci i produkcja IL4 i IL10,
a spada liczba limfocytów B opuszczających szpik. Obniża się
reaktywność przeciwciał w stosunku do szczepionek.

101
 • Wiele czynników biorących udział w rozwijaniu zapalenia/odporności
wrodzonej działa przez NFκB (nuclear factor kappa-light chain-enhancer
of activated B cells) i jego szlaki transdukcji sygnałów. Jest on
heterodimerem składającym się z różnej kombinacji białek Rel.
W normalnych warunkach jest związany w cytoplazmie przez białko
IκB. Jego aktywacja przez m.in. kinazę IKK powoduje transport do
jądra gdzie z koaktywatorami i polimerazą RNA przeprowadza
transkrypcję.
• Skutkiem aktywacji NFκB jest aktywacja i transkrypcja prozapalnych
cytokin, chemokin, cząsteczek adhezyjnych, cykooksygenaz (COX),
eikosanoidów, metaloproteaz, syntatazy NO i innych – włączają one
zapalenie/odporność wrodzoną. Z wiekiem wzrasta stężenie cytokin
prozapalnych co indukuje zwiększone wydzielanie kortyzolu, jego rola
przeciwzapalna objawia się na obwodzie, a w korze mózgu i hipokampie
działa prozapalnie.
• Inhibitory NFκB:
◦ Kwas acetylosalicylowy (aspiryna) – blokuje miejsce wiązania ATP
w IKK.
◦ Niesteroidowe leki przeciwzapalne.
◦ Glukokortykoidy – zatrzymują NFκB w cytoplazmie.
◦ Antyoksydanty.
◦ Inhibitory proteasomów rozkładających IκB.
◦ Statyny – inhibitory reduktazy HMG acetylokoenzymu A.
◦ Polifenole roślinne blokujące aktywność kinazy IKK.
◦ Rekombinowane peptydy blokujące interakcje białka-białka
i zatrzymujące NFκB w cytoplazmie.
• Wysiłek fizyczny spowalnia proces starzenia działając przeciwzapalnie,
skurcze mięśni szkieletowych wywołują wydzielanie dużych ilości IL6,
a te działa hamująco na TNF-α i CRP, osłabia zapalenie starcze.
• W czasie snu obniża się wydzielanie TNF-α i niemięśniowej IL6,
a podwyższenie ich stężenia daje uczucie senności, wyczerpania
i zmęczenia, dlatego w stanach starczych zaburzeń snu stosuje się
steroidy płciowe pobudzające cytokiny prozapalne.
• Statyny – inhibitory reduktazy HMG acetylokoenzymu A stosowane
do obniżania LDL we krwi hamują rozwój zapalenia starczego.

mTOR w zapaleniu starczym

• W obecności NFκB TNF-α aktywuje mTORc (kinaza serynowo-
treoninowa), a ono hamuje autofagię. Prowadzi to do gromadzenia
uszkodzonych i zużytych cząsteczek (SAMP), uszkodzenia
mitochondriów i zaburzeń metabolizmu.

102
 • Przy nieaktywnym NFκB TNF-α stymuluje ekspresję białka Beclin1,
które aktywuje autofagię.
• Są ważnymi kinazami integrującymi sygnały o dostępności cytokin,
substancji odżywczych i energii, regulują syntezę białka i autofagię,
włączając cykl komórkowy gdy warunki są sprzyjające, a gdy nie są
uruchamiają katabolizm.
• Hamowanie ich aktywności spowalnia proces starzenia, wydłuża życie
i odmładza tkanki.
• Szlak mTOR reguluje przebieg licznych chorób będących wynikiem
starzenia (Alzheimer, nowotwory, choroby serca, nerek i chorób
autoimmunizacyjnych). Działając rapamycyną wyraźnie spowalnia się
te choroby.
• mTOR powoduje akumulację niesfałdowanych białek i stres ER,
zwiększoną produkcję RFT, oksydacyjne uszkodzenia białek, lipidów
i DNA, hamowanie autofagii, zredukowanie odnowy składników
komórkowych. Powoduje wyczerpanie puli komórek macierzystych
i przyspiesza proces starzenia.
• Zmniejszona aktywność mTOR powoduje zwiększenie długości życia
S. cerevisiae, C. elegans i D. melanogaster, myszy.
• Przypuszcza się, że ograniczenie kaloryczne zwiększa długość życia
poprzez zmniejszenie aktywności mTOR.
• Zmniejszona aktywność mTOR podwyższa poziom glikolizy i usuwanie
patologicznych składników komórkowych poprzez autofagię.

Autofagia a starzenie
• Umożliwia degradację i odzyskiwanie elementów komórkowych.
• Rozkład składników komórek sprzyja przeżyciu komórek w czasie
głodu. Podczas tego procesu fragmenty cytoplazmy są zamykane
w autofagosomach, które łączą się z lizosomami i ich zawartość ulega
rozkładowi do substancji prostych, które następnie powracają do
cytoplazmy (recykling).
• Jest adaptacją do stresu i promuje przetrwanie, lecz w pewnych
przypadkach wydaje się prowadzić do śmierci komórek.
• Autofagia jest przyczyną zwiększenia długości życia w przypadku
ograniczenia kalorycznego.

Podwzgórze a starzenie
• W komórkach nerwowych jego jąder ilość NFκB zwiększa się
drastycznie z wiekiem. Hamowanie NFκB podwzgórza przez
inaktywację kinazy IKK-β wydłuża życie myszy o 20%. NFκB na
starzenie wpływa przez GnRH (jego podanie spowalnia starzenie).

103
Progerie
• Wrodzone choroby ujawniające się w dzieciństwie, do objawów należą:
skrócenie ciała, siwienie włosów, zmarszczki, zanik skóry, tkanki
podskórnej, mięśni (sarkopenia) i zmniejszenie masy kości (osteopenia),
odporność na insulinę, hiperlipidemia, nieprawidłowy kolagen
i zwiększony metabolizm. U chorych rozwija się miażdżyca,
osteoporoza, zaćma i nowotwory złośliwe.

Zespół Wernera
• Autosomalna recesywna anomalia występująca w Japonii i Sardynii
1:20-40 tys. urodzeń, a w reszcie świata 1:100 tys.
• Objawy: zahamowanie wzrostu, przedwczesne siwienie, łysienie,
zmarszczki, zanik skóry i tkanki tłuszczowej, zaćma, przedwczesna
miażdżyca, cukrzyca typu 2, osteoporoza, częściej występują oponiaki.
• Przyczyną jest mutacja genu WRN kodującego WRNp (helikaza,
naprawia podwójne uszkodzenia nici, przeciwdziała utracie nadmiernie
długich fragmentów telomerów, współdziała z p53 i białkiem
replikacyjnym A) i wtórne mutacje skutkujące zaburzeniem podwajania
genomu, skracaniem telomerów.
• Nieprawidłowe WRNp może doprowadzić do hamowania p53 i inhibicji
apoptozy.
• Śmierć przed 50 r.ż.

Zespół Cockayne'a
• Dziedziczony autosomalne recesywnie, jest skutkiem mutacji csB
kodującego rodzinę ATP-az – SW12 (kofaktor polimerazy II).
Występują także zaburzenia reparacji DNA.
• Prócz objawów przedwczesnego starzenia, charakterystyczna jest
nadwrażliwość na światło, degeneracja układu nerwowego i niedorozwój
gonad. Brak zwiększonej predyspozycji do nowotworów.
• Chorzy umierają przed 40 r.ż.

Laminopatia (zespół Hutchinsona-Gilforda)

• Niezwykle rzadka choroba genetyczna (1:8 mln urodzeń) spowodowana
mutacją punktową de novo, której objawy przypominają aspekty
starzenia, ujawnia się w bardzo młodym wieku.
• Chorzy żyją do 20 r.ż. U dzieci z progerią pierwsze objawy pojawiają się
zwykle w ciągu pierwszych kilku miesięcy. Ścieńczenie skóry, łysienie,
ograniczony wzrost, następnie pomarszczona skóra, miażdżyca tętnic,
uszkodzenie nerek, utrata wzroku i choroby sercowo-naczyniowe.
• Pacjenci z tym zespołem zwykle mają małe, delikatne ciała, jak u osób
w podeszłym wieku.

104
 • Spowodowany mutacją genu LMNA, którego cytozyna w pozycji 1824
jest zamieniona na tyminę. LMNA koduje prelaminę A z dołączoną
grupą farnezylową – składnikiem blaszki jądrowej. Normalnie grupa jest
usuwana, ale w tym zespole pozostaje związana z laminą tworząc
progerynę łączącą się z blaszką jądrową.
• Inne mutacje LMNA prowadzą do miopatii, choroby Charcota-Marie'a-
Tootha typu 2 i lipodystrofii rodzinnej.
W prawidłowej komórce W komórce z progerią
• LMNA koduje prelaminę A • LMNA koduje prelaminę A.
• Prelamina A posiada grupę • Prelamina A (50
farenzylową, jest ona usuwana aminokwasów krótsza)
i powstaje lamina A. posiada grupę farenzylową.
• Prelamina A nie jest • Powstaje nieprawidłowa forma
inkorporowana w blaszkę laminy A, progeryna, jest ona
jądrową, jądro komórkowe jest inkorporowana w blaszkę
prawidłowe. jądrową i jądro jest
nieprawidłowe.

Ogniska heterochromatyny związane ze starzeniem (SAHF)

• SAHF wiążą loci genów kodujących propodziałowe białka w struktury
heterochromatynowe, co zapobiega ich transkrypcji. Nie jest jasne w jaki
sposób dochodzi do powstawania SAHF, wiadomo tylko, że uczestniczą
w nim białka chaperonowe histonów i metylotransferazy.

Profil wydzielniczy komórek związany ze starzeniem (SASP)

• Obejmuje kilka grup rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych czynników,
które mogą oddziaływać na otaczające komórki poprzez aktywację
receptorów powierzchniowych i szlaki sygnałowe prowadząc do wielu
stanów patologicznych (w tym nowotworzenie). Czynniki SASP można
podzielić na rozpuszczalne cząsteczki sygnałowe (interleukiny,
chemokiny, czynniki wzrostu), wydzielnicze proteazy i składniki ECM.
• Proteazy mogą wywierać 3 główne efekty:
◦ Złuszczanie białek związanych z błoną – rozpuszczalna wersja
receptorów
◦ Degradację cząsteczek sygnałowych
◦ Degradację ECM.
• W ten sposób komórki ulęgające procesowi starzenia mogą modyfikować
otaczające tkanki.

105
• Komórki ulegające procesowi starzenia np. fibroblasty skóry – gromadzą
się wraz z wiekiem. Starzejące się fibroblasty stymulują wzrost
przedrakowych i rakowych komórek nabłonka. Jest to spowodowane,
przynajmniej częściowo, przez czynniki produkowane przez starzejące
się komórki. Ta stymulacja jest widoczna, gdy starzejące się komórki
stanowią 10% populacji fibroblastów.

106
 APOPTOZA

Apoptoza a martwica
• Komórki mogą zginąć przez apoptozę lub przez martwicę (nekrozę).
• Programowana śmierć jest niezbędna do rozwoju i funkcjonowania
organizmów wielokomórkowych, jej najczęstszą formą jest apoptoza.
Apoptoza Aktywny proces wymagający uruchomienia wielu uśpionych
szlaków biochemicznych i syntezy nowych białek. Dotyczy
pojedynczych komórek rozsianych w narządzie. Pojawienie się
komórek apoptotycznych nie wywołuje zauważalnej reakcji.
Komórki apoptotyczne kurczą się, a błona uwypukla się co prowadzi
do podziału komórki na wiele obłonionych ciałek apoptotycznych
(zawierają cytoplazmę i funkcjonalne organelle). Chromatyna ulega
kondensacji obwodowej, a kształt jądra pozostaje niezmieniony.
W końcowych stadiach jądro z resztkami chromatyny rozpada się,
a fragmenty trafiają do ciałek apoptotycznych, a te są fagocytowane
przez sąsiednie komórki lub makrofagi. Odbywa się dzięki
wybiórczej proteolizie. DNA jest cięte na fragmenty 180-200 pz.
Występuje w organizmach ulegających rozwojowi zarodkowemu,
płodowemu, pozapłodowemu jak i w dojrzałym organizmie.
Martwica Proces pasywny, spowodowany czynnikami zewnątrzpochodnymi
powodującymi rozległe uszkodzenia komórek. Ulegają jej komórki
znajdujące się w skupiskach. Pojawieniu się martwicy towarzyszy
proces zapalny (naciek granulocytów obojętnochłonnych i
makrofagów). Komórki ulegają obrzękowi co prowadzi do
rozerwania błony komórkowej i wylania cytoplazmy. W komórkach
następuje trawienie składników przez uwolnione hydrolazy
lizosomalne, denaturacja prowadzi do zaprzestania aktywności
większości enzymów cytoplazmatycznych, a DNA rozpada się na
fragmenty różnorodnej wielkości. Zazwyczaj proces patologiczny,
z pewnymi wyjątkami – menstruacja.
• Apoptozę dzieli się na dwa etapy:
◦ Inicjacji – może przebiegać na kilka sposobów: szlak
wewnątrzpochodny i zewnątrzpochodny. Istnieją też alternatywne
metody aktywacji kaspaz np.: stres ER może doprowadzić do
aktywacji związanej z nią prokaspazy 12. Mogą być one także
aktywowane przez granzym B (enzym proteolityczny wprowadzany
do cytoplazmy przez limfocyty T cytotoksyczne).

107
 ◦ Egzekucji – zależy od aktywności proteaz – kaspaz, degradujących
kluczowe białka komórki. Zawsze przebiega w ten sam sposób.

Kaspazy
• Proteazy cysteinowe, hydrolizujące wiązania C-końcowe od reszt kwasu
asparaginowego. Dzieli się je na:
Inicjatorowe 2, 8, 9, 10 (8 i 10 posiadają DED)
Egzekutorowe 3, 6, 7
Nieapoptotyczne 1, 4, 5 (związane z procesami zapalnymi)
• Występują w cytoplazmie jako nieaktywne prokaspazy, aktywowane są
proteolizą na łańcuch długi i krótki, dwa krótkie i dwa długie agregują
tworząc aktywny tetramer z dwoma miejscami aktywnymi.
• Ich aktywacja zachodzi przez proteolizę zależną od innych kaspaz –
sprzężenie zwrotne dodatnie.
• Prodomeny kaspaz inicjatorowych 2, 9 zawierają domenę rekrutacji
kaspaz (CARD – caspase recruitment domains, składa się z 6 helis alfa).
• CARD uczestniczy w oddziaływaniu z białkami aktywatorowymi
prowadząc do powstania pod wpływem bodźców inicjujących apoptozę
kompleksów aktywacyjnych – apoptosom (szlak wewnątrzpochodny)
lub kompleks sygnalizacyjny śmierci (DISC – death-inducing signaling
complex, szlak zewnątrzpochodny). W obrębie tych kompleksów
prokaspazy ulegają autokatalitycznej aktywacji.
• Pozbawione CARD prokaspazy egzekutorowe są aktywowane przez
inicjatorowe.
• Inaktywują białka komórkowe prowadząc do charakterystycznych zmian
biochemicznych i morfologicznych np.: laminy jądrowe, białko
inhibitorowe DNA-zy zależnej od kaspaz (ICAD – inhibitor of caspase
activated DNAse).
• Inaktywacja ICAD prowadzi do uwolnienia CAD (DNA-za zależna od
kaspaz), jest ona translokowana do jądra i prowadzi do fragmentacji
DNA. Przecina DNA w odcinkach usytuowanych pomiędzy
nukleosomami (co ~180 p.z.), dlatego że DNA jest zwykle ciasno
owinięte wokół histonów. DNA łączące to fragmenty łatwo dostępne dla
CAD. Fragmenty DNA mogą obejmować odcinki liczące 180 lub
wielokrotność (360, 540, 720 itd.) – drabinka apoptotyczna.
• Ich spontanicznej aktywacji zapobiegają IAP (inhibitors of apoptosis),
drobnocząsteczkowe białka wiążące prokaspazy i blokujące ich
aktywność enzymatyczną.

108
 • Niektóre IAP mają właściwość ligazy ubikwityny prokaspaz. Mogą one
ulec inaktywacji przez oddziaływanie z czynnikami uwalnianymi
z mitochondriów wskutek sygnałów proapoptycznych. Aktywny IAP jest
blokowany przez DIABLO (SMAC), jest uwalniany z mitochondriów
po zadziałaniu bodźców proapoptotycznych
• cIAP1,2 także wiążą kaspazy.
• Surwiwina ulega ekspresji w wielu nowotworach, ale nie w terminalnie
zróżnicowanych komórkach (może być celem terapi). Uczestniczy także
w regulacji cyklu komórkowego, jest obecna w fazie G2-M, współdziała
z tubuliną wrzeciona mitotycznego. Działa prawdopodobnie na p53.

