You are on page 1of 8

STANDARD OPERATION PROCEDURE

TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN


HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

Distribution to:

VN: BHC-Filling VN: BHC-Human


VN: BHC-Everyone
Packaging Supervisor Resources Department
VN: BHC-Department VN: BHC-Industrial VN: BHC-MRP - MRP
Heads Performance group
VN: BHC-NQCC VN: BHC-Outsourcing
VN: BHC Supervisors
Department Department
VN: BHC-Coffee and VN: BHC-QA VN: BHC-SC
X
Beverage Supervisors Supervisors Warehouse
VN: BHC-
VN: BHC-Culinary VN: BHC-Engineering
Administration
Supervisors Supervisors
Department
VN: BHC-Application
VN: BHC-Management
Group Supervisors

Document change:

Rev. Effective date Page Nature of change


1 -

Page 1 of 8
STANDARD OPERATION PROCEDURE
TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

I. Mục đích
Vi sinh vật hiếu khí chịu nhiệt trung bình được xem như chỉ thị vi sinh cho chất lượng của
thực phẩm. Mặc dù chỉ giới hạn trong việc đánh giá sự an toàn của sản phẩm, số lượng vi sinh
này là giá trị cho sự chỉ định những sai lệch trong quy trình sản xuất, bảo quản v vận chuyển.
Tài liệu này mô tả hai phương pháp với kết quả như nhau cho việc đếm vi sinh vật hiếu khí
chịu nhiệt trung bình trong tất cc dạng sản phẩm :
- Phương pháp đếm đĩa tiêu chuẩn
- Phương pháp đếm đĩa Petrifilm
Chú ý: Những kỹ thuật khác không được mô tả ở đây, như là cấy trải trên bề mặt môi trường,
nhỏ giọt trên đĩa hoặc phương pháp cấy vòng tròn đĩa có thể được sử dụng cho những ứng
dụng đặc biệt.

II. Phạm vi áp dụng


Tài liệu này hướng dẫn phương pháp đếm vi khẩn hiếu khí có trong mẫu nguyên liệu, mẫu
trên dây chuyền sản xuất, mẫu thành phẩm và mẫu môi trường,...

III. Tài liệu tham khảo


LI-00.701-2 Enumerration of Aerobic Mesophilic Microorganisms.

IV. Nội dung


1. Định nghĩa.....................................................................................................................3
2. Nguyên lý.......................................................................................................................3
2.1 Kiểm tra TPC chuẩn bằng phương pháp đổ đĩa.......................................................3
2.2 Kiểm tra TPC bằng Petrifilm...................................................................................3
2.3 Kiểm chứng..............................................................................................................3
3. Hướng dẫn an toàn.......................................................................................................3
4. Hóa chất và dung môi...................................................................................................4
4.1 Yêu cầu về hóa chất.................................................................................................4
4.2 Chuẩn bị môi trường................................................................................................4
a. Phương pháp đếm đĩa.......................................................................................4
b. Phương pháp Petrifilm......................................................................................5
5. Tiến hành.......................................................................................................................5
5.1 Lấy mẫu....................................................................................................................5
5.2 Chuẩn bị mẫu...........................................................................................................5
5.3 Cấy mẫu...................................................................................................................5
a. Phương pháp đếm đĩa chuẩn.............................................................................5
b. PetrifilmTM......................................................................................................5
5.4 Ủ mẫu.......................................................................................................................6
5.5 Đọc kết quả..............................................................................................................6
6. Tính toán và diễn giải kết quả.....................................................................................6
7. Độ chính xác của phương pháp...................................................................................7
7.1 Phương pháp đổ đĩa..................................................................................................7

Page 2 of 8
STANDARD OPERATION PROCEDURE
TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

7.2 Phương pháp Petrifilm.............................................................................................7


8. Sơ đồ phân tích..............................................................................................................8

1. Định nghĩa
Aerobic mesophilic microorganisms (Vi sinh vật hiếu khí chịu nhiệt trung bình): bao
gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc hình thành khuẩn lạc dưới những điều kiện được
định rõ trong LI này.
Aerobic mesophilic count = AMC ( số đếm vi sinh hiếu khí chịu nhiệt trung bình);
aerobic plate count or plate count (APC :số đếm đĩa vi sinh hiếu khí); standard plate
count (SPC: Số đếm đĩa chuẩn) và Total viable count (TVC: Tổng số đếm vi sinh vật
sống) là thuật ngữ chung được sử dụng để diễn đạt số lượng vi sinh vật hiếu khí chịu
nhiệt trung bình.
Counts (Tổng số đếm) được tính bằng những đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony
forming unit = CFU) trên gram hoặc ml.

