นิพนธ์ต้นฉบับ

การจำแนกชนิดของไข่น้ำโดยการหาลำดับเบสของยีนในคลอโรพลาสต์
Classification of Water Meal by Using Chloroplast DNA Sequencing

อภิเดช แสงดี,1* เบญจรงค์ วังคะฮาด,2 อุดมลักษณ์ มณีโชติ,3

ปิยะเนตร จันทร์ถิระติกุล,4 อาณัติ จันทร์ถิระติกุล5
Aphidech Sangdee,1* Benjarong Wungkahad,2 Udomluk Maneechote,3
Piyanette Chantiratikul,4 Anut Chantiratikul5

บทคัดย่อ
การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อจัดจำแนกสายพันธุ์ของไข่น้ำจำนวน 18 ตัวอย่างในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทย
โดยการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาภายนอก และลำดับ 5ʹ trnK intron จากการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ

ตั วอย่า งไข่ น้ำ พบว่าตัวอย่างไข่น้ำทั้ง 18 ตัวอย่ า ง มี ฟรอนด์ ลัก ษณะรี แต่ มีค วามกว้า งและความยาวเฉลี่ย ของฟรอนด์

แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 99% และเมื่อนำมาหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน Maturase K และ

ลำดับ 5ʹ trnK intron ได้ความยาวของลำดับนิวคลีโอไทด์จำนวน 431 และ 443 คู่เบส ตามลำดับ ผลจากการเปรียบเทียบ

ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้กับฐานข้อมูล GenBank พบว่าตัวอย่างไข่น้ำจากแหล่งต่าง ๆ มีความคล้ายคลึง

กั บ ลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ข องไข่ น้ ำ สายพั น ธุ์ W. globosa มากที่ สุ ด จากข้ อ มู ล ที่ ไ ด้ จ ากการศึ ก ษาครั้ ง นี้ ท ำให้ มั่ น ใจว่ า ไข่ น้ ำ

ทั้ง 18 ตัวอย่าง เป็นชนิด W. globosa

คำสำคัญ: ไข่น้ำ คลอโรพลาสต์ดีเอ็นเอ การหาลำดับนิวคลีโอไทด์
ว วิทย เทคโน มมส 2553;29(3):259-265

Abstract
The objective of this study was to classify the 18 samples of Wolffia spp. collected from the north-east of Thailand
based on external morphology and partial maturase K gene and 5ʹ trnK intron sequence analysis. All Wolffia samples
showed similar ovoid shape except that their frond size was significantly different in both length and width (p<0.01).
The nucleotide sequence of maturase K and 5ʹ trnK intron consisted of 431 and 443 bps, respectively. These nucleo

tide sequences showed highly homology with muturase K and 5ʹ trnk of W. globosa in GenBank databases,

suggesting that these 18 Wolffia samples are W. globosa.

Keywords: water meal, chloroplast DNA, nucleotide sequencing
J Sci Technol MSU 2010;29(3):259-265
1,2,3
ผู้ช่วยศาสตราจารย์, ภาควิชาชีววิทยา, 4 ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหาสารคาม อำเภอกันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม 44150
5
คณะสัตวแพทยศาสตร์และสัตวศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหาสารคาม อำเภอเมือง จังหวัดมหาสารคาม 44000
1,2,3
Assist. Prof., Department of Biology, 4 Department of Chemistry, Faculty of Science, Mahasarakham University, Kantharawichai District,
Maha Sarakham 44150, Thailand., 5 Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Mahasarakham University, Mueang District,
Maha Sarakham 44150, Thailand.
* Corresponding author: Aphidech Sangdee, Department of Biology, Faculty of Science, Mahasarakham University, Kantharawichai District,
Maha Sarakham 44150, Thailand. E-mail: Aphidech_sangdee@yahoo.com, Received: 17 June 2009; Accepted: 31 August 2009.
260 Sangdee A J Sci Technol MSU

บทนำ ไข่น้ำที่มีลักษณะใกล้เคียงกันได้อย่างชัดเจน และจำแนกได้

ละเอียดกว่าการใช้วิธีการใดวิธีการหนึ่งในการจัดจำแนก
ไข่น้ำ หรือผำ (water meal หรือ wolffia) เป็นพืชสีเขียว

ลอยน้ำที่มีดอกขนาดเล็ก รูปร่างกลมหรือเกือบกลม มีเส้น

จากการที่ในประเทศไทยพบไข่น้ำอยู่หลายชนิด แต่ที่
ผ่าศูนย์กลางไม่เกิน 1 มิลลิเมตร ไม่มีราก ลอยอยู่บนผิวน้ำ พบมาก คือ Wolffia globosa (Roxburgh) Den Hartog and
พบทั่ ว ไปตามหนองบึ ง หรื อ ที่ มี น้ ำ ขั ง อาจเกิ ด เดี่ ย วหรื อ
Van der Plas และ Wolffia arrhiza (Linnaeus) Horker ex
ติดกันเป็นคู่ ดอกมีขนาดเล็กออกเป็นช่อประกอบด้วยดอก Wimmer)7 ดังนั้นจากหลักการและวิธีการในการจัดจำแนก
ตัวผู้ 1 ดอก ดอกตัวเมีย 1 ดอก1,2,3 ไข่น้ำจัดอยู่ในตระกูล ชนิ ด ของไข่ น้ ำ ด้ ว ยวิ ธี ก ารทางด้ า นพั น ธุ ศ าสตร์ โ มเลกุลจึง

