Biosenyalització

i Metabolisme
Grau de Biología

Prof.: Ana María Ahumada

AnaMaria.Ahumada@uab.cat

Bioquímica i Biología Molecular

Biociències
 Normes de laboratori

Les pipetes heu

Tots s’han de posar de mirar el seu
guants abans de Tirar els residus de
volum màxim
començar la puntes i les plaques
(ARA) i deixar-les
pràctica. al contenidor groc.
al seu volum
màxim.

Si queda reactiu, La zona de treball

tornar-me els s’ha de deixar igual
eppendorfs que us que la heu trobat.
he proporcionat.
Prof. Ana Maria Ahumada
 Pràctica nº 1

DETERMINACIÓ DELS PARÀMETRES

CINÈTICS DE LA PIRUVAT QUINASA DE
MÚSCUL I FETGE.

Prof. Ana Maria Ahumada

RELACIÓ AMB
LA TEORIA

Prof. Ana Maria Ahumada

Rol de la piruvat quinasa

Prof. Ana Maria Ahumada

Rol de la piruvat quinasa

Objectiu 1
• Determinar l’activitat de la
piruvat quinasa a diferents
concentracions de
fosfoenolpiruvat (PEP) i
concentració constant d’ADP

Prof. Ana Maria Ahumada

Rol de la piruvat quinasa

Objectiu 1
• Determinar l’activitat de la
piruvat quinasa a diferents
concentracions de
fosfoenolpiruvat (PEP) i
concentració constant d’ADP

Prof. Ana Maria Ahumada

 ISOENZIMS de la piruvat quinasa

PKL PKM
Regulació [glucosa]sang Múscul:↑↑ ATP
Localització Fetge (L) PKL Múscul (M) PKM
tissular
Ronyó, intestí prim Cervell

Mr subunitat 58.500 59.000

Cinètica (PEP) Sigmoidal Hiperbòlica
PEP S0,5 = 0.5-1.0 mM KM = 0,08 mM
ADP S0,5 = 0,1-0.4 mM KM = 0,30 mM
Ref. Imamura,K. i Tanaka, T. (1982). Methods in Enzymology 90, 150-165.
Prof. Ana Maria Ahumada
 ISOENZIMS de la piruvat quinasa

PKL PKM
Regulació [glucosa]sang Múscul:↑↑ ATP

Localització
tissular Objectiu 2

Mr subunitat Determinar els paràmetres cinètics de

Cinètica (PEP) Sigmoidal Hiperbòlica
les isoformes muscular i hepàtica de
PEP S0,5 = 0.5-1.0 mM KM = 0,08 mM
ADP S0,5 = 0,1-0.4 mM l`enzim Piruvat kinasa . KM = 0,30 mM
Prof. Ana Maria Ahumada Ref. Imamura,K. i Tanaka, T. (1982). Methods in Enzymology 90, 150-165.
ISOENZIMS de la piruvat quinasa: PKM

Múscul:↑↑ ATP
Localitzaci Múscul (M)
ó tissular

Mr 59.000
subunitat
Cinètica Hiperbòlica
(PEP)
PEP KM = 0,08 mM
ADP KM = 0,30 mM
Prof. Ana Maria Ahumada
ISOENZIMS de la piruvat quinasa: PKM

Múscul:↑↑ ATP
Localitzaci Múscul (M)
ó tissular

Mr 59.000
subunitat
Cinètica Hiperbòlica
(PEP)
PEP KM = 0,08 mM
ADP KM = 0,30 mM
 ISOENZIMS de la piruvat quinasa: PKL

Equació de Hill:
Descriu la fracció de
macromolècules saturades
PKL pel lligand en funció de la
concentració de lligand.

S0.5: Concentració de substrat a la qual la proteïna (P) està

Regulació [glucosa]sang semisaturada. Coincideix amb el canvi de la cinètica sigmoïdal.
Local. tissular Fetge (L) Coeficient de Hill (n): Mesura del grau de cooperativitat en la unió del
lligand.
PKL
- n>1: Unió cooperativa positiva. Tant bon punt un lligand s’ha unit a la proteïna, la seva afinitat
subunitat 58.500 per altres lligands augmenta.
Cinètica (PEP) Sigmoidal - n<1: Unió cooperativa negativa. Tant bon punt un lligand s’ha unit a la proteïna, la seva afinitat
per altres lligands disminueix
PEP S0,5 = 0.5-1.0 mM - n=1: L’afinitat de l’enzim per la molècula no depèn de si està unit o no a altres lligands (Michaelis-
Menten).
ADP S0,5 = 0,1-0.4
 Activitat enzimàtica de la piruvat quinasa
Determinació de velocitats inicials per a calcular Km i Vmàx

850 µL tampó TPQ1

n μL de tampó TPQ
Blanc amb aire n μL de PEP 0,5/5/40 Mm
o (TPQ) 50 μL Extracte fetge(1/10) ó múscul(1/10)

1ml

Prof. Ana Maria Ahumada

Determinació de la concentració de proteïna
per un mètode colorimètric.

