Ontwikkelingsbiologie

H1: Inleiding tot de dierlijke ontwikkelingen

Embryologie (= ontwikkeling organisme tss bevruchting van de zygote en geboorte) ≠
ontwikkelingsbiologie (= ontwikkeling van het organisme voor de gehele levensduur)
Ontwikkelingsbiologie => oplossen van belangrijke vragen
1. Vraag van differentiatie: Hoe kan een bevruchte eicel met 1 set aan genen zoveel
verschillende celtypes genereren
2. Vraag van morfogenese: Wat zorgt ervoor dat cellen georganiseerd zijn in complexe weefsel
en organen en niet willekeurig verspreid als cellen
3. Vraag van groei: Hoe wordt celdeling zo precies gereguleerd en stoppen ze op tijd met delen
4. Vraag van reproductie: Hoe worden geslachtscellen onafhankelijk gehouden van somatische
cellen en verzekeren ze vorming van de volgende generatie
5. Vraag van evolutie: Hoe creëren veranderingen in de ontwikkeling nieuwe lichaamsvormen
6. Vraag naar integratie in de omgeving: In welke mate speelt de omgeving een invloed  in de
ontwikkeling van een organisme
Verschillende benaderingen om embryologie te bestuderen => anatomische, experimentele en
genetische/moleculair genetische benadering
Via verschillende soorten studies kan de anatomische benadering  in ontwikkelingsbiologie worden
bepaald
1. Vergelijkende embryologie: Studie van van anatomische veranderingen gedurende de
ontwikkeling van verschillende individuen
2. Evolutionaire embryologie:  Studie van hoe veranderingen in de ontwikkeling evolutionaire
veranderingen veroorzaken en hoe de voorouders van een organisme de types van
veranderingen beperken die worden toegelaten
3. Teratologie:  Studie van geboorteafwijkingen
4. Mathematisch modelling: Beschrijven van ontwikkelingsfenomenen in termen van
mathematische vergelijkingen
2 tegengestelde theorieën voor vergelijkende embryologie: Preformatie en epigenese
Triploblastische organismen (= embryo bevat 3 lagen; ectoderm, mesoderm en endoderm => zie
pg 1.2 )><  diploblastisch organismen (= embryo bevat 2 lagen; missen mesoderm of bevatten
rudimentaire vorm van enkele losliggende cellen in gelatineuse massa)
inductie: proces waarbij verschillende types van weefsel interacties met elkaar aangaan en elkaar
gaan aanzetten tot de ontwikkeling van nieuw weefsel en organen
Notochord: Staaf van de meest dorsaal gelegen mesoderm dat het embryo in een linker- en
rechterhelft verdeeld
De 4 principes van Karl Enrst von Baer => algemene wetten van de embryologie ( zie pg 1.4)
 1. De algemene eigenschappen van een grotere groep van dieren verschijnen vroeger in het
embryo dan de gespecialiseerde eigenschappen
2. Minder algemene eigenschappen worden ontwikkeld van de meer algemene, tot wanneer de
meest gespecialiseerde verschijnen
3. Het embryo van een gegeven species, in de plaats van de volwassen stadia van lagere dieren
te doorlopen, verwijdert zich verder van deze lagere dieren
4. Daardoor is een vroeg embryo van een hoger dier nooit gelijk aan een lager dier, maar enkel
zoals het embryo van het lager dier
Stadia in dierlijke ontwikkeling => fusie van twee gameten (= bevruchting) + opeenvolgende stadia
gezamenlijke (= embryogenese)
1. Bevruchting wordt onmiddellijk  gevolgd door mitotische celdeling zonder volume-toenamen
=> cellen worden blastomeren genoemd, geheel blastula
2. Na snelle celdelingen volgt een fase van celherschikkingen waarbij de blastomeren drastische
verplaatsingen ondergaan tegenover hun vorige relatieve posities (= gastrulatie) => embryo
wordt in deze fase gastrula genoemd. Er ontstaan 3 kiemlagen: ectoderm, endoderm en
mesoderm => geven later aanleiding tot de vorming van organen
3. Na de vorming van de drie kiemlagen zal het embryo overgaan tot de volgende fase,
organogenese => verdere drastische herschikkingen van cellen die verder zullen ontwikkelen
tot organen
4. Gespecialiseerde delen van het ei-cytoplasma zullen aanleiding geven tot precursoren van
