- .

""
:
-
-
- ( )
?
,
?

1
2

:
:
- (
)
- (
)
- (
)
:
- ( ), (
"ATP-a" ),
( ),
( ) ...


30 000 2.
50% .
,
.

(, ,

,
,

...

: , .
:
, , .

:

(%)

(%)

20

80

60

40

60-65

35-40

48-52

52-48

50-60

50-40

55-65

10-20


:
, .


()
.

(
)
().


.
(
)

.

 :
:

(
)

().

:



.

(
)


.

14 24
.
.


( =
).

PtdCho - Phosphatidylcholin; PtdEtn - Phosphatidylethanolamin;

PtdIns - Phosphatidylinositol; PtdSer - Phosphatidylserin


,
,
.

M -.

:
() ().
(
).



().

( )

(
).


.
(60-400 nm)
6.5-7.5 nm
1.5-2 nm
,

() (
),
.

-.


:
- .
- "" .
CT MRI
.

CT
(

).

?
(
).
. :
-
-
( )
.


.

(black film)

( )

SUV
(out-in 65-35%)
LUV (out-in 50-50%)
Small or large
unilamellar
vesicles

:

1mm
.

.

.

MLV
Multilamellar vesicles



. - .


(
)

()

(-)

a
- .

.

10-7-10-8s.

" " (
).
-
, , .

.
, -
.

-

.
, .
-
( -20C
+60C ).
(
).

.
- ,

1-3nm

.

.


(
).

( )
.

- (.
Ca+2

, ).

 ()
20 , 8 ( ,
).
( -)
(. . ).

, , .
.
.
-, - , .
. - -, ,
, ...
.
.
.
, .
, ,
, ( ), (, ,
).
, ,
, .
.
, , .



,
(, ...).
.


.
pH .

().

( ).


-
-

.
z E :
Fp=zE
Ft
, r
v.
Ft = 6 r v
,
:
zE=6rv
( v/E)
.


:
-
-
- (SDS PAGE)
:
- , , EDTA (
).
-
o .H-TRIS).
:
- (5-8 V/cm)
() 1
() 2

.
2D



- .

.

( Ca+2).
.
.

Halobacterium halobium

(
, , ... )


(
).


?
-
... ?
,
( )
() .
,
( ), .
- .
. ""
.

-
( "P-").

50 g 120 ml
. 250 m , 3 m
, 50 m ris-HCl (pH 7.5), 1 m 10% (v/v) .
12000 g 10 .
100000 30 .
(2 m -HCl, pH 7.5; 250 m , 10% v/v ) 100000 g 30
. 3 (5 - , pH 7.8; 330
m ; 3 m KCl) . ,
3 g 12 g 6.5% (v/v)
500, 6.5% (v/v) 335, 330 m , 3 m KCl, 5 m 2HPO4, pH 7.8.
30-40 5 1500 g. 90%
. (U3 )
10 100000 g 30 .

2-3 mg .
-60C.

(.)
( ).
.

( , , , ... ).
: . , , , ... , ... ( , ,
). ( ).
. (1200 )
( , ...).
(26000 g .. ). ,
, (25000 g),
. , 2-4C

- :)


:
- ( , , )
- (, , )

: ( ),
( ), (
- ).
-
(. ) , ...

()

(""
)



. :
1) : (
), ,
G<0 i S>0. :
-
-
2) : ,
G>0 i S<0.


""
.
.:
, ( ).

, 1 :
Jx = - D (d/dx)
Jx = (1/m2s),
( x-)
D = (m2/s)
dC = (mol/m3)
dx = (m)
.
D P, T .
2
:
(C/t)x = D (2C/x2)t




( , ...).
(.
) .

D.

- O


( ).

.

:
G<0 S>0



(
).

.
- :
=CMRT
-
CM -
R -
T -

(
)
: 0.145 NaCl, pH=7,
.

,
( )
(
).

 ?
,
.
,
. ?
""
. .
!

,
.
""
.


( ).

.


(Na+, K+, Cl-) (. )
.
A . ?
(.
).
.
, G<0,
S>0.
,
.

