2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Lựa chọn các điều kiện định lượng enrofloxacin tồn dư trong thịt
gia cầm
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ

Xác định các thông số tối ưu cho MS/MS:

- Sử dụng hệ thống sắc ký khối phổ UPLC - MS/MS loại tứ cực chập 3 với
nguồn ion hóa kiểu ESI.

- Chọn chế độ khảo sát tự động để chọn ion mẹ, ion con dùng để định lượng,
định tính.

- Các thông số MS/MS được tự động tối ưu bằng chế độ MS tune của thiết
bị.

2.2.1.2. Khảo sát điều kiện sắc kí

a. Chọn cột sắc ký

- Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột phân tích :

+ Cột ACQUITY UPLC HSS C18 1,8 μm; 2,1 x 30 mm

+ Cột ACQUITY UPLC BEH C18 1,7 μm; 2,1 x 50 mm

Các điều kiện cố định:

- Thiết bị phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Xevo TQD Water,
CBIC/Eqm .01.01
- Pha động: ACN: acid formic 0,1%
- Nồng độ mẫu: 10 ng/mL
- Thể tích tiêm mẫu: 1 µL
- Tốc độ dòng : 0,2 mL/ phút
 - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Thời gian chạy mẫu: 3 phút
Lựa chọn cột có khả năng phân tách tốt với pic cân đối, kết quả về hệ số bất
đối xứng nhỏ hơn 1,5, số đĩa lý thuyết đủ lớn.
b. Chọn tỷ lệ pha động

- Khảo sát tỷ lệ của pha động ở các tỷ lệ 85:15, 90:10;95:5

Các điều kiện được cố định:
- Thiết bị phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Xevo TQD Water,
CBIC/Eqm .01.01
- Cột: lựa chọn theo mục a phần 2.2.1.2
- Pha động: ACN: acid formic 0,1%
- Mẫu tiêm: mẫu thử Enrofloxacin nồng độ 10 ng/ml.
- Thể tích tiêm mẫu: 1 µL
- Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Thời gian chạy mẫu: 3 phút
Tiến hành sắc ký, dựa vào kết quả sắc ký đồ của 3 mẫu thử chạy sắc ký ở 3
tỷ lệ pha động khác nhau, chọn ra tỷ lệ pha động cho píc với thời gian lưu và độ
chọn lọc tốt nhất.
c. Khảo sát tốc độ dòng
Tiến hành khảo sát tốc độ dòng ở 2 giá trị là 0,2 mL/phút và 0,3 mL/phút
Các điều kiện cố định:

- Thiết bị phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Xevo TQD Water,
CBIC/Eqm .01.01
- Cột: lựa chọn theo mục a phần 2.2.1.2
- Pha động: ACN: acid formic 0,1% lựa chọn theo mục b phần 2.2.1.2
 - Mẫu tiêm: mẫu thử Enrofloxacin nồng độ 10 ng/ml.
- Thể tích tiêm mẫu: 1 µL
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Thời gian chạy mẫu: 3 phút
Tiến hành sắc ký, dựa vào kết quả sắc ký đồ của 2 mẫu đo ở 2 tốc độ dòng
khác nhau, chọn ra tốc độ dòng cho píc với thời gian lưu và độ chọn lọc phù hợp
nhất.

d. Khảo sát thể tích tiêm

Tiến hành khảo sát thể tích tiêm ở 3 giá trị là 5 µL, 2 µL,1 µL.
Các điều kiện cố định: dựa trên các khảo sát ở mục a,b,c phần 2.2.1.2.

Tiến hành sắc ký, dựa vào kết quả sắc ký đồ của 3 mẫu đo ở 3 thể tích tiêm
khác nhau, chọn ra thể tích tiêm cho píc với thời gian lưu và độ chọn lọc phù hợp
nhất
2.2.1.2. Khảo sát xử lý mẫu thịt gia cầm
Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành xử lý mẫu theo qui trình sau:

Cân thịt gà đã xay nhuyễn cho vào ống ly tâm 50ml.

Thêm dung dịch K2HPO4 0,1M vào các mẫu đã chuẩn bị, lắc vortex 10 phút.
Ly tâm 15 phút ở tốc đô ̣ 4000 vòng/ phút. Lấy 5 ml dịch chiết sau ly tâm cho qua
cột SPE MCX.

Làm sạch bằng cột SPE MCX 6 ml/150 mg

+ Hoạt hóa cột bằng 5 ml MeOH, 5 ml nước cất, sau đó cho 5 ml đệm chiết
mẫu K2HPO4 0,1M

+ Load mẫu lên cột, tốc độ 1 ml/phút. (Không để khô cột giai đoạn cho mẫu
lên cột và rửa cột).

+ Rửa bằng 4 ml nước, sau đó rửa tiếp bằng 4 ml MeOH.