(Family) Lemnaceae ซึ่งในตระกูล Lemnaceae แบ่งย่อย น่าจะมีศักยภาพในการนำมาเป็นเครื่องมือในการจัดจำแนก

ออกเป็ น 5 จี นั ส คื อ Lemna spp., Landoltia spp., ชนิดของไข่น้ำในประเทศไทยให้มีความถูกต้องมากขึ้น
Spirodela spp., Wolffiella spp. และ Wolffia spp. ไข่น้ำ

ถูกจัดอยู่ในจีนัส Wolffia spp.4,5 ภายในจีนัสนี้มีสมาชิกอยู่ วัสดุอุปกรณ์และวิธีการศึกษา

หลายชนิด (species) เช่น Wolffia angusta, W. arrhiza, การเก็บรวบรวมและเพิ่มปริมาณ และการศึกษาลักษณะ

W. australiana, W. columbiana และ W. globosa เป็นต้น สัณฐานวิทยาภายนอกของตัวอย่างไข่น้ำ
การจั ด จำแนกไข่ น้ ำ ในอดี ต มั ก ใช้ ลั ก ษณะทาง
เก็ บ รวบรวมตั ว อย่ า งไข่ น้ ำ จากแหล่ ง เพาะเลี้ ย งใน
สัณฐานวิทยาภายนอกและลักษณะทางกายวิภาคในการจัด ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ และแหล่งน้ำธรรมชาติ มาแยกให้
จำแนก แต่พบว่าการใช้ลักษณะดังกล่าวไม่สามารถจำแนก ได้ไข่น้ำที่บริสุทธิ์ปราศจากการปนเปื้อนของพืชน้ำชนิดอื่น
หรื อ แยกชนิ ด ของไข่ น้ ำ ที่ มี ลั ก ษณะทางสั ณ ฐานวิ ท ยา และจุลินทรีย์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ จากนั้นนำมาเพิ่มขยาย
ภายนอกและลักษณะทางกายวิภาคที่มีความใกล้เคียงกัน ปริ ม าณในระดั บ ห้ อ งปฏิ บั ติ ก าร (laboratory scale) ใน
ออกจากกันได้6 นอกจากนี้ยังพบว่าหากไข่น้ำเจริญในสภาวะ อาหารสูตร MS เพื่อใช้ในการศึกษาสัณฐานวิทยาภายนอก
แวดล้ อ มที่ ต่ ำ กว่ า ระดั บ ที่ เ หมาะสมจะทำให้ ลั ก ษณะทาง และการศึกษาอื่น ๆ ต่อไป
สั ณ ฐานวิ ท ยาของไข่ น้ ำ มี ค วามผั น แปรมากจนทำให้ ก าร
จำแนกชนิดของไข่น้ำได้ลำบากมากยิ่งขึ้น ขณะที่ในปัจจุบัน การแยกสกัดจีโนมิกดีเอ็นเอของไข่น้ำ
ได้มีการนำเทคนิคหรือวิธีการทางพันธุศาสตร์โมเลกุลเข้ามา แยกสกัดจีโนมิกดีเอ็นเอ โดยการดัดแปลงวิธีการสกัด
ใช้ในการจัดจำแนกไข่น้ำโดยใช้ยีนในส่วนของคลอโรพลาสต์ จากเนื้อเยื่อพืชของ Doyle and Doyle8 ซึ่งมีวิธีการคร่าว ๆ
เช่ น การเปรี ย บเที ย บลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ข องยี น matK ดังนี้ คือ นำไข่น้ำจำนวน 100-500 มิลลิกรัม มาบดร่วมกับ
coding region, rpl16 intron และ trnK intron ซึ่งเป็นยีนที่ Lysis buffer ที่เติม 2% CTAB ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ในโกร่ง
อยู่ ใ นส่ ว นคลอโรพลาสต์ พบว่ า การเปรี ย บเที ย บลำดั บ
ที่แช่เย็น จากนั้นนำตัวอย่างใส่ลงในหลอด Microcentrifuge
นิ ว คลี โ อไทด์ ข องยีนดังกล่าวสามารถจัดจำแนกไข่ น้ ำ ต่ า ง ขนาด 1.5 มิลลิลิตร แล้วนำไปบ่มที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส
ชนิ ด ที่ มี ลั ก ษณะทางสั ณ ฐานวิ ท ยาภายนอกใกล้ เ คี ย งกั น
นาน 30 นาที จึงนำไปสกัดต่อด้วย Phenol: Chloroform:
ออกจากกันได้อย่างชัดเจน4 นอกจากนั้นยังได้มีการนำวิธี Isoamylalcohol จำนวน 2 รอบ แล้วจึงตกตะกอนดีเอ็นเอ
ผสมผสาน (polyphaxic taxonomy) มาช่วยในการจัดจำแนก ด้ ว ย Isopropanol ที่ แ ช่ เ ย็ น จั ด เก็ บ ตะกอนดี เ อ็ น เอด้ ว ย
พบว่าสามารถจัดจำแนกชนิดของไข่น้ำที่ใกล้เคียงกันออก การนำไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 13,000 รอบต่อนาที เป็น
จากกั น ได้ อ ย่ า งชั ด เจน เช่ น การศึ ก ษาของ Donald
เวลา 20 นาที แล้วล้างตะกอนดีเอ็นเอ 2 ครั้ง ด้วย 70%
และคณะ6 ได้ใช้วิธีผสมผสาน ได้แก่ การวิเคราะห์ลักษณะทาง
ethanol จากนั้นจึงละลายดีเอ็นเอด้วย TE buffer
สัณฐานวิทยา ร่วมกับการวิเคราะห์ฟลาโวนอยด์ (flavonoid),
ออโลไซม์ (allozyme) และการเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอ การเพิ่มปริมาณยีน matK ด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอร์เรส
ไทด์ของยีน matK coding region, rpl16 intron และ trnK นำจีโนมิกดีเอ็นเอที่ได้มาเพิ่มปริมาณยีน matK โดย
intron ในการจัดจำแนกไข่น้ำ พบว่าสามารถแยกชนิดของ ใช้ไพรเมอร์ matK 3 และ matK 5 โดยสภาวะปฏิกิริยาลูกโซ่
Vol 29, No 3, Jul-Sep 2010 Classification of Water Meal by Using Chloroplast DNA Sequencing 261