:



: Na+, K+, Cl-, Ca+2, H2O.
( )
, , .
( )
( e ).

.: A Bacillus brevis
,
-.
Na+ + (,
), Ca+2.

,
.

,
.
(
) Nistatin amfotericin B
( ).


(, , )
.
, ( )
.

: G<0 S>0.
- ,
.
,
.
: .
: antibiotika

Streptomyces
fulvissimus.
-

+ (
Na+).

,
(102 -104
107 -108 /s)


o: GLUT1 - .
.
.

6 .
GLUT1 .
D- D- (
) GLUT1
.

GLUT1
GLUT1 : (
), , ( ),
( ), (), , ,
.



:
- ( )
( )
.
- .
-
.
-
.
-
.
- .


, ,
(
).

.

.
.
G>0 S<0.
.
P-.
(
).

P
3

1/3 P- .
3/4 ATP- .

 : P-
P- ?
P :
- (
. ).
- ( , ).
- ( ).
- ...
P
( ).
P
( ).
P-
, , , ...
P-

1/4 .
36 P-.


:
- (G>0)
-
- ( )
- (,
...) ( ).
-
( ).
,
(. Na+ K+),
(: N+/K+ P- ).

ouabain digitoxigenin
.
.

N+/K+
N+/K+ P-
.
N+/K+ P-
N+ K+ P-:
ATP+H2O ADP+P+H+
(N+/K+ P-)
N+ K+ .
N+/K+ 10 ms.
N+/K+ P- :
3Na++2K++ATP 3Na++2K++ADP+P+G
G - 50 /mol

[N+]/[K+] = 3/2
, .
( ).
N+ K+
, .


, .

N+/K+
N+/K+ P-
: .
10
().
( ) P P DP (. P
).

. .
N+/K+ P-
.

Na/K

Na/K

- (N+/K+ )
N+/K+ P-
P-.

: a N+ , a
+ .
N+/K+ P

50-70 mV.

Jens Skou je 1997.

.

 (P- P-)

: H+,K+ ATP-a, Ca2+ ATP-ae, K+ ATP-ae,
H+ ATP-ae, ... .
H+,K+ ATP-a
pH .
:
nH++nK++ATP nH++nK++ADP+P+G
Ca2+ ATP-a Ca+2 (0.1)

Ca+2 ( ).
2Ca2++ATP 2Ca2++ADP+P+G

Ca2+ ATP-a

Ca ATP-a

Ca ATP-a

 (P- F-)
H+ ATP-a
(Halobacterium halobium, Escherichia coli), , .
(Halobacterium halobium) ATP-a
(Escherichia coli) H+- (
).

ATP-a (Halobacterium
halobium) (Escherichia coli).
, H+-,
( P ).
ATP-a V ()

pH
(
ATP-a P-

).
H+ ATP-a

H+ ATP-a ATP

"ABC"
-
: -, , , ,
( . ).
MDR1
(
).
"" .
, .
""
( -).

,

, ""
.

""
.

: .


, .
. GluT1 (
).
.

GluT1

GluT7

GluT2

,
,

GluT8

,
,

GluT3

GluT9

GluT4

GluT10

GluT5

, ,

GluT11

GluT6

,
,

GluT12

(
)

GluT1 .

(- ).

 ()
(Sout), (Sin),
"" "" ... ""
:

(
)
)

:
:

:
,

SoutT1 SinT2,
,
,
1 .

1 2.

 ()
,
( 5 m).
, (
) ( ).
GluT4
(, GluT4 ).
?


( ).

GluT4
"".
""
15 .
,

GluT4 .
1 (diabetes mellitus)
,
()
, (

).
2?
? ( .
"" ($$$$$$$$$$).

 (
)
Na+ H+

(, , ...) .
H+

E.
coli:

H+
. ( ).
Na+ .
Na+/K+ ATP- ,
Na+ .


-
.
10 .
.

( ).
( )
.
109 1/s,
( ).
4x107 1/s (
).
,
(.
3+).
?

 -
QP-1. ,

1
(d=2-3).
6
2 (
).

