‫בס"ד‬

‫בס"ד‬

‫תהליכים כימיים המתרחשים במהלך התסיסה‬

‫המאלולקטית‬

‫)‪(Wine Folly‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫תסיסה מאלולקטית‬
‫‪ ‬תסיסה מאלולקטית (‪ ,)Malolactic fermentation/MLF‬היא תהליך שבו מתבצע פירוק של חומצה מלית‬
‫(‪ )L-Malic‬ליצירת חומצה לקטית (‪ )L-Lactic‬ופחמן דו חמצני‪ ,‬כמתואר באיור‪:‬‬

‫)‪(Adapted from: Guisard, et al. (2014). Viticulture and Wine Science. In G. R. Dixon, & D. E. Aldous (Eds.), Horticulture: Plants for People and Places‬‬

‫‪ ‬תהליך זה נקרא גם"‪ " biological deacidification‬בשל הפחתת החמיצות הנוצרת בעקבות התהליך ע"י‬
‫מיקרואורגניזמים‪.‬‬

‫‪ ‬הפחתת חומציות היין היא בעקבות ההמרה של חומצה עם שתי קבוצות קרבוקסיליות לחומצה עם קבוצה‬
‫קרבוקסילית אחת‪ ,‬כלומר מעבר לחומצה חלשה יותר ובעקבותיה קבלת ‪ pH‬גבוה יותר‪ .‬בקירוב‪ ,‬כל גרם‬
‫של חומצה מלית מומר בתהליך ל‪ 0.33-‬גרם פחמן דו חמצני ול‪ 0.67-‬גרם חומצה לקטית‪.‬‬

‫‪ ‬למעשה‪ ,‬החומצה המלית ביחד עם החומצה הטרטרית מהוות מעל ‪ 90%‬מהחומציות הכוללת של היין‬
‫(‪.)Lasik, 2013‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫המיקרואורגניזמים האחראים לתסיסה המלולקטית‬

‫‪ ‬התסיסה המלולקטית מתבצעת ברובה על ידי פעילות מיקרוביאלית המתרחשת ביין על ידי קבוצת חיידקים‬
‫מהמשפחה הלקטית‪ ,‬הנקראים חיידקי חומצת חלב\בקטריות לקטיות (‪.)Lactic Acid Bacteria‬‬

‫‪ ‬חיידקים אלו פועלים לרוב ללא נוכחות חמצן (תנאים אנאירוביים) והם יכולים להימצא בכרם‪ ,‬ביקב‪,‬‬
‫בענבים ולכן גם בתירוש וביין התוסס‪ .‬בתנאים מתאימים‪ ,‬החיידקים יכולים להתחיל בתסיסה בצורה‬
‫ספונטנית (ללא התערבות חיצונית) (‪.)Guisard et al., 2014‬‬

‫‪ ‬התסיסה המלולקטית מתרחשת ע"י הזנים‪ Oenococcus oeni, Lactobacillus spp :‬ו‪Pediococcus -‬‬
‫‪ .spp‬זן ה‪ Oenococcus oeni (O. Oeni) -‬הוא העמיד ביותר לתנאי ‪ , pH‬אלכוהול וגופרית דו חמצנית‬
‫של היין ולכן לרוב הוא הזן העיקרי המבצע את התסיסה (‪.)Liu, 2012‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪ ‬שמרים מסוימים (כדוגמת‪ )Schizosaccharomyces pombe :‬מסוגלים לפרק חומצה מלית תוך כדי‬
‫פירוק גלוקוז ויצירת אלכוהול בתהליך הנקרא ‪ .Maloethanolic fermentation/MEF‬אם זאת‪ ,‬החלק‬
‫העיקרי של התסיסה המלולקטית אינו מתרחש במסלול זה‪ ,‬אלא מתבצע על ידי הבקטריות הלקטיות‬
‫((‪Volschenk et al., 2003‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫אופן פעולת חיידקי חומצת החלב (הבקטריות הלקטיות)‬