Szlak wewnątrzpochodny
• Ulega aktywacji pod wpływem czynników uszkadzających DNA, braku
czynników troficznych lub zaburzonych oddziaływań komórki z innymi
komórkami i macierzą zewnątrzkomórkową (anoikis).
• Jego inicjacja zależy od uwolnienia cytochromu c, który po dostaniu się
do cytoplazmy łączy się z APAF1 (apoptosis protease activating factor),
prowadząc do powstania kolistego heptameru APAF1 (~1,4 Mda) –
aptosomu. Posiada CARD i rekrutuje cząsteczki prokaspazy 9,
następuje ich autokatalityczna aktywacja.
• Innym czynnikiem uwalnianym z mitochondrium jest czynnik
aktywujący apoptozę AIF (apoptosis inducing factor), aktywuje on
floppazy, endonukleazy CAD i pośrednio prowadzi do aktywacji
kaspazy.
• Uwolnienie cytochromu c odbywa się pod kontrolą rodziny białek Bcl-2.
Białka Bcl-2, Bcl-XL – charakteryzują się czterema domenami
antyapoptotyczne homologii Bcl2 (BH1234).
Proapoptotyczne Białka BH123 – posiadają trzy domeny BH. Głównymi
białkami tego typu są Bax i Bak.
Białka BH3 – posiadają jedną domenę BH. Obejmują takie
białka jak Bid, Bim, Bad i Puma.
• Białka rodziny Bcl-2 tworzą homo-, heterodimery utrzymujące się
w stanie wzajemnej równowagi. Tworzą one kanały jonowe
w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, ich aktywacja prowadzi do
uwolnienia białek z przestrzeni międzybłonowej do cytosolu.
• Aktywacja wewnątrzpochodnego szlaku może się odbyć przez
przesunięcie równowagi w stronę białek proapoptycznych przez:

109
 ◦ Zaburzenia oddziaływania komórki z macierzą zewnątrzkomórkową
i innymi komórkami (anoikis) – uwolnienie Bim (związanego
z cytoszkieletem). Wiąże się on z Bak i Bax uwalniając je od Bcl-2,
Bcl-XL. Następuje uwolnienie cytochromu c i DIABLO.
◦ Uszkodzenia DNA prowadzą do aktywacji p53, gdy są one
nieodwracalne następuje indukcja Puma i (lub) Noxa, ta wiąże się
z Bak i Bax co prowadzi do uwolnienia cytochromu c i DIABLO.
◦ Oddziaływanie przez brak odpowiednich czynników wzrostu na
komórkę powoduje aktywację Bad, te wiąże się z Bak i Bax.
Obecność czynników wzrostu powoduje jego fosforylację przez
kinazę białkową B (Akt/białko B, aktywowana PIP3),
ufosforylowany Bad tworzy w cytosolu nieaktywny kompleks
z białkiem 14-3-3. Może być defosforylowane przez kalcyneurynę.
Inne czynniki zapobiegają apoptozie przez indukcję ekspresji białek
antyapoptotycznych Bcl-2, Bcl-XL.
◦ W alternatywnym szlaku p53 aktywuje śmierć komórkową przez
PIDD – składnik PIDDosomu uaktywniający kaspazę 2 (może być
również aktywowana przez DISC i kaspazę 8), która aktywuje
białko BID, a to powoduje, uwolnienie cytochochromu c. Kaspaza 2
indukuje również apoptozę wywołaną przez RFT i stres ER. Droga
kaspazy 2 może zatem być zapasowym mechanizmem apoptozy
zależnym od p53. PIDDosom jest zbudowany z:
▪ PIDD (p53-induced protein with a death domain)
▪ RAIDD (RIP-associated Ich-1/Ced-3 homologous protein with
a death domain)
▪ kaspazy 2
• We wczesnej fazie apoptozy zwiększa się produkcja RFT
w mitochondriach i kardiolipina ulega oksydacji. Cytochrom c jest
wówczas odłączany i może być uwalniany do cytoplazmy przez pory
w zewnętrznej błonie.
• DIABLO jest białkiem mitochondrialnym nazywanym SMAC (second
mitochondria-derived activator of caspases). Wiąże IAP, tym samym
uwalniając kaspazy i przyczyniając się do aktywacji apoptozy.

110
Szlak zewnątrzpochodny
• Komórki są zmuszane do apoptozy przez aktywację receptorów śmierci
(DR, rodzina receptorów TNFR), należą do nich przede wszystkim
receptor dla TNF typu I i receptor FAS (apoptosis stimulating
fragment). Posiadają one część zewnątrzkomórkową (wiąże ligand),
transbłonową i cytoplazmatyczną (zawiera domenę śmierci – DD).
• Związanie ligandu powoduje trimeryzację receptora, co umożliwia
wiązanie do białek adaptorowych zawierających domenę śmierci
umożliwiającą wiązanie się z domeną śmierci receptora i domenę
efektorową śmierci (DED) zdolną do przyłączanie prokaspazy 8 i/lub
10. Taki megakompleks aktywowanych ligandami receptorów śmierci,
cytoplazmatycznych białek adaptorowych i prokaspaz inicjatorowych
nazywa się kompleksem sygnalizującym śmierci – DISC (deadth-
inducing signaling complex).
• Białka adaptorowe z domenami DD i DED:
◦ TRADD (tumor necrosis factor receptor type 1-associated death
domain protein)
◦ FADD (fas-associated protein with death domain)
• Receptory wabikowe konkurują z receptorami śmierci. Wiążą ligandy,
lecz nie przekazują proapoptotycznego sygnału (nie mają odpowiednich
domen).
• Niekiedy aktywacja receptorów TNF typu I może prowadzić do
aktywacji NFκB (zapobiega apoptozie).
• W niektórych komórkach są obecne receptory wabikowe (decoy
receptors), wiążące ligand, ale nie przekazujące sygnału
proapoptycznego ze względu na brak domen cytoplazmatycznych.
Zapobiegają one apoptozie przez rekrutację proapoptotycznych ligandów.
• Ligandy przekazujące sygnał śmierci mogą występować w wolnej
postaci lub związanej z powierzchnią komórek efektorowych (limfocyty
T cytotoksyczne – FAS i NK).
• Uwalnianie TNF przez makrofagi prowadzi do masowej apoptozy
w przebiegu przewlekłych chorób zapalnych.
• FAS prowadzi do apoptozy komórek zainfekowanych wirusami,
komórek przeszczepów niezgodnych tkankowo i niektórych komórek
nowotworowych.
• Aktywacja szlaku zewnątrzpochodnego zazwyczaj prowadzi do wtórnej
aktywacji wewnątrzpochodnego. Jednym z substratów kaspazy 8 jest
Bid, wskutek ograniczonej proteolizy powstaje jego aktywna forma
zwana tBid, blokuje ono Bcl-2 i Bcl-XL indukując oligomeryzację
Bak i Bax.

111
 • Czynniki antyapoptotyczne:
◦ TRAF1,2 (TNF receptor associated factors) – działające z IAPs.
◦ Kinaza RIP1 (receptorinteracting serine/threonine-protein kinase)
z domeną DD współdziała z FADD, TRADD, TRAF2 i promuje
aktywację NFκB, który indukuje produkcję IAPs i hamuje apoptozę.
◦ FLIP (FADD-like IL-1β-converting enzyme) – białko inhibitorowe
zawierające domenę DED i hamujące apoptozę indukowaną przez
TNF, Fas-L i TRAIL, a także apoptozę indukowaną przez
chemioterapię w komórkach nowotworowych.
◦ XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein – XIAP lub IAP3).
Hamuje apoptozę indukowaną przez wirusy. Wiąże i hamuje
kaspazy 3, 7 i 9. Jest blokowany przez DIABLO.

Perforynowo-granzymowy szlak indukcji apoptozy

• Cytotoksyczne limfocyty T i komórki NK mają ziarnistości zawierające
perforyny i granzymy. Po degranulacji wbudowują się w błonę komórki
docelowej i oligomeryzują tworząc pory (zależne od Ca2+). Pozwalają
one na dyfuzję proapoptotycznnych proteaz serynowych zwanych
granzymami.
• Granzym B indukuje apoptozę poprzez aktywację kaspaz 8, 10, 3, 7,
białka BID oraz ICAD.

Sfingomielinowo-ceramidowy szlak indukcji

• Sfingomielina składa się z fosfocholiny i ceramidu.
• Po stymulacji bodźcem proapoptotycznym (FAS ligandem lub TNF) jest
rozkładana przez sfingomielinazę i ceramidazę do ceramidu i sfingozyny.
Ceramid jest również generowany de novo przez syntazę ceramidu.
Sfingozyna i ceramid indukują apoptozę przez szlak mitochondrialny
(aktywacja Bid i Bad).

Niezależny od kaspaz szlak indukcji apoptozy.

• AIF (Apoptosis-inducing factor) mitochondrialna flawoproteina o
aktywności oksydazy NADH. Przemieszcza się z mitochondriów do
cytozolu i do jądra w wyniku indukcji apoptozy, indukuje kondensację
chromatyny i fragmentację DNA. Może być uwalniany
z mitochondriów procesie zależnym i niezależnym od kaspaz.
• Enzymy efektorowe tego szlaku to:
◦ Katepsyny – uwalniane z lizosomów.
◦ Kalpainy – są aktywowane przez napływ jonów Ca2+ do komórki
pod wpływem stresu ER.
◦ Proteazy serynowe.

112
 • Katepsyny i kapaliny są zaangażowane w cięcie i translokację Bax i Bid
do mitochondriów i cięcie AIF. Bax i Bid powodują uwolnienie AIF
z mitochondriów, a ten fragmentacje DNA.

Paraptoza
• Pierwotny szlak śmierci komórkowej, indukowany przez IGF1R
charakteryzujący się powstawaniem w cytpolazmie licznych wakuol,
pęcznieniem mitochondriów, a także translokacją fosfatydyloseryny
z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony komórkowej.
• Wymaga syntezy nowego RNA i białek. Okrągłe komórki, reorganizacja
cytoplazmy, wakuolizacja są widoczne pod mikroskopem świetlnym.
Ten obraz może wynikać z zaburzenia wewnątrzkomórkowej równowagi
jonów i ciśnienia osmotycznego. Gdy komórka pęka jej zawartość
zostaje uwolniona, co prowadzi do procesów zapalnych.

Nekroptoza
• Programowana śmierć komórki w wyniku zapalenia.
• Część mechanizmu obronnego przed wirusami, pozwalająca na
samobójstwo w sposób niezależny od kaspaz w obecności wirusowych
inhibitorów kaspaz.
• Produkcja TNF podczas infekcji prowadzi do stymulacji TNFR1.
TRADD związany z TNFR pobudza RIPK1, który rekrutuje RIPK3
tworząc nekrosom (zawiera RIPK1, RIPK2, MLKL (mixed lineage
kinase domainlike) i kaspazę 8). Indukuje on produkcję RFT
w mitochondriach.
• Fosforylacja MLKL przez RIPK3 powoduje oligomerizację MLKL, co
prowadzi do inkorporacji MLKL do błony komórkowej i wzrostu jej
przepuszczalności. Integracja MLKL prowadzi do uwolnienia DAMPs,
które indukują odpowiedź immunologiczną.

Onkoza
• Pasywna, przypadkowa śmierć komórki. Zazwyczaj spowodowana
niedokrwieniem, towarzyszy jej proces zapalny.
• Charakteryzuje się pęcznieniem jądra, cytoplazmy i mitochondriów,
wakuolizacją cytoplazmy, tworzeniem pęcherzyków oraz wzrostem
przepuszczalności błon (uszkodzenie pomp jonowych).
• Zwykle zmianom tym towarzyszy karioliza. DNA jest cięte
w niespecyficzny sposób.

113
Egezekujca apoptozy
Stadium Porzucenie połączeń z macierzą zewnątrzkomórkową
uwolnienia i sąsiadującymi komórkami co prowadzi do przybrania przez
komórkę kształtu kulistego. Następuje reorganizacja połączeń
międzykomórkowych, utrata włókien naprężeniowych, rozpad
mikrotubul, przebudowa szkieletu aktynowego prowadząca do
ułożenia włókien tuż pod błoną. Aktywowanie kaspazy prowadzi
do proteolizy ICAD i aktywacji CAD. Degradacja lamin
jądrowych prowadzi do rozpadu jądra na mniejsze fragmenty.
Stadium Dochodzi do serii skurczów położonych obwodowo włókien
uwypuklania aktynowych przez oddziaływanie z miozyną II, jest to ułatwione
przez zależną od kaspaz degradację białek szkieletu błony
oddziałujących z aktyną.
Stadium Apoptotyczna komórka rozpada się na wiele ciałek
kondensacji apoptotycznych, towarzyszy temu depolimeryzacja aktyny.
Ciałka są usuwane przez makrofagi i sąsiednie komórki.
• Komórki ulegające apoptozie i ich fragmenty są rozpoznawane przez
obecność na powierzchni fosfatydyloseryny (w komórkach żywych
i martwiczych występuje po wewnętrznej stronie błony). Jest ona
przenoszona na zewnątrzkomórkową powierzchnię przez floppazę. Jej
związanie z receptorem makrofagów powoduje fagocytozę
(efferocytozę), oraz uwolnienie przez nie cytokin przeciwzapalnych
(TGF-β) i zahamowanie produkcji cytokin prozapalnych. Podczas
efferocytozy komórki żerne pochłaniają ciałka apoptotyczne, formując
duże pęcherzyki – efferosomy.
• Ciałka apoptotyczne – małe pęcherzyki otoczone błoną. Ich tworzenie
jest mechanizmem zabezpieczającym przed wydostaniem się
toksycznych lub immunogennych składników wnętrza umierającej
komórki.

Medyczne aspekty apoptozy

• Zaburzenia prawidłowej liczby komórek prowadzi do przerostu
(hiperlplazji) lub zaniku (atrofii).
• Odpowiada za zanik komórek tworzących błony między palcami, lub
nadmiaru neuronów w OUN. Zaburzenia apoptozy w czasie rozwoju
zarodkowego prowadzą do wad rozwojowych spowodowanych
nadmiarem komórek.
• Bez apoptozy byłaby niemożliwa negatywna selekcja komórek
immunologicznie kompetentnych w grasicy, lub eliminacja nadmiaru
granulocytów w szpiku.

114
 • Indukcja apoptozy przez brak czynników wzrostu pozwala uniknąć
pojawienia się komórek których proliferacja wymknęłaby się spod
kontroli. Powstanie komórek nowotworowych odbywa się przez
nadmierną ekspresję białka Bcl-2, zapobiega ona apoptozie
nieprawidłowych komórek.
• Utrata aktywności p53 zapobiega indukcji bloku cyklu komórkowego
i apoptozy wskutek uszkodzenia DNA.
• Wirusy np.: brodawczaka ludzkiego blokują apoptozę przez
ubikwitynację p53.
• Przedłużający się stres ER prowadzi do apoptozy komórek β wysp
Langerhansa w przebiegu cukrzycy.
• Apoptoza kardiomiocytów występuje przy niektórych kardiomiopatiach,
oraz w obszarze otaczającym martwicę wywołaną zawałem.
• Apoptoza neuronów występuje w chorobie Alzheimera, parkinsona,
niektórych formach zaćmy i głuchoty.
• U pacjentów z udarem apoptoza neuronów otaczających obszar prowadzi
do znacznego powiększenia uszkodzenia.

Wykrywanie apoptozy
• Użycie mikroskopu świetlnego pozwala oznaczyć komórki w późnych
stadiach apoptozy, lepsze efekty daje mikroskop fluroescencyjny.
• Do najpopularniejszych technik wykrywania apoptozy zalicza się metodę
TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dependent nick end
labeling). Wolne końce 3'-hydroksylowe powstają przez aktywność
nukleaz.
• Użycie przeciwciał monoklonalnych wykrywających epiptopy
aktywnych kaspaz (nieobecne w prokaspazach) pozwala na
wyznakowanie komórek w początkowych stadiach apoptozy. Możliwe
jest to także przez odnalezienie charakterystycznych produktów
degradacji substratów.
• Białko aneksyna V ma zdolność wiązania się z fosfatydyloseryną.
Wykorzystuje się aneksynę V wyznakowaną znacznikiem
fluorescencyjnym (fluorosceina).
• Żeby odróżnić komórki martwicze stosuje się dodatkowe barwienie
jodkiem propidium (wiąże się z DNA), nie przenika on przez błony
żywych komórek i apoptotycznych, ale bez trudu wnika do komórek
martwiczych.
• Komórki oznakowane aneksyną i jodkiem propidium ogląda się
w mikroskopie fluorescencyjnym lub analizuje za pomocą cytofotometrii
przepływowej.

115
• Powstała wskutek martwicy mieszanina cząstek DNA o różnej masie
daje w elektroforezie obraz smugi, natomiast apoptotyczne fragmenty
180-200 p.z. i ich wielokrotności dają drabinki DNA. Modyfikacją tej
metody jest próba kometowa – preparat pokrywa się agarozą
i przeprowadza elektroforezę in situ, a potem wybarwia bromkiem
etydium i obserwuje pod mikroskopem. Komórki apoptotyczne ukazują
wtedy charakterystyczną smugę DNA niczym warkocz komety.

116
 RÓŻNICOWANIE I KOMÓRKI MACIERZYSTE

• Rozwój osobniczy zaczyna się podczas zapłodnienia, podziały

blastomerów prowadzą to powstania wielokomórkowego zarodka.
Następująca po bruzdkowaniu gastrulacja jest czasem migracji
komórek, wtedy wyodrębniają się pierwsze tkanki.
• Dyferencjacja – różnicowanie, wieloetapowy proces, polega na
stopniowym ograniczaniu potencji rozwojowych kolejnych pokoleń
komórek i determinowaniu ich losów w organizmie.
• Komórki totipotencjalne – mają zdolność do wytworzenia wszelkich
typów komórek danego organizmu. Komórką 100% totipotencjalną jest
zygota, oraz wczesne komórki zarodka.
• U ssaków totipotencjalne są blastomery do stadium 8-komórkowego
co jest warunkiem poliembrionii – tworzenie bliźniąt jednojajowych
(występuje jako element biologii rozrodu u szczerbaków z rodziny
Dasypus i u np.: motylicy wątrobowej).
• Komórki pluripotencjalne – mają zdolność do tworzenia wielu, ale nie
wszystkich typów komórkowych. Następnie powstają komórki
ukierunkowane i komórki szlaku końcowego różnicowania (mają
ściśle określoną funkcję, strukturę i są niedzielące się lub o ograniczonej
proliferacji).

