Saponin

& Dược liệu chứa Saponin

Email: levan@ump.edu.vn
mathanh@ump.edu.vn

09/2022 1
Sau khi học xong bài này, sinh viên phải:

1. Trình bày được định nghĩa và phân loại các saponin

2. Ứng dụng được các tính chất (lý, hóa) chính của saponin để
định tính và định lượng saponin trong dược liệu

3. Trình bày và lựa chọn được các phương pháp chiết xuất,
phân lập saponin

4. Nêu được các tác dụng & công dụng chính của các saponin

5. Nêu được thành phần hóa học chính và công dụng của các
dược liệu chứa saponin quan trọng

2
Phần 1: Đại cương về Saponin
1. Khái niệm - Định nghĩa
2. Cấu trúc - Phân loại
3. Lý tính
4. Hóa tính
5. Phân bố / tự nhiên
Phần 2: Các dược liệu chứa Saponin
1. Các loài thuộc chi Panax
3. Cam thảo
3
6. Chiết xuất
7. Phân lập - Tinh chế
8. Định tính
9. Định lượng
10. Tác dụng - Công dụng
2. Rau má
4. Đinh lăng …
 NHẮC LẠI VỀ GLYCOSID

GLYCOSID

Holosid Heterosid
(Glycon + Glycon) (Glycon + Aglycon)

Carbohydrat Glycosid tim Saponin

Flavonoid Anthraglycosid...

Số mạch đường/ glycosid Số đường đơn/ mạch đường

monoglycosid monosid
diglycosid (bidesmosid) biosid

4
 NHẮC LẠI VỀ GLYCOSID
HETEROSID

O-Glycosid Pseudo-glycosid C-Glycosid S-Glycosid N-Glycosid

Ose-O-genin Ose-O-CO-genin Ose-C-C-genin Ose-S-genin Ose-N-genin

Bị thủy phân Bị thủy phân Bền, khó Cản trở hấp Kháng
bởi H+, enzym bởi kiềm thủy phân thu Iod khuẩn
tuyến giáp Kháng K
Phổ biến nhất

5
 NHẮC LẠI VỀ GLYCOSID
Glycosid
(tùy mạch đường dài Tan / chiết trong dm phân cực
hay ngắn)
Độ tan /
Chiết xuất
Aglycon
Tan / chiết trong dm hữu cơ
(tùy nhóm ái nước
trong aglycon)

H+/ enzym
Glycosid Aglycon + Đường

✓ Chiết Glycosid nguyên thủy: phải diệt enzym (ổn định dược liệu)
✓ Glycosid thứ cấp: để enzym tác dụng.
✓ Loại tạp tan trong nước.
✓ Loại tạp tan trong dầu.

6
SAPONIN là gì?

7
 Rau má (Centella asiatica)

Có bọt Saponin?
8
 Bồ kết (Gleditsia fera)

Có bọt Saponin?

9
 Soap bark (Quillaja saponaria)

Soapnut (Bồ hòn, Sapindus saponaria) 10

11
12
13
 14
Wang, Pengfei. “Natural and Synthetic Saponins as Vaccine Adjuvants.” Vaccines vol. 9,3 222. 5 Mar. 2021
Diêm mạch (Chenopodium quinoa)

Quinoa foam

15
 Phần I. Đại cương về saponin

16
 Phần I. Đại cương về saponin

“Sapo” = soap, savon

Chi Saponaria hay loài Quillaja saponaria.
- Soapbark: Quillaja saponaria
họ Quillajaceae.
- Soapwort: Saponaria officinalis
họ Caryophyllaceae.
- Soapberry: Sapindus saponaria
họ Sapindaceae.
- Soapnut: Sapindus mukurossi
họ Sapindaceae.
- Soaproot: Chlorogalum pomeridianum
Họ Asparagaceae.
17
 Phần I. Đại cương về saponin
Độc với cá (Fish poison)

Cotus sp.

fish take in saponins directly into their

bloodstream through their gills.
The toxin acts on the respiratory organs
of the fish without affecting their edibility.
18
https://www.primitiveways.com/fish_poison.html
 Phần I. Đại cương về saponin

• Ph.ứng màu (Salkowski, 1872; Liebermann, 1885; Burchard, 1889).

• Phản ứng tạo phức Digitonin + Cholesterol (Windaus, 1909).
• Phân loại saponin theo tính acid-kiềm (Robert, 1917).
• Chiết saponin với n-BuOH bão hòa nước (M.E. Wall, 1952).
• “Die Saponine” Ludwig Kofler (1927)

•Thuật ngữ saponin:

Gmelin (1819): đa số tài liệu
Grothus (1815) (theo Kichter, 1939)
P.A. Bucholz (1811) (theo Bernard, 1949).
19
 Adelheid Kofler (1889–1985) and Ludwig Kofler
(1881–1951).
Austrian chemists and developers of various
advanced techniques and apparatus for measuring
melting points
 Phần I. Đại cương về saponin

1.1. Quan niệm truyền thống:

Saponin còn gọi là các saponoside là các glycosid tự nhiên, gặp chủ yếu
trong thực vật, một số từ động vật (cá sao, hải sâm) có tính:

✓ Tạo bọt nhiều (bền khi lắc với nước); Làm giảm sức căng bề mặt của
dung dịch
✓ Phá huyết (làm vỡ hồng cầu) ở nồng độ rất thấp.
✓ Độc đối với cá & các loài thân mềm (giun, sán, ốc…)
✓ Kích ứng niêm mạc (gây hắt hơi, đỏ mắt…)
✓ Tạo phức với cholesterol & các Δ’ 3-OH-steroid.

Tuy nhiên, nhiều saponin kinh điển (Đậu nành, Cam thảo, Nhân sâm, Tam
thất…) lại ko thể hiện đầy đủ các tính chất này; nhất là tính phá huyết &
tính tạo phức với cholesterol…
Sarsaparilloside (từ chi Smilax) không có tính phá huyết/ tạo phức với cholesterol.

21
 Phần I. Đại cương về saponin

Bernard (1949) Rosenthaler (1939)

Saponin là các heterosid, có Saponin là các chất có tính
bản chất keo (colloidal), tan tạo bọt bền trong dung dịch
trong nước và có tính tạo bọt nước, có cấu tạo glucosid
trong nước. Chúng có mùi (hay Δ’ glucuronid) của
hăng nồng, vị đắng, gây hắt polyterpen hay của cholan
hơi, gây phá huyết. (tức sterol).
Kurt Hostettmann (1995): Saponin là các glycosid có
KLPT lớn của triterpenoid hay steroid.

Lưu ý:
• Các glycosid trợ tim cũng thuộc nhóm saponin.
22 • Các sapogenin, vẫn được xếp vào “nhóm saponin”
23
24
 Phần I. Đại cương về saponin

Steroid alkaloid skeleton

Saponin là các glycosid có KLPT lớn của triterpenoid hay steroid.
(K. Hostettmann and A Marston,Saponins, 1995). 25
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
❑ Robert, 1917: saponin acid, trung tính, kiềm.
❑ 1995 →nay: phân loại theo khung của aglycon = [sapo]genin.

26
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

27
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

28
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

Phần mạch đường trong saponin

❖ Ví trí gắn đường: C-3, C-6, C-20, C-28…

❖ Nối đường: O-glycosid (thường gặp ở 3β-OH → ose).

ψ-glycosid (thường gặp ở 28β-COOH → ose).
❖ Loại đường:
* hexose: D-Glc (và Δ’ GlcA) D-Fuc (6-desoxy)
D-Gal (và Δ’ GalA) L-Rha (6-desoxy)
* pentose: D-Xyl (f, p) L-Ara (fura/pyranose)

❖ Mạch đường: 1-3 mạch đường, thẳng/ phân nhánh.

Mỗi mạch có thể có 1-5 đường, có khi hàng chục đường
29
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

30
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

❖ Thường từ tên khoa học (tên Chi, tên loài) của mẫu.
❖ Aglycon (genin): diosgenin... (= EU, USA).
❖ Glycosid thường có vĩ ngữ “osid”: ginsenosid... (EU, USA: oside).

Ví dụ:
Genin: Smilagenin, Diosgenin, Hederagenin, Gypsogenin…
Glycosid: Panaxosid, Ginsenosid, Asiaticosid, Polysciacosid,
Senegin, Mollugocin, Glycyrrhizin, Cucurbitacin…

31
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

Triterpenoid (30 C)

Triterpen 4 vòng (all: trans) Triterpen 5 vòng

Tetracyclic triterpenoid
a. Phân nhóm Oleanan **
a. Phân nhóm Dammaran *
(Me: 10 + 8) b. Phân nhóm Ursan *
b. Phân nhóm Lanostan c. Phân nhóm Lupan
(Me: 10 + 13)
c. Phân nhóm Cucurbitan
d. Phân nhóm Hopan
(Me: 9 + 13) e. Ph. nhóm taraxasteran
d. Phân nhóm Tirucallan f. Phân nhóm khác
(Me: 10 + 13)
32
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

Triterpenoid (30 C)

Triterpen 4 vòng (all: trans) Triterpen 5 vòng

Tetracyclic triterpenoid Pentacyclic triterpenoid

a. Phân nhóm Dammaran *

a. Phân nhóm Oleanan **
(Me: 10 + 8)
b. Phân nhóm Lanostan b. Phân nhóm Ursan *
(Me: 10 + 13) c. Phân nhóm Lupan
c. Phân nhóm Cucurbitan
d. Phân nhóm Hopan
(Me: 9 + 13)
e. Ph. nhóm taraxasteran
d. Phân nhóm Tirucallan
33 (Me: 10 + 13) f. Phân nhóm khác
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

Gồm 6 đơn vị isopren (C5H8); nối chủ yếu theo kiểu “đầu → đuôi”

isopren (C5H8)

Sap triterpene 5 vòng : chỉ có nối vòng D/E là cis.

Sap triterpene 4 vòng : cả 3 nối vòng (A/B, B/C, C/D) đều là trans.
34
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.1 Triterpen 5 vòng (8 nhóm methyl)

❖ 5 vòng 6 cạnh: Oleanan, Ursan, Taraxasteran

❖ 4 vòng 6 cạnh + 1 vòng 5 cạnh: Lupan, Hopan
35
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.1 Triterpen 5 vòng – khung oleanan

12

28

HO 3

Rất phổ biến trong thiên nhiên, thường là dẫn xuất của -amyrin
(3-hydroxy olean-12-en) 29 30

19 20 21

12 18
13 22
25 26 17
1 COOH
15 28
16

3 27

HO
CH2OH
24 23

Acid oleanolic Hederagenin

Có cấu trúc 12-en-28-oic acid (Hedera helix/ Ivy) 36
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.1 Triterpen 5 vòng – khung ursan
29

30


12

28

HO 3

Ursan → -amyrin
29

30 19
20 21

12 18
13 22
25 26 17
1 COOH
15 28
16

3 27

HO
24 23

Acid quinovic
→ acid ursolic

Khá phổ biến là dẫn xuất của α-amyrin (3-hydroxy ursan-12-en).