gameten => deze kiemcellen zullen gametogenese ondergaan
5. (Niet bij alle soorten) het ontstaan van een larve-fase
Levenscyclus van de kikker
Onbevruchte eicel van kikkers zijn asymmetrisch met een gepigmenteerde bovenste laag (=
animale pool, cellen afgeleid van deze regio zijn actief en mobiel geanimeerd, terwijl de
dooier bevattende cellen immobiel zijn - vegatief) en lager gelegen gebied (= vegetatieve
pool) gekarakteriseerd door een accumulatie van dooier granules. Animale pool wordt later
voorste eind embryo
De kikker volgt hetzelfde schema als hierboven beschreven: klievingen (= mitotische
delingen), verkrijgen van een blastula na 12 celdelingen met een blastocoel(= open holte
gevuld met vloeistof), ontstaan van de drie kiemlagen, het ontstaan van het notochord en
somieten (= blokken mesoderm die in een dubbele rij gerangschikt liggen langs de neurale
buis) tijdens de gastrulatie, het ontstaan van de neurale buis tijdens de neurulatie
Belangrijk binnen de beschrijvende embryologie is het traceren van de lijnen van de cellen: volgen
van individuele cellen en hun lot => opstellen van bestemmingskaarten (= fate maps) om de
oorsprong van cellen, weefsels en organen te kunnen volgen. Hiervoor worden verschillende
technieken zoals radio-actief merken gebruikt
 Blastoporus: gleufvormige invaginatie aan het dorsale oppervlak van het embryo die markeert waar
de gastrulatie aanvangt
Spemann organisator: Kleine regio die de vorming van het embryo controleert
H2: Algemene concepten
1. Ontwikkeling impliceert celdeling, het ontstaan van een patroon, verandering van vorm,
celdifferentiatie en groei
Patroonvorming: spatiale en temporale organisatie van activiteiten van cellen
Definitie van lichaamsassen helpen bij het vastleggen van lichaamsbouwplan: Anterieur-
posterieur, dorsaal-ventraal en links-rechts
Toekennen van cellen tot 1 van de 3 kiemlagen, morfogenese
Celdifferentiatie (250 structureel en functioneel verschillende celtypes):
Patroonvorming en celdifferentiatie zijn sterk verweven met elkaar. Zoogdieren
illustreren een verscheidenheid die vooral terug te voeren is op patronen
Groei: toename in volume door vermenigvuldiging van cellen alsook door afzetting van
extracellulaire materiaal zoals been, vocht etc
2. Het gedrag van cellen vormt de verbintenis tussen de activiteit van genen en
ontwikkelingsprocessen
De gen-expressie "status"  van de cel bepaalt het gedrag van de cellen en het cellulair
gedrag en de betrokken cellulaire processen bepalen de embryonale ontwikkeling. Cellulaire
processen betrokken bij de embryonale ontwikkeling: Spemann organisator, aanvang
gastrulatie, afzonderen van de neurale buis, celdood, celproliferatie, verandering in adhesie
3. Genen controleren het gedrag van cellen door te controleren weke eiwitten door een
welbepaalde cel worden aangemaakt
Maar een beperkte hoeveelheid aan ontwikkelingsgenen in vergelijking met huishoud genen (
enkele 10-tallen tov enkele 1000'den)
Transcriptiefactoren zijn specifiek van belang voor het sturen van de ontwikkeling
Sommige genen worden "hergebruikt" later in andere fasen van de ontwikkeling
4. Differentiële genactiviteit controleert de ontwikkeling
Zorgt ervoor dat er in de individuele cellen maar een beperkt "genprogramma" actief is. Deze
genexpressie is meestal enkel de eerste stap in een cascade van cellulaire processen, waarbij
dat celmigratie en interactie een belangrijke rol spelen
5. Ontwikkeling gebeurd gradueel en de bestemming van de cellen wordt op verschillende
tijdstippen vastgelegd
Celbestemming (= ontwikkelingspatroon van de cel indien deze zich op de normale positie
bevind) en determinatie-toestand (= differentiatie van de cel indien deze zich op een
vreemde plaats bevind) zijn duidelijk verschillend van elkaar en van celspecificatie (=