Stabilność genomu w czasie różnicowania

• W jądrach wszystkich komórek somatycznych znajduje się taki sam
zestaw 23 par chromosomów homologicznych.
• Jeśli genom nie zmienia się jakościowo to możliwa jest zmiana programu
rozwojowego komórek zróżnicowanych, czego przykładem podczas
wczesnej embriogenezy jest transdyferencjacja (przeróżnicowanie).
Można je zaobserwować u ssaków in vitro np.: gdy z hodowli komórek
chromochłonnych rdzenia nadnerczy usunie się glikokortykoidy,
a wprowadzi NGF zaczynają się one przekształcać w neurony i zamiast
adrenaliny wydzielać noradrenalinę. Występuje ona również podczas
regeneracji narządów (narządem o dużym potencjale regeneracyjnym
jest wątroba).
• U traszki amputacja kończyny powoduje, że komórki zróżnicowane
tworzą populację komórek odróżnicowanych (blastema), a z nich
utworzy się nowa kończyna
• Powstałe w wyniku klonowania organizmy zawierają identyczny genom
jak dawca jądra komórkowego.

117
 • Od reguły stabilności genomu istnieją wyjątki.
Poliploidyzacja Zwielokrotnienie podstawowego zestawu chromosomów.
genomu Komórki poliploidalne są z reguły większe, a transkrypcja
może zachodzić z większą intensywnością.
Amplifikacja Selektywna replikacja tylko wybranych genów.
W komórkach ssaków amplifikacja protoonkogenów jest
jedną z form ich aktywacji i może doprowadzić do
transformacji nowotworowej.
Dyminucja Występuje u pewnych obleńców (glisty świńskiej),
chromatyny w powstających komórkach somatycznych są degradowane
znaczne części genomu. W limfocytach może dochodzić do
delecji fragmentów genów immunoglobulinowych
i reorganizacji genetycznej związanej z wytwarzaniem
przeciwciał.

Zróżnicowana ekspresja genów

• Przyczyną specjalizacji strukturalno-funkcjonalnej jest modyfikacja
epigenetyczna.
• Komórki zróżnicowane różnią się wzorcem ekspresji genów. Analiza
procesów różnicowania pozwala to na wyróżnienie w każdej komórce
dwóch klas genów:
◦ I – niezbędne do przebiegu podstawowych czynności
metabolicznych (bez nich procesy życiowe ulegają zahamowaniu),
ulegają one ekspresji we wszystkich komórkach organizmu (np. gen
dehydrogenazy bursztynianowej) – „housekeeping genes”.
◦ II – ich ekspresja powoduje powstawanie białek (cech)
charakterystycznych jedynie dla danego typu komórki.
• Każda klasa zróżnicowanych komórek korzysta z innego zestawu genów
wytwarzając swoiste białka enzymatyczne i strukturalne.
• W czasie rozwoju i różnicowania wzór ekspresji może się zmieniać.
• Do regulacji funkcji genu może dochodzić na każdym poziomie jego
ekspresji, ale najczęściej występuje na poziomie transkrypcji, a za
regulację odpowiadają czynniki transkrypcyjne.
• Podczas bruzdkowania podziały prowadzą do powstania licznych
blastomerów, a całkowita masa zarodka nie ulega zmianie – materiał
ooplazmy zostaje rozdzielony. U wielu gatunków rozmieszczenie
struktur w ooplazmie jest nierównomierne, a podziały prowadzą do
rozdysponowania różnych blastomerów do różnych obszarów jaja. Ze
względu na skład ooplazmy mimo identycznych genów podziały mogą
być asymetryczne.

118
 • Determinanty ooplazmatyczne – substancje obecne w różnych
obszarach ooplazmy wpływające na losy tworzących się blastomerów.
• Swoistej lokalizacji w komórce podlegają mRNA kodujące czynniki
transkrypcyjne. Stosując metody genetyki molekularnej określono że
zdeponowany w cytoplazmie przedniego bieguna komórki jajowej
Drosphila mRNA jest produktem transkrypcji homeotycznego genu
bicoid. Ulega on translacji w pierwszych etapach rozwoju, a powstałe
białko jest TF zawierającym domenę homeotyczną. Białko bicoid
wchodzi do jąder blastomerów powstających z przedniego bieguna
i aktywuje transkrypcję genu hunchback – będą one tworzyć przednie
segmenty ciała owada, a pozostałe odwłok.
• Oocyty różnych grup zwierząt mogą w bardzo istotny sposób różnić się
heterogennością rozmieszczenia determinantów w cytoplazmie.
• Rozmieszczeniem typu mozaikowego określa się rozmieszczenie
determinantów niczym mapy, a już pierwsze podziały bruzdkowania
przyczyniają się do zdeterminowania losów komórek. Przeciwieństwem
tego schematu są jaja cytoplazmatycznie homogenne np.: ssaków, ich
bruzdkowanie jest symetryczne, blastomery do stadium
8-komórkowego pozostają niezróżnicowane.
• Do asymetrii podziałowej dochodzi także również w późniejszych
fazach embriogenezy i u form dorosłych.

Połączenia międzykomórkowe a różnicowanie

• W kolejnych etapach embriogenezy i różnicowaniu komórek dorosłych
biorą udział oddziaływania międzykomórkowe – oddziaływania
indukcyjne (indukcja). Mają one bardzo niewielki zasięg.
• Stężenie induktorów (ligandów) jest niskie. Potencje indukcyjne
(zdolność do wytwarzania ligandów) i kompetencja (zdolność do
odpowiedzi) są krótkotrwałe.
• Przebieg:
1. Wysłanie sygnału w postaci ligandu.
2. Pobudzenie receptora komórki kompetentnej.
3. Kaskada reakcji cytoplazmatycznych prowadząca do uaktywnienia
TF.
4. Zmiana wzoru ekspresji genów.
• Te same induktory mogą być zaangażowane w bardzo różnych
oddziaływaniach na wielu etapach rozwoju. Wiele z nich ma charakter
peptydowy: peptydowe czynniki wzrostu (FGF, TGF-β), hedgehog
i glikoproteidy Wnt.

119
 • Duże znaczenie dla procesów różnicowania ma sposób przekazywania
sygnału indukcyjnego. Ligand może pozostawać związany z jej błoną
komórkową – wymagany jest bezpośredni kontakt. Może on też być
zakotwiczony w macierzy zewnątrzkomórkowej lub może też być
wydzielany do środowiska zewnątrzkomórkowego (sekrecja
parakarynna).
• Dyfundujący ligand może podlegać powolnej degradacji co prowadzi do
utworzenia gradientu stężeń. Substancje które działają przez gradient
stężeń są nazywane morfogenami. Odgrywają one kluczową rolę
w różnicowaniu układów wielokomórkowych. Zdolność do różnego
reagowania na ich stężenia powoduje że w populacji identycznych
komórek może się pojawić równocześnie wiele typów komórek.
• Na zespół tkankowy może działać jednocześnie wiele morfogenów
o różnym gradiencie i mechanizmu działania. Komórki w tkance mogą
być predeterminowane na odbiór bodźców indukcyjnych.
• Utrudnieniem jest to że przekazywanie przez indukcje ma charakter
kaskadowy – komórki indukowane mogą ulec przekształceniu
w centrum sygnalizacji i vice versa.

Informacja pozycyjna
• Przekazywanie sygnału prowadzi do utworzenia się w zespole
komórkowym przestrzennego „wzoru” (pattern) rozmieszczenia
wyspecjalizowanych komórek.
• Powstające podczas organogenezy narządy mogą być zbudowane z tych
samych tkanek, ale różnić się wzorem przestrzennej organizacji.
• Teorie opisujące powstawanie wzorów zakładają, że komórki tworzące
niezróżnicowane zawiązki organów znają swoje położenie w tkance
i potrafią się zróżnicować w tym lub innym kierunku.
• Koncepcja informacji pozycyjnej została wprowadzone przez Lewisa
Wolperta. Badania przeprowadza się na kończynach ptaków. Są one
wzgórkami mezenchymy pokrytej ektodermą. W obrębie zawiązka
kończyny są wyznaczone osie i płaszczyzny symetrii powstającego
narządu. Właściwa interpretacja informacji pozycyjnej przez komórki
w osi przód-tył powoduje że z komórek położonych w przedniej części
zarodka kończyny będzie się rozwijać palec 2, a z komórek w strefie
tylnej 4. Tworzenie informacji pozycyjnej zależy od sygnalizacji
międzykomórkowej (oddziaływań indukcyjnych). W tylnej strefie
zawiązka kończyny znajduje się grupa komórek mezenchymatycznych
pełniąca funkcję sygnalizacji przednio-tylnej (strefa aktywności
polaryzacyjnej), wydzielają one morfogen, komórki które będą się
znajdować w niskim stężeniu będą tworzyć palec 2, a w wysokim 4.

120
 • W komórkach tworzących strefy aktywności polaryzacyjnej dochodzi do
ekspresji genu sonic hedgehog (shh).
• Shh należy do peptydów sygnałowych hedgehog (u kręgowców
występują: desert hedgehog, indian hedgehog i sonic hedgehog).
• Shh mają zdolność do polaryzowania zawiązka powstającej kończyny
w osi przednio-tylnej.
• Hodowane in vitro fibroblasty u których wymuszono ekspresję shh
wszczepiono do przedniego regionu zawiązka kończyny, spowodowało
to powstanie zdeformowanych kończyn (odwrócona polaryzacja-
przednio-tylna), oraz zduplikowania palców o symetrycznym wzorze
ułożenia.
• Przypuszcza się że utworzony gradient stężenia Shh (z innymi
czynnikami) aktywuje transkrypcję genów homeotycznych
Hox a i Hox d (na matrycach genów homeotyczych powstają białkowe
TF zawierające homeodomeny). W zależności od stężenia Shh
dochodzi do ekspresji różnych genów Hox, nakładające się domeny
ekspresji wyznaczają wzór przestrzenny. Zróżnicowanie ekspresji genów
tworzy podłoże informacyjne na którym zostają wytworzone struktury
morfologiczne o zdeterminowanej organizacji przestrzenny.
• Białko Shh może prócz polaryzacji morfogenetycznej kończyn brać
udział w determinowaniu struktur OUN, lub regulowaniu
funkcjonowania komórek tworzących mieszki włosowe.
• Zaburzenia sygnalizacji zależnej od Shh prowadzi do powstania np.
cyklopii, zespołu Pallistera-Halla i do rozwoju nowotworów.

Pamięć komórkowa
• Proces różnicowania polega na stopniowym ograniczaniu potencji
rozwojowych komórek, powstały w wyniku różnicowania wzór ekspresji
genów charakterystyczny dla danej linii komórkowej zostaje zapisany
w pamięci komórkowej i jest dziedziczony.
• Mechanizmy zachowywania wzoru ekspresji genów:
◦ Pozytywne sprzężenie zwrotne – produkt genu jest TF aktywującym
ten gen, aktywacja genu zachodzi w wyniku oddziaływań
indukcyjnych, a potem podlega on samokontroli np. białkowy
produkt myoD jest aktywatorem ekspresji myoD. Obecność MyoD
jest niezbędne do prawidłowego tworzenia włókien mięśniowych.
◦ Chemiczne modyfikacje w obrębie chromosomów i DNA –
selektywna kondensacja chromatyny. Wzory rozmieszczenia
heterochromatyny są charakterystyczne dla danych linii
komórkowych. Metylacja cytozyny w miejscach CG (metylaza
DNA rozpoznaje obecność metylowanej cytozyny i powoduje
przyłączanie grup metylowych w nowo syntezowanym DNA).

121
Odnowa i przebudowa tkanek
• Zmiany orientacji programu rozwojowego (transdyferenjacje)
występują jedynie w sytuacjach wyjątkowych, ale możliwe jest
niewielkie odwracalne przekształcenia zachodzące w obrębie tego
samego typu tkankowego – metaplazja.
• Metaplazja w obrębie tkanki nabłonkowej jest uważane za stan
przedrakowy.
• Największy zakres zmian kierunków różnicowania dotyczy tkanki
łącznej (w zależności od warunków pluripotencjalne komórki osteogenne
mogą się różnicować w osteoblasty lub chondroblasty). Jednym z tych
czynników jest jest ciśnienie parcjalne tlenu w tkankach (przy wysokim
przekształcają się w osteoblasty, a przy niskim w chondroblasty).
• Przy odpowiedniej zmianie warunków środowiskowych osteoblasty
mogą zamieniać się w chondroblasty.
• Największe potencje do zmiany orientacji różnicowania mają
fibroblasty, które mogą różnicować się w kilka typów komórek tkanki
łącznej.
• W organizmie istnieją komórki osiągające stan ostatecznej specjalizacji
jeszcze w czasie embriogenezy lub w okresie postembrionalnym i nie
zmieniają się przez całe życie: tkanka nerwowa, mięśnia sercowego,
komórki soczewki oka, ale mimo determinacji procesy różnicowania nie
zostały zakończone. Tkanki podlegają ciągłej przebudowie i odnowie.
• Odnowa tkankowa odbywa się w różnym czasie w zależności od tkanki
– śluzówka jelita cienkiego tydzień, komórki trzustki ponad rok.
• Odnowa może następować w wyniku proliferacji komórek
zróżnicowanych, lub niezróżnicowanych komórek macierzystych.
• Dzięki proliferacji hepatocytów jest możliwa regeneracja wątroby.
Liczba hepatocytów jest zdeterminowana. Ich podziały są stymulowane
drastycznymi bodźcami (zabieg chirurgiczny, intoksykacja tanki).
• Zaburzenia w procesach regeneracyjnych prowadzą do zmniejszenia
proliferacji hepatocytów i zastąpienie ich fibroblastami.
• Komórki macierzyste występują u ssaków w nabłonkach, wątrobie,
szpiku kostnym i OUN.
• By sklasyfikować komórkę jako macierzystą musi ona być zdolna do
odnowy i dawania zróżnicowanego potomstwa. Dodatkowo mają
bardzo aktywną telomerazę, zachodzi w nich ekspresja markerów
komórek embrionalnych (oct3/4, nanog) i dobrze funkcjonujący
mechanizm usuwania toksyn.
• Komórki macierzyste hematopoetyczne charakteryzują się ekspresją
antygenów CD34, CD133, SSEA-4, c-kit i brakiem antygenów
liniowych CD38, CD33, CD71, CD3.

122
• W krwi krążą komórki progenitorowe śródbłonka (<0,01 %),
charakteryzują się markerami CD34 i CD309, są one zdolne do
tworzenia kolonii i połączeń z naczyniami krwionośnymi in vitro.
Charakteryzuje je też ekspresja markerów charakterystycznych dla
śródbłonka – CD31.
• Uszkodzenie tunica intima prowadzi do powstania skupisk komórek
śródbłonka intensywnie proliferujących – sugeruje to obecność komórek
macierzystych. Komórki macierzyste są też obecne w tunica media
i adventita. W tunica adventita znajdują się nisze tkankowe z komórkami
macierzystymi/progeniterowymi o wysokim potencjale angiogennym,
mogą one uczestniczyć w procesach chorobowych.
• Naskórek jest budowany z keratynocytów, komórki macierzyste znajdują
się w warstwie bazalnej nabłonka. W miąższu naskórka można
zaobserwować strefowy układ komórek o odmiennym stopniu
zróżnicowania i dojrzałości.
• Komórki macierzyste odpowiedzialne za budowę włosa, regenerację
gruczołów łojowych i regenerację naskórka znajdują się w mieszkach
włosowych.
• Powstanie mieszków włosowych w 1 trymestrze kontrolowane jest
przez białka szlaku Wnt/β-katenina, a następnie Shh. U podstawy
mieszka włosa znajduje się brodawka zasiedlana przez fibroblasty
i mezenchymalne komórki macierzyste, te drugie mogą różnicować się
w komórki tłuszczowe, mięśniowe, kostne i hematopoetyczne.
• Pomiędzy brodawką, a gruczołem łojowym znajduje się region
przyczepu mięśnia przywłosowego i nisza z epitelialnymi komórkami
macierzystymi w stanie uśpienia, wyjście komórek z niszy w kierunku
naskórka powoduje ich przekształcenie w progenitorowe.
W fizjologicznych warunkach w regeneracji biorą też udział komórki
warstwy bazalnej.
• W jelitach komórki macierzyste znajdują się w niewielkiej odległości od
dna krypty, podobnie jak w naskórku widoczny jest wektor
różnicowania skierowany od głębokich stref krypty jelitowej do szczytu
kosmka.
• W układzie krwionośnym różnicowanie komórek odbywa się
w nieuporządkowanej tkance szpiku kostnego. Z komórek macierzystych
po przeszczepie można odtworzyć wszystkie komórki krwi. W kolejnych
stadiach różnicowania można wyróżnić populację komórek
przejściowych (komórki ukierunkowane), nie mają one zdolności do
samoodnawiania się, ale intensywnie proliferują, a ich losy są
ograniczone jedynie do jednego kierunku różnicowania. Zdarzenia
związane z różnicowaniem prowadzą od komórek ukierunkowanych do
prekursorowych.

123
Komórki macierzyste
• W tkankach funkcjonować musi bardzo dokładny mechanizm kontroli
proliferacji i samoodnawiania komórek macierzystych. Jego zaburzenia
mogą prowadzić do stanów patologicznych.
• Niewłaściwa proliferacja komórek macierzystych naskórka może
doprowadzić do nadprodukcji kertynocytów i ich niekontrolowanego
rogowacenia i złuszczania – np. w łuszczycy (psoriasis).
• Mogą rozwijać się w nowotwory.

