Professional Documents
Culture Documents
3 4
• Từ xưa, con người đã biết sử dụng một số thực vật để tắm gội,
• Khi dùng các cây nói trên để tắm giặt, người ta nhận thấy chúng
giặt giũ… do chúng có tính tạo bọt, tẩy rửa.
có thể làm chết cá, ốc, đỉa… và 1 số động vật thân mềm khác
• Nhiều loài cây đã được sử dụng cùng mục đích giặt tẩy: (nên chúng còn được dùng để thuốc cá *; khác Derris elliptica!).
• Ludwig Kofler (1927): Xuất bản cuốn “Die Saponine” tổng quan • Ph.ứng màu: (Salkowski, 1872; Liebermann, 1885; Burchard, 1889).
hệ thống về lịch sử nghiên cứu, về tính chất lý hóa, sinh học… • Phản ứng tạo phức Digitonin + Cholesterol: (Windaus, 1909).
cùng sự phân bố, xuất xứ của nhiều saponin thực vật. • Phân loại saponin theo tính acid-kiềm: (Robert, 1917).
• Chiết saponin với n-BuOH bão hòa nước: (M.E. Wall, 1952).
• Rosenthaler (1939): Saponin là các chất có tính tạo bọt bền
trong dung dịch nước, có cấu tạo glucosid (hay ∆’ glucuronid)
của polyterpen hay của cholan (tức sterol). Từ 1975 – nay:
Rất nhiều tiến bộ về sản xuất dược liệu, chiết xuất, phân lập,
• Bernard (1949): Saponin là các heterosid, có bản chất keo
kiểm nghiệm, nghiên cứu cấu trúc, tác dụng sinh học…
(colloidal), tan được và có tính tạo bọt trong nước.
của các saponin từ thực vật và cả hải sinh vật
Chúng có mùi hăng nồng, vị đắng, gây hắt hơi, gây phá huyết.
Đối tượng được nghiên cứu đặc biệt: Panax spp. Araliaceae
7 8
9 10
Tuy nhiên, nhiều saponin kinh điển (/ Đậu nành, Cam thảo,
1.1. Quan niệm truyền thống: Saponin là các glycosid tự nhiên Nhân sâm, Tam thất…) lại ko thể hiện đầy đủ các tính chất này;
(gặp chủ yếu trong thực vật, một số từ động vật) có tính: nhất là tính phá huyết & tính tạo phức với cholesterol…
OH OH Me
6
• Fucose (Fuc) và Rhamnose (Rha) đều là 6-deoxy ose.
6 1
4
O
Me O
αL-rhamnose βD-fucose 1 OH • Xylose (Xyl) và Arabinose (Ara) đều là các pentose.
HO HO
OH
HO
OH
• βD-Fuc # βD-Gal (nhưng mất Oxy ở C-6: CH2OH → CH3).
O
OH OH • αL-Ara(p) # βD-Gal (nhưng mất nhóm CH2OH cuối mạch).
5 O 4 4
HO * OH 1 5 O
HO OH 5 *
HO 3 2
HO OH
OH
1
3
2
1 • βD-Xyl(p) # βD-Glc (nhưng mất nhóm CH2OH cuối mạch).
OH OH
17 18
Gồm các (6) đơn vị isopren; nối chủ yếu theo kiểu “đầu → đuôi” 29 30
β 30
29
α 30
29
20 21
19
12 E E
18
11 13 22
25 26 17
1 28
9 14
16
2
10 8 15
đầu 27
3 4 6 7
5
23 24
2 đuôi
đuôi Khung Oleanan Khung Ursan Khung Taraxasteran
đuôi
Khung Lupan Khung Hopan All = 8 nhóm methyl
29
đầu 30 20
19
21 19
20
12
18 E 12 18 E 21
30
11 13 22 13
11
25 26 17 25 26 17 22
1 28 1 28
9 14 9
16 16 29
2 2
5 vòng: only C/D: cis 10 8
27
15 10 8
27
15
3 4 6 7 3 4 6 7
5 5
4 vòng: all 3 trans 23 24 23 24
19 20
29 30 29 30
19 20 21 19 20 21
29 29
12 12 18 12 18
13 22 13 22
19
25 17 25 17 30 20 21 30 20
26 26
28 1
15
COOH
28
1
15
COOH
28 12
18
← Khung Lupan E
16 16 13 22
11
25 26 17 C
3 27 3 27
1 28 D R
9 14
→
3 28
HO HO HO 2
10 8 15
16
R = H: Lupeol
24 CH2OH A B
23 27
→
24 23 3 4 6
5 7
R = CH2OH: Betulin HO 3
30 30 19 30 19
←Khung Hopan
20 21 20 21 19
20
12 12 18 12 18 12 30
13 22 13 22 18 21
11 13
Diplopten →
25 26 17 25 26 17 25 26 17 22
28 1 COOH 1 COOH 1
28 28 9 28
15 15 16
16 16 2 29
10 8 15
3 27 3
COOH 27
27 3 4 6
3 7
HO HO HO 5
24 23 24 23 24
23
21 22
29 30
30 29
30 20
29
19 21 19 20
20 20
E E E E 21 29
22 22
30
23 24
2.1.2. Saponin triterpenoid 4 vòng 2.1.2a. Khung dammaran
OH OH
21 21
22 24 26 22 24 26 26 26
21 21 OH 20
22 24 OH 20
22 24
20 23 25
8C 20 23 25 12 12
11 27 11 27
17 16 17 16
27 27 19 18 19 18
13 13
15 15
9 14 9 14 1 14 1 14
8 8
10 8 10 8 3 30 3 30
6 6
30 (17 + 5) C 30 HO 7
HO 7
29 28 29 28
OH
28 29 28 29
protopanaxadiol (genuin) protopanaxatriol (genuin)
dammaran (10β + 8β) cucurbitan (9β + 13β)
27
24
panaxadiol (artefact) 26
25
23
panaxatriol (artefact)
lanostan (10β + 13β) tirucallan (10β + 13α) O 22
20
OH
21
22 24 26 12
21
20 23 25 các ginsenosid các ginsenosid
13
27
13 Rb1, Rb2, Rc, Rd… Rg1, Rg2, Re, Rf…
14 30
9 6
14 Oses O
10 8 10
30
28 29 R
28 29
Oses O • Từ Lanostan → các phân nhóm khác nhau về vị trí gắn nhóm Me:
All = 8 nhóm methyl
O
22
24 OH 22
24
21 25 27 21 25 27
18 20 23 oses 18 20 23
26
11 O 11 OH OAc
26
H 16 H 16
9
2 HO 2
3 19 30 3 19 30
5 O 5
28 29 28 29
22 27 8C 20 27
23 O 23
2.2.2. Phân nhóm Furostan (dễ biến thành Spirostan) 18 20
O
24 18 22
O
24
17 12 17
19 19
(17 + 2) C
Nhận xét về khung của saponin steroid: HO 5 HO
6
• Vòng (A): không có gem-dimethyl ở C-4 (≠ sap. triterpenoid). Diosgenin (All = 4 nhóm Me) Hecogenin
• Saponin steroid đa số chỉ có 1 mạch đường (monodesmosid); Khi chiết xuất, nhóm Me-27α dễ chuyển thành Me-27β
còn sap. triterpenoid có thể đến 3 mạch đường (tridesmosid). (và hecogenin, tigogenin, gitogenin → neohecogenin...)