พอลีเมอร์เรส คือ Initial denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียส ทางสัณฐานวิทยาภายนอกภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อศึกษา

นาน 3 นาที จำนวน 1 รอบ จึ ง เข้ า สู่ ป ฏิ กิ ริ ย าลู ก โซ่ พ อลี รู ป ร่ า ง และขนาด พบว่ า ตั ว อย่ า งไข่ น้ ำ ทั้ ง 18 ตั ว อย่ า ง

เมอร์เรสจํานวน 35 รอบ แต่ละรอบควบคุมสภาวะการทดลอง

มีลักษณะรูปร่างคล้ายคลึงกันมาก โดยในตัวอย่างไข่น้ำจาก
ดั ง นี้ Denaturation ที่ 94 องศาเซลเซี ย ส นาน 1 นาที แหล่งเดียวกัน มีฟรอนด์ที่มีทั้งลักษณะกลมและรี มีสีเขียว
Annealing ที่ 60 องศาเซลเซียส นาน 1 นาที Extension
และเขียวอ่อนสลับกันไป เมื่อพิจารณาสีของฟรอนด์สามารถ
ที่ 72 องศาเซลเซียส นาน 2 นาที และ Final extention ที่
แบ่งไข่น้ำได้เป็น 3 กลุ่ม คือ 1) กลุ่มที่มีฟรอนด์สีเขียวซีด
72 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที จำนวน 1 รอบ จึงตรวจสอบ มาก ได้แก่ CHA, MD, NOB, NOK, NP, SK, SR และ SS
ผลผลิ ต จากปฏิ กิ ริ ย าลู ก โซ่ พ อลิ เ มอร์ เ รส (PCR-product) 2) กลุ่ ม ที่ มี ฟ รอนด์ สี เ ขี ย วซี ด ได้ แ ก่ RO, UBO และ YS

ด้วยเทคนิค Agarose gel electrophoresis 3) กลุ่ ม ที่ มี ฟ รอนด์ สี เ ขี ย วเข้ ม ได้ แ ก่ AUM, BUR, KAR,
การหาลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ (DNA sequencing) และ
KHO, MAH, NR และ UDO (Figure 1)
การวิเคราะห์ข้อมูล
หาลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอในยีน matK ของ
ตัวอย่างไข่น้ำที่พบในพื้นที่ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ โดยใช้
บริ ก ารจากหน่ ว ยบริ ก ารชี ว ภาพ ศู น ย์ พั น ธุ วิ ศ วกรรมและ
เทคโนโลยี ชี ว ภาพแห่ ง ชาติ (BIOTEC) สำนั ก งานพั ฒ นา
วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ (สวทช) แล้วจัดลำดับ
นิ ว คลี โ อไทด์ ใ ห้ ถู ก ต้ อ งด้ ว ยโปรแกรม BioEdit Version
7.0.9.0 หลั ง จากนั้ น ใช้ ฟั ง ก์ ชั น Clustal W Multiple
alignment ในการจัดเรียงลำดับนิวคลีโอไทด์ของไข่น้ำจาก
แหล่งต่าง ๆ เพื่อตัดลำดับเบสส่วนที่เหลื่อมล้ำกันออกก่อน
จากนั้นจึงนำลำดับนิวคลีโอไทด์ไปเปรียบเทียบกับฐานข้อมูล
ออนไลน์ด้วยการใช้โปรแกรม BLAST (NCBI, 2551 ได้จาก
website http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ในการเปรียบเทียบ
วิเคราะห์ คำนวณ และประเมินผลข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์
ของตัวอย่างไข่น้ำจากแหล่งต่าง ๆ กับลำดับนิวคลีโอไทด์ยีน Figure 1 External morphology of tested Wolffia under
matK ในฐานข้อมูลออนไลน์เพื่อระบุชนิดของไข่น้ำ microscopy (40x)
1 = AUM 6 = MAH
ผลการศึกษา 2 = BUR 7 = MD
3 = CHA 8 = NOB
การเก็บรวบรวมและเพิ่มปริมาณ และการศึกษาลักษณะ 4 = KAR 9 = NOK
สัณฐานวิทยาภายนอกของตัวอย่างไข่น้ำ 5 = KHO
สามารถเก็ บ ตั ว อย่ า งไข่ น้ ำ จากจั ง หวั ด ต่ า ง ๆ ใน

