Professional Documents
Culture Documents
Bai 2 Vector Host
Bai 2 Vector Host
2
THỂ MANG GEN (VECTOR) VÀ TẾ BÀO CHỦ
3
NỘI DUNG
-Plasmid vectors
-Phage vectors
-Cosmids
-Phagemids
-Vectors sử dụng trong nấm men
-Vectors sử dụng trong tế bào động vật hữu nhũ
-Vectors sử dụng trong tế bào động vật không xương
sống
-Vectors sử dụng trong tế bào thực vật
-Chủng chủ E. coli
4
Theå mang gen: vector
- Vector: phaân töû DNA kích thöôùc nhoû duøng ñeå mang
gen, sao cheùp, thao taùc treân gen
- Ñaëc ñieåm:
+ Coù trình töï ñieàu khieån sao maõ ñoäc laäp
+ Mang gen chæ thò cho quaù trình saøng loïc hoaëc tuyeån
choïn
+ Coù theå ñöôïc thu nhaän vôùi soá löôïng lôùn töø teá
baøo
5
Theå mang gen: vector
+ Vector taïo doøng: chuyeån vaø löu tröõ gen taùi toå hôïp trong
teá baøo chuû, nhaân baûn, thao taùc, phaân tích sau ñoù treân
DNA taùi toå hôïp seõ deã daøng hôn
+ Vector bieåu hieän: taïo saûn phaåm cuûa gen taùi toå hôïp ôû
möùc phieân maõ, dòch maõ, phaân tích trình töï ñieàu hoøa söï
bieåu hieän cuûa gen
1. Vector dùng cho Escherichia coli
Plasmid vectors
Phage vectors
Cosmids
Phagemids
7
Plasmid
- Yếu tố di truyền DNA độc lập hiện diện trong tế bào chủ
- Chứa một vài gen cần cho tế bào chủ
8
Plasmid mang gen
kháng kháng sinh
9
Phân loại plasmid tự nhiên
- Plasmid F (fertility): chứa gen tra tạo pilus cần cho quá trình tiếp hợp
(plasmid F ở E. coli)
- Plasmid R (resistance): chứa các gen kháng kháng sinh, có vai trò
quan trọng trong lan truyền tính kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh
(plasmid RP4 ở Pseudomonas)
- Plasmid Col: chứa gen mã hóa protein colicin tiêu diệt các vi khuẩn
khác (ColE1 ở E. coli)
- Plasmid phân hủy (degradative plasmid): mang gen giúp thủy phân
các hợp chất dị sinh (TOL ở Pseudomonas putida)
11
Plasmid tiếp hợp và plasmid được vận chuyển
- Plasmid tiếp hợp: plasmid có
thể chuyển từ tế bào (donor)
cho qua tế bào nhận
(recipient) trong quá trình tiếp
hợp: chứa oriT, tra (tạo pilus),
mob (tạo protein chuyển)
- Plasmid được vận chuyển:
chứa oriT, mob, thiếu gen tra;
chỉ chuyển từ tế bào cho sang
tế bào nhận nhờ một plasmid
tiếp hợp
- Đa số plasmid tự nhiên thuộc
nhóm được vận chuyển
12
Tính không tương thích, nhóm không tương thích
- Tính không tương thích: hai plasmid khác nhau là không tương
thích nhau khi không thể cùng tồn tại bền vững trong cùng một tế
bào khi không có áp lực chọn lọc
- Hai plasmid khác nhau có thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào
được gọi là tương thích với nhau
- Các plasmid không tương thích nhau được xếp chung vào một
nhóm không tương thích:
+ hai plasmid khác nhau trong cùng nhóm không tương thích thì
không có thể cùng tồn tại chung trong tế bào
+ hai plasmid khác nhau có thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào
khi thuộc hai nhóm không tương thích khác nhau
+ các plasmid thuộc các nhóm không tương thích khác nhau:
ColE1, p15A, pSC101, F, R6K, RP4
13
Plasmid sát nhập và không sát nhập
- Sát nhập
(intergrative plasmid,
episome): có khả năng
sát nhập, gắn vào bộ
gen của tế bào chủ
14
Kích thước các loại plasmid
15
Số lượng bảo sao plasmid trong một tế bào
- Số bản sao thấp: 1-2/tế bào (mini-F, pSC101)
- Số bản sao trung bình: 2-10/tế bào (pACYC177, 184)