(phổ IR sẽ hơi khác)
29 30
δc ~100 ppm
2.3.3. Phân nhóm amino-furostan:
Tương tư“ Furostan, 3-OH → 3-NH2
HO HO
14 14
3 5 3 5
HO HO
H H
Solasonin Tomatin
21
20 22 24
23
18
N
17 25
19 13 26 27
10
3
Oses O 5
Solanin 33 34
Thường từ tên khoa học (tên Chi, tên loài) của mẫu. protopanaxadiol protopanaxatriol
Ginsenosid
Aglycon thường có vĩ ngữ “genin”: diosgenin... (= EU, USA). (Σ các đường đơn) (Σ các đường đơn)
Ra1, Ra2, Ra3 5
Glycosid thường có vĩ ngữ “osid”: ginsenosid... (EU, USA: oside).
Rb1, Rb2, Rb3, Rc 4
Tên thông thường:
Rs1, Rs2 4
Rd 3
Theo EU, USA Theo DĐVN IV
Rg3 2
• saponin: không có e cuối. • saponin: không có e cuối
Rh2 1
• alkaloid: có e cuối*. • alkaloid: không có e cuối
Re 3
Rf, Rg1, Rg2 2
Genin: Smilagenin, Diosgenin, Hederagenin, Gypsogenin… Rh1 1
Glycosid: Panaxosid, Ginsenosid, Asiaticosid, Polysciacosid Ro Khung Oleanan với 3 ose ở 2 mạch
3.3. Tính tạo bọt (bền trong môi trường nước) Ghi chú: Có nhiều ghi nhận về tính phá huyết (TPH) của saponin
Do có tính lưỡng cực, làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch,
• Tốc độ và TPH của sap. steroid > sap. triterpenoid.
các saponin có tính tạo bọt nhiều và bền khi được lắc mạnh.
• TPH của monodesmosid > bidesmosid hay tridesmosid.
Mạch ose càng nhiều & dài, tính tạo bọt càng rõ rệt.
• Trong monodesmosid thì:
Tính chất này được ứng dụng trong tẩy rửa, làm thuốc long đàm.
- TPH sẽ giảm khi aglycon có nhiều nhóm phân cực.
3.4. Tính phá huyết (ngay cả khi ở nồng độ rất thấp) - TPH sẽ tăng khi mạch ose dài đến 4-6 đường đơn.
Nhiều saponin có tính phá huyết rất mạnh (làm vỡ hồng cầu → - TPH của 3-O-Glc > 3-O-GlcA (glycyrrhin có TPH rất kém).
không được đưa saponin vào mạch máu, nguy cơ gây tan máu).
Tuy nhiên, 1 số saponin lại thể hiện tính chất này không rõ. • Chưa thấy sự liên hệ giữa TPH // tính tạo phức với cholesterol.
• Riêng về tỉ lệ khối lượng giữa [aglycon / ose]:
3.5. Tính kích ứng niêm mạc nhiều báo cáo lại có ghi nhận ngược nhau về sự tăng / giảm TPH.
Nhiều saponin có tính kích ứng niêm mạc
(làm đỏ mắt, chảy nước mắt; gây hắt hơi mạnh; vd. bột Bồ kết…) (Ref: SM. Hassan, 2008, Ph.D. Thesis, pp. 30-32).
39 40
Phổ UV của 1 số saponin triterpenoid 5 vòng + H2SO4 đđ.
3.6a. Phổ UV của saponin
VD. Ponomarev, ET. Oganesyan, VF. Semenchenko (1971).
• Các saponosid & genin thường không cho phổ hấp thu UV-Vis Khimiya Prirodynykh Soedinenii, No 2, pp. 147-150.
Cực đại hấp thu của chúng thường << 250 nm.
310 nm 310 nm 310 nm
HPLC-UV, HPLC-PDA thường không thích hợp với saponin.
Detector hữu hiệu thường phải ~ 205 nm.
Thay vào đó, cần dùng các detector khác (RI, ELSD, MS…)
3.6b. Phổ IR của saponin Phổ IR (KBr) của Diosgenin (25R, theo SDBS)
• Trên phổ IR, sẽ cho các băng hấp thu đặc trưng của các nhóm
OH: ~3300; -O-C: ~1100 và O=C<: ~1700 cm-1.
• Có thể phân biệt các đồng phân 25R vs 25S nhờ quan sát cường độ
của bộ tứ tín hiệu tại band 1*, 2*, 3* và 4 như sau:
1* [1] 21
22 27
O
23
24
17
19
4* 980-987 [4]
Hecogenin
25
O 26
21
20 27
O 18 23
22 24
O
12 17
19
HO
45 46
có thể phân biệt được 2 đồng phân hecogenin (25 R) & neohecogenin (25 S).
band ν (cm–1) [cường độ]
C-23 C-24 C-25 C-26 C-27
[1] 850 42% [1] < 860
(25 R) hecogenin 31.5 γ 28.8 30.2 (R) 66.9 17.1 (eq)
[2] 895 35%
[2] < [3] neohecogenin 26.0 γ 25.8 27.0 (S) 65.1 16.0 (ax)
[3] 922 70%
[4] 982 63% B. Phân tích tín hiệu phổ 1H-NMR của 26-CH2 (Jaa >> Jae, Jea > Jee)
• hecogenin: [H-26ax & H-26eq] ghép với [H-25ax] → Jaa (lớn) và Jea (nhỏ).
