A mikrobiológiai laboratórium

felépítése, berendezései (GLP)

 A mikrobiológiai laboratórium felépítése

• Mikrobiológiai laboratórium „légzsilip” előtérrel

• Járulékos helyiségek:
 előkészítő,
 mérlegszoba, (táptalaj készítő és tároló )
 mosogató,
 sterilező.

A szűkebben értelmezett mikrobiológiai munka céljára

szolgáló steril övezetet el kell különíteni a már
elszaporodott mikroorganizmusokat tartalmazó edények
és eszközök kezelését szolgáló helyiségektől.
Mikrobiológiai vizsgálatokkal foglalkozó
laboratóriumokban zajló főbb
munkafolyamatok

Táptalaj főzés (és sterilezés)

Mintaelőkészítés
Leoltás
Inkubálás
Kiértékelés
Identifikálás
Sterilezés
Mosogatás
Eszközök sterilezése
Törzsfenntartás
 A táptalajkészítés és -tárolás berendezései

• Mérlegek

• Desztilláló berendezés vagy ioncserélő gyantát tartalmazó patron

• Főzőlap, vagy vízfürdő

• Hőmérsékletkompenzációs pH mérő

• Automata adagoló

• Hűtőszekrény
 Táptalajok típusai

- eredet (természetes, mesterséges, szintetikus)

•- halmazállapot (szilárd, folyékony, félfolyékony)

•- funkció (általános, szelektív, differenciáló)

 Mintaelőkészítés berendezései

• Homogenizáló berendezés:
– régebben un. forgókéses homogenizáló berendezés
– ma már (főleg az élelmiszer-mikrobiológiában) a Stomacher-készülék
alkalmazása az általános

• Rázókeverő

• Fagyasztó
 Mintaelőkészítés folyamata
• CÉL: összetétele ne változzon meg
• minta megfelelő hűtése (4 °C) közvetlenül a mintavételtől egészen a
vizsgálatig.
• mintavétel és a vizsgálat ideje között nem telhet el több, mint 24 óra
• reprezentatív minta legalább 200 g ill. ml
• A szilárd halmazállapotú minta:
– fel kell aprítani és összekeverni.
– az előkészített mintából 10  0,1 g-ot a vizsgálathoz steril Stomacher-
tasakba kell mérni,
– 9-szeres mennyiségű hígítóoldattal kiegészíteni (A hígítófolyadék
hőmérséklete 10-20°C)
– hogenizálni.
• A folyékony minta
– a vizsgálati minta kivétele előtt alaposan át kell keverni, majd rövid ideig
állni hagyni, hogy a légbuborékok felszállhassanak.
– Ezt követően a minta, steril pipettával kimért 10 ± 0,1 ml mennyiségéből
el kell készíteni a törzsoldatot (kiindulási hígítás) a szilárd mintáknál
leírtakkal azonos módon.
Az elkészített törzsoldat képezi a további vizsgálathoz az alapot.
 A steril munkavégzés berendezései
(biológiai biztonsági szekrények)
Cél: mikrobamentes környezet biztosítása.
A laborban keletkező kis légörvények kivédésére I.- II.- III.-kategóriájú
biológiai biztonsági szekrényeket alkalmazunk.

I.- kategóriájú
biológiai biztonsági
szekrény
II.- kategóriájú biológiai biztonsági szekrény

Lamináris box: A levegő szűrése révén mikrobamentes légteret

biztosít a berendezés munkaterében. Elnevezését a lamináris
(turbulenciamentes) légáramlás megvalósítása alapján nyerte. Előnye,
hogy kis helyigényű, munkatere lehetővé teszi a steril munkát.

HEPA (High efficiency particulate air) szűrő

 II. - kategóriájú biológiai biztonsági
szekrény

A légáramlás iránya szerint

megkülönböztetünk függőleges (vertikális)
és vízszintes (horizontális) légáramlású
lamináris boxokat.
 III. - kategóriájú biológiai biztonsági
szekrény
• Hermetikusan zárt belső tér
Alkalmas nagyon
• A munkálatok a belső térben rögzített, karhosszúságú veszélyes fertőző
gumikesztyűk segítségével folynak. anyagok kezelésére
• Anyagok bevitele, csak légzáró zsilipen keresztül lehetséges
• Az anyagok eltávolítása autoklávon vagy folyékony fertőtlenítőszerrel
töltött merítő tankon át történik.
 Az inkubálás berendezései

• Termosztátok: a mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló, kívánt

hőmérsékletre beállítható szekrények.

• Vízfürdő

• Rázógépek: Főleg aerob mikroorganizmusok tenyésztésénél használják.