Trong tự nhiên có đi kèm nhóm olean.
37
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.1 Triterpen 5 vòng – khung lupan

29

19
30 20 21
12
18
11 13 22
25 26 17
1 28
9 14
16
2
10 8 15
27
3 4 6 7
5

23 24
Lupeol/ hạt Lipinus luteus
Khung Lupan

Thường là dẫn chất của 3-hydroxy lupan 20(29)-en.

Ít gặp trong tự nhiên
38
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.1 Triterpen 5 vòng – khung hopane
19
20
12 30
18 21
11 13
25 26 17 22
1 9 28
16 29
2
10 8 15
27
3 4 6 7
5

23 24 Khung Hopan

Diplopten (Hopene)
Hopane xuất phát từ chi Hopea (Sao),Dipterocarpaceae (họ Dầu)
(a source of the resin/John Hope)

Thường là dẫn chất của 3-hydroxy hop-22(29)

Ít phổ biến trong tự nhiên, thường gặp trong bacteria/primitive organism.
39
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.1 Triterpen 5 vòng

• Trong 5 vòng A, B, C, D, E: vòng E có thể là 6 cạnh hay 5 cạnh.

• 4 vòng A-D: có 6 nhóm Me (lưu ý: gem-dimethyl ở vòng A).
• E 6 cạnh: thêm 2 nhóm Me (geminal: Oleanan, vicinal: Ursan).
• E 5 cạnh: thêm 2 nhóm Me / isopropyl (: Lupan; : Hopan).
• Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; ≠ sap. steroid).
30 29 29
30

30 20
29 19 20
20 20 19 21
E E E E 21 29
22
22

30

Oleanan Ursan Lupan Hopan

( 2 singlet x 3H) (2 doublet x 3H) (1 doublet x 6H) (1 doublet x 6H) 40
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng (8 nhóm methyl)

8C

(17 + 5) C

41
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung dammaran

Tiêu biểu là các sapogenin thật protopanaxadiol và protopanaxatriol

trong Nhân sâm thu được khi thủy phân các glycoside bằng enzyme
(crude hesperidinase)

42
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2 Triterpen 4 vòng – khung dammaran

Protopanaxadiol Protopanaxatriol Ocotillol

(PPD) (PPT) (OCT)
OH
21
26 OH
OH 20
22 24 21
OH 22 24 26
12 20
11 27 12
17 16
19 18 11
17 16 27
15 19 18
1 14
8 15
1 14
3 30 8
6
7
HO 3
6
30
7
HO
29 28
29 28
OH

O-glycosid: C-3, C-20 O-glycosid: C6, C-20 O-glycoside: C-6

Ví dụ: các ginsenoside Ví dụ: các ginsenoside Ví dụ: các majonoside R1,
Rb1, Rb2, Rc, Rd… Rg1, Rg2, Re, Rf… R2…

43
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung dammaran

Panaxadiol (PD)
H+ (HCl)

Protopanaxadiol - PDD/
Protopanaxatriol - PPT

Panaxatriol (PT)

Nếu thủy phân các ginsenosid bằng acid sẽ cho các genin giả như PD/PT
44
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung lanostan (10-Me)

21 22 24 26
20
18 23 25
12 17
11 16 27
19 13
9
15
2
10 8
30

A/B; B/C; C/D: trans

3 4 6 7
5

28 29

5- lanostan 5- lanostan

45
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung lanostan (10-Me)

21 22 24 26 O O
20
HO O
18 23 25
12 17 R
11 16 27
19 13
9
15
2
10 8
30 Oses O
3 4 6 7
5

28 29 các Holothurin (R = H hay OH)

Nấm lỗ (Polyporaceae) Hải sâm (Sea cucumber)

Họ nấm lỗ: > 30 hợp chất saponin thuộc cấu trúc lanostan.
Phá huyết mạnh.
46
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung lanostan (10-Me)

Major holothurins from black sea cucumber Holothuria atra

47
Mar. Drugs 2019, 17(2), 86
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung cucurbitan (9-Me)
24
21 22 27
25

18 20 23

11
26
H 16
9
2

3 19 30
5

28 29

Cucurbitacin A Cucurbitacin B
Đây là saponin ít phổ biến, chỉ Có trong hầu hết các loài thuộc họ
được tìm thấy trong chi Cucumis Cucurbitaceae. Cucurbitacin B glucosid
(Cucurbitaceae) được phân lập từ rễ của Picrorhiza kurrooa
(Scrophulariaceae)
48
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung cucurbitan (9-Me)

thiếu nhóm acetyl ở 25-OH

Cucurbitacin C Cucurbitacin D

Hoạt chất này rất hiếm trong tự Được phân lập trong một số họ:
nhiên, chỉ được tìm thấy trong loài Cucurbitaceae, Elaeocarpaneae,
Cucumis sativus (Cucurbitaceae). Datiscaceae

Ngoài ra còn có cucurbitacin E, F, G, H, O, P , Q, R, S, T và các cucurbitacin

không phổ biến khác.

49
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung tirucalan (10-Me)

50
Bioorganic Chemistry, Volume 84, March 2019, Pages 309-318
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.2. Triterpen 4 vòng – khung cycloartane

Cấu trúc 9,19-cyclo(9)lanostan: các astragaloside trong Astragalus

51
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

• Trong 4 vòng A, B, C, D: chỉ vòng D là 5 cạnh (Σ → 17 C).

• Khung có sẵn 5 nhóm Me; có gem-dimethyl / vòng A (→ 22 C).

• Vòng D thêm nhánh 8 C; trong đó có 3 nhóm Me nữa (→ 30 C).

• Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me; khác hẳn sap. steroid).

• Từ Lanostan → các phân nhóm khác nhau về vị trí gắn nhóm Me.

52
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3. Saponin steroid – 27C

2.3.1. Phân nhóm Spirostan/ Furostan :

Spirosolan: tương tự Spirostan, vòng (F): O → NH.
2.3.2. Phân nhóm Solanidan
2.3.3. Phân nhóm amino-furostan:
Tương tự Furostan, 3-OH → 3-NH2

2.3.4. Phân nhóm Polypodo-saponin

2.3.5. Phân nhóm Osladin
2.3.6. Phân nhóm -Spinasteroid

53
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.1. Saponin steroid – spirostan

F
E

Cấu tạo giống cholestane nhưng mạch nhánh từ C-20 đến C-27 tạo
thành 2 dị vòng chứa O là vòng E, và vòng F, nối nhau qua cầu nối
C 22, tạo thành mạch spiroacetal

54
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.1. Saponin steroid – spirostan

Cis/trans
25S/25R

Nhóm spirostan: có nhiều C*, hưng do chướng ngại lập thể nên số đồng
phân giảm nhiều. Có 2 đồng phân chính – cis/trans (do 2 vòng A/B) –
đồng phân cấu hình tuyệt đối ở vị trí C25 55
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.1. Saponin steroid – spirostan
27

O 26 25
21
22
H
23
20 24
O

Smilax
HO

Một vài saponin steroid gặp trong tự nhiên

Digitalis
56
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.1. Saponin steroid – spirostan

(4 nhóm Me)
25 25
O 26 O 26
21 21
22 27 20 27
18 20
23
24 8C O 18 23
22 24
O O
17 12 17
19 19

(17 + 2) C
HO 5 HO
6

Diosgenin/ Dioscorea (củ nâu) Hecogenin/ Agave

Các saponin thuộc nhóm spirostan thường được dùng làm nguyên liệu
quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid.
Khi chiết xuất, nhóm Me-27 dễ chuyển thành Me-27
(và hecogenin, tigogenin, gitogenin → neohecogenin...)
57
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.2. Saponin steroid – furostan

c ~110 ppm 27 27
HO
OH 26 25 O 26 25
21 21
22
H 22
H
23 23
20 24 20 24
O O

  c ~100 ppm

HO HO

Sarsaparilloside  Parillin

Ít gặp hơn Spirostan. Furostan dễ đóng vòng thành Spirostan

Dưới tác dụng của enzyme, phần đường mạch nhánh sẽ bị cắt đứt
Và sẽ bị đóng vòng, để tạo vòng F 6 cạnh như spirostan.
Lợi dụng tính chất này để làm giàu nguyên liệu khi chiết xuất saponin
spirostan.
58 Ví dụ: chiết xuất saponin sarsaparilloside trong Smilax
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.2. Saponin steroid – furostan

Trường hợp vòng F có 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy.

Avenacoside Isonuatigenin

Hợp chất avenacoside trong yến mạch có 2 mạch đường, khi thủy
phân cắt đường glucose ở C-26 thì chuyển thành sprirostan.

59
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.2. Saponin steroid

Nhận xét chung về khung của saponin steroid đơn giản

Vòng (A): không có gem-dimethyl ở C-4 (≠ sap. triterpenoid).
- các khung sap. steroid chỉ có # 4 nhóm methyl.
- khung sap. triterpenoid có tới # 8 nhóm methyl.
Rất dễ phân biệt bằng các phổ 13C-NMR (CPD, DEPT).

• Saponin steroid đa số chỉ có 1 mạch đường (monodesmosid);

còn sap. triterpenoid có thể đến 3 mạch đường (tridesmosid).

60
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.3. Saponin steroid – spirosolan

Nguyên tử oxy trên vòng F của sprisostan được thay thế bằng nhóm NH.

Solasonin

61
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.3. Saponin steroid – spirosolan

62
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.3. Saponin steroid – spirosolan

63
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.3. Saponin steroid – spirosolan

 23
21 NH 21
20 22 20 22
26 24
18 25 18 NH 25
O
23
O 
19 24 27 19 26 27

14 14

3 5 3 5
HO HO
H H
Solasonin/Cà lá xẻ Tomatin/Cà chua xanh

All = 4 nhóm methyl

64
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.3. Saponin steroid – solanidan

Vòng E&F có chung 1 C và 1 N

21
20 22 24
23
Solanin 18

N
17 25
19 13 26 27

10
3

Oses O 5 (MW lẻ!)