ภาคตะวั น ออกเฉี ย งเหนื อ ได้ จ ำนวน 18 ตั ว อย่ า ง คื อ เมื่อพิจารณาขนาดความยาวของฟรอนด์พบว่าไข่น้ำ

อำนาจเจริ ญ (AUM), บุ รี รั ม ย์ (BUR), ชั ย ภู มิ (CHA),
กาฬสินธุ์ (KAR), ขอนแก่น (KHO), มหาสารคาม (MAH),
มุกดาหาร (MD), หนองบัวลำภู (NOB), หนองคาย (NOK),
นครพนม (NP), นครราชสี ม า (NR), ร้ อ ยเอ็ ด (RO),
สกลนคร (SK), สุรินทร์ (SR), ศรีสะเกษ (SS), อุบลราชธานี
(UBO), อุดรธานี (UDO) และยโสธร (YS) มาศึกษาลักษณะ
มีขนาดความยาวเฉลี่ยของฟรอนด์ประมาณ 0.57 มิลลิเมตร
และเมื่ อ นำค่ า เฉลี่ ย ของฟรอนด์ ไ ข่ น้ ำ แต่ ล ะตั ว อย่ า งมา
วิเคราะห์ทางสถิติด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว
(One-way analysis of variance) พบว่าขนาดความยาว
ของฟรอนด์มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่
ระดับความเชื่อมั่น 99%
262 Sangdee A J Sci Technol MSU

เมื่ อ พิ จ ารณาขนาดความกว้ า งของฟรอนด์ พบว่ า การหาลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ (DNA sequencing) และ

ไข่ น้ ำ มี ข นาดความกว้ า งเฉลี่ ย ของฟรอนด์ ป ระมาณ 0.43 การวิเคราะห์ข้อมูล
มิลลิเมตร และเมื่อนำค่าเฉลี่ยของฟรอนด์ไข่น้ำแต่ละตัวอย่าง
จากการนำลำดับนิวคลีโอไทด์ของตัวอย่างไข่น้ำทั้ง
มาวิเคราะห์ทางสถิติด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทาง 18 จั ง หวั ด มาวิ เ คราะห์ ด้ ว ยโปรแกรม BioEdit version
เดี ย วพบว่ า ขนาดความยาวของฟรอนด์ มี ค วามแตกต่ า งกั น
7.0.9.0 พบว่ า ชิ้ น ดี เ อ็ น เอเป้ า หมายที่ ถู ก เพิ่ ม ปริ ม าณโดย

อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 99% ไพรเมอร์ matK3 และไพรเมอร์ matK5 ได้ ค วามยาว

การแยกสกัดจีโนมิกดีเอ็นเอของไข่น้ำ ของลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ที่ น่ า เชื่ อ ถื อ ในการนำมาวิ เ คราะห์

ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมขนาด 431 bp และ 443 bp
จี โ นมิ ก ดี เ อ็ น เอที่ ส กั ด ได้ จ ากฟรอนด์ ข องตั ว อย่ า ง
ตามลำดับ โดยเมื่อวิเคราะห์องค์ประกอบของเบสต่าง ๆ ใน
ไข่น้ำจากแหล่งต่าง ๆ ด้วยวิธี CTAB-Phenol chloroform
ดีเอ็นเอพบว่า เมื่อเพิ่มปริมาณด้วยไพรเมอร์ matK3 ลำดับ
method เมื่ อ นำมาวิ เ คราะห์ โ ดยใช้ วิ ธี Electrophoresis