.
,
(-)

.
2



.

- ( )

.
( ),
.

.
.
,
( )
.
, Ca+2
Ca+2
.
,

(107-108 /s)
.
-
(
).

- ( )
"" (
).
"" .
.
-
""
() .

.
,
, (

).
?
patch-calmp (
-
mV, - pA A).

 +
+
Streptomyces lividans.
+
(
).
+ 1.33 10 000
Na+ 0.95 , 108 /s. ?
K+ 4

.

2 ,
-
.

-

-
,
.

 +
, "",
-
+ Na+.
,
.
- (
).
2/3

(. ).
...
( )
H2O
"" (
+). Na+

.
+
,
.

 +
4 + (
).
, 2 .
? 1 3
"" 2 4.


1-3 2-4
.
+

.
,

( 10-100
ns),

.

1
2
3
4

+

 Na+
Na+ -
.

.
Na+ 107 /s.
( )
() .
Na+
.

().
Na+ 1840
4 .
6 .

 Na+
5 6
Na+ ( ).
4
.
"" ( -60 mV)
+40 mV .
4 ( ) .

( )

( )

(+). ?
( )
() . .
, ( 4 )
( ) .
.




, .

.
1000
( ).

"" .
.
,
: .
:
- (
, - )
- ( )
- (, ... )
- ( ).


- ?
- - ?
() ()
.

.

.


-
?
.

? Ca ?
.
: - (, , , , GABA), (,
, , , ) (, ,
, NO, CO, Zn (
...)
- , Ca Ca
.
( )
(
).
- .
Na ,
... .
, -
.
1

 -
-?
- ( )

-

- .

- .

() -
.

 ...


patch-calmp

.
Patch-calmp
( ).
:
- ( 1m)
- .
-
"" .


,
.
gigaseal.


.
Patch-clamp

Patch-calmp


:
- cell attached (

"" - .
- whole cell (

)
-

. .
- inside out ( whole cell


.

.
- outside out ( whole cell

.

Patch-calmp

.
patch-clamp ?
- patch-clamp
-

:
Patch Clamp

Xenopus Oocytes
( )

.
Neher & Sakmann 1991.
patch-clamp


? . ? 2 .
.
( ), ()
NADPH ATP (e-
). 2 ( ).
(, ,
.
( , ),
- 2 .
.
( 2 2)
(, ....
(1,4) (1,6) ...).
Light

1
2



(Atomic Force Microscopy).
,
"", .
-- ,
, - ""
"" .

A . Colli

""
0.1nm.
X Y

0.1 nm.

EPR
-primene u biolokim sistemima-

Spinske probe i spinski

obeleivai
Spinske probe stabilni (dugoivei) slobodni radikali
(nitroksidi) koji se ubacuju u sistem da bi se ispitala neka osobina
Modifikacija osobina
ruka

Sterno zaklanjanje
reaktivne grupe

Spinski obeleivai (spin labels) nitroksidi vezani za druge

molekule praenje ponaanja obeleenih molekula

Spinske probe i obeleivai

(EPR spektri)

TEMPONE

+1
+0
-1

MI

-1
+0
+1

MI

Paramagnetni elektron spin-labela se nalazi u sp3

orbitali izmeu N i O. IN=1, a IO=0.
Jezgro sa spinom 1 ima 3 mogue vrednosti magnetnog
momenta (+1,0,-1) pa dolazi do cepanja oba energetska
nivoa elektrona (mS =1/2 i mS =- 1/2) na po tri.
Iz jednaine E = geB, vidimo da razlike u energiji vode
ka razliitim rezonantnim uslovima.
Na osnovu izbornog pravila mS=1 (spinski nivoi) i mI=0
(Zemanovi nivoi) mogua su 3 prelaza, pa postoje i 3 linije.