Lethal dose: 3-6 mg/kg

65
 Cà chua xanh: 500 mg/kg
Cà chua chín: < 5 mg/kg
66
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
2.3.4. Saponin steroid – aminofurostan

/Solanum paniculatum

67
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

Saponin steroid
- Tính chất tương tự cấu trúc saponin triterpene
- Phân bố ít hơn so với saponin triterpene trong tự nhiên
- Phân bố: Dioscoreaceace; Liliaceace; Agavaceae,..
- Khung sapogenin có 27C
- Tất cả đều có C25 stereoisomerisation
- Đường gắn C-3 & C26 (ít hơn)
- Cấu trúc ít đường hơn
- Càng nhiều đường, hoạt tính phá huyết (haemolytic effect) càng tăng
- Là nguyên liệu bán tổng hợp nên các hormone steroid như:
Diosgenin -> progesterone
- Các nguyên liệu thô khác: sitosterol; stigmasterol.
68
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin

Triterpene 4 vòng Triterpene 5 vòng Saponin steroid

✓ Trong 4 vòng A, B, C, D: ✓Vòng E có thể là 6 cạnh ✓Vòng (A): không có
chỉ vòng D là 5 cạnh (Σ → hay 5 cạnh. gem-dimethyl ở C-4
17 C). ✓Chỉ có # 4 nhóm
✓ 4 vòng A-D: có 6 nhóm
✓ Khung có sẵn 5 nhóm Me; Me (lưu ý: gem-dimethyl ở methyl.
có gem-dimethyl/ vòng A vòng A). ✓Phân biệt bằng các phổ
(→ 22 C). 13C-NMR (CPD, DEPT).
✓ Vòng E 6 cạnh: thêm 2
✓ Vòng D thêm nhánh 8 C; ✓Đa số chỉ có 1 mạch
nhóm Me (geminal:
trong đó có 3 nhóm Me
Oleanan, vicinal:Ursan). E đường (monodesmosid)
nữa (→ 30 C).
5 cạnh: thêm 2 nhóm Me/
✓ Tổng cộng: 30 C (trong isopropyl (: Lupan; :
đó có 8 nhóm Me) Hopan).
✓ Từ Lanostan → các phân ✓ Tổng cộng: 30 C (trong
nhóm khác nhau về vị trí đó có 8 nhóm Me; ≠ sap.
gắn nhóm Me. steroid).

69
Phần 1: Đại cương về Saponin
1. Khái niệm - Định nghĩa 6. Chiết xuất
2. Cấu trúc - Phân loại 7. Phân lập - Tinh chế
3. Lý tính 8. Định tính
4. Hóa tính 9. Định lượng
5. Phân bố / tự nhiên 10. Tác dụng - Công dụng
Phần 2: Các dược liệu chứa Saponin
1. Các loài thuộc chi Panax 2. Rau má
3. Cam thảo 4. Đinh lăng …
70
1. Trình bày được các tính chất vật lý, hóa học chính của
saponin

2. Áp dụng được các tính chất vật lý và hóa học trong

việc định tính các dược liệu chứa saponin

71
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.1. Cảm quan

Saponosid:
o Trạng thái bột vô định hình
o Không màu
o Mùi hăng, đa số có vị đắng nhẫn đến đắng
Các sapogenin (aglycon) có thể ở dạng tinh thể (thường là hình kim).

Momordica charantia
/ Cucurbitaceae Momordicine I
72
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.2. Độ tan

Độ phân cực tăng theo độ dài & số lượng mạch đường .
• Aglycon (sapogenin): dễ tan / dung môi phân cực kém
→ phân cực trung bình (CHCl3, DCM, EtOAc…).
• Saponosid: thường kém tan/ d. môi (rất) kém phân cực

hydrophobic

Lựa chọn dung

môi chiết xuất/
phân lập

hydrophilic

73
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.3. Tính tạo bọt (bền trong môi trường nước)

o Tính lưỡng cực → làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch
→ tạo bọt nhiều và bền khi được lắc mạnh. (Sapo = soap: xà phòng)
o Mạch đường càng nhiều & dài, tính tạo bọt càng rõ rệt.

fat soluble
saponin

Water soluble
Asiaticoside/madecasoside Carbohydrate chain
74
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.3. Tính tạo bọt (bền trong môi trường nước)

Ứng dụng
➢ Tẩy rửa, làm thuốc long đàm.
➢ Định tính saponin bằng phương
pháp tạo bọt

Thực hiện định tính

0,5 g mẫu
Cồn 70%, đun nóng trong 5 phút
Lọc nóng qua bông, cô loại hết cồn
Cao chiết nước
+ 10 ml nước
Lắc 30 lần/ 60 giây
Đánh giá: bọt bền 15’ (+); bền 30’ (++); bền 60’ (+++)
75
 3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.3. Tính tạo bọt – Chỉ số bọt (CSB)
“Là độ pha loãng cần thiết của 1 gam dược liệu để tạo được một lớp bọt cao
1 cm sau khi ngưng lắc 15 phút, tiến hành trong điều kiện quy định.”

n ml dịch A + nước vừa đủ 10 ml

(độ pha loãng = 1/C = 1000/n)

1‰ 2‰ 3‰ 4‰ 5‰ 6‰ 7‰ 8‰ 9‰ 10‰
1000 500 333 250 200 167 143 125 111 100

Ứng dụng: Kiểm tra chất lượng dược liệu chứa saponin.
76
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.3. Tính phá huyết– Hemolysis (khi ở cả nồng độ rất thấp)
o Saponin làm vỡ Hồng cầu
(có thể do chúng kết hợp cholesterol màng hồng cầu -> tạo phức,
giảm tính đàn hồi, kém bền -> vỡ)
o Không có mối tương quan rõ rệt giữa tính phá huyết và tạo phức với
cholesterol.
o Hồng cầu của mỗi động vật nhạy khác nhau.
o Nhiều saponin có tính phá huyết rất mạnh (làm vỡ hồng cầu
→ không được đưa saponin vào mạch máu, nguy cơ gây tan máu).

Ứng dụng: định tính saponin/ đánh giá nguyên liệu chứa saponin

77
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.3. Tính phá huyết – Hemolysis

• Chỉ số phá huyết (CSPH)

Là số mililit dung dịch đệm cần thiết để hòa tan các saponin có trong 1
gam dược liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một
loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định.
78
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin
3.5. Tính kích ứng niêm mạc
Nhiều saponin có tính kích ứng niêm mạc
(làm đỏ mắt, chảy nước mắt; gây hắt hơi mạnh; vd. bột Bồ kết…)

3.6. Độc với cá và động vật thân mềm

Tăng tính thấm biểu mô hô hấp -> mất điện giải.

Một số dược liệu được dùng để thuốc cá.

79
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin

3.7. Phổ UV

Các saponosid & genin thường không cho phổ hấp

thu UV-Vis
Cực đại hấp thu của chúng thường << 250 nm.
❖ HPLC-UV, HPLC-PDA ~ 203 nm.
❖ Các detector khác (RI, ELSD, MS…)

Genin triterpenoid + H2SO4 đđ → sản phẩm có λmax 310 nm

Các genin steroid không có tính chất này *.
Ref: VD. Ponomarev, ET. Oganesyan, VF. Semenchenko (1971).

Phổ UV-Vis của các saponin thực tế không có ứng dụng nhiều
như trường hợp của flavonoid.

80
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin

3.7. Phổ UV

Định lượng saponin bằng phương pháp spectrophotometry

Fig. 2. Absorption spectra of saparal starting solution (a),

starting extract of A. mandshurica roots (b ),
saparal solution after reaction with conc. H2SO4 (c),
and extract of A. mandshurica roots after reaction with conc. H2SO4 (d ).

Quantitative Determination of Total Saponins in Aralia Mandshurica Plant Raw Material. Pharm Chem J 52, 455–458 (2018). 81
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin

3.8. Phổ IR

Trên phổ IR, sẽ cho các băng hấp thu đặc trưng của các nhóm
OH: ~3300; carbinol: ~1100 và carbonyl: ~1700 cm-1.

C=O
-CC-H
C-H

O-H C-H
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin

3.9. Khối phổ (MS)

24 Da
Đặc biệt quan trọng khi khảo sát cấu trúc -MS: [M-H]- +MS: [M+Na]+
các saponosid có nhiều mạch đường.
Khối lượng phân tử
Trên phổ MS, khi có sự phân mảnh:
(-)ESI-MS Sapogenin
o Δm/z 162: glucose, galactose (M = 180)
459 PPD
o Δm/z 146: rhamnose (desoxy) (M = 164) 475 PPT
491 OT
o Δm/z 132: xylose, arabinose (M = 150) 455 OA
(20)α-chain
Khối phổ của các ginsenoside trong chi Panax
Đường-n … Đường-1 Sapogenin Đường-1
Trước đây, các ose thường được xác định bằng ph. pháp SKLM.
(so sánh với các ose chuẩn; thực hiện sau phản ứng
Z0+thủy
-Cn+ phân).
Sapogenin
(+)ESI-MS3
424 PPD
Hiện nay, các ose được xác
Z định
/C
0
+nhờ-chain
n
các kỹ thuật
+ phổ
440MS, NMR. PPT
(định danh + / + fura/pyranose
-150/- +
Xyl cách ghép trong mạch…)
-180/- Glc -32 o2
-312/335 Glc-xyl -44, 86 mal
-326/349 Glc-rha -42 ace
-342/365 Glc-glc -54 acr 83
-444/467 Glc-xyl-xyl -68 but
 Ví dụ phân mảnh của ginsenoside Rb1, Rg1, Rc và F11

MS của saponin là 1 lĩnh vực rất rộng. Các công bố riêng về từng kiểu khung genin
cũng đã rất đồ sộ. Ví dụ tham khảo: MS và sự phân mảnh hay LC-MS, LC-HRMS...
của các ginsenosid trong chi Panax (internet). 84
3. Tính chất vật lý Phần I. Đại cương về Saponin

3.9. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

• Các saponin cho nhiều tín hiệu methylen nên phổ 1H-NMR
tương đối khó phân tích (vì nhiều tín hiệu bị overlapped).
• Để so sánh dữ liệu, thường khai thác phổ 13C hơn là 1H-NMR.
• Dung môi đo phổ NMR thông dụng:
- MeOD, DMSO-d6 hay CDCl3 đối với sapogenin.
- MeOD, DMSO-d6 hay Pyridin-d5 đối với saponosid.