Epigenetyczna regulacja ekspresji

Metylacja DNA
• Poreplikacyjna modyfikacja (kowalencyjne wprowadzaniu grupy
metylowej w pozycję 5 cytozyny sekwencji CpG, w nowo
syntetyzowanej nici DNA.
• Katalizowana przez metylotransferazę DNA1 (DNMT1). Wzór
metylacji DNA zmienia się w trakcie rozwoju zarodkowego.
• Podczas wczesnego rozwoju zarodka dochodzi do demetylacji genomu,
ponowna metylacja, de novo, ma miejsce po implantacji –
odpowiedzialnymi za to są metylotransferazy DNA DNMT3a
i DNMT3b. Podczas rozwoju organizmu ustala się wzór metylacji
charakterystyczny dla określonych tkanek.
• Około 80% wszystkich dwunukleotydów CpG genomu podlega
procesowi metylacji. Wyjątek stanowią te nukleotydy, które znajdują się
CpG, występujących w sekwencjach regulatorowych ważnych genów.
Nie podlegają one metylacji podczas wczesnego rozwoju organizmu
i ustanawiania ekspresji tkankowo specyficznej (z wyjątkiem wysp
połączonych z genami podlegającymi imprintingowi oraz
zlokalizowanymi na inaktywowanym X).
• Geny housekeeping są aktywne we wszystkich komórkach bez względu
na proces różnicowania ich wyspy pozostają w postaci niezmetylowanej.
• Najlepiej scharakteryzowanymi modyfikacjami histonów są metylacja
i acetylacja reszt lizynowych.
◦ Metylacja K9 i K27 połączona jest z represją transkrypcji
(heterochromatynowe rejony centromerów i telomerów, nieaktywny
chromosom X, promotory wyciszonych genów), podczas gdy
metylacja K4 i K36 z jej aktywacją (promotory aktualnie
transkrybowanych genów).
◦ Metylacja K9H3 przez metylotransferazy histonowe grupy
SU(VAR)3-9, umożliwia przyłączanie białek z chromodomeną
(np. HP1), co prowadzi do formowania stabilnej heterochromatyny.

124
 ◦ Acetylacja histonu H3 występuje w pozycjach K9, K14, K18 i K27.
Acetylacja H3 i H4 jest połączona z aktywacją transkrypcji.
◦ Acetylacja H2A i H2B w rejonach regulatorowych pewnych genów
koreluje z ich represją.
• Hipoacetylowane histony są zlokalizowane w transkrypcyjnie
nieaktywnych rejonach chromatyny. Acetylowane ogony histonów
rozpoznawane są przez białka z bromodomeną. Należą do nich białka
kompleksu SWI/SNF (ATP-aza zależna od DNA) rozluźniające
strukturę chromatyny.
• Modyfikacja histonów może również polegać na fosforylacji bocznych
łańcuchów seryny lub treoniny i ubikwitynacji lizyny. Prowadzi to do
zmian struktury chromatyny poprzez zmianę oddziaływań DNA-histony.
• W procesie dziedziczenia, fosforylacja i acetylacja (mało stabilne),
pełnią funkcję pomocniczą, główną rolę odgrywa stabilna metylacja.
Wszystkie potranslacyjne modyfikacje histonów tworzą kod
epigenetyczny (histonowy), który odczytywany przez białka jądrowe
może doprowadzać do zróżnicowanej ekspresji danego genu.
• Do czynników modyfikujących histony oraz DNA zalicza się też siRNA,
które zmniejsza ekspresję białka poprzez wyciszenie promotorów
odpowiednich genów na drodze metylacji de novo.
• Mechanizm epigenetyczny odpowiedzialny jest za inaktywację
chromosomu X, ustanowienie lokalizacji centromeru, piętnowanie
rodzicielskie oraz kontrolę nad transpozonami i sekwencjami
repetytywnymi.
• Metylowany DNA jest łatwo wykrywalny w osoczu, moczu i plwocinie.

Niehistonowe białko heterochromatynowe H1

• Białko jądrowe uczestniczące w tworzeniu wyższego rzędu
heterochromatyny, prowadzącej do wyciszania genów.
• Występują w nim dwie konserwatywne domeny.
◦ W rejonie N – końcowym znajduje się chromodomena (CHD)
rozpoznająca i łącząca się ze zmetylowaną lizyną 9 histonu H3.
◦ W odcinku C – końcowym występuje domena chromoshadow
(CSD), która posiada zdolność dimeryzacji i oddziaływania
z wieloma białkami jądrowymi.
• Pełni rolę łącznika pomiędzy białkami a histonami. Mechanizm
tworzenia się i rozprzestrzeniania heterochromatyny wyższego rzędu
opiera się na sprzężeniu zwrotnym.
• Jednym z białek łączących się z domeną CSD jest metylotransferaza
histonów (SU(VAR)3-9), jej aktywność doprowadza do metylacji K9H3,
rozpoznawanej przez CHD HP1.

125
 • Białko HP1 może wiązać się też ze swoistymi miejscami
w euchromatynie. Ponieważ, domena CSD oddziałuje z różnymi
białkami jądrowymi, efektem działania HP1 może być zarówno represja
jak i aktywacja transkrypcji w obu rodzajach chromatyny.

siRNA
• Dwuniciowy RNA (dsRNA) degradowany jest przez rybonukleazę
Dicer do małych fragmentów RNA. Kompleks RISC połączony
z małymi fragmentami RNA wykorzystuje różne mechanizmy do
przeciwdziałania ekspresji genów.
• RNA odnajduje specyficzny cel, natomiast składniki białkowe RISC
działają bezpośrednio lub współdziałają z białkami represyjnymi.
Sposoby działania układu RISC-RNA:
◦ Konwencjonalne działanie interferencji RNA – kompleks RISC,
połączony z mRNA, wykorzystuje właściwości „tnące” białka
Argonaut do degradacji transkryptu.
◦ Kompleks RISC może wiązać się do komplementarnego transkryptu
i efektywnie blokować jego translację.
◦ Białko RISC indukuje transkrypcyjną represję genu, wykorzystując
właściwość małych fragmentów RNA do modyfikacji chromatyny
bezpośrednio ją wyciszającej, nad komplementarnymi loci DNA.
Docelowe DNA oraz towarzyszące mu histony zostają zmetylowane
przez DNMT i HMT, ponadto dochodzi do deacetylacji histonów
(H3, H4) przez HDAC. Umożliwia to przyłączanie białek
odpowiedzialnych za heterochromatynizację (HP1).

macroH2A
• Jednym ze zjawisk prowadzących do epigenetycznego wyciszenia
chromosomu X jest wymiana H2A na wariant macroH2A (trzykrotnie
większy).
• Jego odcinek N-końcowy wykazuje około 60% podobieństwa sekwencji
do H2A, natomiast w końcu C-końcowym znajduje się niehistonowa
domena macro (25kDa), która posiada aktywność enzymatyczną,
w stosunku do poli-ADP rybozylowanych substratów – jest fosfatazą
ADP-rybozy1.
• Podczas wyciszania genów ma miejsce deacetylacja histonów, wśród
produktów tej reakcji jest O-acetylo-ADP-ryboza.
z potranslacyjnych modyfikacji jest rybozylacja białek jądrowych
(m.in. histonów). Domena macro wiąże O-acetylo-ADP-rybozę,
przyczyniając się do utrzymania stanu wyciszenia genów poprzez
regulację rybozylacji histonów.

126
 • Towarzyszy on również zmetylowanym wyspom CpG w rejonach
kontrolujących imprinting (ICRs – imprinting control regions – obszary
DNA bogate w CpG, zlokalizowane w sąsiedztwie promotorów genów
podlegających imprintingowi, metylacja tych obszarów jest
allelospecyficzna).
• Uczestniczy w kontroli proliferacji komórki.
• Nukleosomy zawierające macroH2A, są oporne na działanie niektórych
kompleksów remodelujących chromatynę (np. SWI/SNF) oraz na
działanie TF (np. NF-KB).
• Uznaje się go za znacznik epigenetyczny.

Polycomb (PcG) i Thrithorax (TrxG)

• Modyfikują one miejscowo właściwości chromatyny, doprowadzając do
transkrypcyjnej represji (PcG) lub aktywności (TrxG).
• Zgrupowane są w wieloskładnikowe kompleksy, w obrębie których
występuje metylotransferaza histonów (MHTase).
• Polycomb tworzą wyciszające kompleksy PRC (polycomb repressive
complex). PRC2/3 odpowiada za inicjację procesu wyciszenia,
natomiast PRC1 za utrzymanie tego stanu.
• Polycomb przyczyniają się do stałej represji genów homeotycznych,
które ustalają los komórek wzdłuż osi zarodkowej przednio-tylnej. Od
ekspresji genów homeotycznych zależy przejście komórki w stan
zróżnicowany
i jego utrzymanie w liniach komórkowych.
• Dzięki białkom PcG zachowany jest stan wyciszenia genów, których
produkty białkowe spełniły swoją rolę na określonym etapie rozwoju
organizmu.
• Uczestniczą także w piętnowaniu rodzicielskim, inaktywacji
chromosomu X oraz w regulacji cyklu komórkowego (wyciszanie
cyklin).
• Grupa białek Trithorax umożliwia aktywację genów homeotycznych
poprzez przeciwdziałanie represji wywoływanej przez PcG.

Test metylacyjny
• Technika ta umożliwia, w pewnych przypadkach, sprawdzenie
skuteczności leczenia po zastosowaniu stymulacji farmakologicznej.
DNA do badań może pochodzić zarówno z komórek somatycznych lub
w przypadku z komórek uzyskanych przez amniocentezę.
• Stosowany w diagnostyce zespołów Pradera – Willego (PWS)
i Angelmana (AS) ocenia wzór metylacji w locus SNRPN na
chromosomie 15. Pochodzący od matki gen jest silnie zmetylowany.

127
 • Etapy:
1. Modyfikacja DNA przy użyciu dwusiarczynu sodu (zamiana
niezmetylowanej cytozyny na uracyl). Cytozyna zmetylowana nie
podlega takiej zamianie.
2. Amplifikacja modyfikowanego DNA, za pomocą dwóch par starterów
przyłączających się specyficznie do zmetylowanej lub niezmetylowanej
nici DNA. W fenotypie prawidłowym produktem reakcji są dłuższe
amplikony pochodzenia matczynego i krótsze amplikony pochodzenia
ojcowskiego.
3. Sprawdzenie produktów amplifikacji. Obecność prążka matczynego
(MAT – prążek górny), przy braku ojcowskiego jest potwierdzeniem
PWS, natomiast obecność tylko prążka ojcowskiego (PAT – prążek
dolny) świadczy o występowaniu AS. DNA osoby zdrowej zawiera
obydwa prążki.

Zespół Praddera-Willego
• Objawami są niski wzrost, upośledzenie umysłowe, niedorozwój
narządów płciowych (hipogonadyzm) oraz otyłość (mniejsze
zapotrzebowanie energetyczne przy jednoczesnym ciągłym
niepohamowanym uczuciu głodu).
• Uwarunkowany jest utratą funkcji genów zlokalizowanych w obrębie
ramienia długiego chromosomu 15 (region q11-13) pochodzącego od
ojca.
• Brak regionu 15q11-13 pochodzącego od matki jest odpowiedzialny za
wystąpienie zespołu Angelmana (odmienny obraz kliniczny).
• W obrębie ulegającego delecji fragmentu tzw. regionie krytycznym,
znajdują się geny, które są aktywnie transkrybowane tylko
z chromosomu pochodzącego od ojca (nieaktywne na chromosomie
pochodzącym od matki). Podobnie w tym samym regionie znajdują się
również inne geny, które ulegają aktywnej transkrypcji z chromosomu
pochodzącego od matki. Gdy taka pojedyncza kopia genów jest utracona
(delecja), to mimo obecności odpowiednich alleli na chromosomie
pochodzącym od drugiego z rodziców (kopie nieaktywne) rozwija się
choroba.
• W regionie krytycznym chromosomu 15 zidentyfikowano specyficzne
geny, których utrata jest związana z powstaniem zespołu Pradera-Willego
i zespołu Angelmana. Jednym z takich genów jest SNRPN (small nuclear
riboprotein), podlegający ekspresji w mózgu, uczestniczący
w dojrzewaniu mRNA w mózgu. Brak ekspresji m.in. genu SNRPN,
podlegającego piętnowaniu matczynemu jest związany z rozwojem
zespołu Pradera-Willego.

128
• Gen UBE3A, podlega piętnowaniu ojcowskiem, ale jest
transkrybowany z chromosomu matczynego, a utrata jedynej aktywnej
transkrypcyjnie kopii genu UBE3A prowadzi do rozwoju zespołu
Angelmana. Koduje on białko związane z zależnym od ubikwityny
procesem degradacji białek w trakcie rozwoju mózgu. Zaburzenie tego
procesu prowadzi do znacznego opóźnienia umysłowego, padaczki,
ataksji.
• Poza delecjami chromosomowymi do rozwoju zespołu Pradera-Willego
i zespołu Angelmana może prowadzić również tzw. disomia
jednorodzicielska – stan, w którym potomstwo dziedziczy dwie kopie
chromosomu tylko od jednego z rodziców.

129
 KANCEROGENEZA

• W komórkach nowotworowych następuje stała, nieregulowana

proliferacja oraz większa odporność na czynniki indukujące śmierć. Nie
odpowiadają one na sygnały regulujące proliferację. Przez te zaburzenia
ich liczba stopniowo się zwiększa. Cały ten proces jest określany
transformacją nowotworową, będącą skutkiem nagromadzenia się
zmian genetycznych w DNA komórek.
• Zmiany genetyczne komórek nowotworowych dotyczą:
◦ Protoonkogenów – kodują białka dające sygnał do proliferacji
(czynniki transkrypcyjne, receptory i ich ligandy, białka szlaków
sygnałowych u regulatory cyklu), zmutowane są określane
onkogenami. Np. Ras, Src, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), EGF-R
(rak piersi), cyklina D1. Ich geny są dominujące (uszkodzenie
jednego allelu powoduje chorobę).
◦ Genów supresorowych nowotworów – kodują białka hamujące
proliferację. Ich geny są recesywne, do rozwoju choroby potrzebna
jest mutacja obu alleli.
◦ Genów regulujących apoptozę.
• Mają zdolność do „oszukiwania układu odpornościowego”. Rozwój
choroby może postępować tylko wtedy gdy funkcjonowanie tego układu
jest zaburzone.
• Czynniki kancerogenne mają różny mechanizm działania (barwniki
anilinowe powodują tworzenie adduktów DNA, azbest powoduje
przewlekły stan zapalny – pobudza to proliferację i utrwala mutację, UV
powoduje tworzenie dimerów pirymidynowych, a promieniowanie
przerywa nici DNA i powoduje zamiany zasad).

Klonalny rozwój nowotworu

• Najczęściej rozwija się on z pojedynczej zmienionej komórki. DNA
któregoś z potomnych klonów może zmutować i dać początek kolejnemu
typowi klonów, takie pojawianie się zmian genetycznych zachodzi
4-5-krotnie i określa się to progresją nowotworu, początkowo jest ona
wolna i trwa latami i w pewnym momencie powstają komórki zupełnie
niezależne od sygnałów regulujących współpracę z innymi. Komórki
nowotworowe opuszczają pierwotne miejsce i rozsiewają się
w organizmie, blokują obronę immunologiczną, stanowią coraz większą
masę i prowadzą do śmierci chorego.

130
Nowotwory złośliwe i łagodne
• Można je odróżnić metodami histopatologiczymi, a w przypadku
chłoniaków i białaczek cytometrią przepływową.
Łagodne Ich komórki namnażają się i przeżywają nadmiernie długo, ale
pozostają skupione w jednym miejscu.
Złośliwe Określane tak gdy uzyskają zdolność do odrywania się z miejsca
wzrostu i przedostawania się do naczyń krwionośnych
i limfatycznych, oraz tworzenia przerzutów w nowych miejscach.
• Rozróżnia się je na podstawie wyglądu komórek i ich jąder, oceny
metodami immunocytochemii i częstości podziałów.
• Łagodność guza przy wycinaniu musi być potwierdzona
histopatologicznym badaniem cienkoigłowym okolicznych węzłów
chłonnych.

Onkogeny
• Zmutowany gen kodujący białko kierujące komórkę do podziału.
Komórki które je mają kontynuują wzrost nawet bez sygnałów.
• Pierwotnie odkryto je w retrowirusach onkogennych, nie są one
wykorzystywane do replikacji, ale są przez nie przenoszone. Po
wbudowaniu do genomu mogą też aktywować sąsiednie geny
regulacyjne komórki.
• Ich aktywność wynika z tego że są wytwarzane:
◦ W formie stale aktywnej.
◦ Pojawiają się w komórkach, gdzie normalnie nie są obecne.
◦ Są wydzielane w nadmiernej ilości.
• U ludzi wirus Epsteina-Barr (EBV) wywołuje chłoniaka Brukkita,
nowotwory limfocytów B, raka nosogardzieli.
• Wirus papilloma (HPV) wywołuje nowotwory skóry, okolicy odbytu
i narządów rodnych. Indukuje raka szyjki macicy (można się zaszczepić).
Kodują białka E6 i E7 hamujące p53 i RB.
• Wirus hepatitis B wywołuje raka wątroby.
• Wirus HTLV1/2 wywołuje białaczkę T-limfocytarną.
• Zarażenie wirusem nie jest jednoznaczne z pojawianiem się nowotworu.