25R 25S
27 • neohecogenin: [H-26ax & H-26eq] ghép với [H-26eq] → Jae (nhỏ) và Jee (nhỏ).
25
27
O 26
• O 26 25
21
22
21 • 25
27 22
O 26 O 26
20 23
24 20
23
24 21 • 21 •
25
22 22
O O 23
27
23
20 24 20 24
O O
hecogenin neohecogenin hecogenin: 25R (H-25 axial) neohecogenin: 25S (H-25 equatorial)
3.7. Khối phổ (MS) Một ví dụ về sự phân mảnh của glycosid có MW 1240
Đặc biệt quan trọng khi khảo sát cấu trúc các saponosid
có nhiều mạch đường. Trên phổ MS, khi có sự phân mảnh:
• ∆m/z 162: dấu hiệu có glucose, galactose (M = 180)
• ∆m/z 146: dấu hiệu có rhamnose (desoxy) (M = 164)
• ∆m/z 132: dấu hiệu có xylose, arabinose (M = 150)
Trước đây, các ose thường được xác định bằng ph. pháp SKLM.
(so sánh với các ose chuẩn; thực hiện sau phản ứng thủy phân).
Hiện nay, các ose được xác định nhờ các kỹ thuật phổ MS, NMR. MS của saponin là 1 lĩnh vực rất rộng. Các công bố riêng về từng kiểu
(định danh + α/β + fura/pyranose + cách ghép trong mạch…) khung genin cũng đã rất đồ sộ. Ví dụ tham khảo: MS và sự phân mảnh
hay LC-MS, LC-HRMS... của các ginsenosid trong chi Panax (internet).
49 50
3.8. Phổ NMR của saponin Có thể phân biệt loại và kiểu khung saponin nhờ phổ 1 chiều:
• Các saponin cho nhiều tín hiệu methylen nên phổ 1H-NMR A. Sap. triterpenoid vs steroid: Trên phổ 13C-CPD, DEPT có sự
tương đối khó phân tích (vì nhiều tín hiệu bị xen phủ). khác biệt rất rõ về số lượng nhóm methyl ở vùng δC < 30 ppm.
• Để so sánh dữ liệu, thường khai thác phổ 13C hơn là 1H-NMR. (Triterpenoid > 5 tín hiệu Me; còn Steroid < 5 tín hiệu Me).
• Dung môi đo phổ NMR có thể là:
- CDCl3, MeOD, DMDO-d6 đối với sapogenin. B. Khung β-amyrin vs α-amyrin (cùng là triterpenoid 5 vòng):
• Phổ 13C: như nhau về số lượng nhóm Me ở vùng δC < 30 ppm.
- Pyridin-d5, MeOD, DMDO-d6 đối với saponosid.
• Phổ 1H: α-amyrin có 2 nhóm >CH-Me → cho 2 tín hiệu doublet
(β-amyrin không có các tín hiệu doublet này)
Lưu ý: Trên phổ 13C-NMR (CPD, DEPT), khung của
• saponin triterpenoid → nhiều (~ 8) tín hiệu methyl C. Glycosid vs genin: Trên phổ 13C-CPD có sự khác biệt rất rõ
• saponin steroid → ít (~ 4) tín hiệu methyl (Glycosid thì có và genin thì không có cụm tín hiệu của ose tại
vùng 60 – 80 ppm)
(xem lại các slide 20-30 ở mục 2. Cấu trúc & Phân loại)
51 52
Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) của ginsenosid Re Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) của ginsenosid Re
Vùng 1,00 – 2,50 ppm (CH3, CH2) bị xen phủ (overlapped), khó phân tích.
(ngay cả khi dãn rộng, cũng khó phân tích)
53 54
(trích) Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) của 1 saponosid / Glinus Các tín hiệu CH3 (*) ở vùng trường cao (< 30 ppm)
của 2 saponin có khung hopan (triterpenoid 5 vòng)
* * *
O
OH
*
55 56
13C-CPD
3.9. Sắc ký lớp mỏng saponin
Phổ của 1 saponin triterpenoid & 1 saponin steroid
Ref:
1. M.W. Hajnos, J. Sherma, T. Kowalska (2008),
8 tín hiệu CH3 / một ginsenosid 4 tín hiệu CH3 / một sap. steroid
TLC in Phytochemistry. p. 519.
(neotigogenin)
2. H. Wagner et als., (2011, 2015),
Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal Medicines, Vol. 1, 2, 3.
3. H. Wagner, S. Bladt (1998), Plant Drug Analysis, A TLC Atlas.
3.9. Sắc ký lớp mỏng saponin 3.9. Sắc ký lớp mỏng saponin
Saponin (genin + glycosid) là nhóm hợp chất rất lớn & đa dạng. Chú ý kỹ thuật thực hiện Ghi chú, mục đích
SKLM saponin là 1 nghệ thuật. Cần chú ý các điểm sau: 1. Chấm mẫu thành băng # 6 -10 mm Tăng khả năng phân giải của bản mỏng
• Bản mỏng: thông dụng nhất là silica gel F 254 pha thuận (NP). 2. Để thật khô dung môi hòa mẫu Tránh làm Rf bị thay đổi do dm còn sót
• Mẫu thử: càng sạch càng tốt; hòa trong [CHCl3 – MeOH; x : y].
3. Khi khai triển bản mỏng Tránh di chuyển khi đang khai triển
nên chấm thành vạch dài # 10 mm (phân giải tốt hơn điểm).
4. Để thật khô dung môi sắc ký Tránh thuốc thử loang lổ không đều
• Dung môi: cùng “tính chất” với đối tượng nghiên cứu
- sapogenin dùng dung môi kém phân cực hơn saponosid. 5. Nhúng thuốc thử (VS, AS…) Nhúng nhanh, tránh làm loang vết
- mẫu có tính acid: dung môi nên có acid (AcOH, TFA, ForOH) 6. Để thật khô dung môi của thuốc thử Tránh làm rộp bản mỏng khi sấy nóng
• Phát hiện vết: UV 254 và/hay thuốc thử AS, VS, VP, H2SO4 10%. 7. Sấy nhẹ kỹ, rồi mới sấy nóng vừa đủ Tránh làm sậm màu nền bản mỏng
• Để có sắc đồ đẹp: tham khảo tài liệu với keywords tương ứng
(Ginsenosid, Gypenosid, Cardenolid, Madecassoid, Glinus, …)
C
• Kỹ thuật cụ thể: Tham khảo và ghi chú trong phần thực tập.