‫‪ ‬עיקר מנגנון פעולתן של החיידקים מתבסס על המרת מקורות אנרגיה (מטבוליזם) שונים‪ ,‬כדוגמת סוכר‬
‫(גלוקוז) וחומצה מאלית לתוצר לוואי עיקרי‪ ,‬חומצה לקטית‪ ,‬גז ‪ CO2‬ותוצרי לוואי משניים כמו חומצה נדיפה‪,‬‬
‫דיאצטיל‪ ,‬אתנול ומרכיבי ארומה וטעם נוספים‪ .‬תוצרי הלוואי תלויים בזן החיידק המבצע את התסיסה (‪Liu,‬‬
‫‪.)2002‬‬

‫‪ ‬יצירת החומצה הלקטית מתבצעת בכמה מסלולים‪ .‬ראשית‪ ,‬לבקטריות יש יכולת לייצר חומצה לקטית‬
‫מסוכרים בשני מסלולים ((‪:Volschenk et al., 2006‬‬

‫‪ .1‬ע"י מסלול מטבולי שבו הגלוקוז עובר פירוק ליצירת חומצה לקטית בלבד (‪Homofermentative‬‬
‫‪)metabolic pathway‬‬

‫‪ . 2‬ע"י מסלול מטבולי שבו נוצרים מהגלוקוז‪ ,‬בנוסף לחומצה הלקטית‪ ,‬גם אתנול וחומצה אצטית‬
‫(‪.)Heterofermentative metabolic pathway‬‬

‫בקטריות לקטיות מסוג‪ Oenococcus, Leuconostoc, Weissella , Pediococcus :‬ו‪-‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ Lactobacillus‬מסוגלות לבצע תסיסה מלולקטית ולפרק ישירות חומצה מלית לחומצה לקטית (לא‬
‫במסלול של פירוק הסוכר) ע"י אנזים שפועל בנוכחות קו‪-‬פקטורים ‪ +NAD‬ו‪Mg2+ (Volschenk et-‬‬
‫)‪.al., 2006‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

)‫אופן פעולת חיידקי חומצת החלב (הבקטריות הלקטיות‬

(Adapted from: MALOLACTIC FERMENTATIONIMPORTANCE OF WINE LACTIC ACID BACTERIA IN WINEMAKING, Lallemand)
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫אופן פעולת חיידקי חומצת החלב (הבקטריות הלקטיות)‬

‫‪ ‬אופן הפירוק של החומצה המלית לחומצה הלקטית ברמת תא הבקטריה מתואר באיור הבא (‪Bisson and‬‬
‫‪.)Walker, 2015‬‬

‫‪ ‬האיור מדגים את צריכת הפרוטונים התוך תאית במהלך הדה‪-‬קרבוקסילציה של החומצה המלית והיווצרות כח‬
‫מניע של פרוטונים (‪ .) Proton Motive Force/PMF‬החומצה המלית נכנסת לתוך תא הבקטריה והופכת לחומצה‬
‫לקטית בצורה אנזימטית‪ .‬בשלב הבא‪ ,‬יוצאת החומצה הלקטית אל מחוץ לתא הבקטריה‪ .‬גרדיינט הפרוטונים‬
‫שנוצר במהלך זה מנוצל ליצירת ‪ ATP‬דרך פעולת משאבה של )‪.ATPase (Bisson and Walker, 2015‬‬
‫)‪(Taken from: Bisson and Walker, 2015‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

(Taken from: http://balsamorhiza.org/2014/10/malolactic_fermentation from: Lallemand)

 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫ בתא החיידק‬ATP ‫ היווצרות הפרש פרוטונים במהלך תסיסה מלולקטית ויצירת‬...‫ושוב‬

‫הלקטי‬

(Adapted from: Mendoza, et al. (2017). Genome-Scale Reconstruction of the Metabolic Network in Oenococcus oeni to Assess Wine Malolactic Fermentation.
Frontiers in Microbiology, 8, 1-16)
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫גורמים המשפיעים על התסיסה המלולקטית‬

‫‪ ‬התסיסה המלולקטית מושפעת מגורמים רבים שרובם מיוחסים לתנאי התירוש והיין מבחינה‬
‫כימית\פיזיקלית ומבחינה מיקרוביאלית‪.‬‬