นิวคลีโอไทด์ประกอบด้วยเบส A ประมาณ 150 เบส, เบส G

บน Agarose gel 1% ย้อมด้วยเอทธิเดียมโบรไมด์ แล้วตรวจ

ประมาณ 69 เบส, เบส C ประมาณ 80 เบสและเบส T

ดู ดี เ อ็ น เอภายใต้ แ สงยู วี พ บว่ า ดี เ อ็ น เอมี ก ารปนเปื้ อ นของ

ประมาณ 131 เบส ขณะที่ เ มื่ อ เพิ่ ม ปริ ม าณด้ ว ยไพรเมอร์

อาร์เอ็นเอและโปรตีนเล็กน้อยโดยภาพรวมมีคุณภาพดีเพียง
matK5 ลำดับ นิวคลีโอไทด์ประกอบด้วยเบส A ประมาณ
พอที่ จ ะนำไปเพิ่ ม ปริ ม าณดี เ อ็ น เอเป้ า หมายด้ ว ยเทคนิ ค
157 เบส, เบส G ประมาณ 91 เบส, เบส C ประมาณ 60
ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลีเมอร์เรส
เบส และเบส T ประมาณ 135 เบส
การเพิ่มปริมาณยีน matK ด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่ เมื่อนำลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นดีเอ็นเอเป้าหมาย

พอลิเมอร์เรส มาวิ เ คราะห์ เ ปรี ย บเที ย บกั บ ข้ อ มู ล ลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ใ น

จากการนำตั ว อย่ า งดี เ อ็ น เอที่ ส กั ด ได้ จ ากตั ว อย่ า ง ฐานข้อมูล GenBank พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอ

ไข่น้ำทั้ง 18 ตัวอย่าง มาเพิ่มปริมาณดีเอ็นในส่วนของยีน เป้ า หมายที่ เ พิ่ ม ปริ ม าณด้ ว ยไพรเมอร์ matK3 มี ค วาม
matK ด้วยไพรเมอร์ matK3 (5ʹAACTAGTCGGATGGAGT คล้ายคลึงกับยีน Maturase K ส่วนลำดับนิวคลีโอไทด์ของ

AG3ʹ) และไพรเมอร์ matK5 (5ʹ TGGGTTGCTAACTCAA

ดี เ อ็ น เอเป้ า หมายที่ เ พิ่ ม ปริ ม าณด้ ว ยไพรเมอร์ matK5 มี
TGG 3ʹ) พบว่าไพรเมอร์ที่ใช้สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ
ความคล้ายคลึงกับลำดับ 5ʹ trnK intron ซึ่งทั้งสองบริเวณ

ในส่วนของยีนดังกล่าวได้ดีเอ็นเอขนาดประมาณ 2700 bp เป็ น ส่ ว นของลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ที่ อ ยู่ บ นคลอโรพลาสต์

(Figure 2) ดีเอ็นเอจริง
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M เมื่อวิเคราะห์รูปแบบความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมใน
รูปแบบ Phylogenetic tree ของตัวอย่างไข่น้ำโดยพิจารณา
จากลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน Maturase K ซึ่งเพิ่มปริมาณ
2700 bp ด้วยไพรเมอร์ matK3 กับลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนดังกล่าว
ของไข่น้ำสายพันธุ์ต่าง ๆ ในฐานข้อมูล GenBank พบว่า
สามารถจัดกลุ่มตัวอย่างไข่น้ำจากแหล่งต่าง ๆ ในภาคตะวัน
ออกเฉี ย งเหนื อ อยู่ ใ นกลุ่ ม เดี ย วกั น กั บ ไข่ น้ ำ สายพั น ธุ์

Figure 2 PCR product of chloroplast DNA from Wolffia W. globosa (Figure 3) ส่ ว นรู ป แบบความสั ม พั น ธ์ ท าง

after separated on 1% agarose gel พันธุกรรมในรูปแบบ Phylogenetic tree ของตัวอย่างไข่น้ำ

Lane M = 1 kb DNA marker Lane 5 = KHO เมื่อพิจารณาจากลำดับนิวคลีโอไทด์ส่วนของลำดับ 5ʹ trnK

Lane 1 = AUM Lane 6 = MAH

Lane 2 = BUR Lane 7 = MD intron ซึ่ ง เพิ่ ม ปริ ม าณด้ ว ยไพรเมอร์ matK5 กั บ ลำดั บ

Lane 3 = CHA Lane 8 = NOB นิวคลีโอไดท์ของยีนดังกล่าวของไข่น้ำสายพันธุ์ต่าง ๆ ใน

Lane 4 = KAR Lane 9 = NOK ฐานข้อมูล GenBank พบว่าเฉพาะ YS และ NR ที่อยู่ในกลุ่ม
Vol 29, No 3, Jul-Sep 2010 Classification of Water Meal by Using Chloroplast DNA Sequencing 263

เดียวกันกับไข่น้ำสายพันธุ์ W. globosa ส่วนตัวอย่างไข่น้ำ ของฟรอนด์ จ ะเปลี่ ย นแปลงไปตามสภาวะแวดล้ อ มที่

จากแหล่งต่าง ๆ ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือในส่วนที่เหลือ เปลี่ยนแปลงไป9 หรืออาจกล่าวได้ว่าลักษณะพันธุกรรมของ
ไม่ ส ามารถจั ด กลุ่ ม กั บ ไข่ น้ ำ สายพั น ธุ์ ใ ดสายพั น ธุ์ ห นึ่ ง ได้ สิ่ ง มี ชี วิ ต ที่ ป รากฏให้ เ ห็ น หรื อ ฟี โ นไทป์ นั้ น เป็ น ผลมาจาก