2. Nguyên lý
2.1 Kiểm tra TPC chuẩn bằng phương pháp đổ đĩa
Cho vào đĩa Petri ( Þ8.5-10 cm) đã được khử trùng 1 ml dung dịch mẫu, thêm 15 ml
môi trường không chọn lọc PCA (44-47oC) vào đĩa. Hòa môi trường và mẫu cẩn thận
cho đều, để môi trường nguội và đông đặc lại. Nuôi cấy ở 30 ± 1 oC trong 72 ± 3 giờ.
Không được chồng các đĩa Petri quá 6 lớp. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc, kết quả
được tính trong 1g hoặc 1ml mẫu.
2.2 Kiểm tra TPC bằng Petrifilm
Một lượng nhỏ dung dịch mẫu được cho vào trên miếng film được phủ môi trường
và trải đều mẫu trên bề mặt bằng que trải mẫu bằng nhựa. Nuôi, đếm và tính kết quả
theo 3.1
Chú ý:
Không sử dụng AC-PetrifilmTM trong các trường hợp sau:
 Sản phẩm có chocolate và cocoa như Milo, trừ trường hợp mẫu được pha
lỗng đủ để không gây ra trường hợp loang màu trên petrifilm.
 Sản phẩm có sử dụng ezyme như amylase hoặc mannanase để làm tăng độ
hịa tan của ngũ cốc, cc phụ gia lm đặc hay các sản phẩm từ bột.
 Sản phẩm có Bacillus, sẽ làm hóa lỏng thành phần gel trên petrifilm.
2.3 Kiểm chứng
Phương pháp đếm đĩa tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 4833:1991và phương
pháp Petrifilm tương đương với phương pháp AOAC 990.12

3. Hướng dẫn an toàn


Trước khi sử dụng hóa chất cần thực hiện theo hướng dẫn Sigma/Aldrich về an toàn hóa
chất hoặc những sổ tay tương đương được cho phép sử dụng của nhà nước và của nhà
cung cấp.

Page 3 of 8
STANDARD OPERATION PROCEDURE
TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

Cas No Hợp chất Nguy hại Khuyến cáo Thải bỏ


Hóa chất thải, không
2,3,5-Triphenyl-2h- Tránh tiếp xúc
298-96-4 Chất kích thích có khuyến cáo đặc
tetrazolium chloride và hít
biệt,

4. Hóa chất và dung môi


4.1 Yêu cầu về hóa chất
3M Fluka Merck Oxoid
Plate count Agar 105463 CM0325
Agar- agar 101614 LP0013
Triphenyltetrazolium chloride 93140
PetrifilmTM Aerobic count Plate 3M -
Buffer Pepton water 107228

4.2 Chuẩn bị môi trường


a. Phương pháp đếm đĩa
Chuẩn bị môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất

i. Plate Count Agar (PCA)


PCA 22.5 g
Nước cất 1000ml

pH sau khi khử trùng là 7.0 ± 0.2 (ở 25oC)

Khi tiến hành kiểm tra các sản phẩm từ sữa, thêm bột skim milk vào môi trường với
lượng 1g/1 lit. Bột skim milk phải không có các thành phần gây ức chế (như kháng
sinh).

ii. Water agar


Agar – Agar 12 g
Nước cất 1000ml
pH sau khi khử trùng là 7.0 ± 0.2 ( ở 25oC)

 Môi trường b và c được hòa tan bằng cách đun sôi. Điều chỉnh pH nếu
cần thiết và hấp khử trùng trong 15 phút ở 121oC.
 Những chai môi trường đã hấp khử trùng được để ở nơi tối ở 3  2oC,
có thể dùng trong 3 tháng hoặc dùng trong 2 tuần nếu để ở nhiệt độ
thường.
 Trước khi sử dụng, làm tan môi trường bằng cách đun cách thủy trong
bể gia nhiệt, trong autoclave hoặc lò vi sóng (microwave oven)
 Nếu sử dụng môi trường ngay sau khi hấp khử trùng, phải để môi
trường nguội tới 44-47 oC trong bể ổn nhiệt trước khi sử dụng.