T
59 60
Tham khảo kỹ thuật chấm mẫu thử thành băng 1 cm. Một ví dụ về TLC & HPTLC các ginsenosid trong Panax spp.
TLC các ginsenosid / Panax spp. HP-TLC các ginsenosid / Panax spp.
Rg1 F11
Rf
Rg1 Rg1
Re
Re Re
Rb1 Rb1
Rb1
Tài liệu & các công bố về HPLC của saponin cực kỳ phong phú.
Ví dụ, các ginsenosid có thể được phân tích trong các điều kiện:
• Cột sắc ký: RP-18 hay RP-8 (cỡ hạt 5 µm, dài 15 - 25 cm) HPLC–ELSD chromatograms of ginsenosides (2 slide kế)
• Pha động: [MeOH – H2O] hay [MeOH – AcCN] (x : y) hay (A) Mixed standards (C) Red ginseng
(B) White ginseng (D) Black ginseng
[A: 10 ml 0.1% H3PO4 / 1 L H2O] + [B: AcCN].
• Tốc độ dòng & chương trình dung môi: rất thay đổi.
1, Rg1; 2, Re; 3, Rf; 4, Rb1; 5, Rc; 6, Rb2; 7, Rd; 8, Rg6;
• Detector: Khúc xạ (LC-RI), tán xạ bay hơi (LC-ELSD),
9, F4; 10, Rk3; 11, Rh4; 12, 20(S)-Rg3; 13, 20(R)-Rg3;
Khối phổ (LC-MS), LC-PDA/UV ở < 210 nm. 14, 20(S)-Rs3; 15, 20(R)-Rs3; 16, Rk1; 17, Rg5; 18, Rs5; 19, Rs4.
65 66
Rb1
Re
Rd
Black Ginseng
67 68
S.N. Kim et als. (2007) S.N. Kim et als. (2007)
14 ginsenosid chuẩn
Bạch sâm
Rg1 Re
Rg1 Rb1
PPT
PPD
Re
S.N. Kim et al. (2007), J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 164–170.
71
4.1. Tính tạo tủa phức với d. dịch chì acetat
Saponin có thể tạo tủa với 3 loại d.dịch chì acetat (acid, kiềm và
4.1. Tính tạo tủa với dd. chì acetat trung tính). Vì vậy, Robert (1917) đã chia saponin thành 3 loại:
• saponin kiềm: tủa với dd. chì acetat kiềm.
4.2. Các phản ứng màu của saponin
• saponin trung tính: tủa với dd. chì acetat trung tính.
• Salkowski (1872).
• saponin acid: tủa với dd. chì acetat acid.
• Liebermann-Burchard (1889) ***
Có thể áp dụng tính chất này để làm giàu, tinh chế saponin
• Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905).
trong quá trình chiết xuất – phân lập saponin.
• Với thuốc thử AS, VS, VP, acid sulfuric…
4.2. Các phản ứng màu
4.3. Tính tạo phức với cholesterol
Từng saponin riêng biệt có thể cho một số phản ứng màu khá
4.4. Phản ứng thủy phân của saponosid chuyên biệt. Tuy nhiên, phản ứng màu chung cho nhóm saponin
(để định tính, phát hiện) thì khá ít và lại không thực sự đặc hiệu.
73 74
Đọc thêm
Phản ứng Salkowski, Liebermann vs Liebermann-Burchard • Trước 1960s, nhiều tác giả dùng phản ứng L – B để phân biệt 2 nhóm
- triterpenoid: lớp d.dịch bên trên có màu nâu vàng, nâu đỏ, nâu sậm.
Ban đầu, cả 3 phản ứng màu này đều áp dụng riêng cho cholesterol.
- steroid: lớp d.dịch bên trên có các màu xanh rêu, xanh lá, xanh tím.
Có thể tóm tắt như sau (mẫu = vài mg cholesterol / 1 ml dung môi).
• Đến 1960s, người ta nhận thấy saponin/quả Bồ kết tuy là triterpenoid,
Phản ứng dung môi + 1-2 γ H2SO4, lắc + 1 ml H2SO4 dọc thành ống ngo
nhưng lớp dung dịch bên trên lại có màu xanh rêu đến xanh lá.
Salkowshi • lớp trên: đỏ nâu, vàng nâu
1 ml CHCl3 màu đỏ, đỏ nâu • Hiện nay, không thấy báo cáo phân biệt steroid vs triterpenoid
(1872) • nhẫn: nâu, nâu đen (loang)
bằng cách quan sát màu lớp dung dịch bên trên nữa.
Liebermann • lớp trên: xanh lá sậm, tối Chỉ còn quan sát vòng nhẫn: (+) → saponin (triterpenoid or steroid).
1 ml Ac2O đỏ rồi →→ xanh lá
(1885) • nhẫn: nâu, nâu đen (loang)
• Tuy vậy, nếu lớp d. dịch phía trên có màu xanh rêu, xanh lá thì vẫn
L-Burchard 1 ml h.hợp • lớp trên: xanh lá sáng, lan lên
xanh lá (hơi chậm) có thể sơ bộ kết luận rằng: có khung steroid trong mẫu thử
*(1889)* CHCl3 Ac2O • nhẫn: tím hồng, tím, tím sậm
(áp dụng trong định tính khung steroid / glycosid steroid trợ tim).
hay EtOAc, n-BuOH, AcOH • Phổ NMR hiện là công cụ hữu hiệu để phân biệt steroid // triterpenoid.
79 80
4.3. Tính tạo phức với ∆’ 3β-OH-steroid
Hoặc không cần quy đổi, có thể thực hiện theo cách sau:
Từ 1910, Windaus đã nhận thấy rằng, tính phá huyết của saponin
sẽ giảm rất mạnh khi có mặt của cholesterol (và ∆’ 3β-OH-steroid). • Dung dịch saponin / nước + bột cholesterol (chính xác, thừa).