 + Rửa giải bằng 4ml NH4OH 5% trong MeOH.

- Dung dịch rửa giải được thổi khô bằng khí N2 ở 400C. Hòa tan cặn khô
bằng 1 ml pha động, vortex và lọc qua màng lọc 0,45µm. Dịch lọc được phân tích
bằng máy UPLC/MS/MS.

Tiến hành khảo sát các yếu tố của qui trình xử lý mẫu thông qua độ thu hồi
và độ lặp lại ở các mẫu:

- Khối lượng mẫu thịt gà: khảo sát các khối lượng 1, 2 và 5g.
Các điều kiện cố định: VK2HPO4 0,1M =10 mL và VNH4OH= 4 mL
- Thể tích dung môi rửa giải NH4OH 5% trong MeOH: 1,2 và 4ml.
Các điều kiện cố định: m=1g và VK2HPO4 0,1M =10 mL

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỊNH LƯỢNG
ENROFLOXACIN TRONG THỊT GIA CẦM
Từ các kết quả thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu và điều
kiện sắc ký lỏng khối phổ để định lượng enrofloxacin trong thịt gia cầm như sau:

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

a. Khảo sát cột phân tích

Kết quả khảo sát hiệu lực cột phân tích được thể hiện qua sắc ký đồ như hình
3.1 và 3.2:
 C122 Smooth(Mn,2x2) MRM of 2 channels,ES+
360.04 > 245.02
0.08 1.659e+004
100

1.19
0.92 1.27 1.56 1.81
2.13 2.36
% 2.61 2.76

0 min
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin khi sử dụng cột 2,1 x 30
mm
C149 Smooth(Mn,2x2) MRM of 2 channels,ES+
360.04 > 245.02
enrofloxacin 3.629e+005
100 0.53
16477
1.65e4

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.2: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin khi sử dụng cột 2,1 x 50
mm

Dựa vào kết quả về sắc ký đồ thu được, ta thấy sắc ký đồ ở hình 3.1 không
lên pic, sắc ký đồ hình 3.2 cho pic cân xứng, pic tách hoàn toàn khỏi pic tạp có
trong mẫu. Do đó, cột LC C18 1,7 μm; 2,1 x 50 mm là phù hợp nhất, lựa chọn cột
này làm cột dùng cho phân tích.
 b. Khảo sát pha động
Tiến hành khảo sát tỷ lệ của pha động bao gồm dung môi ACN và acid
formic 0,1% ở các tỷ lệ 85:15, 90:10, 95:5 cho kết quả thu được thể hiện qua các
sắc ký đồ sau:
C223 Smooth(Mn,2x2) enrofloxacin MRM of 2 channels,ES+
0.50 360.04 > 245.02
18449 4.092e+005
100

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.3: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở pha động có tỷ lệ 85:15
C149 Smooth(Mn,2x2) MRM of 2 channels,ES+
360.04 > 245.02
enrofloxacin 3.629e+005
100 0.53
16477
1.65e4

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.4: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở pha động có tỷ lệ 90:10
 C228 Smooth(Mn,2x2) enrofloxacin MRM of 2 channels,ES+
0.52 360.04 > 245.02
12184 2.177e+005
100

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.5: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở pha động có tỷ lệ 95:5

Dựa vào sắc ký đồ thu được khi khảo sát hệ pha động ở các tỷ lệ khác nhau,
ta thấy sắc kí đồ ở hình 3.3 píc không cân xứng, có hiện tượng kéo dài đuôi. Ở hình
3.4, hệ pha động ở tỷ lệ 90:10 có khả năng tách tốt, píc gọn, cân đối và thời gian
lưu phù hợp, còn ở hình 3.5 thì pic không cân xứng, có hiện tượng dãn pic. Do đó
lựa chọn tỷ lệ 90:10 để khảo sát những bước tiếp theo.

c. Khảo sát tốc độ dòng

Kết quả khảo sát tốc độ dòng được thể hiện qua sắc ký đồ như hình 3.6 và
3.7:
C213 Smooth(Mn,2x2) enrofloxacin MRM of 2 channels,ES+
0.53 360.04 > 245.02
20933 4.566e+005
100

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.6: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở tốc độ 0,2 ml/ phút
 C219 Smooth(Mn,2x2) MRM of 2 channels,ES+
360.04 > 245.02
0.35 3.487e+005
100

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.7: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở tốc độ 0,3 ml/ phút

Dựa vào sắc ký đồ thu được khi khảo sát tốc độ dòng ở 2 giá trị . Hình 3.6
pic cân đối

c. Khảo sát thể tích tiêm

Kết quả khảo sát thể tích tiêm được thể hiện qua sắc ký đồ như hình 3.8 và
3.9 và 3.10:

C204 Smooth(Mn,2x2) enrofloxacin MRM of 2 channels,ES+

0.53 360.04 > 245.02
65728 1.404e+006
100

0.62

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở thể tích 5 µL

 C208 Smooth(Mn,2x2) enrofloxacin MRM of 2 channels,ES+
0.52 360.04 > 245.02
38126 8.278e+005
100

0.61

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở thể tích 2 µL

C212 Smooth(Mn,2x2) enrofloxacin MRM of 2 channels,ES+

0.53 360.04 > 245.02
21657 4.627e+005
100

0 min
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

Hình 3.10: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Enrofloxacin ở thể tích 1 µL

Dựa vào sắc ký đồ thu được khi khảo sát thể tích tiêm ở các tỷ lệ khác nhau,
ta thấy sắc kí đồ ở các hình 3.8 và 3.9 có các pic phụ ở thời gian 0,62 phút và 0,61
phút cao sẽ ảnh hưởng đến mẫu chuẩn khi đo ở nồng độ cao. Sắc kí đồ hình 3.10
có ưu điểm nổi bật cho pic khá cân xứng, píc gọn và có độ chọn lọc cao. Do vậy,
lựa chọn thể tích tiêm V= 1µL cho quá trình sắc ký.

Dựa trên kết quả khảo sát cột, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm xác
định được điều kiện sắc ký để tiếp tục tiến hành nghiên cứu như sau:

Cột sắc ký: cột LC C18 1,7 μm; 2,1 x 50 mm

Dung môi pha động là ACN : acid formic tỷ lệ 90:10

Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút

Thể tích tiêm: 1 µL.

3.1.2. Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu:

* Khảo sát khối lượng mẫu thịt gà: khảo sát các khối lượng 1, 2 và 5g.

Các điều kiện cố định: VK2HPO4 0,1M =10 mL và VNH4OH= 4 mL

Khối lượng thịt gà (g) Tỷ lệ thu hồi (%)

1 79,78-82,03
2 79,64-85,33
5 82,57-85,98
Độ thu hồi và độ tái lặp ở cả 3 mức khối lượng không có sự khác biệt khi
phân tích, tuy nhiên mẫu 2 và 5g có khối lượng lớn, quá trình đồng nhất mẫu khó
khăn hơn mẫu 1g, nhiễu đường nền cũng cao hơn có thể do khối lượng mẫu lớn,
lượng tạp trong mẫu nhiều hơn. Vì vậy chọn khối lượng mẫu là 1g để tiến hành
phân tích.

* Khảo sát thể tích dung môi rửa giải NH4OH 5% trong MeOH: 1,2 và 4ml.

Các điều kiện cố định: VK2HPO4 0,1M =10 mL và m=1g

Thể tích dung môi rửa giải (ml) Tỷ lệ thu hồi (%)
 1 20,56-22,78
2 40,76-46,87
4 80,78-82,1

Độ thu hồi và độ tái lặp ở cả 3 thể tích có sự khác biệt khi phân tích, tuy
nhiên mẫu 1 và 2 ml có thể tích kém hơn, quá trình đồng nhất mẫu khó khăn hơn
mẫu 4ml, nhiễu đường nền cũng cao hơn có thể do khối lượng mẫu lớn, lượng tạp
trong mẫu nhiều hơn. Vì vậy chọn khối lượng mẫu là 4ml để tiến hành phân tích.

Nhận xét:

- Theo kết quả nghiên cứu ở trên, lựa chọn được qui trình xử lý mẫu để tiếp
tục tiến hành thẩm định phương pháp như sau:

Cân 1g thịt gà đã xay nhuyễn cho vào ống ly tâm 50ml.

Thêm dung dịch 10ml K2HPO4 0,1M vào các mẫu đã chuẩn bị, lắc vortex 10
phút. Ly tâm 15 phút ở tốc đô ̣ 4000 vòng/ phút. Lấy 5 ml dịch chiết sau ly tâm cho
qua cột SPE MCX.

Làm sạch bằng cột SPE MCX 6 ml/150 mg

+ Hoạt hóa cột bằng 5 ml MeOH, 5 ml nước cất, sau đó cho 5 ml đệm chiết
mẫu K2HPO4 0,1M

+ Load mẫu lên cột, tốc độ 1 ml/phút. (Không để khô cột giai đoạn cho mẫu
lên cột và rửa cột).

+ Rửa bằng 4 ml nước, sau đó rửa tiếp bằng 4 ml MeOH.

+ Rửa giải bằng 4 ml NH4OH 5% trong MeOH.

- Dung dịch rửa giải được thổi khô bằng khí N2 ở 400C. Hòa tan cặn khô
bằng 1 ml ACN:acid formic (90:10), vortex và lọc qua màng lọc 0,45µm. Dịch lọc
được phân tích bằng máy UPLC/MS/MS.