‫‪ ‬מבחינה כימית‪ ,‬התנאים העיקריים המשפיעים על התסיסה המלולקטית הם‪ :‬רמת אלכוהול‪,‬‬
‫‪ pH‬ו‪ . SO2-‬הטמפרטורה אף היא משפיעה על פעילות הבקטריות האחראיות על התסיסה‪.‬‬

‫‪ ‬מבחינה מיקרוביאלית‪ ,‬יש השפעה למיקרואורגניזמים הקיימים בתירוש\יין (שמרים וחיידקים)‬

‫ובאינטראקציה ביניהם (‪.)Comitini et al., 2005‬‬

‫)‪(Adapted from: “Achieving successful malolactic fermentation”, Fact sheet winemaking AWRI, 2016‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫‪pH‬‬
‫‪ ‬אחד הפרמטרים המשפיעים ביותר על התסיסה המלולקטית הוא ה‪ .pH-‬זנים מסוימים של‬
‫בקטריות לקטיות מסוגלות לפרק חומצה מלית בערכי ‪ pH‬נמוכים של ‪ 3‬אך רוב הזנים יבצעו את‬
‫התסיסה בערכי ‪ pH‬של ‪ 3.5‬ומעלה‪.‬‬

‫‪ ‬עבור מרבית הזנים‪ ,‬ערכי ‪ pH‬של ‪ 3.3‬ומעלה לא אמורים להוות בעיה לתחילת תסיסה מלולקטית‬
‫ספונטנית ולא לסיומה (‪.)Bauer & Dicks, 2004‬‬

‫‪ ‬משערים שהשפעת ה‪ pH-‬קשורה בפעילות הבקטריה המלולקטית בתא‪ .‬מנגנון הפעולה משויך‬
‫לצריכת הפרוטונים‪ .‬החוקרים מתארים מספר מנגנונים שונים שתלויים גם בזני החיידקים השונים‬
‫האחראיים על התסיסה‪ ,‬אך בצורה כללית הרעיון הוא שפירוק החומצה המלית מייצר גרדיינט ‪pH‬‬
‫טרנס‪-‬ממברנאלי במקביל לגרדיינט של פוטנציאל חשמלי‪ .‬במהלך הדה‪-‬קרבוקסילציה יש בקרה של‬
‫ה‪ pH-‬בתוך התא כשהפרש הפוטנציאלים משמש לסינטזה של )‪.ATP (Bauer & Dicks, 2004‬‬

‫‪ ‬השפעת ה‪ , pH -‬מעבר ליצירת תנאים מתאימים לפעילות הבקטריה משפיעה גם על סוג התרכובות‬
‫הארומטיות הנוצרות (‪.)Volschenk et al., 2006‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫אתנול‬
‫‪ ‬אתנול מפריע לגידול הבקטריה הלקטית (כנראה כתוצאה משינוי בנוזליות ממברנת תא‬
‫הבקטריה)‪.‬‬

‫‪ ‬בריכוזים של בין ‪ )v/v( 8-12%‬אין עיכוב משמעותי של התסיסה המלולקטית‪ ,‬אך יש ירידה‬
‫לינארית בקצב הגידול של הבקטריה הלקטית העיקרית ( ‪ )O. Oeni‬ככל שריכוז האתנול גדל‪.‬‬

‫‪ ‬הגבול העליון שהיא עמידה אליו הוא ‪ 14%‬אתנול‪ .‬בשילוב של טמפ' גבוהה מ‪ 25C-‬העיכוב‬
‫מתחיל כבר מ‪ 10% -‬אתנול (‪.)Bauer & Dicks, 2004‬‬
‫‪ ‬‬
‫גופרית דו חמצנית (‪)SO2‬‬

‫‪ ‬גופרית דו חמצנית‪ ,SO2 ,‬בעיקר בצורתה החופשית (שאינה קשורה לתרכובות ביין)‪ ,‬מהווה‬
‫גורם מעכב ואפילו ממית לבקטריות הלקטיות; אם זאת‪ ,‬לרוב עיכוב זה מתבצע רק באמצעות‬
‫פרמטרים נוספים נלווים שפועלים בצורה סינרגיסטית (ובעיקר ערכי ‪ pH‬נמוכים)‪.‬‬