Đó là do saponin kết hợp với các steroid này để tạo 1 tủa phức. • Khuấy kỹ 1 – vài giờ. Để lắng, lọc & rửa tủa vài lần với nước.
Phản ứng này sẽ xảy ra dễ dàng với saponin có mạch ose dài. • Thu lấy kết tủa và sấy nhẹ (# 40oC) đến khi tủa thật khô.
Sự kết hợp giữa Digitonin (1 saponin có 1 mạch gồm 5 ose) với • Hòa tan tủa hoàn toàn vào V ml pyridin lạnh, khan (phá phức).
Cholesterol xảy ra gần như hoàn toàn (ph. ứng ko loại bỏ H2O): • Thêm # 10 V ml ether ethylic lạnh vào:
Digitonin + Cholesterol → → Tủa Cholesterol-Digitonid Cholesterol (mới sinh + còn dư) sẽ tan hết trong Et2O.
(1229 = 76,1%) (386 = 23,9%) (1615 = 100%) Saponin ko tan / Et2O được lọc & rửa kỹ bằng Et2O lạnh.
• Sấy tủa saponin sản phẩm đến khối lượng không đổi.
Có thể dùng phản ứng này để định lượng digitonin bằng cholesterol
• Tính hiệu suất %...
(và ngược lại). Khi định lượng 1 saponin khác digitonin, có thể dùng
phản ứng này với sự quy đổi theo MW của saponin thực tế dùng.
81 82
(gốc: Windaus, 1910; thực hiện theo Schoenheimer & Dam, 1933; Một áp dụng của phản ứng này trong kỹ thuật làm giảm
hay cải tiến khác bởi Christiani & Pailer, 1937; Bergmann, 1940…)
hàm lượng “chất béo” & cholesterol trong sữa:
Trộn Pg bột Celite với 3P g hỗn hợp saponin từ cây Quillaija
saponaria (cả 2 đều đạt tiêu chuẩn thực phẩm).
Cho 4P g matrix trên vào 100P g sữa cần loại bớt cholesterol.
Bột Celite sẽ giúp phức [sap – cholesterol] mau lắng xuống
và được tách riêng.
Sữa thu được sẽ có cholesterol% giảm đáng kể.
83 84
4.4. Phản ứng thủy phân của saponosid B. Nếu genin dễ biến tính bởi nhiệt độ cao:
Tùy cấu trúc, độ dài của mạch đường, tùy độ bền của phần genin, Có thể thủy phân bằng các điều kiện nhẹ nhàng, ví dụ:
tùy mục đích… có thể thủy phân bằng các đ. kiện rất khác nhau. • các enzym (β-glucosidase từ hạt Hạnh nhân, β-glucuronidase lấy
từ nhớt con Sên Helix pomatia, hay hesperidinase, diastase…)
A. Để xét cấu trúc, trình tự của mạch đường dài, có thể sử dụng
• AcOH 50% ở 70oC × 6 giờ (pp. Shibata).
ph. pháp thủy phân từng phần (pp. bậc thang) ở to thường:
Hiện nay, pp. phổ NMR cũng đã giải quyết tốt mục tiêu này rồi.
(phân tích trình tự mạch ose mà không cần thủy phân nữa!)
85 86
Có thể thủy phân lâu bằng các acid vô cơ mạnh + nh. độ cao: Phân bố rộng rãi trong giới thực vật, đặc biệt là ở Ngành Hạt kín.
• HCl 5%, 10%, 15%, đun nóng 100oC x vài giờ. (thực tế, không gặp saponin trong Ngành Hạt trần).
• H2SO4 10% / nước hay cồn; đun hồi lưu sôi trong vài giờ. Một số hải sinh vật (Sao biển, Hải quỳ…) cũng chứa saponin
Sản phẩm thủy phân sẽ gồm (các) sapogenin + các loại ose. • Sap. triterpenoid (75% Σ) gặp chủ yếu trong Lớp Hai lá mầm.
Trong nhiều trường hợp, nếu mạch ose có phần glycuroric • Sap. steroid gặp chủ yếu trong Lớp Một lá mầm (như Liliaceae,
(như GlcA, GalA…), nhóm ω-COOR / ose vẫn ko bị thủy phân. Dioscoraceae, Agavaceae, Smilacaceae…); ít gặp trong Lớp Hai lá
mầm (Fabaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae)
Để theo dõi quá trình thủy phân, có thể kiểm tra liên tục các • Sap. steroid alkaloid hay gặp trong chi Solanum (Solanaceae)
sản phẩm (sapogenin) sau 1, 2, 3, n giờ bằng ph. pháp SKLM.
• Saponin có trong nhiều bộ phận thực vật khác nhau, ở cả phần
Các genin (kém phân cực hơn saponosid) sẽ cho vết có Rf cao
dưới mặt đất cũng như trên mặt đất.
hơn hẳn saponosid trên sắc ký đồ. Khi diện tích của vết genin
• Hàm lượng saponin trong cây thường cao, một số có thể > 10%
không thay đổi nữa, ta nói phản ứng thủy phân đã hoàn toàn.
87
(Cam thảo, Quillaja, Bồ kết, Bồ hòn, Yucca…) 88
Note: Hiện nay đã có > 1050 saponin từ 29 bộ, 100+ họ thực vật;
trong đó khoảng 3/4 là saponin triterpenoid (BGDL I, p. 212).
• Saponin triterpenoid
Đã gặp 750 sap. triterpenoid với 360 aglycon (J.M. Berger, 2001).
Sap. triterpenoid (chủ yếu là phân nhóm oleanan) có trong > 500
loài / 100 họ thực vật. Phân nhóm Lanostan hay gặp trong hải sinh
vật (Sao biển, Hải sâm…)
• Saponin steroid
Đã gặp trong > 85 loài thuộc 59 chi thực vật (SM. Hassan, 2008).
Các chi hay gặp saponin steroid là Agave, Dioscorea, Yucca.
• Sap steroid alkaloid: thường gặp / chi Solanum (họ Solanaceae).
Tính đến 2013, đã phân lập được > 20.000 triterpenoid
Hai nhóm saponin được khai thác thương mại nhiều nhất là từ cây dưới dạng sapogenin hoặc saponin (Q. Michaudel, 2013)
Yucca schidigera và Quillaja saponaria (đều thuộc Châu Mỹ).