Prof. Ana Maria Ahumada

λ:595 nm
 ul
Determinació tge
fe 0)
c
ús )
m 0
e
ct (1:5 e
colorimètrica [proteïna a a c (1:1
t
x tr ata x tr ata
E r E r
total] (Bradford) de de

El Stock normalment està a 1 mg/ml: diluir a 0.1

f1 f2 m1 m2
BSA (0,1 mg/ml) PBS (µl) [BSA]final
0 (blanc) 1000 0 (blanc)
10 990 1
20 980 2
40 960 4
60 940 6
80 920 8 Mostra 20 ul Mostra 40 ul Mostra 20 ul Mostra 40 ul
100 900 10 PBS 980 ul PBS 960 ul PBS 980 ul PBS 960 ul

+ 200 µl Bradford, 10 min

Mesura 1.2 ml a λ=595 nm

+ 200 µl Bradford, 10 min

Mesura 1.2 ml a λ=595 nm

Prof. Ana Maria Ahumada
Explicación RECTA CALIBRACIÓN Excel
 Activitat enzimàtica de la piruvat quinasa
Determinació de velocitats inicials per a calcular Km i Vmàx

850 µL tampó TPQ1

50 μL Extracte fetge(1/10) ó múscul(1/10)
Blanc amb aire n μL de tampó TPQ
o (TPQ) n μL de PEP 0,5/5/40 Mm

1ml

Prof. Ana Maria Ahumada

 Activitat enzimàtica de la piruvat quinasa
Determinació de velocitats inicials per a calcular Km i Vmàx
Blanc amb aire 850 µL tampó TPQ1
o (TPQ) 50 μL Extracte fetge(1/10) ó múscul(1/10) Abs(340nm)= c·ε·l
n μL de tampó TPQ
Calcular velocitat de la
n μL de PEP 0,5/5/40 Mm
reacció (µmols de NADH
(ε=6220 M·cm-1) utilitzats
per minut)
Representar vs [PEP]
Anotar Abs340 Anotar Abs340
PEP
PEP 5
[PEP] 0.5 TPQ [PEP] PEP 40 mM TPQ
mM
(mM) mM (µL) Fetge Múscul (mM) (µL) (µL) Fetge Múscul
(µL
(µL)

0,01 ? - ? - Cada 15 s (3 minuts) 0,6 ? ? Cada 15 s (1 minut) Cada 15 s (1 minut)

0,025 ? - ? - Cada 15 s (3 minuts) 1 ? ? Cada 15 s (1 minut) -

0,05 - ? ? Cada 30 s (2 minuts) Cada 15 s (2 minuts) 1,2 ? ? Cada 15 s (1 minut) -

0,075 - ? ? - Cada 15 s (1 minut) 1,6 ? ? Cada 15 s (1 minut) -

0,1 - ? ? Cada 30 s (2 minuts) Cada 15 s (1 minut) 2 ? ? Cada 15 s (1 minut) -

0,2 - ? ? Cada 30 s (2 minuts) Cada 15 s (1 minut) 3 ? ? Cada 15 s (1 minut) -

0,5 - ? ? Cada 30 s (2 minuts) Cada 15 s (1 minut)

 Activitat enzimàtica de la piruvat quinasa
Determinació de velocitats inicials per a calcular Km i Vmàx
Blanc amb aire 850 µL tampó TPQ1
o (TPQ) 50 μL Extracte fetge(1/10) ó múscul(1/10) Abs(340nm)= c·ε·l
n μL de tampó TPQ
Calcular velocitat de la
n μL de PEP 0,5/5/40 Mm
reacció (µmols de NADH
(ε=6220 M·cm-1) utilitzats
per minut)
Representar vs [PEP]
Anotar Abs340 Anotar Abs340
PEP
PEP 5
[PEP] 0.5 TPQ [PEP] PEP 40 mM TPQ
mM
(mM) mM (µL) Fetge Múscul (mM) (µL) (µL) Fetge Múscul
(µL
(µL)

0,01 20 - 80 - Cada 15 s (3 minuts) 0,6 15 85 Cada 15 s (1 minut) Cada 15 s (1 minut)

0,025 50 - 50 - Cada 15 s (3 minuts) 1 25 75 Cada 15 s (1 minut) -

0,05 - 10 90 Cada 15 s (2 minuts) Cada 15 s (2 minuts) 1,2 30 70 Cada 15 s (1 minut) -

0,075 - 15 85 - Cada 15 s (1 minut) 1,6 40 60 Cada 15 s (1 minut) -

0,1 - 20 80 Cada 15 s (2 minuts) Cada 15 s (1 minut) 2 50 50 Cada 15 s (1 minut) -

0,2 - 40 60 Cada 15 s (2 minuts) Cada 15 s (1 minut) 3 75 25 Cada 15 s (1 minut) -

0,5 - 100 0 Cada 15 s (2 minuts) Cada 15 s (1 minut)

Prof. Ana Maria Ahumada
Preparació de reactius

NADH

1 ml 28 mM

TPQ1

TPQ1
210 µl LDH, 11.3 U/ml

1 ml ADP 22mM 80ml TPQ1

ADP 22mM

TPQ 78.2 ml + NADH 28 mM (800 µl)+ ADP

22mM (880 µl) + LDH 11.3 U/ml(210 µl)
(Fet pel profesor)
 Cálculs
Cada parella tindrà vàries taules de registres, una per cada reacció.
• Hauran de representar una recta per cada una de les reaccions fetes: Abs
340nm versus temps (en minuts).
• Hauran de treure la recta amb l'excel i apuntar el pendent a la pissarra.
• El pendent és: UA/temps (unitats d'absorbància per temps) i és una
velocitat (li direm velocitat experimental), així que tindrem dues
velocitats per cada concentració, i podrem fer una mitja.
• Utilitzar els valors de tota la classe
• Amb el programa Solver (CV) aquests valors de velocitat experimentals
s`ajusten a una cinètica desitjada.
• Sabent la cinètica d'aquests dos enzims (Michaelis Menten i Hill) podem
calcular els paràmetres cinètics (Vm i Km per la PK muscular; Vm, S0,5 i h
per la PK hepàtica).

Prof. Ana Maria Ahumada

Explicación SOLVER Excel
Biosenyalització
i Metabolisme
Grau de Biología

Prof.: Ana María Ahumada

AnaMaria.Ahumada@uab.cat

Bioquímica i Biología Molecular

Biociències