Vízfürdős változatban, vagy légtermosztáttal egybeépítetten elterjedten
alkalmazzák mikroorganizmusok laboratóriumi léptékű szaporítására.
 Automata telepszámláló

•80%-al csökken a leolvasásra fordított idő

•600 lemezt olvas le óránként
 A sterilezés

Sterilezés módszere Sterilezés eszköze

Túlnyomásos, telített vízgőzzel autokláv Hőhatás

Forró levegővel hőlégsterilizáló

Etilénoxid gázzal gázsterilizátor
Formaldehides gázzal gázsterilizátor Kémiai
Antimikrobiális anyagok oldatában hidegsterilizátor
Hidrogénperoxid plazmában Plazmasterilizátor (hőre, nedvességre
érzékeny anyagok, eszközök,
műszerek csíramentesítsére
alkamlmas)
Mechanikus módszerrel mikrobamentesítő szűrő
UV-fénnyel UV lámpa
Radioaktív sugárzással generátorok, gyorsítók
 A sterilezés nedves levegővel I.
• Autoklávok (sterilezés gőzzel, nyomás alatt)
– táptalajok és szennyes (kontaminált) edények gőzzel való sterilezésére
szolgáló eszközök
– A táptalajok sterilezésénél figyelembe veszzük azok alkotóelemeinek
hőérzékenységét és tömegét (1000 ml-nél nagyobb volumenben ne, ne
töltsük színültig, kupakokat lazítsuk meg)
– csomagolás nélkül eszközt, anyagot sterilizálni nem szabad
– Az üzemeltetés lépései:
• Vízfeltöltés (desztillált vagy ioncserélt vízzel)
• Felfűtés
• Légtelenítés (levegő eltávolítása a légtelenítő szelepen át-5perc, ha elérte a
100 °C-ot, ekkor a rakomány még csak 50-60°C-os)
• Hőmérséklet-kiegyenlítés (a rakománybak el kell érnie az előírt 121°C, vagy
134°C hőmérsékletet)
• Csírátlanítás (1AT – 121°C 30perc, de 15 minimum,, pl táptalajoknál
2AT – 134 °C 10 perc)
• Túlnyomás megszüntetése, szárítás
 Az autoklávok csoportosítása

Működés szerint: Típus szerint:

kézi szabályozású egyfalú
részben automatikus kettősfalú
automatikus Kivitel szerint:
álló helyzetű
fekvő helyzetű
egyoldali
kétoldali (ún. átadós rendszerű)
 A sterilezés nedves levegővel II.

Frakcionált sterilezés (tindallozás)

Az Bacillus és Clostridium nemzetségbe tartozó
baktériumok igen nagy ellenállóképességgel rendelkező
endospóráinak elpusztítására szolgál áramló gőzben.
Általában hőérzékeny anyagok és eszközök sterilezésekor
alkalmazzák. A bakteriális endospórák azt a hőkezelést,
amin minden vegetatív baktérium elpusztul, túlélhetik.
Ezért a sterilezendő anyagot vagy eszközt 3 napon át napi
fél órára áramló gőzbe kell helyezni. Az első napon a
hevítés elpusztítja a vegetatív baktériumokat, a további
hőkezelések pedig a spórákból kicsírázó baktériumokat.
 A sterilezés nedves levegővel III.

Sterilezés áramló gőzben

A sterilezés áramló gőzben légköri nyomáson 100 °C-on
30 percen át történik.
A behatási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a
sterilezendő eszköz vagy anyag elérte a 100 °C-os
hőmérsékletet.
A sterilezésnek ez a módja végezhető autoklávban
(fúvatás), vagy Koch-fazékban.
Ezt az eljárást kell alkalmazni szénhidrátot vagy ennél
magasabb hőmérsékletre érzékeny anyagot tartalmazó
táptalajok sterilezésekor.
 A sterilezés berendezései II.
Hőlégsterilező:
– száraz eszközök (lombikok, Petri-csészék, edények) sterilezésére kialakított szárítószekrény típusú
berendezések

160°C 180 °C 200 °C

Gravitációs 120 perc 60 perc 30perc
Cirkulációs 45 perc 25 perc 10 perc
• Előkészítés, csomagolás (alumínium
fólia , fémtok), munkatér megtöltése
• Felfűtés
• Hőmérséklet kiegyenlítés
• Csírátlanítás
• Lehűtés
Gázégő: a laboratóriumi munka során használt
fémeszközök (oltókacs, oltótű, csipesz)
sterilezésére szolgál.
 Sterilezés kémiai módszerekkel

A kémiai anyagok hatás alapján csoportosíthatók:

bakteriosztatikus hatás
baktericid hatás.
A hatás az anyagi minőségen kívül függ a koncentrációtól és a hatóidőtől .
Kémiai sterilezésre csak cid hatású anyagok alkalmasak.
Követelmény:
– hatásuk széles spektrumú legyen,
– emberre, állatra és növényre ártalmatlanok, környezetkímélők,
– könnyen kezelhetőek és gazdaságosak legyenek.
A kémiai sterilezésre használt anyagok:
– folyékony
– gáz halmazállapotúak. PL: etilén-oxid
Az etilén-dioxid előnye, hogy 500 mg/1 koncentrációban 20 °C-on (hideg
sterilezés) 4-5 óra alatt sterilez, így hőérzékeny eszközök(pl. hőre lágyuló
műanyagok) csíramentesítésére is alkalmas.
Hátránya, hogy az etilén-oxid belélegezve tüdőödémát okoz.
 Plazmasterilizáló
A eljárás alacsony, mintegy 464C hőmérsékleten , elektromos erőtér
hatására létrehozott hidrogénperoxid plazma-állapotát alkalmazza alacsony
páratartalmú közegben csíramentesítésre.
A gázalakú plazmát általában az
anyag negyedik halmaz-állapotának
tekintik, amely ionfelhőből,
elektronokból és semleges atomi
részecskékből áll. Az anyagnak ez a
halmazállapota elektromos erőtér,
vagy mágneses erőtér hatására jön
létre. (A természetes úton létrejövő
plazmára példa a jól ismert
természeti jelenség, mely a Föld
északi pólusán észlelhető, az aurora
borealis, azaz az északi fény.)