89 90
Hàm lượng saponin (%) trong một số thực vật (cần bổ sung):
• Các saponin có hàm lượng cao (Bồ hòn, Bồ kết, Cam thảo…)
→ Kết tủa trong n6, EP, Et2O, Cf, DCM, aceton
• Các saponin có tính acid (Glycyrrhizin, Glycuronid…)
→ Kết tủa trong dung dịch acid loãng (HCl…)
• Các saponin có ít ose (1-2 mạch x 1-2 ose; như ginsenosid)
→ Lắc với “n-BuOH b. hòa nước” hay “i-ProOH b. hòa nước”
• Các saponin có MW khác nhau rõ rệt (và MW < 4000).
→ Dùng SKC rây phân tử (Sephadex G hay LH-20.)
• Các sapogenin & saponosid có độ phân cực khác nhau
→ SKC phân bố với Si gel RP-8 hay RP-18.
→ SKC phân bố với Diaion HP-20 (Mitsubishi).
93 94
2 3
95 Đôi khi thay “n-BuOH bão hòa nước” bằng “isopropanol bão hòa nước” 96
4
Các saponosid
97 98
• Phân lập (isolation) là kỹ thuật tách riêng từng hợp chất tinh khiết
ra khỏi 1 hỗn hợp phức tạp bằng nhiều cách khác nhau.
• Độ tinh khiết của các sản phẩm này phải cao (ví dụ, có thể đem đo
phổ NMR để xác định cấu trúc được).
Muốn vậy, cần phải trả lời được các vấn đề sau
• Tên chính xác (khoa học) của mẫu nghiên cứu.
• Thành phần hóa học (sơ bộ) của mẫu nghiên cứu.
• Đối tượng nghiên cứu cụ thể: cấu trúc chung, độ bền, tính tan…
- Glycosid: số & độ dài mạch ose. Glycosid hay glycuronid
- Aglycon: độ phân cực tương đối.
100
B. Trình tự tiến hành (đề nghị) B2. Loại tạp, làm giàu dịch chiết (→ cao Σ chứa ít tạp hơn)
B1. Chiết xuất (→ cao chứa hầu hết các thành phần chính) Xác định nhóm tạp (tinh bột, diệp lục, chất béo, polyphenol…)
• Chọn cách loại bỏ tạp
• Chọn quy cách dược liệu (cỡ bột thô, vừa, mịn…)
• Chọn dung môi chiết - tinh bột: chọn d. môi chiết chứa ít nước; để lắng lạnh.
- cho glycosid: MeOH-nước hay EtOH-nước (25; 50; 70%...) - diệp lục, sắc tố: nước lạnh, than hoạt, chì acetat.
- cho genin: cồn cao độ - chất béo & kém ph.cực: lắc phân bố với các dmhc kém ph.cực.
- cho các cấu trúc có tính acid: dùng [cồn + kiềm]… - polyphenol (tannin…): chì acetat*, Celite, cột Silica gel, …
• Chọn kỹ thuật chiết (ngấm kiệt ngược dòng, đun hồi lưu…)
• Chọn dung môi chiết “chuyên biệt” (lắc phân bố với dd. nước)
• Chọn nhiệt độ chiết (thường, nóng)
- với ginsenosid (et als): chiết với “n-BuOH bão hòa nước”
• Cách kiểm tra việc chiết được, hoặc chiết đã xong.
- với sapogenin: chiết với CHCl3, EtOAc, “EtOAc bão hòa nước”
• Cách cô dịch chiết (thường, cách thủy, giảm áp…)
• Kiểm tra hiệu quả loại tạp (SKLM cao trước & sau khi loại tạp).
101 102
Chọn cách phân lập sơ bộ (→ các phân đoạn đơn giản hơn)
- VLC với Silica gel NP, SKC với Diaion HP-20…
- Cách theo dõi thành phần các ph. đoạn (hệ SKLM & th’ thử…)
• Chọn cách phân lập chính
- qui mô nhỏ (< hàng chục mg): p-TLC, p-HPLC
- qui mô lớn hơn: SKC (h’. phụ, ph. bố, rây ph. tử…), p-HPLC…
- cách theo dõi quá trình phân lập (hệ SKLM với th’ thử…)
• Chọn cách tinh chế sản phẩm
- Kết tinh phân đoạn, kết tinh lại hay tinh chế qua SPE, cột mini…
- Tinh chế bằng các kỹ thuật khác
• Kiểm tinh khiết: SKLM, HPLC, so sánh dữ liệu phổ UV, IR…
103 104
2
25(S)
O
H
neo-tigogenin
Benzen – EtOAc (1 : 1)
HO 25S
O
21
22
H
O
20
O
12
neo-hecogenin
HO 3
25(S)
O
H
HO
Σ nT nH nG Σ
neogitogenin
HO
105
3 4
7b2. Dùng Chì acetat (Lấy tủa phức chì - saponin)
( + H2S → PbS↓ )
109 110
Khi các saponin bị lẫn nhiều tạp phân cực (nhất là tannin)
thì có thể tinh chế saponin theo cách sau
• Hòa tan mẫu [sap + tannin] vào 1 lượng tối thiểu* nước nóng.
• Tẩm dịch nước đậm đặc này vào 1 lượng vừa đủ* bột hấp phụ
(bột Kieselguhr = Celite; bột polyamid hay bột Mg oxyt).
• Do phân cực hơn saponin nên tannin không bị giải hấp ra khỏi
matrix này.
111 112
7b5. Phương pháp thẩm tích (qua màng bán thấm, MBT) 7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký
MBT Mẫu thử: Dạng bột khô / Si-gel, P mẫu # 1/10 P Si-gel.
Hệ dung môi sử dụng: có độ phân cực tăng dần ***.
Saponin lẫn tạp Thể tích mỗi phân đoạn: nhiều [V (ml) # P Si-gel (gam)]
có phân tử nhỏ
Các phân đoạn đầu sẽ chứa các tạp kém phân cực (bỏ).
Các phân đoạn giữa sẽ chứa các sapogenin rồi saponosid (thu).
Các phân đoạn cuối (hoặc phần bị giữ lại trong cột) sẽ chứa các
tạp có phân tử nhỏ tạp rất phân cực (tannin, polysaccharid, muối, đường tự do…).
bị rửa trôi
Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 và th’ thử AS, VS hay H2SO4 10%.