ontwikkelingspatroon van de cel indien deze zich in isolatie bevind) => zie vb kikker pg 2.3
 Species kunnen oftewel een hoge determinatie vertonen (= veel differentiatie maar weinig
variatie, alles staat vast en cellen verliezen totipotentie) oftewel een hoge regulatie vertonen
(= cellen bezitten nog totipotentie en kunnen zelf nog uitgroeien tot nieuwe embryo's)
6. Inductieve interacties maken cellen verschillend van elkaar
Binnen de embryo gaan cellen met elkaar communiceren doormiddel van inducerende
signalen, waarbij de inductie zeer lokaal als over grotere groepen van cellen kan plaatsvinden
=> via diffusie, direct contact en gap junctions
Een belangrijke vereiste voor inductie is competentie van de responderende cel. Indien de
responderende cel geen receptor heeft op zijn membraan is deze cel niet competent
7. het specifieke antwoord op inducerende signalen hangt af van de "status" van de
responderende cel
Responderende cellen zijn vaak beperkt in het aantal mogelijke antwoorden op het signaal =>
inducerend signaal selecteert een bepaald antwoord (= selectief vs instructief sensu strictu)
8. Patronen en positionele informatie - morfogenen
In embryo's gaan cellen zich vaak ontwikkelen volgens hun positie langs de embryonale as,
waarbij de cellen in dit model reageren op een gesecreteerde factor - een morfogen - die
diffundeert vanaf de plaats waar hij wordt aangemaakt (= bron) naar een plaats waar hij wordt
afgebroken (= afvoer)
Franse vlag model: Model waarbij we werken met drempelwaarden en er bij het overschreiden
van een drempelwaarden een cellulaire reactie zal volgen van de cel
Andere weefsels kunnen dezelfde morfogen-gradiënt gebruiken, maar anders reageren.
Cellen reageren afhankelijk van hun positie in de gradiënt, maar wel op een manier die typisch
is voor het weefsel waarvan ze afkomstig zijn.
Zie extra vb pg 2.6-7 !!
9. laterale inhibitie kan ruimtelijke patronen genereren
Patronen kunnen ook worden gegenereerd door de expressie en/of secretie van een
inhiberende substantie => vb.  de cellen die een veer zullen vormen verhinderen cellen in hun
onmiddelijke omgeving om dit ook te doen
10. Localisatie van cytoplasmatische determinanten en asymmetrische celdeling
Assymetrische verdeling van cytoplasmatische componenten speelt een grotere rol bij
organismen die een zogenaamde mozaïsche ontwikkeling vertonen
H3: Genen en ontwikkeling
Deel I: Historiek
Cytoplasmatisch model van overerving: Model dat de preformatietheorie verwerpt, maar
gelooft dat het cytoplasma en niet de genen instaan voor overerfbare patronen
Genetische theorie werd verworpen aangezien er geen antwoord bestond op drie
fundamentele vragen
 1. Hoe identieke chromosomen in elke cel van het organisme de wisselende types van
cytoplasma bepaalde en veranderende in de cel
2. Aangezien op dat moment enkel genen van finale eigenschappen gekend waren, moest
er aangetoond worden hoe genen ook de vroegere stappen van de embryogenese
controleerden
3. Het fenomeen van geslachtsbepaling bij bepaalde invertebraten en vertebraten kunnen
verklaren waarbij de omgeving het seksueel fenotype bepaalt
Het vele onderzoek gericht op het beantwoorden van bovenstaande vragen leidde tot het
ontstaan van een nieuwe discipline, namelijk ontwikkelingsgenetica. Helaas kon veel
onderzoek pas effectief bevestigd worden in de laatste paar jaar omwille van de technische
evolutie die adequate experimenten toelaat
Een van de grootste uitdagingen bestond in het bewijzen dat het genoom in elke cel hetzelfde
was
Een eerste experiment kwam met het verwijderen en de regeneratie van salamenderoog
=> de regeneratie van Wolff
De vorming van de lens in het salamanderoog door gedifferentieerde cellen van de
iris word metaplasia/ transdifferentiatie genoemd
Metaplasia/ transdifferentiatie: Transformatie van een gedifferentieerd
celtype naar een ander