Az alacsony hőmérsékletű H2O2 plazma aktív szabad gyökei hatékonyan

elpusztítják a vírusokat, baktériumokat, spórákat, steril állapotot hozva létre.
A folyamat végén vízpára és O2 marad vissza, a rakomány száraz, azonnal
használható, illetve a hatékony csomagolás révén szállítható és a kívánt ideig
tárolható.
 Sterilezés szűrővel
Folyékony és gáz halmazállapotú anyagok szűréssel is sterilezhetők.
Pórus átmérők:
– bakteriológiában: 0,22-0,65 m között változik
– virológiai laboratóriumok 25-100 nm közötti, ami alkalmassá teszi ezeket a szűrőket a
vírusok nagyság szerinti differenciált visszatartására (ultraszűrés).
Korábban a szűrőket égetett agyagból, kovaföldből vagy mázatlan porcelánból
készítették, ma már:
– A Seitz-féle szűrők azbesztből préselt korongok, egyszer használatosak.
– Az üvegszűrők szűrőfelülete préselt üveghab vagy üvegszál.
– A membránszűrők cellulóz-észterből készült vékony filterek. Egyszer használatos
szűrők. Előnyük, hogy pórusátmérőjük szabályozható, egy-egy szűrőnél valamennyi
pórus azonos méretű, a szűrés rajtuk keresztül gyors, a szűrendő folyadékból keveset
adszorbeálnak, felhasználásuk sokrétű. Kaphatók ipari szűrésre megfelelő méretű és
laboratóriumban használatos formában is (fecskendőre rögzíthető, vákuumszűrésre
alkalmas stb).
A membránszűrők segédeszközként felhasználhatók kis baktériumtartalmú folyadékok
csíraszámának meghatározásakor is.  
 Sterilezés UV fénnyel

A nem ionizáló sugárzások közül az. ultraibolya sugárzást használjuk

csíramentesítésre
Az UV-sugárzás teljes spektruma (136-400 nm) károsítja a sejteket, de a legjobb
baktericid (baktériumölő) hatást a 250-280 nm hullámhosszú sugarakkal
érhetjük le, ami főként a DNS-molekulák károsításával magyarázható.
Az UV (germicid)-lámpákat elterjedten alkalmazzák kórházakban,
laboratóriumokban a légtér és felületek csíramentesítésére.
Alkalmazhatóságának határt szab, hogy hatékonysága a fényforrástól
távolodva négyzetes arányban csökken, áthatolóképessége kicsi, és
hatékonyságát a felületeken található szennyeződések a sugárelnyelés révén
jelentősen csökkentik.
Mindemellett tekintettel kell lenni arra, hogy az UV-sugárzás károsítja a szemet,
és karcinogén hatása van, ezért az UV-lámpa üzemeltetésekor lehetőség szerint a
helyiséget el kell hagyni. Amennyiben erre nincs mód, UV-fényt szűrő
szemüveget kell viselni.
 Sterilezés ionizáló sugárzással ()

• A nagy energiájú ionizáló sugárzások közül ipari

méretekben a jó áthatolóképességű, rendszerint kobalt-
izotópból származó gamma-sugárzást használják
injekciós tűk, fecskendők, kötszerek, gyógyszerek és
egyes élelmiszerek (fűszerek) sterilezésére.
• A gamma-sugárzás előnye, hogy a csomagoláson is
áthatol, hátránya, hogy - mint minden radioaktív sugárzás
- permanens, és minden irányba szóródik, ezért csak
speciális körülmények között alkalmazható.
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

A mintavétel és előkészítés eszközei

•Szilárd mintákból : steril szike, olló és
csipesz.
•A folyékony minták beméréséhez 10 vagy 20
ml-es steril pipetta
•A mintákat sugárzással sterilezett polietilén
tasakban homogénezzük
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

Tenyésztőedények
1. Kémcső
2. Widal-cső
3. Erlenmeyer-lombik
4. Álló lombik
5. Táptalaj üveg
6. Roux-palack
7. Petri-csészék
8. Durham féle
fermentációs cső
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

Oltóeszközök
• oltókacs
• oltótű,
• pipetta
• szélesztőbot
• automata adagoló pipettákat
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

A mikroszkópos vizsgálat eszközei

– tárgylemez
– fedőlemez
– tárgylemez-csipesz
– festőkád vagy festőtálca
– számlálókamra