113 114
7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký 7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký
B. Dùng cột rây phân tử (Sephadex LH-20* hoặc G-25). C. Dùng cột phân bố đảo (Diaion HP-20*)
Dùng để loại bỏ các tạp chất có MW khác xa* MW của sap. Mục đích: Chọn phân đoạn (hỗn hợp) có độ ph. cực thích hợp.
Thường dùng cột có d hẹp (1-3-5 cm); h dài (~ 100 cm) Thường dùng cột có d khá lớn (~ 5 cm), h tr. bình (50-60 cm).
Pha tĩnh: Sephadex LH-20* (dạng hỗn dịch / MeOH). Pha tĩnh: Diaion HP-20* (Mitsubishi), hỗn dịch / nước or MeOH.
Mẫu thử được hòa trong MeOH (V mẫu # 1/20 V Sephadex). Mẫu thử: hòa tan (hay hỗn dịch) / nước hoặc MeOH-nước.
Khai triển với MeOH* (thông dụng nhất) hay (H2O + MeOH). Khai triển bằng [H2O – MeOH] (với MeOH% tăng dần).
Các hợp chất có MW lớn hơn sẽ ra trước, MW nhỏ hơn sẽ ra sau. Các hợp chất rất phân cực (ose, muối, PS, tannin) sẽ ra trước.
Kiểm tra vết bằng SKLM / UV 254 và th’ thử VS, AS, H2SO4 10% Các glycosid phân cực → glycosid ít ph. cực → genin sẽ ra sau.
Các hợp chất kém phân cực sẽ ra sau cùng (hoặc bị giữ lại cột).
Sephadex LH-20 rất đắt tiền (> 30 triệu VNĐ / 100 gam)
Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 hay thuốc thử AS, VS, H2SO4 10%.
115 116
7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký
D. Dùng SKLM chế hóa (SK lớp dày / Silica gel NP) 8.1. Định tính tạo bọt (trong ống nghiệm)
Lớp Si-gel có diện tích lớn; bề dày 1 – vài mm; Xác định chỉ số bọt (CSB)
Mẫu (chỉ vài chục mg) hòa / MeOH, chấm thành băng liên tục 8.2. Định tính phá huyết (lam, thạch máu, ống nghiệm)
117 118
B. Thực hiện (thống nhất theo 1 quy định chung, xem thực tập)
1000 500 333 250 200 167 143 125 111 100
121
• Khi mẫu thử có tính phá huyết hoàn toàn, tất cả hồng cầu bị
phá hủy màng, hemoglobin thoát ra và nhuộm hồng dung dịch
123
đẳng trương (không có hồng cầu lắng xuống đáy tube). 124
A. Nguyên tắc chung (tt) B. Các kỹ thuật chung
• Để tránh nhầm lẫn khi nhận định kết quả (do fibrin lắng Có thể thử nghiệm tính phá huyết bằng cách quan sát
xuống đáy tube), máu thử nghiệm cần phải loại bỏ hết fibrin.
- Quá trình phá huyết trên lame (qua kính hiển vi).
Môi trường thử nghiệm cũng phải là môi trường đẳng trương
- Sự khuếch tán hemoglobin + hồng cầu lắng đọng (tube)
(thường dùng dung dịch muối sinh lý trong suốt thử nghiệm). - Vòng phá huyết trên dĩa thạch máu (pétri).
Căn cứ vào đường kính vòng phá huyết (dĩa thạch máu); hoặc
• Máu thử nghiệm được quy định tùy tài liệu, nhưng nên chọn máu
nồng độ tối thiểu của dịch thử gây nên sự phá huyết hoàn toàn*
động vật mà màng hồng cầu dễ bị phá hủy (nhạy).
(/ tube) → khái niệm định lượng về tính phá huyết của (saponin
Thường chọn máu cừu, đôi khi của thỏ, bò & động vật có sừng.
trong) dịch thử nghiệm.
Sau khi loại bỏ fibrin, pha máu thành dịch treo 2%, bảo quản mát.
(có thể thêm chất chống đông…) 125 * ống phá huyết “đầu tiên và hoàn toàn” 126
Là độ pha loãng cần thiết của 1 gam dược liệu để tạo được một
lớp bọt cao 1 cm sau khi ngưng lắc 15 phút, tiến hành trong
điều kiện quy định.
Là số mililit dung dịch đệm cần thiết để hòa tan các saponin có
trong 1 gam dược liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn
đối với một loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định.
CSB: dịch thử + dung môi. không phá huyết hoàn toàn phá huyết hoàn toàn
CSPH: dịch thử + dung môi + dịch máu khác “phá huyết không hoàn toàn” dung dịch trong veo!
127 128
(thực hiện trong dãy ống nghiệm nhỏ)
• Phản ứng Salkowski (1872)
Mẫu/CHCl3 + vài giọt H2SO4 đđ. nâu đỏ, tím, tím sậm Ban đầu, cũng chỉ dùng để định tính cholesterol (Є steroid)
• Phản ứng Liebermann (1885, chưa dùng CHCl3):
Ban đầu, phản ứng này chỉ dùng để định tính cholesterol. (Steroid / Ac2O) + H2SO4 đđ → màu xanh / đỏ.
Với saponin nói chung, màu của sản phẩm phản ứng thì không • Phản ứng L-B (1889; dùng CHCl3 + Ac2O):
thực sự rõ ràng (ngay cả khi thực hiện với kỹ thuật dùng nhiều
(Steroid / CHCl3.Ac2O) + H2SO4 đđ → dd. màu xanh.
acid, nhỏ dọc thành tube… và ngay cả khi thực hiện trên mẫu
là cholesterol tinh khiết).
Ac2O dùng để làm khan môi trường và để pha loãng H2SO4.
Có thể thay Ac2O bằng AcOH glacial, EtOAc, hay BuOH (khan).
Hiện nay, phản ứng Liebermann-Burchard (L-B) thì thông dụng Cơ chế phản ứng: có nhiều đề nghị, nhưng chưa rõ ràng (2007).
và hữu hiệu hơn (xem phần sau). Kỹ thuật thực hiện: dùng ít/nhiều H2SO4; xem slides phía sau.
131 132
Một nhận định tham khảo
Các phản ứng Salkowski và L-B được nghiên cứu khá nhiều.