De vorming van de lens volgt een verschillend ontwikkelingspatroon in de embryo
als in volwassen salamanders
Klonering van amfibia: restrictie van de nucleaire potentie => werkten met embryo's van
Rana pipiens
Het idee achter het experiment is dat als een gedifferentieerde cel geen
irreversibele functionele restrictie ondergaat, dan zou elke somatische kern, zoals
elke zygote kern, in staat moeten zijn e volledige ontwikkeling te regelen van een
organisme wanneer ze worden getransplanteerd in een geactiveerde eicel waar de
nucleus is verwijderd
Het perfectioneren van drie technieken was van belang voor het bewijs: (1)
methode voor enucleatie van gasteicellen zonder beschadiging, (2) methode om
intake donor nuclei af te zonderen, (3) methode om nuclei te transfereren in de
geactiveerde eicel zonder de nucleus of de oöcyte te beschadigen
Doormiddel van prikkeling met glasnaalden kan de eicel worden geactiveerd en de
nucleus uit de eicel kan worden geëxtraheerd, de afgezonderde nuclei kunnen
worden overgebracht worden door microinjectie
 Uit de experimenten kon worden afgeleid dat uit nuclei van vroegere stadia, vb. uit
de blastomeren, een volledige kikkerlarve kon worden verkregen, maar nuclei uit
somatische gedifferentieerde cellen hun vermogen om de volledige ontwikkeling te
sturen compleet zijn verloren tijdens deze differentiatie
Klonering van amfibia: de pluripotentie van somatische cellen => werken met Xenopus
laevis
Xenopus embryonale cellen behouden potentie langer hoewel verlies van potentie
wel optreed
Bij het overbrengen van 1-nucleolated stam (=intestinale mesoderm van voedende
dikkoppen) naar 2-nucleolated stam (= geïrradieerde, geactiveerde eicellen) werd
met een kans van 1.4% een volledige ontwikkeling doorgemaakt naar het dikkop
stadium of zelf naar volwassen kikker van het 1-nu genotype, wat op een
uitzondering op de regel bleek
Seriële transplantatie: Eerst worden de intestinale nuclei geplaatst in geactiveerde
eicellen, en na blastula vorming worden de nuclei van de blastomeren weer
getransfereerd in nieuwe geactiveerde eicellen => het gebruik van deze methode
verhoogd de ontwikkeling tot 7%
Het experiment werd meerdere malen uitgevoerd als tegemoetkoming van de vele
kritiek
Door de transfer van DNA uit een somatisch wordt de nucleus gedwongen om
terug te keren naar fysiologische omstandigheden waaraan het niet gewend is,
zoals de hoge klievingssnelheid. Aangezien DNA niet even snel kan delen, zullen er
vele chromosomale breuken ontstaan => verhoogde mutatie in dikkoppen
Behandelen van het DNA met spermine en het laten afkoelen van de eicel na
transfer zijn methoden om efficiëntie te verhogen tot 62% => vb. van hoe
experimentele voorwaarden en omstandigheden grote invloed kunnen hebben op
de uitkomst
Klonering van zoogdieren
Kloneren van schaap uit de somatische celkernen van een volwassen schaap =>
borstkliercellen van een ooi in cultuur brengen met specifiek medium (= dwong
cellen in G0 - fase te blijven) , oöcyten van een ander schapenras gebruiken als
acceptor en nuclei verwijderen. Doormiddel van elektrische impulsen werd fusie
tussen de celmembranen verkregen en werd de oöcyt geactiveerd. Hierna werden
de bevruchte eicellen binnengebracht bij een draagmoeder
Dit experiment werd bevestigd in koeien en muizen
Propageren van transgene dieren voor de productie van recombinante eiwitten in
melk van geit, koe of schaap
 Maken van transgene dieren geen efficiënt proces ( +/- 0.05-0.01%
slaagpercentage)
Differentiële gen-expressie
Voorgaande experimenten waren nog geen bewijs of uitleg over hoe het genoom in een
gedifferentieerde cel werd gereguleerd
Drie postulaten van de differentiële gen expressie werden toen naar voren geschoven
1. Elke kern van een cel bevat het volledig genoom zoals het werd samengesteld in
de bevruchte eicel, met uitzondering op de regel van gen constantheid zijn de