Page 4 of 8
STANDARD OPERATION PROCEDURE
TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

iii. Triphenyl tetrazolium chloride ( TTC)


Chuẩn bị dung dịch TTC 1%: Cân 1 g TTC hòa tan trong 100 ml nước cất và
lọc khử trùng.
Có thể dùng dung dịch thương mại đã pha sẵn có nồng độ tương tự.

b. Phương pháp Petrifilm


i. Buffer peptone water (BPW)
Chuẩn bị môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kiểm tra chất lượng
môi trường theo hướng dẫn LI-00.702 và LI-00.703 hoặc theo thông tin của
nhà cung cấp.

ii. PetrifilmTM Aerobic Count Plate


Sử dụng AC-PetrifilmTM và bảo quản theo hướng dẫn của nhà cung cấp.

5. Tiến hành
5.1 Lấy mẫu
Lấy mẫu theo tiêu chuẩn của sản phẩm liên quan
Việc lấy mẫu và giữ mẫu theo LI-00.700 hoặc theo những LI chuyên biệt.
5.2 Chuẩn bị mẫu
Việc chuẩn bị mẫu và dung dịch pha loãng được mô tả theo LI-00.700 hoặc trong những
trường hợp đặc biệt theo những LI thích hợp cho những sản phẩm chuyên biệt.
Đối với sản phẩm chua như Nestea, dùng BPW thay cho dung dịch ringer khi sử
dụng Petrifilm.
5.3 Cấy mẫu
a. Phương pháp đếm đĩa chuẩn
 PCA được đun cách thủy cho tan, giữ ở 44-47oC trong 15 phút trước khi sử
dụng.
 Dùng pipette vô trùng hút 1ml dung dịch mẫu cho vào petri (đường kính 8.5-
10 cm)
 Thêm 15 ml PCA, trộn đều mẫu và môi trường thật cẩn thận, để thạch nguội
và đông lại. (Thời gian từ khi pha loãng mẩu đến khi rót PCA không vượt
quá 15 phút)
 Nếu cần thiết, có thể đổ thêm lớp thứ hai khoảng 5 ml water agar lên lớp
PCA đã đông cứng để hạn chế sự lan rộng trên bề mặt thạch của vi sinh vật
như Bacillus spp.

b. PetrifilmTM
Nhấc cẩn thận lớp film bên trên và cho 1ml dịch mẫu vào giữa lớp bên dưới. Để
miếng bên trên sao cho không có bọt khí xuất hiện giữa lớp trên và lớp dưới. Phân
phối mẫu dàn trải đều trên lớp film bên dưới bằng cách ép nhẹ vào plastic
spreader. Nhấc plastic spreader lên và chờ ít nhất 1 phút để cho lớp gel đông đặc
lại. (Tham khảo thêm hướng dẫn sử dụng của 3M).
Chú ý: thời gian từ lúc cấy mẫu cho đến lúc nuôi ủ mẫu không vượt quá 45 phút.

Page 5 of 8
STANDARD OPERATION PROCEDURE
TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

5.4 Ủ mẫu
Lât ngược các đĩa và nuôi trong 72  3 giờ ở 30  1oC. Không để chồng lên nhau
quá 6 đĩa.
Đối với Petrifilm không lật ngược, không được chồng quá 20 miếng, cung cấp độ ẩm
cho tủ ấm để giảm thiểu sự mất ẩm.
Chú ý:
Có thể nuôi ở thời gian ngắn hơn trong 48 giờ ở 35-37 oC(FDA,1992).Trong
những trường hợp này sự tương đương đối với kết quả đạt được ở 30 oC trong 72
giờ nên được kiểm tra (kết quả tùy thuộc vào dạng vi sinh vật).