Powstawanie onkogenów w komórkach niezarażonych wirusem

• Mogą powstawać z protoonkogenów przez mutacje i rearanżacje DNA.
• Przenoszenie onkogenów z DNA – transferowanie komórek
onkogenami in vitro jest standardową techniką badawczą (oczyszczony
DNA z komórek rakowych jest wprowadzany do prawidłowych mysich
komórek in vitro).

131
 • Genom komórek nowotworowych jest niestabilny i często ulega
zmianom. Przyczyny powstawania onkogenów w komórkach
niezarażonych:
◦ Mutacje punktowe – np. G→T w kodonach 12,13 i 61 w genie
rasH raka pęcherza moczowego. Powoduje to pojawienie się waliny
zamiast glicyny. Może to być wywołane chemicznymi
kancerogenami. Białka RAS funkcjonują na drodze transdukcji
sygnałów do podziału komórki. Częste mutacje punktowe są też
w genie białka p53.
◦ Duże homozygotyczne delecje (utrata dużych fragmentów jednego
z chromosomów homologicznych). Zdarzają się pod wpływem np.
napromieniowania, może doprowadzić do usunięcia ważnych dla
komórki genów i zbliżenie genów oddalonych od siebie.
◦ Translokacje chromosomowe i powstawanie genów fuzyjnych –
wzajemna wymiana części chromosomów. Przykładem jest
chromosom Philadelphia w komórkach przewlekłej białaczki
szpikowej (CML) – gen kinazy tyrozynowej abl zostaje
przeniesiony z chromosomu 9 na 22, na 22 powstaje gen fuzyjny
kodujący białko BCR/ABL. Zapobiega ono apoptozie. Innym
przykładem jest gen cykliny D1 który może zostać przekształcony
w onkogen PRAD1 przez translokację chromosomową lub
amplifikację genu, powoduje to podziały bez udziału czynnika
wzrostu.
◦ Metylacje cytozyny w pozycji 5' w CpG, regionu promotora
w wyspie CpG (bywa procesem prawidłowym np. genu IGF2).
Ponad 40% p16INK4a jest tak wyłączone w raku żołądka.
◦ Amplifikacja genu – zachodzi w około 14% raka pęcherza
moczowego, dochodzi do nadekspresji genu receptora
nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF-R). W komórkach raka
dochodzi do jego amplifikacji z delecją N-końcowej części białka
zawierającej miejsce wiązania EGF, prowadzi to do powstania
receptora podwójnego stale obecnego w błonie – ErbB (HER2/new)
jest on niezdolny do wiązania EGF, ale za to pozostaje aktywny
kinazowo.

Geny supresorowe
• Geny onkosupresorowe hamują cykl, spowalniają częstość podziałów
(p53, RB, p16INK4, NF1, NF2, APC).
• Obecność w komórce jednego prawidłowego genu wystarcza do
hamowania podziałów tak by nie miały charakteru nowotworowego, gdy
jeden allel jest prawidłowy, a drugi nie to większa jest szansa, że układ
hamowania zawiedzie – heterozygotyczność alleli.

132
 • Zaobserwowanie utraty drugiego allelu (utrata heterozygotyczności –
LOH) w proliferującej komórce nowotworowej pozwala sądzić,
że w danym fragmencie DNA jest zlokalizowany gen supresorowy.
• Mutacja lub utrata inaktywująca produkt białkowy obu alleli genu
supresorowego powoduje jej zmianę w nowotworową.
• Doświadczenie Harrisa ukazuje że fuzja komórki tumorogennej
z prawidłową powoduje jej zamianę w nienowotworową.

Białko p53
• W komórkach nowotworowych obserwuje się immunochemicznie
stężenie 50-70% (w zdrowych jest niskie) związane z mutacją genu
p53. Najczęściej są to mutacje punktowe (nie dotyczą domeny
oligomeryzacji), zazwyczaj późne i poprzedzają przeżuty.
• Jest ono TF mogącym indukować i hamować ekspresje wielu genów,
kontrolują podziały komórek, indukują apoptozę.
• Posiada też właściwości niezwiązane z transkrypcją.
• Aktywne znajduje się w jądrze, a nieaktywne w cytoplazmie.
• Tworzy ono dimery i tetramery, cząsteczki oddziałują przez domeny
oligomeryzacji. Gdy oba allele p53 są prawidłowe to tetramery i dimery
są zbudowane z prawidłowych aktywujących się jednostek, jeśli jeden
jest zmutowany to pojawiają się nieaktywne tetramery, gromadzące się
w cytoplazmie w dużym stężeniu.
• Jego niskie stężenie w komórce jest utrzymywane przez oddziaływanie
z MDM2, taki kompleks jest kierowany do degradacji w proteasomie.
p53 zwiększa ekspresję MDM2, przez to prawidłowy okres półtrwania
w komórce wynosi ok. 20 min). Nieprawidłowe tetramery nie tworzą
kompleksu z MDM2.
• Stres komórkowy prowadzi do rozpadu kompleksu i zwiększania
stężenia p53 (MDM2 jest desforylowane).
• Przy niedużym wzroście stężenia p53 w komórce tworzy ono dimery
hamujące cykl (aktywują geny zatrzymania cyklu i reparacji DNA). Gdy
naprawa nie nastąpi, stężenie wzrasta i pojawiają się tetramery oraz
dimery p53 związane z koaktywatorami, p53 wiąże się bezpośrednio
w miejscu uszkodzonego DNA. Powoduje to transkrypcję białek
proapoptotycznych (nie zachodzi przy zmutowanym p53).

Białko p21
• Przedstawiciel rodziny p21 (p21, p27, p57).
• Jest inhibitorem kompleksów cyklin i CDK: CDK4/D, CDK6/D
i CDK2/E. Kompleksy tych kinaz z cyklinami kontrolują wchodzenie
w cykl.

133
 • Jego ekspresja jest regulowana białkiem p53. Jego utrata powoduje stałą
nieregulowaną syntezę DNA.

Białko p16
• Wchodzi w skład rodziny białek (p15, p16, p18, p19) których geny są
zlokalizowane na ramieniu krótkim chromosomu 9 (9p21).
• Znajduje się na chromosomie 9p21, wiąże się z CDK, p16INK4 jest
inhibitorem CDK4 i CDK6.
• Brak jego obu alleli, albo inaktywacja kodowanego nim białka
supresorowego powoduje nieregulowane podziały.
• Wyciszenie jego genu zachodzi przez błędną metylację cytozyny.

Telomery
• U człowieka wystarczają na około 70 podziałów, ale mogą zostać
odbudowane przez telomerazę (rodzaj odwrotnej transkryptazy).
W warunkach prawidłowych jest wytwarzana w okresie życia płodowego
i jest nieobecna po urodzeniu.
• W komórkach nowotworowych są odbudowywane bez końca.
Zahamowanie działania telomerazy w tych komórkach w in vitro
powoduje ich śmierć.

Onkomiry (miRNA, 22 nukleotydy)

• mikroRNA których ekspresja jest związana z rozwojem nowotworów
(miR 17, 19, 21). Antyonkomiry to miR 143, 145.

Utrata heterozygotyczności (LOH)

• W przypadku mutacji jednego z alleli genu supresorowego drugi pełni
funkcję
• Do transformacji potrzebne jest wyłączenie drugiego allelu (teoria
dwóch uderzeń Alfreda Knudsona).
• Zazwyczaj pierwsze uszkodzenie jest mutacją (często dziedziczoną),
a drugie ma charakter mutacji chromosomalnej (rozległa delecja).
Prowadzi to do utraty całego allelu, zatem w komórce pozostaje tylko
jedna kopia (uszkodzonego) genu – nie jest już heterozygotą.

Rak okrężnicy
• By doszło do jego rozwoju muszą zostać zmienione geny:
◦ APC (adenomatous polyposis coli – gruczolakowa polipowatość
jelita grubego) jest to białko związane z kateninami.
◦ DCC – gen jednego z białek adhezyjnych IgCAM. Odgrywa rolę
w połączeniach międzykomórkowych nabłonka.
◦ Gen białka p53.

134
 ◦ Protoonkogen RasK. Białko Ras należy do białek G i uczestniczy
w aktywacji innych protoonkogenów np. fos.
• Etapy rozwoju:
1. Zmiany genu APC – komórka zaczyna się dzielić częściej i powstaje
mały polip.
2. Uszkodzenie genu RasK – prowadzi do wzrostu polipa.
3. Uszkodzenie DCC – dalszy wzrost polipa.
4. Uszkodzenie p53 – nowotwór staje się złośliwy i zaczyna naciekać
na inne tkanki i daje przerzuty.
• W jego komórkach jest zwiększona ekspresja GLUT co jest związane
z glikolitycznym metabolizmem.

Zespół Li-Fraumeni
• Spowodowany defektem genu tp53. U połowy chorych nowotwór
ujawnia się przed 40 r.ż.
• Towarzyszy mu występowanie mięsaków, raka piersi, kory nadnerczy,
białaczek, guzów mózgu.

Polipowatość jelita grubego

• Spowodowany mutacją genu kodującego APC (mutacja germinalna na
chromosomie 5, w 30% mutacja de novo).
• Pacjencji rozwijają tysiące polipów. Średnia zachorowania na raka jelita
grubego wynosi u ich 39 lat, przed 45 r.ż. 90% na niego choruje.
• Występują też inne nowotwory przewodu pokarmowego, zmiany
siatkówki i guzy łagodne.

Zespół Lyncha (HNPCC)

• Spowodowany mutacją germinalną w genach naprawy DNA – mutacje
mismatch (MLH1, MSH2, MLH3, MSH6, PMS1, PMS, TGFBR2).
• Powoduje do 5% raków jelita grubego. U kobiet powoduje raka
endometrium.
• Średnia wieku zachorowania na raka jelita grubego wynosi 44 lata
(zazwyczaj rozwija się w proksymalnej części okrężnicy).
• Nie związany z polipami.

Zespół Nijmegen
• Autosomalna recesywna choroba jednogenowa. Spowodowana mutacją
genu NBS1 (koduje białko nibrin – składowa kompleksu
naprawiającego pęknięcia dsDNA).
• Powoduje niestabilność chromosomalną (są łamliwe, wrażliwe na
promieniowanie jonizujące).

135
 • Występuje głównie w Polsce, Czechach i krajach środkowej i wschodniej
Europy. Czterokrotny wzrost ryzyka zachorowania u heterozygotycznych
nosicieli (haploinsuficjencja), może być przyczyną 2% nowotworów
w Polsce.
• Rokowane jest przeżycie do 52 lat. Powoduje 1000 razy większą
skłonność do zachorowań na nowotwory (głównie NHL i ALL). 40%
chorych przed 20 r.ż. zachoruje na NHL.

Tolerancja immunologiczna
• Komórki nowotworowe mają zmienioną reaktywność i antygenowość
spowodowaną obecnością nowych białek.
• In vivo obserwuje się znikomą efektywną odpowiedź immunologiczną.
• Antygeny związane z nowotworem zwykle pojawiają się wewnątrz
komórki i czasem ich epitopy nie są prezentowane na powierzchni. Może
to być spowodowane:
◦ Nieprawidłowym przygotowaniem antygenu w proteasomach.
◦ Mogą utracić zdolność ekspresji MHC I.
◦ Nowotwór i otaczające tkanki mogą zyskać zdolność wytwarzania
czynników immunosupresyjnych (np. TGF-β hamującego aktywną
stymulację limfocytów T dziewiczych).
◦ Pojawia się znaczna liczba limfocytów Treg produkujących Il-10
zmniejszającą odpowiedź cytotoksyczną.
◦ Komórki białaczki wytwarzają substancje hamujące dojrzewanie
tymocytów.
◦ Możliwe jest by guz wzrastał za szybko w stosunku do namnażania
prekursorowych komórek limfocytów T.

Ignorancja
• Badano ją na myszy transgenicznej której wszystkie limfocyty T CD8 +
były swoiście skierowane przeciw fragmentom dehydrogenazy
α-ketoglutaranu (DKG) komórek skóry i nowotworowych. Były one
prezentowane przez MHC I.
• U myszy przeszczepy skóry DKG+ były odrzucane, ale nowotwory dalej
rosły. Transgenicze limfocyty T CD8+ mogły rozpoznawać ten sam
epitop zarówno w komórkach guza, jak i prawidłowych.
• W czasie wzrostu komórki guza nie traciły ekspresji DKG, nie miały też
ekspresji Fas-Ligand (Fas-L) na powierzchni co powodowałoby zabijanie
limfocytów atakujących nowotwór.
• Traktowanie myszy przeciwciałem anty-CD8 (ale nie anty-CD4)
zapobiega odrzuceniu przeszczepu.

136
Anergia
• Przypisuje się ją brakowi sygnałów kostymulujących zależnych od
oddziaływania CD28 i CD80 (B7-1).
• Komórki nowotworowe mogą nie mieć cząsteczek kostymulujących B7
oddziałujących z CD28 limfocytów T i wzmacniających cytotoksyczny
efekt.
• Mysie nowotwory immunogenne (chłoniak RMA, EL4, mastocytoma
P815) nie mają ekspresji B7 i są tumorogenne po wszczepieniu do myszy
syngenicznej, ale tracą tumorogenność po transfekcji B7.
• Nowotwory nieimmunogenne np. mysi mięsak MCA101 lub melanoma
B16 po transfekcji genem B7 pozostają tumorogenne.
• Kostymulacja jest konieczna na etapie oddziaływania limfocyt
T-komórka docelowa, ale warunkiem jej skuteczności jest
immunogenność nowotworu,

Delecja
• Delecja niektórych limfocytów T może być spowodowana ekspresją
Fas-L na komórkach nowotworowych.
• Aktywowane cytotoksyczne limfocyty T (CTL) mające ekspresje Fas
po zbliżeniu się do komórek z Fas-L otrzymują sygnał do apoptozy.
• Inny mechanizm polega na pobieraniu przez CTL kompleksów peptyd
MHC, prezentują one wtedy pobrane antygeny nowotworowe i stają się
wrażliwe na swoistą lizę przez sąsiednie limfocyty T (fraticide).

Leczenie nowotworów
• Chirurgiczne – często nie usuwa wszystkich komórek, a podczas
zabiegu niektóre mogą zostać przesunięte poza teren guza.
• Napromieniowanie – Najczęściej nie usuwa wszystkich komórek
nowotworu, wymaga drogiego sprzętu.
• Chemioterapia – stosowana przy nowotworach układu
hemopoetycznego i przy niektórych guzach. Jest to podawanie dożylnie
lub doustnie przez kolejne dni substancji hamującej podziały
i specjalizacje komórek. Takie kursy leczenia są powtarzane
wielokrotnie. Wśród niepożądanych skutków jest zmniejszenie
odporności chorego na zakażenia. Trwałe wyleczenie po chemioterapii
obserwuje się w białaczkach u dzieci i raku jądra, skuteczna u chorych
z kosmówczakiem i u 15% chorych z rakiem drobnokomórkowym płuc.
U dzieci po chemioterapii białaczek występują mutacje limfocytów T.
• Immunoterapia – nie jest obciążona niepożądanymi skutkami. Jej celem
jest zmniejszenie masy komórek nowotworowych i przełamanie
tolerancji immunologicznej.

137
 ◦ W leczeniu chłoniaków B-komórkowych o niskiej złośliwości
stosuje się chimeryczną immunoglobulinę przeciw epitopowi CD20,
ma ona mysie części zmienne łańcuchów, ale ludzkie części stałe,
przez co nie jest szybko niszczona. Epitop CD20 jest zlokalizowany
w limfocytach pre-B i dojrzałych B.
◦ W leczeniu raka sutka stosuje się przeciwciało przeciw receptorowi
EGF, białko kodowane onkogenem HER-2/new stale aktywne bez
udziału ligandu przypomina ten receptor. Przeciwciało hamuje
rozrost tego nowotworu szczególnie przy łączeniu z chemioterapią.
Komórki nowotworowe związane ze skierowanymi przeciw nimi
immunoglobulinami są niszczone w reakcji cytotoksycznej
zależnej od przeciwciał – ADCC.
◦ W powierzchniowym raku pęcherza podaje się dopęcherzowo BCG
(atenuowane prątki gruźlicy) w celu wywołania odczynu zapalnego
aktywującego miejscowe limfocyty cytotoksyczne, daje to
zatrzymanie bądź cofanie nowotworu i pozwala uniknąć usunięcie
pęcherza.
◦ Miejscowe podanie do nowotworu inhibitora angiogenezy (IL-12,
IFN-α, inhibitora metaloproteinaz) powoduje jego gorsze
odżywienie i zmniejszenie masy.
◦ Przerwanie tolerancji immunologicznej osiąga się przez podanie
napromieniowanych komórek własnego nowotworu, powoduje to
wytworzenie odczynu zapalnego, podane komórki ulegają apoptozie
i aktywują dendrytyczne, te przenoszą się do węzłów chłonnych
i aktywują limfocyty T cytotoksyczne.

Terapia genowa
• Metoda leczenia polegająca na wprowadzeniu do komórek prawidłowej
kopii genu, którego defekt jest odpowiedzialny za rozwój choroby.
• Do wprowadzenia genu stosuje się wektory retrowirusowe
i adenowirusowe, a także bazujące na lentiwirusach, wirusach opryszczki
i adenosatelitarnych, oraz liposomy.
• Stosowana eksperymentalnie do leczenia wrodzonej ślepoty, X-SCID,
ADA-SCID.
• Jej ograniczenia w onkologii są wywołane:
◦ Możliwością dania niepożądanych skutków.
◦ Przedłużonym czasem działania.
◦ Przypadkowa integracja może uszkodzić inne ważne geny.
• Sekwencję DNA zmienia się stosując ZNF-nukleazy (zinc finger
nucleases), TALEN (transcription activator-like effector nucleases),
CRISPR/Cas9 (CRISPR associated protein 9).