Lưu ý: Trên phổ 13C-NMR (CPD, DEPT), khung của

• saponin triterpenoid → nhiều (~ 8) tín hiệu methyl
• saponin steroid → ít (~ 4) tín hiệu methyl
(xem lại ở mục Cấu trúc & Phân loại)

85
 Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) của ginsenosid Re
Vùng 1,00 – 2,50 ppm (CH3, CH2) bị chồng lấn (overlapped), khó phân tích.

86
 Phần I. Đại cương về Saponin
Kết luận
✓ 8 tính chất vật lý chính của hợp chất saponin
✓ Ứng dụng khả năng tạo bọt và tính chất gây tán huyết trong
định tính saponin
✓ Nêu được phương pháp làm thử nghiệm định tính phá huyết
và tính tạo bọt

Further reading
1. So sánh khả năng phá huyết của saponin steroid và saponin
triterpene Hemolysis of human erythrocytes with saponin affects the
membrane structure. Acta Histochem. 2000;102(1):21-35.
doi:10.1078/0065-1281-00534
2. Liên quan cấu trúc và tác dụng của saponin và tính chất phá
huyết Structure-Activity Relationships of Haemolytic Saponins,
Pharmaceutical Biology, 2002, 40:4, 253-262.
87
 Phần I. Đại cương về Saponin
4. Tính chất hóa học

4.1. Tính tạo tủa với dd. chì acetat

4.2. Các phản ứng màu của saponin

• Salkowski (1872).
• Liebermann-Burchard (1889) ***
• Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905).
• Với thuốc thử AS, VS, VP, acid sulfuric…

4.3. Tính tạo phức với cholesterol

4.4. Phản ứng thủy phân của saponosid

88
 Phần I. Đại cương về Saponin
4. Tính chất hóa học

4.1. Tính tạo tủa với dd. chì acetat

Robert (1917) đã chia saponin thành 3 loại:
• saponin kiềm: tủa với dd. chì acetat kiềm.
• saponin trung tính: tủa với dd. chì acetat trung tính.
• saponin acid: tủa với dd. chì acetat acid.

Có thể áp dụng tính chất này để làm giàu, tinh chế saponin trong quá
trình chiết xuất – phân lập saponin.

4.2. Các phản ứng màu

Từng saponin riêng biệt có thể cho một số phản ứng màu khá
chuyên biệt. Tuy nhiên, phản ứng màu chung cho nhóm saponin
(để định tính, phát hiện) khá ít và lại không thực sự đặc hiệu.
89
 Phần I. Đại cương về Saponin
4. Tính chất hóa học
4.2.1. Phản ứng Salkowski (1872).

Salkowski reaction is the reaction of cholesterol with concentrated

sulphuric acid. Concentrated sulphuric acid is highly hygroscopic
and it removes two molecules of water from two molecules of
cholesterol, it causes a connection at position 3, forming bi-
cholestadien (a). Simultaneously the sulphuric acid sulphonates
the molecule of bi-cholestadien at positions 7,7’ of aromatic ring
and, as a final product, red colour bi-sulphonic acid of bi-
cholestadiene is formed (b)

Thực hiện: Cho ~ 1 ml H2SO4 đđ. dọc theo thành ống nghiệm chứa sẵn
~ 1 ml d. dịch saponin (hòa tan kỹ trong CHCl3).
Kết quả: mặt ngăn cách: có vòng nhẫn màu sậm (tím – tím than).
Lớp d. dịch phía trên có màu tím, nâu, nâu đỏ (không thật rõ).
90
 Phần I. Đại cương về Saponin
4. Tính chất hóa học
4.2.2. Phản ứng Liebermann-Burchard (L-B, 1889).

THE Liebermann–Burchard reaction for steroids1, which consists in

adding a few drops of acetic anhydride and concentrated sulphuric acid
to the chloroform solution of the sterol, is not only used as a qualitative
test for it but also for its quantitative estimation in blood, etc. Formation
of coloured halochromic sulphate of ketone was suggested by Wieland
and Weil2 in explaining this reaction.

91
 Phần I. Đại cương về Saponin

H2SO4 đđ. (thẳng đứng)

• vòng nhẫn
(màu sậm)
(saponin) H2SO4 đđ.
• lớp trên có
(Ac2O + CHCl3)
màu (xanh, đỏ,
2 cm
tím…)
1 cm

Thực hiện: Cho ~ 1 ml H2SO4 đđ. dọc theo thành ống nghiệm chứa sẵn
~ 1 ml d. dịch saponin (hòa tan kỹ trong CHCl3 + Ac2O).
Quan sát: mặt ngăn cách: có vòng nhẫn màu sậm (tím hồng – tím than).
• lớp d. dịch phía trên có màu xanh lá (~ có khung steroid) hoặc màu nâu đỏ
(~ có triterpenoid).
Ph. ứng này chỉ nên dùng để phát hiện saponin (q. sát vòng nhẫn).
Việc
92 phân biệt (q. sát màu d. dịch bên trên) thì ko thực sự chắc chắn.
 Phần I. Đại cương về Saponin

• Toàn bộ hệ thống (mẫu, tube, pipet…) phải thật khô.

Nếu không: Khi cho acid vào sẽ sôi mạnh, phá vỡ vòng nhẫn.
• Nếu vòng nhẫn quá dày hoặc/và lớp trên có màu quá sậm:
Cần phải pha loãng mẫu thử (với Ac2O hay với CHCl3)
• Phản ứng dương tính (có saponin; steroid hay triterpenoid) khi:
- Có vòng nhẫn màu sậm (hồng tím, tím, tím than, nâu sậm…)
- Lớp trên màu xanh rêu, xanh lá đậm nhạt; nâu đỏ… đều được.
• Phản ứng nguy hiểm:
- Không thực hiện trên tay (phải để nghiêng / giá hay / becher…)
- Khi rửa tube: tuyệt đối không rót nước vào tube còn nhiều acid.
93
 Phần I. Đại cương về Saponin
4. Tính chất hóa học
Phản ứng Salkowski, Liebermann vs Liebermann-Burchard

Ban đầu, cả 3 phản ứng màu này đều áp dụng riêng cho cholesterol.
Có thể tóm tắt như sau (mẫu = vài mg cholesterol / 1 ml dung môi).

Phản ứng dung môi + 1-2  H2SO4, lắc + 1 ml H2SO4 dọc thành ống ngo

Salkowshi • lớp trên: đỏ nâu, vàng nâu

1 ml CHCl3 màu đỏ, đỏ nâu
(1872) • nhẫn: nâu, nâu đen (loang)

Liebermann • lớp trên: xanh lá sậm, tối

1 ml Ac2O đỏ rồi →→ xanh lá
(1885) • nhẫn: nâu, nâu đen (loang)

L-Burchard 1 ml h.hợp • lớp trên: xanh lá sáng, lan lên

xanh lá (hơi chậm)
* (1889) * CHCl3 Ac2O • nhẫn: tím hồng, tím, tím sậm

hay EtOAc, n-BuOH, AcOH

94
 Phần I. Đại cương về Saponin
4. Tính chất hóa học
4.2.3. Các phản ứng màu khác
Một số tài liệu còn đề cập tới vài phản ứng màu của saponin:
✓ Ph.ứng Rosenthaler (Vanillin + HCl, Δ) → màu tím hoa cà.
✓ Ph.ứng Carr-Price (SbCl3/ CHCl3) → h. quang vàng, xanh.
Các phản ứng này đều ít có ứng dụng thực tế.

95
 Phần I. Đại cương về Saponin

4. Tính chất hóa học

4.2.4. Phản ứng với các thuốc thử (hiện màu / SKLM)

Thường dùng các th’ thử có [ald. thơm] hay [Oxy acid mạnh]:

✓ Vanillin Sulfuric (VS)

✓ Vanillin Phosphoric (VP).
✓ Anisaldehyd Sulfuric (AS)
✓ H2SO4 10%/ cồn tuyệt đối.
✓ NH4HSO4 trong H2SO4 15%...

Sau khi sấy bản: vết

saponin thường cho các
màu tím khác nhau.
96
 4.3. Tính tạo phức với Δ’ 3β-OH-steroid
Từ 1910, Windaus đã nhận thấy rằng, tính phá huyết của saponin sẽ giảm
rất mạnh khi có mặt của cholesterol (và Δ’ 3-OH-steroid).

Đó là do saponin kết hợp với các steroid này để tạo 1 tủa phức.
Phản ứng này sẽ xảy ra dễ dàng với saponin có mạch ose dài.
Sự kết hợp giữa Digitonin (1 saponin có 1 mạch gồm 5 ose) với
Cholesterol xảy ra gần như hoàn toàn (ph. ứng ko loại bỏ H2O):

Digitonin + Cholesterol → → Tủa Cholesterol-Digitonid

(1229 = 76,1%) (386 = 23,9%) (1615 = 100%)

Có thể dùng phản ứng này để định lượng digitonin bằng cholesterol
(và ngược lại). Khi định lượng 1 saponin khác digitonin, có thể dùng
phản ứng này với sự quy đổi theo MW của saponin thực tế dùng.

97
 Hoặc không cần quy đổi, có thể thực hiện theo cách sau:
B1. Dung dịch saponin / nước + bột
cholesterol (chính xác, thừa).
B2. Khuấy kỹ 1 – vài giờ.
(Sap. + Tạp) / H2O
Để lắng, lọc & rửa tủa vài lần với
nước. a. bột Cholesterol, đun 1 giờ b. Để lắng qua đêm, Lọc lấy tủa

B3. Thu lấy kết tủa và sấy nhẹ (# Phức  (Sap – Cholesterol) 
40oC) đến khi tủa thật khô.
B4. Hòa tan tủa hoàn toàn vào V ml a. Để khô tự nhiên. b. Hòa tan tủa bằng Pyridin khan.
pyridin lạnh, khan (phá phức).
Dd. (Sap + Cholesterol) / Pyr
B5. Thêm # 10 V ml ether ethylic lạnh
vào: a. Kết tủa Sap bằng Et2O b. Loại bỏ Cholesterol / Et2O.