‫‪ ‬ריכוז גופרית דו חמצנית חופשית (‪ )Free SO2‬הנמוך מ‪ 10 -‬מ"ג\ליטר וריכוז גופרית דו‬
‫חמצנית כוללת (‪ )SO2 Total‬שנמוך מ‪ 30-‬עם ערכי ‪ pH‬של ‪ 3.2-3.4‬לא אמור לעכב את‬
‫התסיסה המלולקטית (‪.)Lasik, 2013‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫טמפרטורה‬

‫‪ ‬מרבית הזנים של הבקטריות הלקטיות פועלות בתנאים אופטימליים של ‪ .20-25C‬כמובן‬

‫שהשפעה זאת תלויה אף היא בתנאים הנוספים של התירוש\יין‪.‬‬

‫‪ ‬לרוב‪ ,‬טמפרטורות נמוכות (עד בקירוב ‪ )20C‬מעכבות את תסיסה מלולקטית וטמפרטורות‬

‫גבוהות (בקירוב ‪ )25C‬מזרזות את התסיסה (‪.)Lasik, 2013‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫השפעת שמרים האחראים על התסיסה הכוהלית‬

‫‪ ‬שמרים יכולים להשפיע על הבקטריות הלקטיות האחראיות על התסיסה המלולקטית בכמה דרכים‬
‫והשפעתם לעיתים מזרזת את התסיסה‪ ,‬לעיתים מעכבת ולעיתים לא משפיעה (תלוי בשמר המוסף‬
‫ובגורמים נוספים הקשורים בסוג הענבים ובתהליך ייצור היין) (‪.)Lonvaud-Funel et al., 1988‬‬

‫‪ ‬ההשפעה יכולה להתבצע כתוצאה מהשפעתם של השמרים על המדדים הכימיים (‪ ,pH‬אלכוהול וגופרית דו‬
‫חמצנית) וחלקם ע"י הפרשה של חומרים חוץ תאיים שמשפיעים על פעילות הבקטריה וחלקם מתחרים על‬
‫חומרי מזון זמינים ובכך גורמים לעיכוב התסיסה (‪.)Lonvaud-Funel et al., 1988‬‬

‫‪ ‬מדיווחים בספרות נראה כי לשמרי ‪ Saccharomyces cerevisiae‬יש יכולת לעכב את פעילות הבקטריה‬
‫‪ O. Oeni‬ובכך לעכב את התסיסה המלולקטית‪ .‬אם זאת‪ ,‬קיימים גם דיווחים בהם בתנאים מסוימים‬
‫השמרים יכולים גם לגרום לפעילות מוגברת של הבקטריה (‪.)Comitini et al., 2005‬‬

‫‪ ‬אחת הדרכים שבהן העיכוב ע"י השמרים מתבצע (מעבר להשפעה על המדדים הכימיים‪ ,‬כפי שהוזכרה‬
‫לעיל) הוא ע"י ייצור של חומצות שומן באורך בינוני (‪ ,)Medium-chain fatty acids‬כלומר חומצות שומן‬
‫באורך שבין ‪ 6-12‬אטומי פחמן‪ .‬חומצות אלו פוגעות ביכולת גידול של הבקטריה‪ .‬השמרים יכולים ליצור‬
‫חומצות בעלות הרכב משתנה ורמת הפגיעה תלויה בסוג החומצה הנוצרת‪ .‬הפגיעה משויכת לפגיעה‬
‫במבנה הממברנה של תא הבקטריה‪ .‬דרך נוספת קשורה ביצירת פפטידים חוץ תאיים שרעילים לקיום‬
‫הבקטריה (‪.)Comitini et al., 2005‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫השפעות התסיסה המלולקטית על איכות היין‬

‫ביצוע התסיסה מוביל להפחת חומציות היין ("ריכוך") ובכך תורם לטעם עדין יותר‪ .‬יש מעבר מטעם חמצמץ (טעם‬ ‫‪‬‬
‫של החומצה המלית שהוא טעם של תפוח) לטעם מעודן חמאתי (שתורמת החומצה הלקטית\חומצת החלב)‪.‬‬