lymfocyten en de immunoglobuline genen
2. Ongebruikte genen in gedifferentieerde cellen worde niet vernietigd of gemuteerd
en behouden hun potentieel om geëxpresseerd te worden
3. In elke cel wordt slechts een beperkt percentage van het genoom geëxpresseerd
en het deel van RNA dat wordt aangemakt is specifieker voor dat celtype
Bewijs voor postulaat drie werd gevonden in polytene chromosomen (= chromosomen
die 29 tot 210 parallelle DNA dubbele helixen bevatten). Deze chromosomen worden
10.000 maal breder dan normale chromosomen en aangezien er geen mitose plaatsvind
zet de cel uit tot 150 oorspronkelijk volume. Deze cellen sterven af gedurende
metamorfose en worden vervangen door diploïde cellen die clusteren in bepaalde
regio's van de larve. Onderzoek toonden aan dat het bandenpatroon van de polytene
chromosomen identiek zijn over de hele larve, en er geen verlies of toevoeging is in de
chromosomale gebieden in verschillende celtypes. Een gestreept bandenpatroon met
afwisselende gekleurde banden is te wijten aan een vouwingspatroon van de
chromatiden waardoor er DNA-rijk (= chromomeer) en DNA-arme regio's ontstaan. De
verdikking op bepaalde plaatsen van het chromomeer (=puffs) verschillen naargelang
het weefseltype en het ontwikkelingsstadium (vb. Balbiani ringen in muggen). Deze
verdikkingen zijn plaatsen van hoge transcriptionele activiteit. Het Puff patroon
verandert dus ook naargelang behandeling of celtype
Deel II: Functional genomics in modelorganismen
Om de functie van een gen in de embryonale ontwikkeling te bepalen worden er doorgaans 3
strategieën toegepast
1. RNA localisatietechnieken => voornaamste techniek door gebrek aan geschikte
antilichamen, vinden van RNA geen garantie dat er ook effectief een eiwit zal worden
aangemaakt
Algemene technieken die worden gebruikt: Northern blotting, micro arrays, RT-
PCR, RNA sequencing
Doorgaans wordt hiervoor heel embryo gelyseerd of worden verschillende
organen uitgedissecteerd
 In situ hybridisatie: Embryo's worden eerst gefixeerd waarna secties worden
gemaakt de dan worden gehybridiseerd met een gemerkte antisense probe gericht
tegen een specifiek gen
Whole-mount in situ hybridisatie: Hierbij wordt het volledige embryo gekleurd voor
specifieke mRNA's. In plaats van radioactiviteit worden er kleurstoffen gebruikt,
wat toelaat om volledige embryo's te bekijken zonder secties te moeten maken
2. Gain-of-function experimenten
Gebruik maken van transgene dieren of transiënte technieken (vb. injectie
synthetisch mRNA)
3. Loss-of-function experimenten
Gene targetting ("knockout") experimenten, "knock-down" experimenten (=
antisense RNA/RNA interference/morpholinos), TALENs en CRISPR/Cas9
gemedieerde gendisruptie
Door de kracht van deze technieken is het mogelijk om in eender welk organisme
KO's te maken
NHEJ en DHR zal gebroken chromosomen herstellen met fouteninbouw zodat er
deleties of puntmutaties zullen ingebouwd worden in het DNA
H4: De cellulaire basis van de morfogenese
Morfogenese: multicellulaire schikking tot weefsels en organen => ontwikkeling houd zowel
morfogenese als differentiatie van de cellen in
De discussie rond morfogenese kan worden samengevat in vijf verschillende vragen ( zie pg 4.1)
Twee grote groepen van cellen in de embryo: epitheliale cellen (= onderling hecht verbonden in
lagen of tubes) en mesenchymale cellen (= staan los van elkaar en opereren als onafhankelijke
eenheden)
Morfogenese gebruikt maar een beperkt repertoire van processen in deze twee klassen van cellen:
(1) richting en aantal celdelingen; (2) verandering in celvorm; (3) celbeweging; (4) celgroei; (5)
celdood; (6) verandering in samenstelling van celmembraan en extracellulaire matrix (=ECM)
Intercellulaire communicatie tijdens morfogenese gebeurt op 2 verschillende manieren: oplosbare