- Cholesterol (mới sinh + còn dư) sẽ

Tủa Saponin thô.
tan hết trong Et2O.
- Saponin ko tan / Et2O được lọc & Rửa lại n lần với Et2O
rửa kỹ bằng Et2O lạnh.
Tủa Saponin sạch hơn.
B6. Sấy tủa saponin sản phẩm đến
khối lượng không đổi. Tính H%...
98
 Phần I. Đại cương về Saponin
Minh họa sự tạo phức của Saponin với Cholesterol
(gốc: Windaus, 1910; thực hiện theo Schoenheimer & Dam, 1933;
hay cải tiến khác bởi Christiani & Pailer, 1937; Bergmann, 1940…)

Dung dịch Saponin (Digitonin, Tomatin, Tigogenin…)

+ 3β-OH-Steroid (như Cholesterol…)

Tủa [Sap - Cholesterol] = [Phức Digitonide]

+ Pyridin lạnh + Et2O

Saponin kết tủa (Cholesterol tan / dung dịch)

99
Một áp dụng của phản ứng này trong kỹ thuật làm giảm
hàm lượng “chất béo” & cholesterol trong sữa:

Trộn Pg bột Celite với 3P g hỗn hợp saponin từ cây Quillaija

saponaria (cả 2 đều đạt tiêu chuẩn thực phẩm).
Cho 4P g matrix trên vào 100P g sữa cần loại bớt cholesterol.
Bột Celite sẽ giúp phức [sap – cholesterol] mau lắng xuống
và được tách riêng.

Sữa thu được sẽ có cholesterol% giảm đáng kể.

100
 Phần I. Đại cương về Saponin
4.4. Phản ứng thủy phân của saponosid

Tùy cấu trúc, độ dài của mạch đường, tùy độ bền của phần genin,
tùy mục đích… có thể thủy phân bằng các đ. kiện rất khác nhau.

A. Để xét cấu trúc, trình tự của mạch đường dài, có thể sử dụng
ph. pháp thủy phân từng phần (pp. bậc thang) ở to thường:

(Saponosid / MeOH) + (HCl 5%, khuấy 6-12 h) → → các ose

Các ose (thu được tuần tự sau 1, 2, n giờ) sẽ được phân tích
(SKLM, SKG…) so sánh với các chuẩn (Gal, Glc, GlcA, Rha…)
để cung cấp các thông tin về mạch đường của saponosid.

Hiện nay, pp. phổ NMR cũng đã giải quyết tốt mục tiêu này rồi.
(phân tích trình tự mạch ose mà ko cần thủy phân nữa!)
101
 Phần I. Đại cương về Saponin

B. Nếu genin dễ biến tính bởi nhiệt độ cao:

Có thể thủy phân bằng các điều kiện nhẹ nhàng, ví dụ:
• các enzym (β-glucosidase từ hạt Hạnh nhân, β-glucuronidase lấy
từ nhớt con Sên Helix pomatia, hay hesperidinase, diastase…)
• AcOH 50% ở 70oC  6 giờ (pp. Shibata).

Sản phẩm thủy phân là các sapogenin + hỗn hợp các ose.

102
 Phần I. Đại cương về Saponin
C. Nếu các sapogenin bền nhiệt

Có thể thủy phân lâu bằng các acid vô cơ mạnh + nh. độ cao:
• HCl 5%, 10%, 15%, đun nóng 100oC trong vài giờ.
• H2SO4 10% / nước hay cồn; đun hồi lưu sôi trong vài giờ.

Sản phẩm thủy phân sẽ gồm (các) sapogenin + các loại ose.
Trong nhiều trường hợp, nếu mạch ose có phần glycuroric
(như GlcA, GalA…), nhóm ω-COOR / ose vẫn ko bị thủy phân.

Để theo dõi quá trình thủy phân, có thể kiểm tra liên tục các
sản phẩm (sapogenin) sau 1, 2, 3, n giờ bằng ph. pháp SKLM.
Các genin (kém phân cực hơn saponosid) sẽ cho vết có Rf cao
hơn hẳn saponosid trên sắc ký đồ. Khi diện tích của vết genin
không thay đổi nữa, ta nói phản ứng thủy phân đã hoàn toàn.
103
 Phần I. Đại cương về Saponin
5. Phân bố saponin

Phân bố rộng rãi trong hơn 90 họ thực vật

- Saponin triterpen gặp chủ yếu trong cây 2 lá mầm:
Fabaceae, Araliaceae, Sapindaceae, Cucurbitaceae,
Rosaceae….
- Saponin steroid gặp trong các họ thuộc nhóm 1 lá
mầm như Liliaceace (Smilax, Muscari,…);
Dioscoreaceae (Dioscorea spp.), Amarylidaceae
(Agave spp.)…
- Ít gặp trong Hai lá mầm: Scrophulariaceae (Digitalis
spp.), Solanaceae (Capsicum annum)
- Saponin alkaloid steroid đặc biêt gặp trong chi
Solanum (Solanaceae)
- Động vật: Hải sâm, sao biển

Vincken JP, Heng L, de Groot A, Gruppen H. Saponins, classification and occurrence in the plant kingdom. 104
Phytochemistry. 2007
 Phần I. Đại cương về Saponin
5. Phân bố saponin

• Saponin triterpenoid
Sap. triterpenoid (chủ yếu là phân nhóm oleanan) có trong > 500
loài / 100 họ thực vật. Phân nhóm Lanostan hay gặp trong hải sinh
vật (Sao biển, Hải sâm…)
Riêng trong chi Panax có hơn 300 saponin cấu trúc khác nhau. (2014)
• Saponin steroid
Đã gặp trong > 85 loài thuộc 59 chi thực vật (SM. Hassan, 2008).
Các chi hay gặp saponin steroid là Agave, Dioscorea, Yucca.
• Sap steroid alkaloid: thường gặp / chi Solanum (họ Solanaceae).

Hai nhóm saponin được khai thác thương mại nhiều nhất là từ cây
Yucca schidigera và Quillaja saponaria (đều thuộc Châu Mỹ).
105
 Phần I. Đại cương về Saponin
5. Phân bố saponin

Saponin thường chứa trong các không bào và có thể tìm

thấy trong các bộ phận của cây
- Rễ: Nhân sâm, Tam thất…(cũng có trong lá)
- Thân: Ngũ gia bì chân chim
- Lá: rau má
- Quả: bồ hòn, bồ kết
- Hạt: táo
Hàm lượng saponin trong dược liệu thường rất cao, có thể
từ 5-20% (sâm), 10% (bồ kết), 8-10% (cam thảo)

106
 Phần I. Đại cương về Saponin
5. Phân bố saponin

Tính đến 2013, đã phân lập được > 20.000 triterpen ở

dạng sapogenin hoặc saponosid (Q. Michaudel, 2013).

107
 Phần I. Đại cương về Saponin
6. Chiết xuất saponin
Chiết xuất saponin thô:
Dung môi:
▪ Chiết xuất với dung môi PHÂN CỰC như MeOH, EtOH, nước
hoặc hỗn hợp MeOH-H2O, EtOH-H2O.
▪ Loại tạp béo, kém phân cực thông thường bằng petroleum
ether (quá trình này có thể được tiến hành trước hoặc sau khi
chiết cao toàn phần)
▪ Dịch chiết sau khi loại tạp được hòa trong nước và chiết phân
bố với n-BuOH bão hòa nước.
▪ Kết tủa saponin bằng diethyl ether hoặc aceton.

Phương pháp chiết:

▪ PP chiết thông dụng: ngâm, ngấm kiệt, chiết nóng
▪ PP hiện đại khác: chiết lỏng siêu tới hạn, vi sóng, PLE, SPE…
108
 Phần I. Đại cương về Saponin
6. Chiết xuất saponin

Sap. / Dược liệu

a. Chiết bằng ROH.H2O b. Cô thu hồi ROH

(Sap. + tạp) / H2O

1 2 3 4

Kết tủa / dmhcơ Kết tủa / acid Lắc với n-BuOH.H2O SKC / Diaion HP-20

Saponin có % lớn Saponin acid Saponin “ít ose” Sap + tạp phân cực

(Bồ kết…) (Cam thảo...) (Nhân sâm…) (rất nhiều…)

109
• Các saponin có hàm lượng cao (Bồ hòn, Bồ kết, Cam thảo…)
→ Kết tủa trong n6, EP, Et2O, Cf, DCM, aceton
• Các saponin có tính acid (Glycyrrhizin, Glycuronid…)
→ Kết tủa trong dung dịch acid loãng (HCl…)
• Các saponin có ít ose (1-2 mạch x 1-2 ose; như ginsenosid)
→ Lắc với “n-BuOH b. hòa nước” hay “i-ProOH b. hòa nước”
• Các saponin có MW khác nhau rõ rệt (và MW < 4000).
→ Dùng SKC rây phân tử (Sephadex G hay LH-20.)
• Các sapogenin & saponosid có độ phân cực khác nhau
→ SKC phân bố với Si gel RP-8 hay RP-18.
→ SKC phân bố với Diaion HP-20 (Mitsubishi).
110
1

Bột quả Bồ kết

Đun hồi lưu với cồn 96%

Dịch chiết cồn 96%

Cô thu hồi cồn đến cắn khô Hòa tan trong MeOH (min)

Dịch MeOH đậm đặc

Rót dịch MeOH vào Et2O (hoặc aceton). Khuấy đều

Kết tủa màu nâu đen

111
2

Bột rễ Cam thảo (1 kg)

Ngấm kiệt nguội với cồn 70%

Dịch chiết cồn (V ~ 6 lít)

Cô thu hồi cồn, còn 1 lít Pha loãng với 5 lít nước

Dịch chiết loãng (6 lít)

Rót HCl 10% vào đến pH 2 Khuấy mạnh trong 5 phút

Kết tủa dẻo, màu nâu đỏ

(rất giàu Glycyrrhizin)

112
3

Mẫu / H2O được lắc với “n-BuOH bão hòa nước”.

(ko phải n-BuOH nguyên chất, neat)

(1-2 mạch) x (1-2 ose)

• các saponin “ít” ose
Lớp n-BuOH
• các glycosid “ít” ose

• các saponin “nhiều” ose

• các glycosid “nhiều” ose
Lớp nước
• các polysaccharid, tannin
• đường tự do, muối…

Đôi
113
khi thay “n-BuOH bão hòa nước” bằng “isopropanol bão hòa nước”
 Bột Tam thất (TT)

1 CHCl3 (hồi lưu > 2 h) (bỏ dịch CHCl3)

Bột TT đã loại tạp kpc

2 MeOH 70% (hồi lưu) (x 3 lần; lọc bông)

Dịch chiết MeOH

3 cô thu hồi MeOH rồi thêm nước.

Lắc 3 lần với n-BuOH bh nước

Lớp n-BuOH (trên)

4 cô quay đến khô, hòa trong MeOH

Saponin Σ / MeOH

Để chấm sắc ký
114
4

Mẫu / H2O được nạp lên cột chứa Diaion HP-20.