138
 TERAPIA NOWOTWORÓW

Metaloproteinazy (MMP)
• Mają Zn2+ w centrum aktywnym. Wydzielane są przez: komórki
nowotworowe, tuczne, śródbłonka, fibroblasty, makrofagi, neutrofile.
Uczestniczą w migracji, angiogenezie i EMT.
• Zbudowane są przynajmniej z dwóch domen, katalitycznej
i prodomeny, zawierają także peptyd sygnałowy.
• Domena katalityczna zawiera wysoce konserwatywny motyw
HEXGHXXGXXH, trzy reszty histydyny odpowiedzialne za wiązanie
z katalitycznym jonem cynku. Znajduje się w niej także strukturalny jon
cynku i przeważnie trzy jony wapnia, które stabilizują strukturę enzymu.
• Wymagają aktywacji, polegającej na usunięciu prodomeny.
• Może w nich także występować:
◦ Domena hemopeksyny – odgrywa znaczącą rolę w prawidłowym
rozpoznaniu substratu, oddziaływaniu z tkankowymi
inhibitorami metaloproteinaz (TIMP1, 2, 3, 4) oraz wiązaniu
enzymu do ECM lub powierzchni komórki.
◦ Elastyczny łącznik – pomaga utrzymać stabilną strukturę enzymu,
łączy domenę hemopeksyny z katalityczną, a także może mieć
znaczenie przy degradacji niektórych substratów MMP.
Matrylizyny MMP7, 26 trawią składniki macierzy i odcinają
z powierzchni komórki: FASL, pro-TNF-α, E-kadheryna
Kolagenazy MMP1, 8, 13, 18 degradują kolagen I, II, III, V, IX
Stromielizyny MMP3, 10 degradują ECM
Żelatynazy MMP2, 9 degradują kolagen IV, lamininę, żelatynę
(produkowane przez makrofagi)
Błonowe MMP bezpośrednio w błonie komórek
Niesklasyfikowane MMP
• Choć MMP są istotne dla przeżycia i ekspansji komórek
nowotworowych, to są przez nie wytwarzane w niewielkim stopniu.
• Komórki nowotworowe, parakrynowo, przez interleukiny, interferony,
czynniki wzrostu i induktory metaloproteinazy macierzy
zewnątrzkomórkowej (EMMPRIN), inicjują otaczające komórki
gospodarza do wytwarzania potrzebnych im MMP.

139
 • MMP wydzielane przez prawidłowe komórki mogą być wiązane na
powierzchni komórek nowotworowych.

Angiogeneza
• Wzrost guza powyżej średnicy 2-3 mm wymaga zaopatrzenia w tlen
i składniki odżywcze.
• Istnieje kilka sposobów tworzenia naczyń krwionośnych:
◦ Waskulogeneza – tworzenie de novo z angioblasów.
◦ Angiogeneza – na bazie istniejącej sieci naczyń krwionośnych
poprzez kiełkowanie naczyń z komórek śródbłonka.
◦ Naśladownictwo naczyniowe – komórki macierzyste nowotworu
różnicują się w nowotworowy śródbłonek.
• Część zaadoptowanych nowych naczyń krwionośnych z powodu
szybkiego wzrostu guza ulega przerwaniu stąd często martwica
w środku guza. Naczynia nowotworowe z powodu gwałtowności
rośnięcia są często kręte, poszerzone i nieszczelne.
• HGF jest głównym morfogenem, który powoduje angiogenezę i EMT,
ponadto jest wywoływana przez TGF-β, VEGF i β-FGF.
• Sorafenib – małocząsteczkowy doustny inhibitor wielu kinaz
tyrozynowych hamujący angiogenezę. Działa poprzez blokadę licznych
kinaz – kinazy Raf, receptorowych kinaz: PDGFβ (PDGFRβ), VEGF
oraz pośrednio białka C-KIT, C-RAF, B-RAF i kinazy tyrozynowej RET.
Wydłuża przeżycie u chorych na raka wątrobowokomórkowego.

Adhezja komórkowa
• Konieczna do formowania i podtrzymywania trójwymiarowej struktury
i prawidłowego funkcjonowania tkanek. Kompleksy odpowiedzialne za
formowanie struktur adhezyjnych składają się z trzech typów białek:
receptorów, zewnątrzkomórkowych molekuł macierzy i białek
tworzących połączenia międzykomórkowe, są one strukturami
dynamicznymi (wychwytują i reagują na sygnały pochodzenia wewnątrz-
i zewnątrzkomórkowego).
• Wśród cząsteczek adhezyjnych odpowiedzialnych za przyleganie
wyróżniono: integryny, selektyny, kadheryny i cząsteczki
immunoglobulinopodobne.

Transformacja epitelialno-mezenchymalna (EMT)

• Komórki, które tworzyły silne oddziaływania komórka-komórka
(kadheryny), oraz oddziaływania komórka-macierz pozakomórkowa
(integryny) nabywają zdolności samodzielnego przemieszczania się.

140
 • Połączenia międzykomórkowe zostają osłabione, komórki tracą kontakt
z podłożem. Towarzyszy temu zmiana wyglądu komórek – z postaci
przypominającej tkankę nabłonkową przeistaczają się one do formy
podobnej do mezenchymy.
• Ma miejsce tak zwane „przełączenie kadherynowe” (ekspresja
N-kadheryny). Zmienia się polarność komórek .
• EMT jest głównym mechanizmem odpowiedzialnym za inwazyjność
i przerzuty nowotworów w późnym stadium zaawansowania, jak
również formowanie wielu rodzajów tkanek w procesie embriogenezy.
• Przerzutujące komórki nowotworowe, w odległych organach, stają się
komórkami osiadłymi (przejście mezenchymalno-epitelialne, MET).
W wyniku tej reakcji komórki nowotworowe odzyskują fenotyp zbliżony
do fenotypu komórek epitelialnych, a wpływ na tę reakcję mają komórki
mikrośrodowiska.
• Proces EMT może być indukowany czynnikami wzrostowymi (EGF,
FGF, HGF, TGF-β, białka morfogenetyczne kości, czynnik wzrostu
komórek pnia, szlak Wnt) lub stymulatorami z mikrootoczenia komórki
nowotworowej.
• W EMT istotną rolę odgrywają TF: Snail (SNAI1), Slug (SNAI2), Twist
(hamujące ekspresję kadheryn i innych białek tworzących połączenia
międzykomórkowe). Wzrost ekspresji tych czynników doprowadza do
aktywacji wielu genów i w efekcie wzrostu tempa proliferacji,
zahamowania apoptozy, wzrostu mobilności.
Twist (TF o budowie Aktywowany Zwiększa ekepresję N-kadheryny,
helisa-zwrot-helisa) przez AKT, zmniejsza E-kadheryny. Powoduje
STAT3, Ras, przerzuty, angiogenezę, rozwój
Wnt. komórek macierzystych guza
i odporność na chemioterapię.
Snail, Slug Aktywowany Aktywacja prowadzi do podniesienia
(TF o budowie palca przez EGF, poziomu MMP, czynników
cynkowego, represor HGF, FGF, proangiogennych
ekspresji E-kadheryny) TGF-β, Wnt. i antyapoptotycznych.
• W komórkach przechodzących EMT pojawiają się markery
macierzystych komórek nowotworowych (Notch, Oct-4).

Komórki macierzyste guza

• Komórki hipotetyczne.
• Komórki macierzyste dzielą się bardzo rzadko, są w fazie G0 i trudno je
zabić, zazwyczaj żyją w niszach schowane przed wpływem środowiska
(na dnie krypt, głęboko w mieszku włosowym, w zachyłkach szpiku
kostnego).

141
 • Wykazują wysoką ekspresję gp-100 i są MDR, zazwyczaj są oporne na
indukcję apoptozy.

Oporność wielolekowa
• Może dotyczyć jednocześnie wielu leków, również tych celowanych.
Transportery ABC determinują biodostępność, wydalanie, penetrację
oraz chronią organizm przed ksenobiotykami.
• P-gp (Gen ABCB1 na chromosomie 7) należy do rodziny białek
charakteryzujących się występowaniem wysoce konserwowanego
motywu zwanego kasetą wiążącą ATP (ABC).
• Rodzinę ABC tworzą transportery błonowe, które przenoszą cząsteczki
przez błonę komórkową wbrew gradientowi stężeń, zużywając energię
pochodzącą z hydrolizy ATP.
• W ludzkim genomie zidentyfikowano 49 genów kodujących transportery
ABC, tworzące 7 podrodzin.
• P-gp jest pierwszym odkrytym członkiem podrodziny B dlatego też
znana jest pod nazwą ABCB1 (ATP-binding cassette subfamily B
member 1). Zwyczajowo nazywana jest też białkiem oporności
wielolekowej 1 (MDR1, multidrug resistance protein 1) ze względu na
związek z lekoopornością linii komórek nowotworowych, w których
ulega nadekspresji.
• Przyjmuje się, że mechanizm działania P-gp oparty jest na modelu
hydrofobowej pompy próżniowej. Model ten zakłada, że substrat
znajdujący się w cytoplazmie lub w wewnętrznej warstwie błony
komórkowej oddziałuje z białkową kieszenią wiążącą lek, a następnie
dzięki energii powstałej z hydrolizy ATP jest transportowany do
przestrzeni zewnątrzkomórkowej.
• Transportery ABC są specyficzne substratowo.

Leki onkologiczne
Tradycyjne Cisplatyna, Doxorubicyna, 5-fluorouracyl, Thalidomid
Celowane Ihibitory proteasomów (bortezomib), przeciwciała (rituximab),
drobnocząsteczkowe inhibitory kinaz (Gleevec – imatinib).

Związki Działając przyłączają grupę alkilową Chlorambucyl,

aklilujące do DNA, do guaniny w pozycji 7
łańcucha DNA (sieciowania nici
DNA).
cyklofosfamid, izosfamid,
busulfan, temozolomid,
karmustyna, lomustyna,
fotemustyna, dakarbazyna,
procarbasine, mustina

142
Alkaloidy Stabilizują mikrotubule wrzeciona Winblastyna, winkrystyna,
kariokinetycznego fazie M.
Pochodne podofiliny
Hamowanie topoizomerazy II→
blokowanie syntezy DNA→
zatrzymanie cyklu komórkowego.
Antybio- Interferują z białkami
tyki cytoplazmatycznymi (głównie
rybosomami).
Antyme- Wszystkie są swoiste dla fazy S
tabolity cyklu komórkowego. Znajdują
szerokie zastosowanie
w leczeniu nowotworów układu
krwiotwórczego oraz większości
guzów litych. Blokują biosyntezę
kwasów nukleinowych.
Inhibitory Hamują syntezę DNA blokując
enzymów reduktazę rybonukleotydową,
działa w fazie S i G2.
Hormony Tamoxifen – selektywny modulator receptora estrogenowego
(SERM). Herceptyna.
Steroidy Działają w fazie G1 cyklu
komórkowego
Związki Wiążą się z DNA
platyny
143
taksol
Etopozyd, tenipozyd
Daunorubicin, doxorubicin,
epirubicin, idarubicin,
valrubicin, mitoxantrone,
bleomycyna (analogi
antracyklin)
Metotreksat,
5-fluorouracyl, cytarabina,
kapecytabina, arabinozyd
cytozyny, fludarabina,
kladrybina, gemcytabina,
pemetreksed
Hydroksymocznik
Dexamethason (Dexaven) -
chłoniaki, szpiczak mnogi
Prednizon (Encorton) -
chłoniaki, białaczki
Medroksyprogesteron (Depo
Provera) - rak endometrium,
rak piersi, rak nerki
Metyloprednizolon (Depo
Medrol) - przeciwobrzękowo,
przeciwwymiotnie
Cisplatyna, karboplatyna,
oksaliplatyna
Mechanizmy tradycyjnej chemioterapii
• Destabilizacja DNA komórki nowotworowej. Nie zawsze jest
selektywne, ale idealny lek ma być wysoce selektywny np. cisplatyna,
daunorubicyna, doksorubicyna, i etopozyd.
• Blokowanie syntezy nowego DNA aby zatrzymać podziały komórek,
gdyż replikacja powoduje, że guz rośnie np. metotreksat,
merkaptopuryna, 5-fluororuracyl, i hydroksymocznik.
• Zatrzymanie komórki w fazie mitozy np. winblastyna, winkrystyna
i taxol.
Leki działające w fazie G1: Asparaginaza, glikokortykosterydy
Leki działające w fazie S: Doksorubicyna, fludarabina, fluorouracyl,
gemcytabina, kapecytabina, metotreksat,
prokarbazyna
Leki działające w fazie G2: Bleomycyna, irynotekan, mitoksantron
Leki działające w fazie M: Winkrystyna, winblastyna, etopozyd, paklitaksel,
docetaksel
Podstawy farmakologicznego leczenia nowotworów
• Wrażliwość nowotworu na leczenie:
◦ Zależna od fazy cyklu komórkowego
◦ Zależna od odsetka komórek proliferujących (Ki-67)
◦ Heterogenność komórkowa guza (różna wrażliwość na różne
substancje lecznicze)
◦ Masa guza
◦ Ukrwienie guza
◦ Obecność receptorów – punktów „uchwytu” dla leków na
powierzchni komórek nowotworowych
• Terapie hormonalne
• Terapie „celowane” – Tzw. terapie genowe – leczenie ukierunkowane na
szlaki przekazywania informacji wewnątrz komórki (kinazy).

Rodzaje leczenia systemowego nowotworów

• Rodzaje hormonoterapii:
◦ Estrogeny (rak prostaty), androgeny (rak piersi)
◦ Gestageny (progesteron – rak endometrium)
◦ Antyhormony (tamoxifen – rak piersi)
◦ Analogi gonadoliberyn (podwzgórze) – rak prostaty, rak piersi
◦ Czynniki wzrostu (granulocytów, erytrocytów)
◦ Leki tzw. biologiczne – celowane (inhibitory kinaz i innych szlaków
przekazywania sygnału)

144
Nowe leki onkologiczne
• Przeciwciała monoklonalne sprzężone z lekiem, toksyną, lub
radioizotopem.
• Modyfikatory odpowiedzi immunologicznej (n.p., interferony, IL-2)
• Immunoterapia
• Hematopoetyczne czynniki wzrostu
• Induktory różnicowania komórkowego (retionoidy)
• Terapia genowa
• Terapia antysensowa (użycie krótkich fragmentów DNA lub RNA w celu
wyciszenia genów).
• Szczepionki przeciwnowotworowe
• Leki ograniczające przerzuty (inhibitory metaloproteinaz)
• Inhibitory angiogenezy
• Inhibitory proteasomów (bortezomib, carfilzomib)
• Toksyna BCG jest wykorzystywana w leczeniu raka pęcherza
moczowego.

Szlaki rozwoju nowotworów

Ras/Raf/MEK/ERK
• K-Ras (rak płuca, jelita grubego, trzustki, przewodów żółciowych)
• N-Ras (czerniak)
• H-Ras (rak pęcherza moczowego)
• Białka Ras są farnezylowane.
• Sama nadekspresja Ras może wystarczyć do transformacji.
• Nadaktywność Ras stwierdza się w 20-80% wszystkich nowotworów.
• Nadekspresja występuje szczególnie często w czerniakach.
• MEK jest kluczową kinazą.
• ERK bezpośrednio aktywuje czynniki transkrypcje w tym c-myc.

WNT/Katenina
• Stabilna β-kateniana jest aktywatorem TCF.
• NLPZ – pośrednio blokują ten szlak hamując transkrypcję zależną od
β-kateniny poprzez jej fosforylację.
• Exisulinid (Aptosyn) inhibitor kinazy białkowej G.
• Retinoidy aktywują receptor RXR I indukują oddysocjowanie
b-kateniny od TCF .

mTOR (Mammalian target of rapamycyn)

• Kinaza białkowa treoninowo-serynowa.
• Reguluje wzrost, proliferację i ruch komórki, translację i transkrypcję.

145
 • Działa poprzez szlak insulinowy i insulinopodobny.
• Jest sensorem komórkowego poziomu ATP.
• Inhibitory kinazy mTOR to ewerolimus (rak wątrobowokomórkowy
i jasnokomórkwy rak nerki) i temsyrolimus (immunosupresyjny).

Receptory wzrostu
• HER2 jest przezbłonowym receptorem o aktywności kinazy
tyrozynowej. Aktywuje w komórce PI3K/Akt, oraz MAPK.
• Blokowanie HER2 powoduje blok w fazie G1, zmniejszenie
angiogenezy i indukcję ADCC (cytotoksyczność komórkowa zależna od
przeciwciał).
• Niepożądane efekty: zaburzenia rytmu serca i kardiomiopatia, toksyczna
nekroliza naskórka, objawy grypopodobne.

Herceptyna (trastuzumab)
• Rekombinowane, humanizowane przeciwciało monoklonalne IgG1,
łączące się wybiórczo z receptorem ludzkiego naskórkowego czynnika
wzrostu typu 2 (Human Growth Factor Receptor – HER2).
• Preparat jest stosowany do leczenia przypadków raka piersi
z przerzutami, w których stwierdzono nadekspresję HER2.
• W kombinacji z innymi chemoterapeutykami istotnie zmniejsza ryzyko
nawrotu choroby i stopień odpowiedzi na leczenie.
• Niepożądane efekty: zaburzenia rytmu serca i kardiomiopatia, objawy
grypopodobne.