‫‪ ‬ההמרה של חומצה מלית לחומצה לקטית‪ ,‬תורמת בצורה משמעותית ליציבותו הבקטריאלית של היין על ידי‬
‫הרחקת מקור אנרגיה זמין לבקטריות המסוגלות להשפיע באופן שלילי על איכותו של היין ועלולים להוביל לעלייה‬
‫נכרת בחומצה נדיפה והפקת תרכובות טעם וארומה פוגעניות‪ .‬החומצה המלית נחשבת "לא יציבה" כיון שהיא‬
‫משמשת כסובסטרט לבקטריה בעוד שהחומצה הלקטית הינה "יציבה" ולא ניתנת לפירוק ע"י הבקטריות‪.‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

‫השפעות התסיסה המלולקטית על איכות היין‬

‫‪ ‬יצירת חומרי ארומה שתורמים לאיכות היין (דיאצטיל וחומרים נדיפים נוספים‪ ,‬המקנים ארומה פירותית‬
‫ומורכבת ליין)‪.‬‬

‫‪ ‬תרומה נוספת של התסיסה המלולקטית היא ביצירת אנזימים הקרויים גליקוזידאזות (אנזימים המפרקים‬
‫קשרים עם סוכר)‪ .‬חומרי ארומה רבים נמצאים ביין בצורה קשורה לסוכר‪ ,‬צורה חסרת ריח‪ .‬הגליקוזידזות‬
‫מפרקות את הקשר הגליקוזידי וכך חומרי הארומה בצורתם החופשית תורמים לארומה של היין‪ ,‬כפי שניתן‬
‫לראות באיור הבא‪.‬‬

‫איור ‪ .3‬איור סכמטי של שבירת הקשר הגליקוזידי הקיים בין חומר ארומטי וסוכר ע"י גליקוזידאות‬
‫( ‪.) https://www.accuvin.com/wp-content/uploads/2015/04/Malolactic-Fermentation.pdf‬‬
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

(Adapted from: MALOLACTIC FERMENTATIONIMPORTANCE OF WINE LACTIC ACID BACTERIA IN WINEMAKING, Lallemand)
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

(Adapted from: MALOLACTIC FERMENTATIONIMPORTANCE OF WINE LACTIC ACID BACTERIA IN WINEMAKING, Lallemand)
 ‫בס"ד‬
Organoleptic defects caused by uncontrolled malolactic fermentation ‫בס"ד‬

(Adapted from: MALOLACTIC FERMENTATIONIMPORTANCE OF WINE LACTIC ACID BACTERIA IN WINEMAKING, Lallemand)
 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

Mean values for pH and selected MLF‐related compounds in wines from

different grape varieties inoculated with two strains of Oenococcus oeni.

Adapted from: Waterhouse et al., 2016: "Understanding Wine Chemistry"

 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

Formation of l‐lactic acid from l‐malic acid metabolism (pathway A) and MLF‐associated volatile
compounds, diacetyl and acetoin, from citric acid metabolism (pathway B) by Oenococcus oeni. Other metabolites
arising from citrate, via pyruvate, are also shown. Numbers for the steps refer to the following: 1, carboxylate
transporter; 2, malolactic enzyme; 3, citrate lyase; 4, oxaloacetate decarboxylase; 5, pyruvate decarboxylase; 6,
α‐acetolactate synthase, 7, oxidative decarboxylation (nonenzymatic), 8, α‐acetolactate decarboxylase, 9, diacetyl
reductase, 10, acetoin reductase

Adapted from: Waterhouse et al., 2016: "Understanding Wine Chemistry"

 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

Diacetyl

Diacetyl concentrations (mg/L) during MLF as a function of time after inoculation, showing that semi‐
aerobic conditions promote greater formation of diacetyl than anaerobic conditions. In both situations,
diacetyl will eventually be reduced to acetoin and 2,3 ‐butanediol through LAB metabolism

Adapted from: Waterhouse et al., 2016: "Understanding Wine Chemistry"

 ‫בס"ד‬
‫בס"ד‬

THE INFLUENCE OF MALOLACTIC FERMENTATION ON WINE COMPOSITION

(Adapted from: MALOLACTIC FERMENTATIONIMPORTANCE OF WINE LACTIC ACID BACTERIA IN WINEMAKING, Lallemand)
‫בס"ד‬
‫בס"ד‬
‫בס"ד‬
‫בס"ד‬