factoren (= hormonen, groeifactoren en morfogenen) en door contact tussen de oppervlaktes van
twee naastliggende cellen
Organogenese: Het proces waar individuele cellen en groepen van cellen veranderen van relatieve
posities en gaan associëren met andere types van cellen voor het ontstaan van groepen weefsels
en organen
Soorten bewegingen van de cel: invaginatie, involutie, ingressie, delaminatie en epibolie ( zie pg
2.2)
Differentiële celaffiniteit
Belangrijkste factor die het gedrag van cellen stuurt tijdens migratie of bij herschikking in
weefsels en organen is celaffiniteit => zowel aan elkaar als ECM
 Reconstructie: Na dissociatie tot individule cellen opnieuw op een species-specifieke wijze
associëren tot volwaardige individuen => vb. sponzen
Experimenten op de kiemlagen van amfibia => 1) reaggrerende cellen van elk type zijn
spatiaal gesegreerd; 2) finale posities van de gereaggregeerde cellen kunnen hun
embryonale posities reflecteren; 3) selectieve affiniteit schijnt belangrijk om positionele
informatie mee te delen aan embryonale cellen => kiembladcellen migreren naar hunn
respectievelijke laag; 4) selectieve affiniteit verandert gedurende ontwikkeling
Bevindingen uit experiment op zee-egels (Fink et al): Elke cel heeft ook een hoge affiniteit
voor het ECM die het embryo bedekt en een lage affiniteit voor de eiwitten van de basale
lamina die de embryonale holte (blastocoel) omgeeft. Maar tijdens de aanzet van de
gastrulatie verliest een specifieke groep van cellen aan het vegetatieve uiteinde van de
blastula de affiniteit voor de naburige cellen en de externe ECM, terwijl zij terzelfdertijd
affiniteit verwerven voor de eiwit fibrillen die de blastocoel aflijnen. Deze veradering in
affiniteit zorgen ervoor da de cellen migreren binnen de blastocoel, waar zij het larvale skelet
vormen. Op dat moment veranderen hun adhesieve eigenschappen opnieuw.
Thermodynamisch model van celinteracties (= differentiële adhesie hypothese)
Cellen sorteren niet willekeurig maar bewegen actief om een weefselorganisatie
Cellen volgen de adhesie hiërarchie => meer adhesieve cellen migreren inwaarts, minder
adhesieve cellen migreren buitenwaarts; enkel bij gelijke adhesie zal er willekeurige spreiding
optreden
Als het verschil in adhesieve kracht te groot is tussen twee verschillende soorten cellen,
zal er scheiding van de cellen ontstaan
Het meest thermodynamisch stabiel patroon is deze tussen de cellen die aggregeren
met de kleinste vrije energie tussen de celoppervlakken
Individuele celtypes vertonen verschillen in celadhesie-gegenereerde
oppervlaktespanningen
De enige vereiste om sortering te verkrijgen is dat cellen een voldoende verschillend affiniteit
vertonen => netto-resultaat van interacties tussen verschillende types van adhesie moleculen
Cadherines en celadhesie
het plasmamembraan bevat verschillende eiwitten die met omgeving interageren en
verschillen van elkaar in functie ( zie pg 4.6 voor extra): 1) celadhesie moleculen; 2) celjunctie
moleculen => communicatie/ gap junctions,  transversale communicatiebarrières/ tight
junctions, verankerde junctie; 3) substraatadhesie moleculen; 4) verschillende receptoren
met ligand-bindende functie aan de binnenkant en signaliserende functie aan de buitenkant
Cadherines (Ca+ - afh.) zijn de belangrijkste van de verschillende klassen van
celadhesiemoleculen die voornamelijk interageren met andere gelijkaardige cadherines op
naburige cellen (= homofiele interactie)
 Uit de experimenten met fibroblastcellen die getransfecteerd werden met N-cadherine cDNA
kan er worden aangetoond dat kwantitatieve verschillen in cadherine expressie aanleiding kan
geven tot uitsortingsfenomen
In vivo kunnen concentratie-afhankelijke morfogenetische processen worden
gedocumenteerd => experiment in gastrulerende zebravis embryo's met mutaties voor E-
cadherine pg. 4.7