Ac2O có vai trò làm khan môi trường, pha loãng H2SO4 và có thể
thay thế bằng các dung môi khan khác như AcOH, EtOAc, n-BuOH.
• Hệ thống phải thật khô. Khi thực hiện: cấm cầm trên tay.
• Cho dư Ac2O + Lắc kỹ. Nhỏ acid trôi xuôi theo thành tube.
• Rất chú ý khi rửa ống nghiệm này (Coi chừng phỏng mắt)! 133 134
• Khi các phương pháp phổ (NMR…) còn sơ khai, thì các phản ứng
màu của saponin (và HCTN) còn có nhiều ứng dụng trong định
tính, định danh tuy tính chuyên biệt không thực sự thuyết phục.
khiêm tốn trong việc nhận định & phân biệt sơ bộ mà thôi.
• Để định tính, định danh mẫu; hiện nay, các ph. pháp phân tích
dụng cụ (HPLC-RI, LC-ELSD, LC-MS…) cùng các ph. pháp phổ học
(MS, NMR) được ứng dụng nhiều với sự chính xác rất cao.
135 136
8.4a. SKLM (TLC) và SKLM hiệu năng cao (HP-TLC) 8.4b. HPLC, UPLC (ghép với các detector khác nhau; **LC-det.)
Rất thường được sử dụng nhằm nhiều mục đích
Là các công cụ hữu hiệu, đa năng, đáng tin cậy và phổ biến.
• So sánh các mẫu đa thành phần (dược liệu thử // dl chuẩn…).
Khi ghép nối với các detector khác nhau, tính năng của chúng
• So sánh các hợp chất tinh khiết riêng biệt (đồng nhất Y/N) sẽ càng thêm phong phú. Các ứng dụng chủ yếu:
• Xác định sự có mặt Y/N của 1 chất trong 1 hỗn hợp. Kiểm nghiệm (định tính, định lượng, định danh…) mẫu.
• Theo dõi quá trình phản ứng (tổng hợp, thủy phân,…) Các chi tiết sẽ được tham khảo trong học phần riêng biệt.
• Theo dõi quá trình khai triển SKC
Riêng với saponin, cần chú ý các detector ghép với hệ thống
• Sơ bộ kiểm tinh khiết. Có thể bán định lượng.
(**LC-det.) phải phù hợp với các cấu trúc không có chromophore.
• Định danh nhóm của từng vết (nhở th’ thử chuyên biệt…) Thường dùng các detector RI, ELSD, PDA (vùng cận 205 nm), MS.
• Thử nghiệm sinh học (sàng lọc ngay trên vết của sắc ký đồ) Trong số này, MS là 1 detector cực kỳ hữu hiệu (LC-MS)…
137 138
139 140
Phương pháp cân chỉ thực sự đúng khi hòa tan được (chiết được)
hoặc kết tủa, kết tinh được hoàn toàn & riêng biệt đối tượng thử.
• Không thể chiết hoàn toàn ginsenosid (từ dịch nước Nhân sâm)
bằng “n-BuOH bão hòa nước” nhưng lại chiết được một số chất
khác, không phải ginsenosid (sai số dư ? thiếu ?).
141 Định lượng bằng pp. cân chỉ nên áp dụng trong 1 số trường hợp *.
Ví dụ: Định lượng [tri, di, mono ammonium] glycyrrhizat: Chỉ áp dụng với các mẫu có tính acid (hoặc base) rõ rệt.
Chuyển các ammonium glycyrrhizat → acid glycyrrhizic bằng HCHO. Tính acid / base mạnh sẽ là một thuận lợi.
Chuẩn độ acid glycyrrhizic mới tạo thành bằng d. dịch NaOH 0,1 N. Nếu tính base yếu quá (pKa quá nhỏ, ví dụ < 2): môi trường khan!
Sai số sẽ cao khi có nhiều tạp chất acid (hoặc base) khác.
Dung dịch định lượng thường đã có màu khá sậm, khó quan sát
(CH2)6N4 điểm tương đương nhờ chỉ thị màu.
acid glycyrrhizic
(C42H62O16 = 822)
145 146
Nhắc lại
Sự tắt quang (quenching) của các vết trên bản mỏng F254
So sánh vết định lượng với 1/các vết chuẩn (đã biết lượng chấm) (Khi quan sát dưới đèn UV 254 nm)
• về diện tích vết / UV (không có hoặc có thuốc thử)
• về cường độ màu (sau khi + thuốc thử hiện màu)
4 vết này che khuất nền sáng
(tạo nên sự tắt quang)
Có thể sử dụng bản mỏng thường hay hiệu năng cao (HP-TLC).
Thường kết hợp HP-TLC với các máy & phần mềm chuyên dụng.
(ví dụ máy Camag TLC Scanner 3; S/w winCATS hoặc tương tự).
silica gel + chất phát huỳnh quang F
(sáng rực dưới UV 254 nm)
Kết quả thực tế còn sai số khá lớn (chỉ được chấp nhận như là
một giải pháp bán định lượng, định lượng sơ bộ mà thôi).
147 148
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HP-TLC) SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HP-TLC)
149 150
QuantiScan
151 152
JustTLC Analysis winCATS / TLC Scanner 3 (CAMAG)
153 154
155 156
HPLC-ELSD (7 ref. ginsenosides vs a Panax Product)
157 158
Rb1
Rg1
noto-R1 Rd
Re Rg2
159 160
10.5. Tác dụng lên mô sẹo
Saponin & các dược liệu chứa saponin có rất nhiều công dụng Asiaticosid / Rau má
10.1. Tác dụng long đờm, trị ho 10.6. Tác dụng diệt các loài nhuyễn thể
Thiên môn, Mạch môn, Cam thảo, Viễn chí, Cát cánh Dùng để diệt nhiều loài ốc (ký chủ trung gian của Sán máng)
10.2. Tác dụng bổ dưỡng, tăng lực 10.7. Tác dụng bảo vệ thành mạch (# vit P, Flavonoid)
Điển hình là các ginsenosid & các dược liệu họ Araliaceae Ruscogenin / Ruscus aculeatus (Protolog®)
Glycyrrhizin / Cam thảo; acid oleanolic / Ngưu tất Tham khảo BGDL I, (2011), pp. 213-214.
161 162
163 164