5.5 Đọc kết quả


Đếm những khuẩn lạc sau khi nuôi. Kiểm tra đĩa và petrifilm thật cẩn thận, nếu cần
thiết nên dùng máy đếm khuẩn lạc để tránh lấy nhầm những phần tử mẫu hoặc chất
kết tủa thay vì những khuẩn lạc thật nhỏ. Một khuẩn lạc mọc lan được xem là 1
khuẩn lạc duy nhất.

Chú ý :
 Đối với phương pháp tiêu chuẩn, để đọc kết quả cho những đĩa khó đọc nên cho
thêm vào những đĩa này một lớp 1ml dung dich TTC và đọc kết quả sau 1-2 giờ
nuôi tiếp theo đó. Phần lớn các khuẩn lạc sẽ chuyển sang hồng cho đến đỏ
 Đối với Petrifilm, các khuẩn lạc chuyển từ màu hồng sang đỏ tùy thuộc vào sự
có mặt của TTC trên tấm film phía trên.

6. Tính toán và diễn giải kết quả


Lấy số lượng từ những đĩa có từ 15 – 300 khuẩn lạc. Số lượng CFU được tính như sau:
c
Số khuẩn lạc trong 1g hoặc 1ml mẫu =
(n1 + 0.1n2) x d

c : tồng số khuẩn lạc trong các petri


n1 : số petri ở nồng độ pha loãng mẫu đầu tiên có số khuẩn lạc từ 15-300 CFU
n2 : số petri ở nồng độ pha loãng thứ hai có số khuẩn lạc từ 15-300 CFU
d : hệ số pha loãng của nồng độ pha loãng đầu tiên

Ví dụ : nồng độ 10-2 : 278 khuẩn lạc


nồng độ 10-3 : 33 khuẩn lạc

278+33
Số khuẩn lạc trong 1g = = 2.8 x104 CFU/g
-2
[1+0.1x 1]. 10
(Xem LI-00.700 cho những trường hợp đặt biệt)

Page 6 of 8
STANDARD OPERATION PROCEDURE
TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

7. Độ chính xác của phương pháp


7.1 Phương pháp đổ đĩa
Repeatability r = 0.25log10
Reptoducibility R = 0.45log10
7.2 Phương pháp Petrifilm
 Độ chính xác các kiểm nghiệm những sản phẩm thịt, gia cầm, sản phẩm chế
biến từ sữa, hải sản, rau quả, sản phẩm từ trứng và một số loại khác có
Repeatability = 0.147
 Đối với sữa thô (raw milk) thì các thông số đó là:
Repeatability ( r ) Reproducibility ( R )
3-4log CFU/ml 0.161 0.571
4-5log CFU/ml 0.308 0.847
5-6log CFU/ml 0.235 0.528
3-7log CFU/ml 0.220 0.477

Page 7 of 8
STANDARD OPERATION PROCEDURE
TITLE: HƯỚNG DẪN KIỂM TRA TỔNG VI KHUẨN
HIẾU KHÍ
Author Position: Name: Classification: Yellow
Document No.: 2131.QA.SOP.MLA.603
Approver Position: Name: Revision: 01
Effective Date: 09.2011

8. Sơ đồ phân tích
Các bước thực hiện Những điểm quan trọng

Chuẩn bị mẫu/ pha loãng mẫu Tham khảo LI-700 hoặc những LI chuyên biệt

Mơi trường: Kiểm tra chất lượng theo LI-00.702-1 hoặc những đề nghị của
Bảo quản Petrifilm theo đề nghị của nh cung cấp
Cấy:
Để nguội thạch về 45-46oC trước khi đổ đĩa.
Cấy 1ml dung dịch mẫu vào
Hịa đều mẫu cấy v mơi trường.
Đảm bảo sự phn bố đều của dịch cấy trn PetrifilmTM
PCA hoặc Petrifilm adverse

Nuôi : 30 ±1 oC/72±3giờ. Áp dụng ICP để đảm bảo nhiệt độ nuơi cấy thật chính xác.
( 35 - 37 ±1 oC/ 48 giờ)

Đếm những chấm nhỏ. Dùng dung dịch TTC nếu cần thiết
Chỉ sử dụng những số đếm trong khoảng 15 – 300 khuẩn lạc để tính kết q
Đếm khuẩn lạc/ Tính kết quả

Page 8 of 8

You might also like