ชัดเจน (Figure 4) การแสดงออกของยี น ในสภาพแวดล้ อ มหนึ่ ง ๆ 10 จะเห็ น

ได้ ว่ า สภาพแวดล้ อ มที่ แ ตกต่ า งกั น อาจทำให้ ลั ก ษณะทาง

วิจารณ์และสรุปผล สัณฐานวิทยาของพืชสายพันธุ์เดียวกันเปลี่ยนแปลงไปจน
การศึกษาครั้งนี้พบว่าลักษณะสัณฐานวิทยาภายนอกของ ยากต่อการจัดจำแนกด้วยตาเปล่า ดังนั้นจึงจำเป็นอย่างยิ่ง

ไข่น้ำเพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอในการจัดจำแนกชนิดของ ที่ จ ะต้ อ งศึ ก ษาลั ก ษณะทางพั น ธุ ก รรมร่ ว มกั บ ลั ก ษณะ

ไข่น้ำ เนื่องจากลักษณะภายนอก เช่น รูปร่าง สี และขนาด สัณฐานวิทยาภายนอกเพื่อให้ได้ผลการศึกษาที่น่าเชื่อถือ
มากที่สุด
w. brasilinensis
w. australiana
w. borealis ลำดับนิวคลีโอไทด์ในส่วนของ 5ʹ trnK intron และ

w. columbiana
w. elongata
w. neglecta ยีน Maturase K เมื่อนำมาวิเคราะห์โดยใช้โปรแกรม BioEdit
w. angusta
w. cylindracea
SR Version 7.0.9.0 ได้ ค วามยาวของลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ที่

YS
KAR
W. globosa
น่าเชื่อถือในการนำมาวิเคราะห์ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรม
UDO
NR
BUR
ขนาด 443 bp และ 431 bp ตามลำดับ โดยลำดับนิวคลี

NP
RO
MD
โอไทด์ของลำดับ 5ʹ trnK intron ของไข่น้ำจากแหล่งต่าง ๆ

KHO
UBO ทั้ง 18 ตัวอย่างมีความคล้ายคลึงกันน้อยกว่าเมื่อเทียบกับ

AUM
SK
MAH ลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ข องลำดั บ Maturase K ทั้ ง นี้ อ าจ
NOK
CHA
SS เนื่ อ งจากยี น Maturase K ซึ่ ง เป็ น ยี น ที่ มี ก ารแสดงออก

NOB
w. microscopica
Spirodela polyrhyza
ตลอดเวลาจึงมีอัตราการเกิดการกลาย (mutant) ต่ำกว่า
0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00
อัตราการเกิดการกลายของลำดับ 5ʹ trnK intron ซึ่งเป็น

ส่ ว นที่ ไ ม่ มี ก ารแสดงออก โดยปกติ ค วามหลากหลายทาง

Figure 3 Dendrogram of tested Wolffia derived from
พันธุกรรมส่วนใหญ่แล้วจะเกิดขึ้นในส่วนของยีนที่ไม่มีการ
DNA sequences of matK gene which were
แสดงออก (non-coding region) มากกว่าส่วนของยีนที่มี

generated by using matK3 primer

การแสดงออก (coding region)11
w. arrhiza
w. cylindracea
w. columbiana
เมื่ อ นำลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ข องตั ว อย่ า งไข่ น้ ำ จาก

w. angusta
UDO
RO
ภาคตะวันออกเฉียงเหนือมาเปรียบเทียบกับลำดับนิวคลีโอ
NOB
MAH
UBO
ไทด์ของไข่น้ำที่มีรายงานในฐานข้อมูล GenBank ทำให้
SR
SS
NOK สามารถจัดจำแนกไข่น้ำทั้ง 18 ตัวอย่าง อยู่ในกลุ่มเดียวกัน
SK
CHA
KHO
MD
กั บ ไข่ น้ ำ สายพั น ธุ์ W. globosa ได้ อ ย่ า งชั ด เจน โดยยีน
NP
KAR
AUM
Maturase K มีความเหมาะสมในการจัดจำแนกสายพันธุ์ของ
YS
NR
W. globosa ไข่น้ำในประเทศไทยได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าการใช้
BUR
w. neglecta
w. angusta ลำดั บ 5 ʹ trnK intron ซึ่ ง สอดคล้ อ งกั บ การศึ ก ษาของ

w. brasilinensis
w. microscopica
w. borealis
w. australiana
Donald และคณะ4 ที่ใช้วิธีการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน
Spirodela polyrhyza
Maturase K, rbcL gene, trnK intron และ rpl16 intron