Khai triển bằng (H2O – MeOH) với MeOH % tăng dần:

độ phân cực giảm dần (chất phân cực nhất sẽ ra đầu tiên)

1 2 3 4 5 6 7 8

Muối vô cơ, đường. Các glycosid Các glycosid Các hợp chất
Polysaccharid, Tannin phân cực mạnh ph. cực trung bình phân cực kém

Các saponosid
115
116
 Phần I. Đại cương về Saponin
7. Phân lập saponin
A. Nguyên tắc chung

• Phân lập (isolation) là kỹ thuật tách riêng từng hợp chất tinh khiết
ra khỏi 1 hỗn hợp phức tạp bằng nhiều cách khác nhau.
• Độ tinh khiết của các sản phẩm này phải cao (ví dụ, có thể đem đo
phổ NMR để xác định cấu trúc được).
Muốn vậy, cần phải trả lời được các vấn đề sau
• Tên chính xác (khoa học) của mẫu nghiên cứu.
• Thành phần hóa học (sơ bộ) của mẫu nghiên cứu.
• Đối tượng nghiên cứu cụ thể: cấu trúc chung, độ bền, tính tan…
- Glycosid: số & độ dài mạch ose. Glycosid hay glycuronid
- Aglycon: độ phân cực tương đối.
117
 Phần I. Đại cương về Saponin
7. Phân lập saponin
B. Trình tự tiến hành (đề nghị)

B1. Chiết xuất (→ cao chứa hầu hết các thành phần chính)
• Chọn quy cách dược liệu (cỡ bột thô, vừa, mịn…)
• Chọn dung môi chiết
- cho glycosid: MeOH-nước hay EtOH-nước (25; 50; 70%...)
- cho genin: cồn cao độ
- cho các cấu trúc có tính acid: dùng [cồn + kiềm]…
• Chọn kỹ thuật chiết (ngấm kiệt ngược dòng, đun hồi lưu…)
• Chọn nhiệt độ chiết (thường, nóng)
• Cách kiểm tra việc chiết được, hoặc chiết đã xong.
• Cách cô dịch chiết (thường, cách thủy, giảm áp…)
118
 Phần I. Đại cương về Saponin
7. Phân lập saponin
B2. Loại tạp, làm giàu dịch chiết (→ cao Σ chứa ít tạp hơn)

Xác định nhóm tạp (tinh bột, diệp lục, chất béo, polyphenol…)
• Chọn cách loại bỏ tạp
- tinh bột: chọn d. môi chiết chứa ít nước; để lắng lạnh.
- diệp lục, sắc tố: nước lạnh, than hoạt, chì acetat.
- chất béo & kém ph.cực: lắc phân bố với các dmhc kém ph.cực.
- polyphenol (tannin…): chì acetat*, Celite, cột Silica gel, …
• Chọn dung môi chiết “chuyên biệt” (lắc phân bố với dd. nước)
- với ginsenosid (et als): chiết với “n-BuOH bão hòa nước”
- với sapogenin: chiết với CHCl3, EtOAc, “EtOAc bão hòa nước”
• Kiểm tra hiệu quả loại tạp (SKLM cao trước & sau khi loại tạp).
119
 Phần I. Đại cương về Saponin
7. Phân lập saponin
B3. Phân lập

Chọn cách phân lập sơ bộ (→ các phân đoạn đơn giản hơn)
- VLC với Silica gel NP, SKC với Diaion HP-20…
- Cách theo dõi thành phần các ph. đoạn (hệ SKLM & th’ thử…)
• Chọn cách phân lập chính
- qui mô nhỏ (< hàng chục mg): p-TLC, p-HPLC
- qui mô lớn hơn: SKC (h’. phụ, ph. bố, rây ph. tử…), p-HPLC…
- cách theo dõi quá trình phân lập (hệ SKLM với th’ thử…)
• Chọn cách tinh chế sản phẩm
- Kết tinh phân đoạn, kết tinh lại hay tinh chế qua SPE, cột mini…
- Tinh chế bằng các kỹ thuật khác
• Kiểm tinh khiết: SKLM, HPLC, so sánh dữ liệu phổ UV, IR…
120
1

Bột quả Bạch tật lê Dịch chiết cồn 70%

Cô bớt cồn, thêm nước nóng Lắc với n-BuOH bh nước

Lớp n-BuOH Lớp nước (bỏ)

Loại các tạp tan trong DCM. Cô giảm áp phần n-BuOH

cao đặc n-BuOH

+ (HCl / MeOH), đun 6 giờ. Lọc nóng. Lắc với EP, cô dịch EP

cắn Ether Petrol

Kết tinh lạnh trong MeOH Lọc thu tinh thể

hỗn hợp sapogenin

SKC Si gel (CHCl3)

neo-tigogenin neo-hecogenin neo-gitogenin

121
 25(S)
O
H

neo-tigogenin
Benzen – EtOAc (1 : 1)
HO 25S
O
21
22
H
O
 20
O
12

neo-hecogenin
HO 3
25(S)
O
H

O

HO
Σ nT nH nG Σ
neogitogenin
HO

122
 Phần I. Đại cương về Saponin
7. Tinh chế saponin
7b1. Dùng Chì acetat (loại bỏ tủa phức chì - polyphenol)
(Sap. + Polyphenol) / H2O

+ dd. chì acetat 30% Lọc bỏ tủa polyphenol-chì

(Sap. + Pb++ thừa) / H2O

+ dd. Na2SO4 15% Lọc bỏ tủa PbSO4

( + H2S → PbS )

(Sap. + Na2SO4 thừa) / H2O

chiết sap. bằng ROH.H2O, Cô giảm áp, loại bỏ ROH.H2O

Cắn Saponin toàn phần

123
7b2. Dùng Chì acetat (Lấy tủa phức chì - saponin)

(Sap. + Tạp) / H2O

+ dd. chì acetat 30% Lọc bỏ dd. chì thừa

Tủa phức (Sap – Pb) + tạp

Rửa tủa = nước. Hòa / MeOH

Lọc bỏ tủa PbS
Sục khí H2S

(Saponin + ít tạp) / H2O

Nếu cần: tinh chế thêm

Cô giảm áp.
= ROH.H2O

(Cắn Saponin + tạp)

124
7b3. Dùng bột Cholesterol (theo Walter, 1954)

(Sap. + Tạp) / H2O

a. bột Cholesterol, đun 1 giờ b. Để lắng qua đêm, Lọc lấy tủa

Phức  (Sap – Cholesterol) 

a. Để khô tự nhiên. b. Hòa tan tủa bằng Pyridin khan.

Dd. (Sap + Cholesterol) / Pyr

a. Kết tủa Sap bằng Et2O b. Loại bỏ Cholesterol / Et2O.

Tủa Saponin thô.

Rửa lại n lần với Et2O

Tủa Saponin sạch hơn.

125
7b4. Dùng bột hấp phụ

Khi các saponin bị lẫn nhiều tạp phân cực (nhất là tannin)
thì có thể tinh chế saponin theo cách sau

• Hòa tan mẫu [sap + tannin] vào 1 lượng tối thiểu* nước nóng.

• Tẩm dịch nước đậm đặc này vào 1 lượng vừa đủ* bột hấp phụ
(bột Kieselgur = Celite; bột polyamid hay bột Mg oxyt).

• Chiết saponin ra khỏi matrix này bằng EtOH 70-80% nóng.

Lọc dịch chiết rồi cô thu hồi cồn thu cắn saponin (sạch hơn).

• Do phân cực hơn saponin nên tannin không bị giải hấp ra khỏi
matrix này bởi EtOH 70-90% nóng.

126
7b5. Phương pháp thẩm tích (qua màng bán thấm, MBT)

Dòng nước chảy liên tục

nước ra nước ra

MBT

saponin +
Saponin lẫn tạp tạp MW nhỏ
có phân tử nhỏ

nước vào nước vào

tạp có phân tử nhỏ
bị rửa trôi

127
7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

A. Dùng cột hấp phụ (ví dụ VLC qua Si-gel NP)

Thường dùng cột VLC (d lớn, h < 20 cm)
Pha tĩnh: Si-gel NP (cỡ hạt vừa = 40-63 hoặc thô = 63-200 μm)
Mẫu thử: Dạng bột khô / Si-gel, P mẫu # 1/10 P Si-gel.
Hệ dung môi sử dụng: có độ phân cực tăng dần ***.
Thể tích mỗi phân đoạn: nhiều [V (ml) # P Si-gel (gam)]
Các phân đoạn đầu sẽ chứa các tạp kém phân cực (bỏ).
Các phân đoạn giữa sẽ chứa các sapogenin rồi saponosid (thu).
Các phân đoạn cuối (hoặc phần bị giữ lại trong cột) sẽ chứa các
tạp rất phân cực (tannin, polysaccharid, muối, đường tự do…).
Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 và th’ thử AS, VS hay H2SO4 10%.
128
 7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

B. Dùng cột rây phân tử (Sephadex LH-20* hoặc G-25).

Dùng để loại bỏ các tạp chất có MW khác xa* MW của sap.
Thường dùng cột có d hẹp (1-3-5 cm); h dài (~ 100 cm)
Pha tĩnh: Sephadex LH-20* (dạng hỗn dịch / MeOH).
Mẫu thử được hòa trong MeOH (V mẫu # 1/20 V Sephadex).
Khai triển với MeOH* (thông dụng nhất) hay (H2O + MeOH).
Các hợp chất có MW lớn hơn sẽ ra trước, MW nhỏ hơn sẽ ra sau.
Kiểm tra vết bằng SKLM / UV 254 và th’ thử VS, AS, H2SO4 10%

Sephadex LH-20 rất đắt tiền (> 30 triệu VNĐ / 100 gam)
129
7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

C. Dùng cột phân bố đảo (Diaion HP-20*)

Mục đích: Chọn phân đoạn (hỗn hợp) có độ ph. cực thích hợp.
Thường dùng cột có d khá lớn (~ 5 cm), h tr. bình (50-60 cm).
Pha tĩnh: Diaion HP-20* (Mitsubishi), hỗn dịch / nước or MeOH.
Mẫu thử: hòa tan (hay hỗn dịch) / nước hoặc MeOH-nước.
Khai triển bằng [H2O – MeOH] (MeOH% tăng dần).
Các hợp chất rất ph. cực (ose, muối, PS, tannin) sẽ ra trước.
Các glycosid ph. cực → glycosid ít ph. cực → genin sẽ ra sau.
Các hợp chất kém ph. cực sẽ ra sau cùng (hoặc bị giữ lại cột).
Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 hay th’ thử AS, VS, H2SO4 10%.