Tamoksyfen
• Wskazania:
◦ Rak sutka hormonowrażliwy (wykazując ekspresję receptorów
estrogenowych) u kobiet po i przed menopauzą.
◦ Chemioprewencja raka sutka u kobiet z dużym ryzykiem.
◦ Indukcja owulacji
◦ Mastopatia
• Organiczny związek chemiczny, należący do selektywnych
modulatorów receptora estrogenowego (SERM), syntetyczny lek
o działaniu antyestrogenowym, stosowany głównie w terapii raka sutka.
• Lek wiąże się również z receptorami estrogenowymi w kośćcu (agonista)
zwiększając gęstość kości.
• Powoduje zmniejszenie stężenia w osoczu wolnego estradiolu, co
prowadzi do pobudzenia wydzielania przez przedni płat przysadki
mózgowej FSH, który stymuluje jajniki do wytwarzania estrogenów
w okresie przedmenopauzalnym.

146
 • Prawdopodobnie indukuje uwalnianie czynnika transformującego TGF-β.
• Wnika do komórki i wiąże się z receptorem estrogenowym
uniemożliwiając wiązanie hormonów, a komórka nowotworowa nie
może się dzielić.

Przeciwciała
Rituximab Anty CD-20 niektóre chłoniaki
Tarstuzumab b HER2
Bevacizumab Inhibitor angiogenezy, humanizowane przeciwciało
anty-VEGF-A
Gemtuzumab Anty CD33 w ostrych białaczkach szpikowych, wycofany
w 2010
Alemtuzumab Wiąże się z białkiem CD52 występującym na powierzchni
limfocytów. Stos. w białaczkach, wycofany w 2012 bo nasilał
infekcje CMV
• W zależności od procentowego udziału białka ludzkiego w budowie
przeciwciała jego nazwa przyjmuje odpowiednią końcówkę:
◦ -cept – ludzkie receptorowe białko fuzyjne.
◦ -omab – białko mysie.
◦ -ksymab (-ximab) – chimeryczne przeciwciało zawierające 50-90%
białka ludzkiego.
◦ -zumab – humanizowane ludzkie przeciwciało (ponad 90% białka
ludzkiego).
◦ -umab – całkowite przeciwciało monoklonalne.
◦ -nib – drobnocząsteczkowe inhibitory kinaz.

Leki drobnocząsteczkowe
Gleevec, imatinib Inhibitor kinazy tyrozynowej zwłaszcza w białaczkach
z chromosomem Filadelfia
Tasigna, nilotinib

Inhibitor kinazy Stosowany w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej

BCLABL II generacji
oraz kinaz SRC
Sorafenib Inhibitor wielu kinaz ERK/MEK/RAF i angiogenezy
Velcade Bortezomib Inhibitor proteasomów w szpiczaku mnogim II gen:
Carfilzomib Kyprolis

147
 BADANIE BUDOWY I FUNKCJI KOMÓREK

Metody

Izolacja komórek
• Wiele badań wymaga uzyskania zawiesiny homogennej komórek –
delikatne mechaniczne rozdrobnienie fragmentu tkanki lub narządu,
a potem potraktowanie go enzymami trawiącymi wiążącą komórki
substancje międzykomórkową. Proces ten kończy się izolacją
pozwalającą oddzielić całe fragmenty komórek od uszkodzonych drogą
wirowania, a z tej zawiesiny można wyizolować komórki określonego
typu przy użyciu cytometru przepływowego.

Homogenizacja
• Bardzo dokładne rozdrobnienie w płynie, mechaniczne lub za pomocą
ultradźwięków. Uzyskuje się homogenat – zawiesinę składników
komórkowych. W zależności od warunków w zawiesinie mogą znaleźć
się nieuszkodzone organelle lub tylko ich fragmenty.
• Różniące się masą struktury komórkowe można podać selektywnej
izolacji przez frakcjonowanie (wirowanie różnicowe) – kilkakrotne
wirowanie homogenatu przy zwiększającej się prędkości. W każdym
cyklu powstaje osad z najcięższych organelli, a nadsącz wiruje się
ponownie. Podobny efekt można uzyskać stosując wirowanie
w środowisku (sacharoza, chlorek cezu) o wzrastającej gęstości
(w gradiencie gęstości), frakcje tworzą wtedy wyodrębnione na różnej
wysokości warstwy.

Hodowla komórek
• Wyizolowane komórki można utrzymać przy życiu in vitro umieszczając
je w pożywkach i przez zapewnienie im odpowiednich warunków
fizycznych. Pełnią one charakterystyczne dla siebie funkcje i namnażając
się.
• Pozwala na obserwację procesów zachodzących w żyjących komórkach
i śledzenia na bieżąco ich dynamiki.
• Pobrane i hodowane komórki mogą służyć do celów diagnostycznych,
lub być materiałem do autoprzeszczepów (ubytki skóry, komórki
macierzyste mięśnia sercowego). Można w nich dokonywać korekt
genomu inżynierią genetyczną (przekształcanie fibroblastów w komórki
macierzyste).

148
 • Można dokonywać fuzji komórek (połączenie cytoplazmy dwóch
komórek różnego typu). Dalsza hodowla prowadzi do hybrydyzacji
(połączenia genomów). Hybrydy są źródłem przeciwciał
monoklonalnych.
• Hodowla pierwotna – hodowla wyprowadzona z komórek, tkanek lub
narządów pobranych bezpośrednio z organizmu.
• Linia komórkowa – powstaje z hodowli pierwotnej po założeniu
pierwszej podhodowli (po pierwszym pasażu).
• Ustalona linia komórkowa – linia, którą można pasażować dowolnie
długo (nieśmiertelna).
• Diploidalna linia komórkowa – linia, w której przynajmniej 75%
komórek ma taki sam kariotyp jak prawidłowe komórki somatyczne.
• Heteroploidalna linia komórkowa – linia komórkowa, w której mniej
niż 75% komórek ma diploidalny kariotyp.
• Czas podwojenia populacji – odstęp czasu, w którym liczba komórek
podwaja się.
• Transformacja komórek – zmiana komórek prawidłowych w komórki
nowotworowe, spowodowana wprowadzeniem nowego materiału
genetycznego lub mutacją.
• Wzrost hodowli – zwiększanie się masy komórek (dawniej określenie to
dotyczyło zwiększania się ich liczby).

Pożywki
• Mają odpowiednie ciśnienie osmotyczne 340 ± 5 mOsm/kg H2O
i pH w zakresie do 7,2 do 7,4.
• Skład: sole mineralne, aminokwasy, glukoza, kwasy tłuszczowe,
witaminy, zasady purynowe i pirymidynowe, czerwień fenolowa,
surowica płodowa – źródło czynników wzrostu i hormonów.

Izolacja komórek lub ich zespołów

• Hodowanie w naczyniu eksplantatu (wyosobnionego fragmentu tkanki
lub narządu) przez czas konieczny do wypełznięcia z niego komórek.
• Rozdzielenie eksplantatu na pojedyncze komórki metodą enzymatyczną:
◦ Gdy jest mało substancji międzykomórkowej np. tkanki płodowe –
trypsyną.
◦ Gdy dużo jest substancji międzykomórkowej np. chrząstka –
kolagenazą z dodatkiem deoksyrybonukleazy.
◦ Rozdzielenie eksplantatu na większe fragmenty np. uzyskanie
pęcherzyków tarczycy lub wysepek trzustkowych – kolagenazą.

149
 • Rozdzielanie heterogennej populacji komórek np. komórek krwi:
◦ Wirowanie w gradiencie gęstości – komórki rozdzielane zgodnie ze
stałą sedymentacji.
◦ Przepuszczanie przez kolumnę magnetyczną wypełnioną kulkami
z odpowiednimi przeciwciałami – komórki rozdzielane zgodnie z ich
powierzchniowymi markerami (MACS – magnetic assisted cell
sorting)

Zahamowanie kontaktowe.
• Zjawisko hamowania podziałów komórek przy zetknięciu się komórek ze
sobą, obserwowane w hodowlach komórkowych prowadzonych na
podłożach stałych.
• Rezultatem jest hodowla składająca się z jednej warstwy komórek
stykających się z podłożem. W tym punkcie prawidłowe komórki
przestają się dzielić. Zawierają kontaktinhibinę – glikoproteinę
występującą w błonie komórkowej i CiR – jej receptor.
• Połączenie receptora z ligandem powoduje zmiany w układzie kinaz
zależnych od cyklin (brak aktywności kompleksu CDK4 z cykliną D),
co prowadzi do zahamowania podziałów komórkowych.
• W komórkach stransformowanych brak CiR.

Limit Hayflicka
• Ludzkie prawidłowe fibroblasty młodego osobnika w hodowli
przechodzą kilkadziesiąt (40-60) podwojeń populacji (skracanie
telomerów).
• Chromosomy liniowe są mniej stabilne niż koliste, ale warunkują
rekombinacje. Końce 3’ oraz 5’ są podatne na działanie enzymów
degradujących DNA, a także chromosomy liniowe mogą ulegać fuzji.
• Uszkodzeniom chromosomów zapobiegają telomery.

Przygotowanie komórek do badań in situ

1. Utrwalenie – zapobiega autolizie. Stosuje się do tego aldehydy,
alkohole, kwasy organiczne, sole metali ciężkich i mikrofale. Powoduje
to inaktywację większości enzymów. Najpowszechniej stosowana jest
formalina (dla mikroskopu świetlnego) i aldehyd glutarowy (dla
elektronowego). Stosuje się też zamrożenie, można je wtedy
przechowywać, w odpowiednich warunkach komórki zachowują
żywotność po rozmrożeniu.
2. Zatapnianie – materiał przepaja się substancją, która zostaje utwardzona
(parafina, żywice akrylowe, epoksydowe).
3. Krojenie – na skrawki (1-10 µm, dla świtlnej, 20-50 nm dla
elektronowej).

150
Elektroforeza białek i kwasów nukleinowych
• Zjawisko poruszania się cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu
elektrycznym dzięki różnicy ładunków i szybkości wędrówki w kierunku
bieguna pola. Szybkość zależy od wielkości, kształtu cząsteczki
i lepkości środowiska.
• Jeśli wykonuje się ją na podłożu stałym to przez wycięcie można
wyizolować wyodrębnioną substancję.
• DNA rozdziela się na żelach agarozowych, przed tym procesem
rozdziela się ja na krótkie odcinki nukleazami restrykcyjnymi.
• Białka rozdziela się najczęściej na żelu poliakrylamidowym w obecności
dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). SDS jest anionowym
detergentem powoduje:
◦ Rozdzielenie kompleksów białkowych na pojedyncze cząsteczki
które są denaturowane (rozwinięte w linearny łańcuch
polipeptydowy).
◦ Przyłącza się do aminokwasów łańcucha nadając mu ładunek
ujemny, jego wartość zależy od liczby aminokwasów (masy
cząsteczkowej białka).
• Mostki dwusiarczkowe (S-S) są redukowane przez merkaptoetanol.
• Elektroforeza tej mieszaniny powoduje rozdział zależny od masy.
• Największą efektywność w rozdzielaniu mieszaniny wielu białek
wykazuje elektroforeza dwukierunkowa. Pozwala na wyodrębnienie
ok. 1000 białek z jednej próbki.
◦ W pierwszym etapie oznacza się ogniskowanie izoelektryczne
(elektroforezę w gradiencie pH – białko zatrzymuje się w wartości
odpowiadającej jego Pi).
◦ Tak rozdzielone białka traktuje się SDS-PAGE, a kierunek
ogniskowania jest prostopadły do poprzedniego.

Identyfikacja rozdzielonych białek i kwasów nukleinowych

• Wykorzystuje się do tego blotting, metodę dla DNA opracował
E. M. Southern – stąd nazwa Southern blotting.
• Polega na przeniesienie rozdzielonych podczas elektroforezy cząsteczek
z żelu (przez odciśnięcie w obecności roztworu ekstrakcyjnego) na błonę
nitrocelulozową lub nylonową – zachowuje rozmieszczenie, ale jest
lepszym podłożem do identyfikacji. Dokonuje się jej przez inkubację
błony w roztworze zawierającym znakowane swoiste substancje.
• Sondy i przeciwciała są znakowane izotopami lub znacznikami
fluorescencyjnymi. Ostatnim etapem jest uwidocznienie miejsca
wiązania sondy (dla izotopów nakłada się emulsję światłoczułą, dla
przeciwciał reakcje barwne cytochemii).
• Pozwala na identyfikacje substancji gdy jest ich 10 pg.

151
Southern Wykrywa pojedyncze łańcuchy DNA, stosuje się znakowane sondy
DNA i RNA.
1. Cięcie DNA enzymami restrykcyjnymi.
2. Elektroforeza DNA.
3. Denaturacja alkaliczna DNA.
4. Transfer na błonę nitrocelulozową lub nylonową
5. Dodanie wyznakowanej sondy.
Southwestern blot – identyfikacja białek wiążących DNA poprzez
ich zdolność do łączenia się z sondami DNA. Białka są poddawane
elektroforezie i transferowane na błonę
Northern Wykrywa RNA, stosuje się znakowane sondy RNA lub DNA.
Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów
ulegających transkrypcji w komórce. RNA poddaje się
elektroforezie na żelu, po rozdziale RNA przenosi się na
odpowiednią membranę, którą inkubuje się z sondą DNA lub RNA,
następnie przeprowadza detekcję (uwidacznianie sondy), która
związała się do poszukiwanej sekwencji RNA na membranie.
Western Wykrywa białka, stosuje się swoiste znakowane przeciwciała.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z SDS-PAGE. Różne
metody detekcji przez stosowanie przeciwciał różnie
wyznakowanych (metoda kolorymetryczna, chemiluminescencyjna,
fluorescencyjna).

Manipulowanie DNA
• Może być cięte przez nukleazy restrykcyjne – enzymy bakteryjne
przecinające DNA w ściśle określonych miejscach.
• Powstałe fragmenty można dowolnie łączyć tworząc rekombinowany
DNA.
• Odcinki DNA można klonować, przez włączenie ich do plazmidów
i hodowlę bakterii. Powstają w ten sposób biblioteki DNA. Genomowe
biblioteki DNA zawierają DNA z intronami, biblioteki cDNA, powstają
przez klonowanie DNA wytworzonego przez odwrotne transkryptazy
na mRNA, zawierają tylko eksony.
• DNA zawierający określone geny może być sztucznie wprowadzony do
komórki – transfekcja. Do procesu wykorzystuje się wirusy
z włączonymi do ich DNA obcymi genami, oraz metody zwiększające
przepuszczalność błony co pozwala bezpośredniego wprowadzić DNA
(eletro-, sonoporacja). Do komórki można też wstrzeliwywać
nanocząsteczki złota z przyłączonym DNA.
• Transfekcja zarodkowych komórek macierzystych i ich wszczepienie do
blastocysty prowadzi do wyhodowania zwierząt transgenicznych.

152
Sekwencjonowanie DNA
• Wg metody Sanger przeprowadza się w procesie syntezy
komplementarnego łańcucha DNA z udziałem polimerazy DNA
w obecności znakowanych dideoksynukleotydów (homologi
nieumożliwiające dalsze wydłużanie). Uzyskuje się wiele fragmentów
o różnej długości, a każdy jest zakończony znakowanym
dideoksynukleotydem.
• Przeprowadza się jednocześnie 4 reakcje, w każdej uczestniczy inny
dideoksynukleotyd z dołączonym odrębnym znacznikiem. Następnie
rozdziela się je elektroforetycznie, a ich rozkład umożliwia oczytanie
sekwencji.
• Wszystkie etapy zachodzą w zautomatyzowanych sekwencerach.
W ostatnich latach wprowadzone szybsze modele działające na innych
zasadach – sekwencjonowanie następnej generacji.

Hybrydyzacja kwasów
• Pod wpływem wysokiej temperatury następuje rozdzielenie nici DNA
(denaturacja), jednoniciowe odcinki kwasów nukleinowych łączą się
gdy są komplementarne – hybrydyzacja.
• Pozwala na identyfikację określonych sekwencji RNA i DNA przy
pomocy sond – zsyntezowane odcinki DNA o komplementarnej
sekwencji nukleotydów, znakowane chemicznie lub izotopami.
• Pozwala na wykrycie konkretnych genów, liczbę kopii, oraz przez
badanie mRNA poziom ekspresji.
• Jednoczesną identyfikację i analizę ekspresji tysięcy genów umożliwiają
mikromatryce DNA. Na płytkach są umieszczone w regularnym
układzie tysiące sond odpowiadających poszczególnym genom, pokrywa
się je odcinkami DNA lub cDNA wyznakowanych fluorochromami.
W miejscu gdzie zaszła hybrydyzacja dochodzi do fluorescencji, jest ona
odczytywana przez zautomatyzowane skanery mikromatryc.

PCR (polymerase chain reaction)

• Metoda umożliwiająca wykrycie i identyfikację śladowych ilości
kwasów nukleinowych. Wykorzystuje polimerazę temperaturooporną
(Taq), polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA
identycznego pod względem sekwencji z wykrywanym odcinkiem, liczba
syntezowanych odcinków narasta wykładniczo.
• Dla RNA przeprowadza się RT-PCR, w pierwszym etapie wprowadza się
odwrotna transkryptazę.

153
 • Real-Time PCR – ilościowa ocena ekspresji genu. Pomiar po każdym
cyklu, obliczenia, znakowane sondy lub primery (odpowiednia
sekwencja DNA). Fluorescencyjny barwnik (R), i wygaszacz (Q) są
doczepione do końców 5’ i 3” sondy. Gdy sonda jest nienaruszona emisja
fluorescencji jest wygaszona. Podczas każdego cyklu polimeraza DNA
odcina R od sondy. Wtedy następuje emisja fluoerscencji
charakterystyczna dla barwnika.