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

ในการจัดจำแนกสายพันธุ์ของไข่น้ำจากแหล่งต่าง ๆ ทั่วโลก
Figure 4 Dendrogram of tested Wolffia derived from โดยพบว่ายีน Maturase K ให้ผลการจัดจำแนกสายพันธุ์ได้
DNA sequences of matK gene which were อย่างมีประสิทธิภาพสูงสุดเมื่อพิจารณาจากผลการวิเคราะห์
generated by using matK5 primer ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมในรูป Phylogenetic tree
264 Sangdee A J Sci Technol MSU

จากการจัดจำแนกชนิดของไข่น้ำในภาคตะวันออก ด้วยเหตุผลเหล่านี้จึงทำให้ลักษณะทางพันธุกรรมของ
เฉียงเหนือของประเทศไทยในครั้งนี้พบว่ามีเพียงชนิดเดียว ไข่น้ำอยู่ในอัตราที่ต่ำมาก การศึกษาครั้งนี้เมื่อเปรียบเทียบ

คือ W. globosa แสดงให้เห็นถึงความหลากชนิดของพืช ลำดับนิวคลีโอไทด์ของไข่น้ำจากแหล่งต่าง ๆ ทั้ง 18 แหล่ง

ชนิดนี้มีค่าต่ำซึ่งอาจเป็นผลเนื่องมาจากปัจจัยหลายอย่าง ไม่พบความหลากหลายในลำดับเบสของยีน Maturase K ที่
ดังนี้ เป็ น เช่ น นี้ น อกจากจะเป็ น เพราะความแปรผั น ต่ ำ อั น เนื่ อ ง

1. แหล่งที่อยู่ของไข่น้ำมักเป็นแหล่งน้ำนิ่ง หรือเป็น มาจากแหล่งที่อยู่อาศัย และรูปแบบการสืบพันธุ์ อาจเป็น

แหล่ ง น้ ำ ขั ง ที่ ไ ม่ มี ก ารไหลเวี ย นของน้ ำ ตลอดเวลา เช่ น
ทะเลสาบรู ป แอก หนอง บึ ง ดั ง นั้ น โอกาสที่ ป ระชากร
bp ซึ่งเทียบได้ประมาณ 1 ใน 4 ของความยาวทั้งหมดของ
ไข่น้ำจากแหล่งหนึ่งจะมีโอกาสสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศกับ
ประชากรแหล่งอื่นจึงเกิดขึ้นเฉพาะปีที่มีน้ำหลากโดยการ
เพราะช่วงของลำดับเบสที่ศึกษาเป็นช่วงสั้น ๆ เพียง 431
ยีนนี้ โอกาสที่จะพบจุดที่ลำดับเบสมีการเปลี่ยนแปลงจึงน้อย
ประกอบกับยีน Maturase K ปกติจะมีปลาย 5ʹ ที่มีอัตรา

ไหลไปตามกระแสน้ำไปยังแหล่งน้ำอื่น ๆ โดยมีลำธาร ห้วย ความแปรผั น ของลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ต่ ำ กว่ า ปลาย 3 ʹ

และแม่น้ำใหญ่ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทย การพิจารณลำดับนิวคลีโอไทด์ในช่วงสั้น ๆ เพียง 431 bp

เช่ น แม่ น้ ำ ชี แม่ น้ ำ มู ล และแม่ น้ ำ โขงเป็ น ทางเชื่ อ มช่ ว ย
ซึ่ ง อยู่ ด้ า นปลาย 5 ʹ ของยี น Maturase K จึ ง อาจเป็ น อี ก

ไม่ให้เกิดกลไกการแบ่งแยกทางภูมิศาสตร์ (geographical เหตุ ผ ลหนึ่ ง ที่ ท ำให้ ไ ม่ อ าจพบความแปรผั น ของลำดั บ

separation) ได้ แต่หากปีใดสภาพอากาศแห้งแล้งโอกาสที่จะ นิ ว คลี โ อไทด์ ดั ง นั้ น การหาลำดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ข องยี น ให้

มีการแลกเปลี่ยนสารพันธุกรรมระหว่างประชากรก็จะมีน้อย ครบทั้ ง ยี น ยั ง คงมี ค วามจำเป็ น เพื่ อ ให้ ไ ด้ ผ ลการทดลองที่

แม้ว่าโอกาสที่ประชากรไข่น้ำจะมีการสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศ น่าเชื่อถือมากยิ่งขึ้น
น้อยกว่าพืชดอกชนิดอื่น ๆ เพียงปีละครั้ง แต่ยังถือว่าใน
แต่ ล ะปี อ าจมี โ อกาสการเกิ ด การเคลื่ อ นย้ า ยยี น ระหว่ า ง กิตติกรรมประกาศ
ประชากร (gene flow) อย่างสม่ำเสมอจนไม่สามารถทำให้ คณะผู้วิจัยขอขอบพระคุณคณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัย
เกิดความแตกต่างทางพันธุกรรมของแต่ละประชากรจนนำ มหาสารคาม ที่ให้การสนับสนุนทุนวิจัย ประเภทเงินรายได้
ไปสู่การเกิดการแตกแขนงของสายพันธุ์ได้12 มูลเหตุเหล่านี้ ประจำปี 2551 เพื่อใช้ในการวิจัยครั้งนี้
จึงช่วยอธิบายสาเหตุที่ไข่น้ำมีความแตกต่างทางพันธุกรรม
ระหว่างประชากรในระดับต่ำ เอกสารอ้างอิง
2. การสืบพันธุ์ของไข่น้ำส่วนใหญ่เป็นการสืบพันธุ์ 1. สมศักดิ์ สันวิลาศ. การเจริญเติบโตและปริมาณโปรตีน
แบบไม่ อ าศั ย เพศ คื อ มี ก ารแตกหน่ อ เป็ น หลั ก สำหรั บ
ของไข่ น้ ำ (Wolffia arrhiza (Linn) Wimm.)

การสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศเกิดขึ้นเฉพาะในช่วงเดือนตุลาคม ที่เพาะเลี้ยงด้วยสูตรอาหารและระดับความเข้มแสงต่างกัน

ถึงเดือนมกราคมเท่านั้น และระยะออกดอกของพืชชนิดนี้
ในสภาพกลางแจ้ง. วิทยานิพนธ์ กศ.ม. มหาสารคาม,
จะขึ้ น อยู่ กั บ ความอุ ด มสมบู ร ณ์ ข องสิ่ ง แวดล้ อ มเป็ น หลั ก
มหาวิทยาลัยมหาสารคาม. 2542.
จากรายงานการศึกษาพืชในสกุลเดียวกันกับไข่น้ำคือ พืชใน
จีนัส Lemna spp. พบว่าหากสภาพอากาศมีความแห้งแล้ง 2. อะโน สุ ข เจริ ญ . การเจริ ญ เติ บ โตและปริ ม าณโปรตี น

ติดต่อกันหลายปีอาจไม่ปรากฏระยะออกดอกของพืชจีนัสนี้ ของไข่น้ำ (Wolffia arrhiza (Linn) Wimm.) ที่เพาะเลี้ยง

เลย 13 ระยะการออกดอกที่ เกิ ดขึ้ นได้ย ากนี้อ าจเกิ ด ขึ้ น กั บ ในชนิ ด อาหาร และระดั บ ความเข้ ม แสงต่ า งกั น ใน

ไข่น้ำซึ่งเป็นพืชในกลุ่มเดียวกันกับพืชในจีนัส Lemna spp.

สภาพกลางแจ้ ง . วิ ท ยานิ พ นธ์ กศ.ม. มหาสารคาม,
ดังนั้นหากมีการสืบพันธุ์แบบไม่อาศัยเพศเพียงอย่างเดียว มหาวิทยาลัยมหาสารคาม. 2542.
ลั ก ษณะพั น ธุ ก รรมของฟรอนด์ ลู ก ทั้ ง หมดจะเหมื อ นกั บ
3. ประวิทย์ สุรนีรนาถ อ้างอิงจาก http://www.ku.ac.th/
ฟรอนด์แม่ทุกประการ Agrlnfo/thaifish/aqplant/aqpt068.html
Vol 29, No 3, Jul-Sep 2010 Classification of Water Meal by Using Chloroplast DNA Sequencing 265

4. Donald HL, Crawford DJ, Landolt E, Gabel JD, and 8. Doyle JJ and Doyle JL. A rapid DNA isolation
Kimball RT. Phylogeny and systematics of procedure from small quantities of fresh leaf tissue.
Lemnaceae, the Duckweed family. Systematic Phytochemistry Bulletin 1987; 19:11-15.
Botany 2002. 27:221-240. 9. John C. Available <http://waynesword.palomar.

5. Rothwell GW, Van Atta MR, Ballard Jr HE, and edu/1wayindx.htm> 13 พฤศจิกายน 2550.
Stockey RA. Molecular phylogenetic relationships 10. ประดิษฐ์ พงศ์ทองคำ. พันธุศาสตร์. คณะวิทยาศาสตร์
among Lemnaceae and Araceae using the มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, กรุงเทพฯ: ปี, 2543
chloroplast trnL-trnF intergenic spacer. Molecular
Phylogenetics and Evolution 2004. 30:378-385. 11. Clark DP. Understanding the genetic revolution.
Molecular biology. Carbondale, Illinois, Southern
6. Donald HL, Landolt E, Crawford DJ. Systematics
Illinois University; 2005.
of the Lemnaceae (duckweeds): inferences

from micromolecular and morphological data.

12. ไพโรจน์ ประมวล. วิวัฒนาการ (Evolution). มหาสารคาม:
Plant Systematics and Evolution 1997; 204:
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหาสารคาม; 2550.
161-177. 13. Vasseur L, Aarssen LW, and Bennett T. Allozymic
7. ธวั ช ชั ย รั ต น์ ช เลศ และเจมส์ เอฟ แมกซ์ เ วล.
variation in local apomicti populations of Lemna
รายชื่อวัชพืชที่มีรายงานพบในประเทศไทย. เชียงใหม่: minor (Lemnaceae). American Journal of Botany.
บริษัทเมืองเหนือจำกัด; 2535. 1993; 80(8):974-9.