130
7b6. Tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký

D. Dùng SKLM chế hóa (SK lớp dày / Silica gel NP)
Lớp Si-gel có diện tích lớn; bề dày 1 – vài mm;
Mẫu (chỉ vài chục mg) hòa / MeOH, chấm thành băng liên tục
Khai triển với hệ dung môi thích hợp*
Phát hiện vết: UV 254*, đôi khi bằng th’ thử (chú ý kỹ thuật).
Cạo các vết trên bản si-gel, chiết lại bằng MeOH (hay MeOH-Cf)
Lọc loại bỏ phần Si-gel (không tan), thu dịch lọc hòa tan vết.
Bay hơi dung môi, thu cắn/tủa…

131
 Phần I. Đại cương về Saponin
8. Định tính saponin

8.1. Định tính tạo bọt (trong ống nghiệm)

Xác định chỉ số bọt (CSB)
8.2. Định tính phá huyết (lam, thạch máu, ống nghiệm)
Xác định chỉ số phá huyết.
8.3. Định tính tạo phức với cholesterol.
8.4. Định tính bằng các phản ứng màu
trong ống nghiệm (Salkowski, Liebermann-Burchard)
trên bản mỏng (thuốc thử AS, VS, VP hay H2SO4...)
8.5. Định tính bằng SKLM/HPLC

132
A. Nguyên tắc chung

• Vì protein, polysaccharid cũng có thể tạo bọt như saponin →

chiết bằng cồn 70% (không chiết bằng nước, tránh pos. giả).
• Vì cồn có thể phá bọt → cần loại bỏ cồn trong dịch thử nghiệm
(tránh neg. giả).

B. Thực hiện (thống nhất theo 1 quy định chung, xem thực tập)

• 0,5 g mẫu + 10 ml cồn 70%, đun cách thủy trong 5 phút.

• Lọc nóng qua bông, cô đến hết cồn (thu dịch nước).
• Cho 0,5 ml dịch cô này vào 1 tube (size 16) có sẵn 10 ml nước.
• Nút tube, lắc mạnh dọc tube (đúng 30 lần / đúng 60 giây).
• Đánh giá: bọt bền 15’ (+); bền 30’ (++); bền 60’ (+++).
133
Chỉ số bọt (CSB) là số ml nước để hòa tan saponin có trong 1 gam
nguyên liệu (= độ pha loãng*), cho cột bọt cao 1 cm sau khi lắc *.

Tiến hành thực nghiệm trong các điều kiện quy định.

• cỡ bột nguyên liệu: 0,5 mm. • 10 tube (1.6 x 16) cm.

• + 100 ml nước sôi * • chứa 1 → 10 ml dịch A.
• đun sôi nhẹ 1 lần = 30 phút. • thêm nước vừa đủ 10 ml.
• Lọc nóng (giấy, bông), để nguội. • Lắc dọc 15 sec = 30 lần *.
• + nước vừa đủ 100 ml (dịch A). • Đo h (cm) cột bọt sau 15’.

134
 (thực hiện trong dãy ống nghiệm nhỏ)

[C] thấp nhất → [C] tăng dần → → [C] tăng dần → →

(3 ống phá huyết)

còn hồng cầu lắng đọng ống phá huyết đầu tiên và hoàn toàn
[C] thấp nhất / các ống phá huyết
135
 • Phản ứng Salkowski (1872)
• Phản ứng Liebermann-Burchard (1889) ***
• Phản ứng Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905)
• Với các thuốc thử (trên SKLM) *

136
 Mẫu/CHCl3 + vài giọt H2SO4 đđ. nâu đỏ, tím, tím sậm

Ban đầu, phản ứng này chỉ dùng để định tính cholesterol.
Với saponin nói chung, màu của sản phẩm phản ứng thì không
thực sự rõ ràng (ngay cả khi thực hiện với kỹ thuật dùng nhiều
acid, nhỏ dọc thành tube… và ngay cả khi thực hiện trên mẫu
là cholesterol tinh khiết).

Hiện nay, phản ứng Liebermann-Burchard (L-B) thì thông dụng

và hữu hiệu hơn (xem phần sau).
137
 Ban đầu, cũng chỉ dùng để định tính cholesterol (Є steroid)
• Phản ứng Liebermann (1885, chưa dùng CHCl3):
(Steroid / Ac2O) + H2SO4 đđ → màu xanh / đỏ.

• Phản ứng L-B (1889; dùng CHCl3 + Ac2O):

(Steroid / CHCl3.Ac2O) + H2SO4 đđ → dd. màu xanh.

Ac2O dùng để làm khan môi trường và để pha loãng H2SO4.

Có thể thay Ac2O bằng AcOH glacial, EtOAc, hay BuOH (khan).
Cơ chế phản ứng: có nhiều đề nghị, nhưng chưa rõ ràng (2007).
Kỹ thuật thực hiện: dùng ít/nhiều H2SO4; xem slides phía sau.
138
 # 1 ml H2SO4 đđ (pipet thẳng đứng!)

ng nghiệm nghiêng

Lớp dd. mẫu, có màu

(xanh lá, đỏ nâu, đỏ…) vòng nhẫn mỏng, màu sậm
(hồng tím, tím, tím than…)

Lớp acid (d ~ 1,84) ko màu; cao > 1 cm

• Hệ thống phải thật khô. Khi thực hiện: cấm cầm trên tay.
• Cho dư Ac2O + Lắc kỹ. Nhỏ acid trôi xuôi theo thành tube.
• Rất chú ý khi rửa ống nghiệm này (Coi chừng phỏng mắt)!
139
 Một nhận định tham khảo

Các phản ứng Salkowski và L-B được nghiên cứu khá nhiều.
Theo Schoenheimer & Sperry (1934); Brieskorn & Capuano (1953):
Cơ chế của các phản ứng này thì như nhau.
Màu của sản phẩm sẽ thay đổi theo tỉ lệ k = [H2SO4 / Ac2O]
• Khi k lớn (ít Ac2O) → red-purple color (phản ứng Salkowski).
• Khi k bé (nhiều Ac2O) → a green color (phản ứng L-B).
Ac2O có vai trò làm khan môi trường, pha loãng H2SO4 và có thể
thay thế bằng các dung môi khan khác như AcOH, EtOAc, n-BuOH.

140
• Khi các phương pháp phổ (NMR…) còn sơ khai, thì các phản ứng
màu của saponin (và HCTN) còn có nhiều ứng dụng trong định
tính, định danh tuy tính chuyên biệt không thực sự thuyết phục.

• Hiện nay, các phản ứng màu của saponin (& HCTN) chỉ có vai trò
khiêm tốn trong việc nhận định & phân biệt sơ bộ mà thôi.

• Để định tính, định danh mẫu; hiện nay, các ph. pháp phân tích
dụng cụ (HPLC-RI, LC-ELSD, LC-MS…) cùng các ph. pháp phổ học
(MS, NMR) được ứng dụng nhiều với sự chính xác rất cao.

141
8.4a. SKLM (TLC) và SKLM hiệu năng cao (HP-TLC)

Rất thường được sử dụng nhằm nhiều mục đích

• So sánh các mẫu đa thành phần (dược liệu thử // dl chuẩn…).
• So sánh các hợp chất tinh khiết riêng biệt (đồng nhất Y/N)
• Xác định sự có mặt Y/N của 1 chất trong 1 hỗn hợp.
• Theo dõi quá trình phản ứng (tổng hợp, thủy phân,…)
• Theo dõi quá trình khai triển SKC
• Sơ bộ kiểm tinh khiết. Có thể bán định lượng.
• Định danh nhóm của từng vết (nhở th’ thử chuyên biệt…)
• Thử nghiệm sinh học (sàng lọc ngay trên vết của sắc ký đồ)

142
8.4.a Sắc ký lớp mỏng saponin

Saponin (genin + glycosid) là nhóm hợp chất rất lớn & đa dạng.
SKLM saponin là 1 nghệ thuật. Cần chú ý các điểm sau:

• Bản mỏng: thông dụng nhất là silica gel F 254 pha thuận (NP).
• Mẫu thử: càng sạch càng tốt; hòa trong [CHCl3 – MeOH; x : y].
nên chấm thành vạch dài 6-10 mm (phân giải tốt hơn điểm).
• Dung môi: cùng “tính chất” với đối tượng nghiên cứu
- sapogenin dùng d. môi kém ph. cực hơn saponosid.
- mẫu có tính acid: d. môi nên có acid (AcOH, TFA, ForOH)
• Phát hiện vết: UV 254 và/hay thuốc thử AS, VS, VP, H2SO4 10%.
• Để có sắc đồ đẹp: tham khảo tài liệu với keywords tương ứng
(Ginsenosid, Gypenosid, Cardenolid, Madecassoid, Glinus, …)
• Kỹ thuật cụ thể: Tham khảo và ghi chú trong phần thực tập.

143
 Phần I. Đại cương về Saponin

8.4.a. Sắc ký lớp mỏng saponin

Chú ý kỹ thuật thực hiện Ghi chú, mục đích

1. Chấm mẫu thành băng # 6 -10 mm Tăng khả năng phân giải của bản mỏng

2. Để thật khô dung môi hòa mẫu Tránh làm Rf bị thay đổi do dm còn sót

3. Khai triển bản mỏng Tránh di chuyển khi đang khai triển

4. Để thật khô dung môi sắc ký Tránh thuốc thử loang lổ không đều

5. Nhúng thuốc thử (VS, AS…) Nhúng nhanh, tránh làm loang vết

6. Để thật khô dung môi của thuốc thử Tránh làm rộp bản mỏng khi sấy nóng

7. Sấy nhẹ kỹ, rồi mới sấy nóng vừa đủ Tránh làm sậm màu nền bản mỏng

144
 Tham khảo kỹ thuật chấm mẫu thử thành băng 1 cm.

Ginsenoside standards Panax MeOH extracts

Mẫu thử: dịch chiết MeOH của các mẫu Panax

145
Bản Si gel F 254 (Merck). Hiện màu vết = thuốc thử VS.
 Tham khảo kỹ thuật chấm mẫu thử thành băng 1 cm.

Ginsenoside standards Panax MeOH extracts

Mẫu thử: dịch chiết MeOH của các mẫu Panax

146
Bản Si gel F 254 (Merck). Hiện màu vết = thuốc thử VS.
 P-F11
G-Rf

P. vietnamensis
P. ginseng P. notoginseng
P. quinquefolius
G-Rb2/G-Rb1<0.4
G-Rg1/G-Rb1<0.3
G-Rb2/G-Rb1 >0.4
8.4.a. Định tính bằng SKLM Phần I. Đại cương về Saponin

Stationary phase: HPTLC Si 60 F254 20 x 10 cm (MilliporeSigma)

151
HPTLC chromatograms under UV 366 nm and under white light after derivatization Ph. Eur.1
8.4.a Định tính bằng SKLM Phần I. Đại cương về Saponin

1. ginsenoside Rf (green arrow); 2: ginsenoside F11 (red arrow); 3: P. ginseng root

extract 4: P. ginseng 5: P. quinquefolium root 6: P quinquefolium
2. 7: P. notoginseng root extract; 8: P. notoginseng root; 9: P. japonicas root;
3. 10: P. vietnamensis root; 11: wild Vietnamese ginseng root. 152
8.4b. HPLC, UPLC (ghép với các detector khác nhau; **LC-det.)