- Số bản sao cao: 20-50/tế bào (pBR322)
- Số bản sao rất cao: ~100/tế bào (pUC plasmids)
16
Dải (biên độ) tế bào chủ
- Hầu hết plasmid có dải tế bào chủ rất hẹp: chỉ nhân
bản được trong chỉ vài loài tế bào chủ gần nhau
17
Vector tạo dòng là plasmid
- Tất cả plasmid vector đều là dạng biến đổi của plasmid tự nhiên
- Được chuyển vào tế bào bằng sự biến nạp
- Tự sao chép độc lập với bộ gene tế bào chủ
- Một số ở trạng thái đa bản sao làm tăng số lượng DNA tái tổ hợp trong
tế bào
- Mang các dấu hiệu
di truyền chọn lọc
- Có multiple cloning site
- Cấu trúc cho phép tạo
đột biến, bất họat chèn
dành cho mục đích
chọn lọc
18
19
20
21
22
Plasmid vector
có nguồn gốc từ
ColE1
- pBR322
- pUC
- pGEM3Z
23
Plasmid pBR322
- Vector đầu
tiên từ ColE1
- Do Bolivar
và Rodinguez
thiết lập
- Đa bản sao
24
Plasmid pUC18/19
- Rất nhiều bản sao (500-700)
- Chứa PCS tương tự như M13 giúp dễ giải trình tự và tạo đột biến
- Sàng lọc bằng bất hoạt chèn
25
Polycloning site của pUC
26
pGEM3Z
- Dẫn xuất của pUC
- Chứa hai promoter giúp
cho sự biểu hiện của gen
- Khi bổ sung RNA
polymerase, plasmid này
có thể tạo ra mRNA
27
Bacteriophage (Phage) và Phage vectors
- Phage
- Phage P1
- Phage M13
28
So sánh vector theo kích thước DNA mục tiêu
- M13: nhỏ hơn 3kb
- Plasmid: nhỏ hơn 8kb (trừ plasmid từ F – BAC)
- Phage : đến 20kb
- Phage P1: đến 100kb
- Plasmid từ F (BAC): đến 300kb
- Vector mang được đoạn gen lớn cần cho việc thiết lập các
ngân hàng gen
29
Hai dạng cấu trúc phổ biến của Phage
30
Phage
- ds DNA thẳng, 49kb, hai đầu
dính: cos site
- Trong tế bào DNA đóng vòng
nhờ cos site
- Phage ôn hòa: prophage gắn vào
DNA bộ gen tế bào chủ
31
Sự đóng vòng DNA của sau khi vào tế bào chủ
32
Phage và sự gắn vào bộ gen của vi khuẩn
33
Đặc điểm sao mã và đóng gói tạo các mới
34
Nhược điểm
của trong
tạo dòng
- Kích thước bộ
gen tái tổ hợp
không được quá
5% so với bộ
gen tự nhiên
- Chứa nhiều
trình tự nhận
diện của RE
35
Đột biến ở
- Loại bỏ vùng gen không cần cho chu trình tan của phage
- Chọn lọc dạng đột biến tự nhiên không chứa trình tự nhận diện của
RE
36
Chọn lọc đột
biến không chứa
trình tự nhận
diện của EcoRI
37
38
Vector chèn ( Insertion vector)
- Vector (35 – 40kb) mất vùng gen không cần cho chu trình tan
- Chứa ít nhất một trình tự nhận diện của RE để cắt và chèn gen
mục tiêu vào vector tạo vector tái tổ hợp
- Có thể mang đoạn gen mục tiêu 8 - 10kb
39
Vector chèn: gt10, ZAPII
- gt10: 8kb gen mục tiêu, chèn vào EcoRI ở gen cI, chọn lọc dòng
tái tổ hợp dựa trên kiểu hình vệt tan trong
- ZAPII: 10kb gen mục tiêu, được chèn vào vùng MCS của lacZ‘,
chọn lọc dòng tái tổ hợp dựa trên vệt tan xanh-trắng
40
41
42
Vector thay thế ( Replacement vector)
- Chứa hai trình tự nhận diện của 2 RE khác nhau nằm hai bên vùng
gen không cần thiết của
- Có thể mang đoạn gen mục tiêu 20kb, được thay vào vùng gen bị
cắt
43
Vector thay thế: EMBL4, GEM11
- EBBL4: 20kb gen mục tiêu, thay thế vào đoạn giữa các vị trí R,
B, S, chọn lọc dòng tái tổ hợp dựa trên kích thước bộ gen
- GEM11, 12: 23kb gen mục tiêu, chứa vùng PCS, chọn lọc
dòng tái tổ
hợp dựa
trên kích
thước bộ
gen
44
45
Tạo dòng bằng vector dạng vòng
- Vector ở dạng vòng được dùng để tạo dòng với qui trình tương tự