EPR spektar

MS=
E1 E2 E3

triplet

* Svaka linija je i dodatno proirena usled interakcije sa protonima (I=1/2) iz susednih CH3 grupa (super hiper fina interakcija), vide se i 13C (I=1/2) sateliti ... ali, polako

Kretanje lipida u membrani

Termalni pokreti
hidrofobnog dela
Ureenost unutranjosti
membrane

Lateralno kretanje lipida

difuzija

Transverzalno kretanje
flip-flop

Fosfolipidne membrane kao modeli za ispitivanje

osobina membrana. Spontano ili indukovano formiranje
fosfolipidnog dvosloja
Planarne membrane (black film)

Liposomi (lipidne vezikule)

spontano ili sonifikacija

SUV
(out-in 65-35%)
Problem je ta sa krajevima, pa se
krajevi zakae za neto

MLV
Multilamellar vesicles

LUV (out-in 50-50%)

Small or large unilamellar vesicles

EM multilamelarne
Goldijeve strukture

Lipozomi - ureenost i fazni prelazi

EPR spinske probe

Fazni prelaz = gel (ureeno) neureeno (teni kristal)

Selektivno obeleavanje pozicije du lanca

DS u vodi

DS u membrani
Uticaj pokretljivosti spinske probe
na izgled EPR spektra

Odreivanje faktora ureenosti S fosfolipidnog

dvosloja metodom EPR spinskih proba

+ H2O

OH

ta se deava sa EPR spektrima spin-labela

kada se ugrade u membranu ???

U vodenom rastvoru

+
Integrisan u membranu
7-DS

Ukupan spektar 7DS-a ugradjenog u membranu potpuno odudara

od onog iz rastvora. Do toga dolazi zbog anizotropije.

5,7,12-DS u membrani
to je fluidnost vea, molekuli se slobodnije kreu pa dolazi do postepenog gubitka anizotropije i spektar je sve
sliniji onom iz rastvora. Spektri za dve ekstremne situacije postaju identini, a ukupni spektar ui zato ???
irina spektralnih linija = (21)-1 + (1 + e2B1212)1/2 2-1 gde su:
1 i 2 longitudinalno i transverzalno relaksaciono vreme, B1 je magnetna komponenta ulaznog zraenja); e je
iromagnetni odnos.
1 opisuje gubitak magnetizacije, relaksaciju koja nastaje kroz proces gde apsorbovana energija prelazi u toplotu
(spin-reetka relaksacija). 2 opisuje gubitak magnetizacije kroz gubitak faze, energija se prenosi sa elektrona na
elektron (spin-spin relaksacija)
irina linije je u principu obrnuto proporcionalna brzini relaksacije.
Kada je membrana rigidnija, spinovi su blii jedan drugome tako
da lake dolazi do spinske difuzije, a vei broj sudara doprinosi
spin-reetka relaksaciji. Relaksacija je tada bra, a linije ire.
Kada se povea mobilnost molekula (spin-label-a) u membrani
relaksacija ide sporije, pa su i linije ue. Ovo je jo jedan faktor,
osim anizotropije, koji daje direktnu vezu izmedju fluidnosti
membrane i irine spektralnih linija.
Fluidnost membrane se poveava od povrine prema
unutra. Polarne glave su relativno gusto spakovane na
povrini, meusobno se privlae ili odbijaju i interaguju
sa vodom u okolini. Od njih se prema sredini membrane
prua(ju) masnokiselinski lanac koji nepolaran. U blizini
glave on je slabo pokretan. Meutim to se ide dalje od
polarnog dela, hidrofobni rep je sve slobodniji i tu se moe
uoiti vea fluidnost.

Odreivanje faznih prelaza lipidnog dvosloja

metodom EPR spin obeleavanja
Fosfolipidi
+
Spinska proba
T = 20 C
Gel ispod faznog prelaza
7-DS
S

T = 75 C
temperatura

Teni kristal iznad faznog prelaza

Lipozomi
lateralna difuzija fosfolipida
Spin-spin irenje

Bliski kontakt spinova dovodi

do irenja linije i indukuje da su
obeleeni fosfolipidi u kontaktu
Pojavljivanje tri linije ukazuje
na razblaivanje lateralnom
difuzijom

Lipozomi
flip-flopfosfolipida

Asc na 0oC
1

Asc na 30oC

0.5

vreme