Metody pomiaru stężeń

• Za pomocą mikromanipulatora można, przez przebicie błony
komórkowej umieścić w cytoplazmie mikroelektrodę z filtrem
przepuszczającym tylko określone jony, reaguje ona na zmianę ich
stężenia.
• Inne elektrody wykorzystuje się w technice łatkowej (patch-clamp),
umożliwia badanie pojedynczych kanałów jonowych. Elektrody
przywierają do błony bez przebijania. Jeżeli w tym obszarze znajduje się
kanał to elektroda bada przepływ. Można też oderwać fragment błony
przywarty do elektrody i badać aktywność kanału pozakomórkowo.

Badania mikroskopowe

Mikroskopy świetlne
• Wykorzystuje 3 składniki układu optycznego: kondensor, obiektyw
i okular do wytworzenia pozornego, odwróconego i powiększonego
obrazu.
• Jego zdolność rozdzielcza (najmniejsza odległość między dwoma
wyodrębnionymi punktami) to 0.2 µm.
Fazowo- Pozwala na przekształcenie przesunięć fazy w zmiany
kontrastowy amplitudy – kontrastuje sktruktury które normalnie są
przejrzyste. Umożliwia obserwacje komórek żywych,
których zabarwienie powoduje śmierć.
Interferencyjny Korzysta z interferencji promieni przechodzących przez
preparat, daje podobne możliwości co fazowo-kontrastowy.
Najlepsze quasi-trójwymiarowe obrazy daje kontrast
interferencujno-różnicowy Nomarskiego (DIC).
Fluorescencyjny Wykorzystuje ultrafiolet jako źródło światła, jest stosowany
do wykrywania fluorochromów wprowadzonych do
komórek. Dzięki wyraźnemu sygnałowi można
zaobserwować substancje zawierające niewielkie ilości
barwnika, a nawet struktury o rozmiarach mniejszych niż
zdolność rozdzielcza.

154
 • Standardowym wyposażeniem mikroskopu jest też aparat fotograficzny
i komputer.
Kofokalny Źródłem światła są lasery emitujące określony zakres
(współogniskowy) widma, skanuje ono preparat (z dużą szybkością przesuwa
się wzdłuż określonych linii) wzbudzając fluorescencje
całej próbki. Układy optyczne kondensora i obiektywu mają
wspólną ogniskową w płaszczyźnie preparatu więc
oświetlana jest cienka warstwa (0,1-1 µm) z której
obiektyw formuje ostry obraz. Obecność wąskiej przesłony
pozwala eliminować promienie spoza warstwy. Obraz jest
rejestrowany przez detektor i zamieniany w formę cyfrową.
Zmniejszając odległość obiektywu od aparatu można
przeglądać jego kolejne warstwy.
Dwufotonowy Wykorzysuje efekt dwufotonowy, jeżeli cząsteczka
fluorochromu jednocześnie (w czasie 10-8) pochłonie dwa
fotony spójnego światła o niższej energii to sumują się one
wywołując fluorescencje. Prawdopodobieństwo rośnie
z gęstością oświetlenia (mocne zogniskowanie światła).
W ognisku gęstość będzie wystarczająca by wywołać efekt.
Źródłem światła jest laser wysyłający pulsy podczerwieni
zogniskowane przez obiektyw. Ponieważ wiązki są bardzo
małe to światło widzialne jest emitowane wyłącznie z jednej
cienkiej warstwy preparatu i nie potrzeba eliminować
promieni z innych warstw.
TIRF Umożliwia uwidocznienie pojedynczych cząstek (np.
(Fluorescencji białek). Wykorzystuje falę zanikającą, powstającą przy
całkowitego oświetlaniu preparatu pod takim kątem pod którym światło
wewnętrznego na granicy preparatu ulega całkowitemu odbiciu. Ma ona
odbicia) mały zasięg (100-200 nm) i z tego obszaru emitowana jest
fluorescencja.

Mikroskopy elektronowe
• Wykorzystuje do tworzenia obrazu strumień elektronów (fala o bardzo
niskiej długości). Zdolność rozdzielcza wynosi od 0,2 do 5 nm. Pozwala
to ukazać nawet pojedyncze białka.
• Strumień elektronów jest wytwarzany w procesie termoemisji lub emisji
polowej przez działo elektronowe, przyspieszany w polu elektrycznym,
a następnie uginany elektromagnetycznie w kondensorze, obiektywie
i projektorze.
• Wszystkie elementy są umieszczone w kolumnie próżniowej (tylko
w niej można formować wiązkę elektronów).

155
Transmisyjny Strumień przechodzi przez preparat w którym kontrastowane
związkami metali ciężkich struktury pochłaniają elektrony.
Obraz pada na ekran pokryty warstwą substancji fluoryzującej
– powstaje monochromatyczny obraz.
Skaningowy Daje prawie trójwymiarowy obraz, ale o niższej rozdzielczości.
Bardzo wąski skupiony przez kondensor i obiektyw strumień
elektronów skanuje powierzchnię preparatu pokrytą warstewką
metalu ciężkiego (złota, platyny). Elektrony odbijają się od
powierzchni i są wychwytywane przez detektor zlokalizowany
powyżej preparatu. W danym momencie liczba elektronów
trafiających do detektora zależy od kąta nachylenia
skanowanego fragmentu padającej wiązki.

Metody stosowane w mikroskopii elektronowej

• W rozmazach niewielkich struktur (białka, organelle, wirusy, kwasy
nukleinowe itp.), do zobrazowania kształtu stosuje się barwienie
negatywowe.
• Cieniowanie – pokrycie preparatu warstwą (1-2 nm) platyny
napylanego pod pewnym kątem, co powoduje zróżnicowanie grubości
zależne od kształtu pokrytych struktur. Warstewka jest wystarczająco
cienka by elektrony mogły przeniknąć, a zróżnicowania grubości
powodują powstanie plastycznego obrazu. Warstewka oddzielona od
powierzchni preparatu to replika.
• Mrożenie i łamanie – używana głównie do badania błon biologiczych.
Materiał zamraża się, a następnie w warunkach próżniowych przełamuje,
a z powierzchni przełomu sporządza repliki. Komórki przełamują się
wzdłuż płaszczyzn najmniejszego oporu (fosfolipodowe dwuwarstwy
błon). Pozwala na badanie rozmieszczenia białek błonowych (cząstki na
tle gładkiej powierzchni lipidów), oraz strukturę kompleksów.
◦ Mrożenie i głębokie rytowanie (deep etching) – materiał cieniuje się
dopiero po kilku minutach od przełamania. Pod wpływem próżnie
dochodzi do sublimacji wody i odsłonięcia głębiej ulokowanych
struktur.

Cytochemia
• Wszystkie współczesne metody cechują się swoistością.
• Klasyczna cytochemia – komórki lub skrawki tkanek umieszcza się
w roztworze zawierającym odpowiednio dobrane substraty dla reakcji
cytochemicznej (z wykrywanym w komórkach związkiem), jej wynikiem
jest barwny lub gęsty elektronowo, nierozpuszczalny produkt którego
lokalizacja określa miejsce występowania substancji.

156
 • Z reguły ma ograniczoną swoistość i pozwalają na wykrywanie
spokrewnionych grup związków, a nie ściśle określonych związków.
Najbardziej popularne metody: PAS (obojętne wielocukrowce), reakacja
Feulgena (wykrywa DNA), FIF (fluorescencja indukowana
formaldehydem wykrywająca aminy biogenne).
• PAS (periodic acid–Schiff ) – wykrywanie wielocukrów. Wielocukry,
kwas nadjodowy (utlenianie grup glikolowych), grupy aldehydowe,
odczynnik Schiffa (bezbarwna fuksyna zasadowa), czerwone zabarwienie
odczynnika Schiffa (glikogenozy, nowotwory).
• Cytochemia enzymów – reakcje wykrywają nie enzym ale aktywność,
komórki inkubuje się w roztworze zwierającym określone substraty takie
by produkt był nierozpuszczalny i barwny. Swoistość zależy od
swoistości substratowej enzymów i nie pozwala wykryć izoenzymów.
Najczęściej stosowana do wykrywania enzymatycznych znaczników
przeciwciał i lektyn. Czasem stosuje się je w diagnostyce
histopatologiczej.

Immunocytochemia
• Opiera się na wiązaniu antygenu z przeciwciałem (wiąże ono część
konkretnego antygenu – epitop, będącego białkiem). Pozwala na
wykrywanie pojedynczych rodzajów białek.
• Komórki inkubuje się w roztworach zawierających przeciwciała, miejsce
wiązania wyznacza lokalizację antygenu.
• Przeciwciała są znakowane:
◦ Fluorochromami (immunoflorescencja).
◦ Enzymami (peroksydaza, fosfataza zasadowe) – ich lokalizacja
uwidacznia dodatkowa reakcja enzymatyczna.
◦ Metalami ciężkimi (złoto koloidalne, ferrytyna) – widoczne
w obrazie mikroskopu elektronowego w postaci ziarenek.
◦ Izotopami (np. 3H, 125J, 35P, 14C).
• Przeciwciała uzyskuje się przez immunizację zwierząt, podaje się
antygen, a po pewnym czasie izoluje z osocza przeciwciała. Są one
poliklonalne (niższa swoistość, wiążą wiele epitopów), albo
przeprowadza się selektywną hodowlę komórek wytwarzających jedno
przeciwciała, a potem izoluje się je z płynu hodowlanego
(monoklonalne).
• Wyróżnia się metody bezpośrednie, pierwsze przeciwciało ze
znacznikiem, lub metody pośrednie (wielostopniowe):
◦ Z użyciem dalszych przeciwciał (znakowanych, lub
nieznakowanych).
◦ Bez użycia dalszych przeciwciał (np. streptawidyna-biotyna).

157
Wykrywanie i ocena ilościowa białek testem ELISA
• Test immunoenzymatyczny, wykrywanie i ocena ilościowa białek
z użyciem przeciwciał związanych z enzymem.
• Dno płytki jest pokryte przeciwciałami wychwytującymi. Do próbki
z badanym białkiem dodaje się przeciwciała sprzęgnięte z enzymem.
• Bezbarwnego substratu przekształca się w barwny produkt, intensywność
barwy zależy od ilości badanego białka, następnie dodaje się roztwór
stopujący reakcję, odczytuje absorpcję.

Cytochemia lektyn
• Grupa glikoproteidów, da się je wyizolować z tkanek roślinnych
i zwierzęcych, swoiście wiążą się z resztami cukrowcowymi.

Hybrydocytochemia
• Umożliwiają wykrycie pod mikroskopem odcinka RNA lub DNA
o określonej sekwencji nukleotydów. Określana hybrydyzacją in situ.
• Sekwencja wykrywanego odcinka musi być znana, syntezuje się
komplementarną sondę RNA lub DNA i znakuje się ją fluorochromami,
znacznikami antygenowymi, lub izotopami.
• Materiał poddaje się najpierw działaniu temperatury, następuje
denaturacja. Następnie inkubuje się skrawki lub komórki w roztworze
sondy. Na koniec uwidacznia się znacznik sondy (fluorochromy,
immunocytochemicznie, FISH – fluorescent in situ hybridization).
• Pozwala na wykrycie genów, lub ich fragmentów, oraz ich lokalizacji
w chromosomach, badanie ekspresji (przez mRNA) oraz identyfikację
obcych kwasów nukleinowych.
• Ma zastosowanie w tworzeniu map genowych, diagnostyce chorób
dziedzicznych i wirusowych oraz w badaniu genetycznego podłoża
nowotworów.
• Jeżeli ilość kwasu jest zbyt mała to stosuje się PCR in situ.
• Hybrydyzacja in situ – wykrywanie sekwencji kwasów nukleinowych
w komórkach. Wykorzystuje zdolności wiązania się jednoniciowych
odcinków kwasów nukleinowych na zasadzie komplementarności, używa
się sody molekularnej wyznakowanej izotopowo lub nieizotopowo
(fluorescencja, biotyna+awidyna, enzymy, digoksygenina).

Znaczniki i wskaźniki wprowadzane do żywych komórek

• Istnieją znaczniki różnych organelli komórkowych, znakujące je
w swoisty sposób przez wiązanie z charakterystycznymi dla nich
związkami chemicznymi lub przez uczestnictwo w toczących się
procesach metabolicznych.

158
 • Pewne substancje fluoryzujące i peroksydaza (uwidaczniana reakcją
cytochemiczną) służą do wykrywania komunikacji międzykomórkowej,
śledzenia procesów absorpcji, endocytozy, trawienia
wewnątrzkomórkowego, przebiegu wypustek i lokalizacji perykarionu
(tracing – śledzenie, podawanie znacznika w zakończeniu nerwowym).
• Niektóre niskocząsteczkowe fluoryzujące substancje wprowadzane do
komórek zmieniają intensywność lub barwę zależnie od wartości
potencjału błonowego. Można więc dzięki nim monitorować zmiany
stężenia jonów, pH, wahania potencjału.
• Nie wszystkie znaczniki mają zdolność do przechodzenia przez błony
komórkowe, niektóre dostają się przez endocytozę lub zostają
wprowadzone mikroiniekcją, lub za pośrednictwem liposomów.

FRET (fluroescence resonance energy transfer)

• Zjawisko polegające na przekazaniu energii emitowanej przez jedną
cząsteczkę fluorochromu cząsteczce innego. Jest możliwe tylko gdy
cząsteczki znajdują się <10 nm od siebie.
• Polega na znakowaniu substancji wewnątrzkomórkowych dwoma
różnymi fluorochromami tak że długość fali emitowanej przez pierwszy
odpowiada długości fali zbudzającej drugi.
• Przy ekspozycji na światło wzbudzające fluorescencje pierwszego będzie
on ją emitował dopóty, dopóki nie dojdzie do kontaktu z drugim (wtedy
nastąpi transfer energii, a zmiana barwy będzie dostrzegana pod
mikroskopem).
• Pozwala na śledzenie interakcji między pojedynczymi cząstkami
związków (zmiany konformacyjne, wiązanie ligandów, polimeryzacja,
depolimeryzacja, fuzje błon).

Genetyczne znakowanie białek

• Pozwala śledzenie znakowanych białek w żywych komórkach.
Wykorzystuje się niskocząsteczkowe zielono fluoryzujące białko (GFP)
występujące w pewnym gatunku meduzy.
• Stosując rekombinację gen GFP można połączyć z genem kodującym
badane białko, a następnie spreparowane DNA wprowadzić do komórki
• Udało się uzyskać metody GFP emitujące różne barwy co pozwala
śledzić jednocześnie wiele białek.
• Znakowanie GFP jest wykorzystywane do badań procesów przepływu
białek, sekrecji, przemieszczania receptorów i cząsteczek sygnałowych,
różnicowania komórek.
• Może pełnić funkcję genu reporterowego (uwidacznia ekspresję innych
badanych genów).

159
Autoradiografia
• Metoda wyrywania izotopów promieniotwórczych przez zaczernianie
emulsji światłoczułych.
• Wprowadzone do żywej komórki sztucznie wytwotworzonych związków
chemicznych z izotopami uczestniczących w procesach metabolicznych
pozwala na śledzenie dynamiki procesów i udziału poszczególnych
organelli.
• Polega na pokryciu gotowego preparatu warstwą emulsji światłoczułej.
Promieniowanie (zwłaszcza β) powoduje wytrącanie się ziarenek
metalicznego srebra widocznych w mikroskopie świetlnym
i elektronowym.
• Obecnie używa się do wykrywania znakowanych sond.

Cytometria przepływowa
• Metoda ilościowej oceny właściwości fizycznych i chemicznych
komórek które pojedynczo przepływają przez miejsce pomiaru
przecinając wąski strumień światła. Zostaje on rozproszony zależnie od
wielkości komórki, jej kształtu oraz właściwości optycznych cytoplazmy
(zabarwienia, konsystencji), wywołuje świecenie fluorochromów.
• Komórki pojedynczo przechodzą przez wiązkę światła lasera.
◦ FSC (forward-scattered light) jest proporcjonalne do rozmiaru
i pola powierzchni komórki.
◦ SSC (side-scattered light) jest proporcjonalne do ilości ziarnistości,
pęcherzyków i komplikacji układu błon wewnątrzkomórkowych
• Używa się zawiesin komórkowych, a odczyty są zliczane i analizowane
przez komputer.
• Oznacza 104 komórek podczas jednego badania.
• Cytometr przepływowy umożliwia wytworzenie z zawiesiny tak
cienkiego strumienia że komórki przepływają szeregowo. Światło
emitowane przez laser.
• Może być wyposażony w sortownik komórek dzielący na 3 grupy
(w zależności od wyniku otrzymują ładunek dodatni, ujemny lub
zerowy).
• Pozwala na badanie kształtu, żywotności, apoptozy, zawartości DNA,
poliplodalność, obecność genów, białek, cukrowców, przepuszczalność
błon, aktywność receptorów, pH, stężenie jonów.
• Wykorzystywana do diagnostyki rozrostowych chorób krwi, zaburzeń
układu immunologicznego i do oceny właściwości komórek
nowotworowych.

160
 SPIS TREŚCI

Błony biologiczne i transport przez błony.....................................1

Cytoszkielet...................................................................................18
Wybrane procesy cytoplazmatyczne.............................................28
Organizacja i funkcjonowanie jądra komórkowego..................... 44
Komunikacja międzykomórkowa................................................. 64
Cząsteczki adhezyjne....................................................................75
Komunikacja cd. …...................................................................... 79
Cykl komórkowy...........................................................................85
Starzenie tkanek............................................................................95
Apoptoza.......................................................................................107
Różnicowanie i komórki macierzyste...........................................117
Kancerogeneza..............................................................................130
Terapia nowotworów.....................................................................139
Badanie budowy i funkcji komórek..............................................148

..
161