như vector plasmid
46
Tạo dòng bằng vector dạng thẳng
- Cắt vector dạng thẳng để tạo thành vai trái và vai phải
- Trộn với gen mục tiêu đã được xử lý bằng RE tương ứng và thực hiện phản
ứng nối
- Bổ sung các protein cần cho sự nạp gen in vitro (in vitro packaging)
- Chọn lọc
dòng có
sự tái tổ
hợp đúng
thông qua
nhiễm nạp
vào tế bào
chủ
47
Phage ôn hòa P1
- ds DNA thẳng, 110kb, hai đầu có vùng
trùng lắp (redundant)
- Trong tế bào DNA đóng vòng nhờ các
đầu trùng lắp
- Sao chép theo cơ chế cuộn vòng
- Phage ôn hòa: prophage ở dạng vòng
không gắn vào DNA bộ gen tế bào chủ
- Bộ gen được nạp theo cơ chế „nạp đầy“
(headful packaging):
+ Pacase của P1 cắt concatemer
+ Protein vỏ (đầu) nhận diện và gắn vào trình tự pac, bắt đầu nạp
bộ gen từ đầu gần pac cho đến khi đầy vỏ (110kb)
+ Concatemer bị cắt và bắt đầu một quá trình nạp (packaging mới)
48
P1 vector: pAd10
- P1 vector: plasmid pAd10, chứa hai trình tự loxP cùng chiều, pac,
plasmid ori, phage ori, KanR, đoạn đệm (stuffer)
- Dùng với E. coli chứa Cre
- Cho phép mang đoạn gen mục tiêu 75 - 100kb
loxP
Stuffer KanR
Sac
pac Bam
loxP
KanR
50
Qui trình tạo dòng
bằng P1 vector
51
Hình thành P1 dimer và cơ chế tách phụ thuộc loxP-Cre
53
Phage ôn hòa M13
54
Cấu trúc M13
56
Xâm nhiễm và nhân bản
của M13 trong E. coli
- Trong tế bào, hình thành
dsDNA, sau đó sao mã thành
ssDNA
- M13 thoát khỏi tế bào, không
làm tan tế bào chủ
- dsDNA của M13 được thu nhận
từ E. coli như thu nhận plasmid
- ssDNA của M13 được thu nhận
từ M13 trong dịch nuôi cấy
E. coli
- Có thể dùng làm vector nhằm
thu nhận DNA mục tiêu ở dạng
mạch đơn
57
Cơ chế sao mã của M13
58
Tạo vector
M13mp1,
M13mp2
- Chèn lacZ‘
vào M13
60
Tạo dòng bằng vector M13mp7 và sàng lọc xanh
– trắng
61
Thu nhận gen
mục tiêu từ
M13mp7 tái
tổ hợp
62
Cặp vector 2 chiều M13mp8/9
63
Chuyển chiều mạch DNA
từ M13mp8 sang M13mp9
64
Giải trình tự DNA bằng cặp
vector 2 chiều M13mp8/9
65
M13mp18/19
66
Vector Cosmid: pHC79
- Cosmid: cos +
plasmid
- Plasmid chứa
trình tự cos giúp
sự nạp gen vào vỏ
phage
- Có kích thước
nhỏ khoảng 5kb
nhưng có thể
mang DNA có
kích thước đến
45kb
- Thường được
dùng làm vector
để thiết lập ngân
hàng gen
67
Các bước trong tạo dòng bằng cosmid
69
Chuyển pEMBL8
thành ssDNA
- Đoạn 1.3kp M13 chứa
trình tự nhận diện của
enzyme tổng hợp
ssDNA
- Tổng hợp vector tái tổ
hợp dạng ssDNA:
nhiễm E. coli bằng
M13w để cung cấp
enzyme sao mã +
protein vỏ và biến nạp
bằng vector tái tổ hợp
- Mang được DNA đến
10kb
- Chọn lọc xanh – trắng
70
Phagemid tạo dòng và biểu hiện: pBluescript SK
71
Tế bào chủ
72
Teá baøo chuû
- E. coli:
+ Teá baøo chuû phoå bieán nhaát
+ Vi sinh vaät gaây beänh cô hoäi
+ Khoâng tieát enzyme
- Bacillus subtilis:
+ Khoâng gaây beänh, khoâng taïo noäi ñoäc toá, tieát protein
+ Pasmid khoâng oån ñònh trong teá baøo chuû
- Saccharomyces cerevisiae:
+ Teá baøo eukaryote ñöôïc nghieân cöùu di truyeàn kyõ nhaát
+ Söû duïng ñeå bieåu hieän gen eukaryote
- Viruùt ñoäng vaät (SV40, retrovirus…):
+ Duøng ñeå doøng hoùa gen vaøo teá baøo höõu nhuõ, cô cheá
tieàm tan
Establishment of transgenic flies by a P-element method
P5‘ white w w
duch-L1 dsRNA P3‘
Embryo microinjection
Drosophila chromosome w
P5‘ white P3‘
duch-L1 dsRNA
Insertion
Analysis 74