Là các công cụ hữu hiệu, đa năng, đáng tin cậy và phổ biến.
Khi ghép nối với các detector khác nhau, tính năng của chúng
sẽ càng thêm phong phú. Các ứng dụng chủ yếu:
Kiểm nghiệm (định tính, định lượng, định danh…) mẫu.
Các chi tiết sẽ được tham khảo trong học phần riêng biệt.

Riêng với saponin, cần chú ý các detector ghép với hệ thống
(**LC-det.) phải phù hợp với các cấu trúc không có chromophore.
Thường dùng các detector RI, ELSD, PDA (vùng cận 205 nm), MS.
Trong số này, MS là 1 detector cực kỳ hữu hiệu (LC-MS)…

153
 Phần I. Đại cương về Saponin
9. Định lượng saponin

9.1 Phương pháp cân

- Chiết xuất dược liệu, tinh chế thu lấy saponin thô và cân khối lượng
9.2. Phương pháp đo quang
- Chiết xuất dược liệu, tinh chế saponin/ sapogenin, phản ứng tạo
màu, đo quang ở bước sóng thích hợp
9.3. Định lượng bằng phổ UV
- Áp dụng cho saponin có phổ hấp thu UV (acid glycyrizic)
9.4. Định lượng dựa vào sắc ký
- Định lượng bằng TLC – densitometry
- HPLC ghép nối đầu dò UV/PDA/ELSD/CDA…
9.5. Định lượng bằng phương pháp acid – base
- Có thể áp dụng cho alkaloid saponin

154
 (Sap + Tạp) / P g DL

Chiết với ROH.HOH Cô thu hồi ROH

(Sap + Tạp) / Nước

1. Thêm nước, Lọc (nếu cần) loại bỏ cắn.

2. Chiết với PE, DCM, EtOAc... Loại bỏ tạp kém phân cực

3. Lắc với n-BuOH bão hòa nước, Loại bỏ lớp nước (dưới)

Saponin / n-BuOH

Cô giảm áp đến cắn

Cắn saponin (p gam)

155
 Bột Cam thảo (100 g)

Ngấm kiệt nguội với cồn 70%

Dịch chiết cồn (600 ml)

Cô thu hồi cồn

Dịch cô (100 ml, hết cồn)

+ 500 ml nước

Dịch loãng (600 ml)

+ HCl 10% đến pH 2-3

Tủa (Glycyrrhizin thô)

156
Phương pháp cân chỉ thực sự đúng khi hòa tan được (chiết được)
hoặc kết tủa, kết tinh được hoàn toàn & riêng biệt đối tượng thử.
Rất khó thực hiện được các yêu cầu này.
Sai số do vậy thường khá lớn đến rất lớn.
Ví dụ:
• Không thể kết tủa hoàn toàn glycyrrhizin (từ Cam thảo) / mt acid
(mọi pH); nhưng lại kết tủa một số chất không phải là glycyrrhizin.

• Không thể chiết hoàn toàn ginsenosid (từ dịch nước Nhân sâm)
bằng “n-BuOH bão hòa nước” nhưng lại chiết được một số chất khác, không phải
ginsenosid (sai số dư ? thiếu ?).

Định lượng bằng pp. cân chỉ nên áp dụng trong 1 số trường hợp *.

157
 Ví dụ: Định lượng [tri, di, mono ammonium] glycyrrhizat:

Chuyển các ammonium glycyrrhizat → acid glycyrrhizic bằng HCHO.

Chuẩn độ acid glycyrrhizic mới tạo thành bằng d. dịch NaOH 0,1 N.

COO – NH4 COO – H COO – Na

HCHO 3NaOH
[Gz] COO – NH4 [Gz] COO – H [Gz] COO – Na
COO – NH4 COO – H COO – Na
(CH2)6N4
acid glycyrrhizic
(C42H62O16 = 822)

1 ml NaOH 0,1 N # 27,4 mg acid glycyrrhizic (= glycyrrhizin)

Kết quả định lượng được quy về # glycyrrhizin

158
Chỉ áp dụng với các mẫu có tính acid (hoặc base) rõ rệt.
Tính acid / base mạnh sẽ là một thuận lợi.
Nếu tính base yếu quá (pKa quá nhỏ, ví dụ < 2): môi trường khan!

Sai số sẽ cao khi có nhiều tạp chất acid (hoặc base) khác.

Dung dịch định lượng thường đã có màu khá sậm, khó quan sát
điểm tương đương nhờ chỉ thị màu.

159
Áp dụng định luật Lambert-Beer, so sánh độ hấp thu của dd. thử
với các dd. đối chiếu đã biết nồng độ (trong vùng tuyến tính).

Abs. Đường chuẩn

(tại λ nm) ·

·
Abs.X ·
·

· [CX]
[C μg/ml]

20 40 60 80 100 120
160
Một ví dụ: Định lượng các genin triterpenoid 5 vòng bằng ph. pháp
quang phổ UV (đo ở 310 nm) sản phẩm của chúng với H2SO4 đđ.

Căn cứ vào độ hấp thu (Abs), so sánh với các dd. chuẩn thích hợp,
có thể suy ra hàm lượng của các sapogenin trong mẫu thử.

161
So sánh vết định lượng với 1/các vết chuẩn (đã biết lượng chấm)
• về diện tích vết / UV (không có hoặc có thuốc thử)
• về cường độ màu (sau khi + thuốc thử hiện màu)

Có thể sử dụng bản mỏng thường hay hiệu năng cao (HP-TLC).
Thường kết hợp HP-TLC với các máy & phần mềm chuyên dụng.
(ví dụ máy Camag TLC Scanner 3; S/w winCATS hoặc tương tự).

Kết quả thực tế còn sai số khá lớn (chỉ được chấp nhận như là
một giải pháp bán định lượng, định lượng sơ bộ mà thôi).

162
 Nhắc lại
Sự tắt quang (quenching) của các vết trên bản mỏng F254
(Khi quan sát dưới đèn UV 254 nm)

4 vết này che khuất nền sáng

(tạo nên sự tắt quang)

silica gel + chất phát huỳnh quang F

(sáng rực dưới UV 254 nm)

163
164
 QuantiScan

165
 JustTLC Analysis

166
 winCATS / TLC Scanner 3 (CAMAG)

167
168
 Phần I. Đại cương về Saponin
9. Định lượng saponin

169
Saponin & các dược liệu chứa saponin có rất nhiều công dụng

10.1. Tác dụng long đờm, trị ho

Thiên môn, Mạch môn, Cam thảo, Viễn chí, Cát cánh

10.2. Tác dụng bổ dưỡng, tăng lực

Điển hình là các ginsenosid & các dược liệu họ Araliaceae

10.3. Tác dụng làm tăng tính thấm

Digitonin / Digitalis. Nhiều saponin được dùng làm tá dược trong
kỹ thuật điều chế vaccin

10.4. Tác dụng kháng viêm

Glycyrrhizin / Cam thảo; acid oleanolic / Ngưu tất
170
10.5. Tác dụng lên mô sẹo
Asiaticosid / Rau má

10.6. Tác dụng diệt các loài nhuyễn thể

Dùng để diệt nhiều loài ốc (ký chủ trung gian của Sán máng)

10.7. Tác dụng bảo vệ thành mạch (# vit P, Flavonoid)

Ruscogenin / Ruscus aculeatus (Protolog®)

10.8. Tác dụng kiểu hormon sinh dục, Σ steroid

Diosgenin, Dioscin, Hecogenin & saponin / Bạch tật lê, Mía dò…

10.9. Tác dụng bảo vệ gan

Acid oleanolic, acid ursolic…

Tham khảo BGDL I, (2011), pp. 213-214.

171
10.10. Tác dụng kháng khuẩn
Saponin của rau má (asiaticoside) có tác dụng kháng khuẩn, từng
được nghiên cứu lâm sáng thử nghiệm bệnh hủi…

10.11. Tác dụng kháng nấm

Saponin steroid có tác dụng mạnh hơn saponin triterpene
Phổ biến, giúp bảo vệ, chống sự xâm nhập của nấm mốc
Holotoxin A,B,C/Hải sâm; tomatine…

172
 Phần I. Đại cương về Saponin
2. Cấu trúc – Phân loại saponin
FPS

Con đường sinh tổng hợp sterol và triterpen

thông qua con đường acid mevalonic (MVA)

Chair-boat-chair enzym oxidosqualen cyclase (OSCs)

BAS
LAS CAS CPQ

Vincken JP, Heng L, de

Groot A, Gruppen H.
Saponins, classification and
occurrence in the plant
kingdom. Phytochemistry. 173
2007
Hợp chất sau đây thuộc khung cấu trúc nào?

Solanin

A. Steroid
B. Alkaloid steroid
C. Dammaran
D. Olean
174
Tính chất nào đơn giản nhất để nhận biết saponin?

A. Tính tạo phức với cholesterol

B. Tạo nhiều bọt bền khi lắc với nước

C. Làm vỡ hồng cầu ngày ở nồng độ

rất loãng

D. Tính độc với cá

175
Chiết cách thủy 0,5 g dược liệu với 10 ml cồn 70%, lọc
nóng qua bông, cô đến hết cồn. Pha với 10 ml nước trong
ống nghiệm cao 16 cm. Lắc 30 lần / đúng 60 giây, (+++).
Hãy nêu lý do vì sao cô loại cồn trước khi định tính?

A. Vì cồn gây tủa saponin

B. Vì cồn phá bọt
C. Vì cồn làm tăng khả năng tạo bọt
D. Vì cồn làm protein tủa

176