Ook kwalitatieve verschillen kunnen aanleiding geven tot uitsortering of separatie =>
verschillende soorten cadherines hebben verschillende effecten in bv. fibroblasten
De vorming van scheidingsvlakken zijn cruciaal voor belangrijke morfogenetische
bewegingen in het embryo => vb. tijdens neurulatie zal het deel dat de neurale plaat zal
vormen een switch van E- naar N-cadherine expressie ondergaan => Bij een zebravis
met een  N-cadherine mutatie zal de neurale buis zich niet kunnen losmaken van
het omgeven ectoderm omdat er een duidelijk scheidingsvlak ontbreekt tussen de
twee
Bij Xenopus zullen heterofiele E- en N-cadherines instaan voor de
scheidingsvlakken tussen het axiale en het paraxiale mesoderm
De extracellulaire matrix als bron voor ontwikkelingssignalen
Het ECM bestaat uit macromoleculen die door de celen worden gesecreteerd aan de
omgeving, waarbij deze macromoleculen de interstitiële ruimte tussen vullen
Macromoleculen zoals glycoproteïnes vormen een 3D-netwerk van cellen en matrix
ECM kan specifieke gen-expressie induceren in ontwikkelende weefsels en celoverleving
promoten (= door aanmaak apoptotische signalen)
ECM bestaat voornamelijk uit fibronectine, lamine + type IV collageen (= voornaamste
componenten basale lamina), proteoglycanen en integrines => zie extra pg 4.9
Epitheliale-mesenchymale transitie (=EMT)
EMT: strict gecontroleerd cellulair proces waarbij cellen hun epitheliale karakteristieke
verliezen en een mesenchymaal karakter verwerven
Cellen verliezen apico-basale polariteit, intercellulaire contacten (= junctions) en
worden migrerende cellen die de omgevende weefsels kunnen invaderen; Gaat ook
gepaard met verandering in expressie van cytoskeletaire componenten en secretie van
EMC eiwitten
EMT is cruciaal betrokken bij vele ontwikkelingsprocessen
Ook in adult organismen speelt EMT een belangrijke rol  bij bv. wondheling , maar speelt
ook als een ontspoord cellulair gedrag betrokken bij de conversie van goedaardige naar
kwaadaardige epitheliale tumoren => metastase is een gelijkaardig proces aan de EMT-
ontwikkelingsprocessen en maken ook gebruik van dezelfde componenten
H5: Cel-cel communicatie tijdens ontwikkeling
Inductie/ proximale interactie: op een gecoördineerde wijze zullen cellen of weefsels van gedrag
gaan veranderen onder impuls van een andere groep cellen of weefsels
Inductie bestaat uit 2 componenten: inducer(= weefsel dat signaal produceert) en
responder(= weefsel dat wordt geïnduceerd ); weefsel is niet altijd in staat om te reageren
op signaal = niet-competent
Competentie is geen passieve status, maar een actief proces
Pax6 pathway in muizen en Xenopus : Pax6 is nodig in ectoderm, maar heeft effect op
de vorming van een lens uit de optische vesikel
Er is geen unieke inducer van de lens, maar een cascade van signalen: 1) het
eerste signaal komt uit het farynx endoderm en het hartvormende mesoderm die
ondeer het lensvormend ectoderm liggen, in mid- en laat gastrula stadium; 2) het
volgend signaal wordt gegenereerd door de anterieure neurale plaat => Pax6 en
Otx2; 3) het laatste signaal is afkomstig van de eigelijke inducer, de optische
vesikel
Optische vesikel secreteert 2 inducerende signalen: 1) BMP4 -> induceert TF Sox2
en Sox3; 2) FGF8 -> induceert TF L-MAF
Pax6, Sox2, Sox3 en L-MAF => lensvorming
Inductieve cascades => veel inductieve interacties zijn van reciproke aard;
weefsels die worden geïnduceerd kunnen zelf andere weefsels weer induceren,
waaronder het initiële inducerende weefsel
Epitheliaal - mesenchymale interacties
Epithelia: aaneengesloten cellen georganiseerd in bladeren of buizen. Ze kunnen afkomstig
zijn van alle kiembladeren van het embryo. De cellen in een epitheel vertonen sterke
intercellulaire interacties
Mesenchymale cellen zijn losser georganiseerd, vaak zonder cel-cel contact. Ze zijn meestal
afkomstig van het mesoderm of de neurale kam
Regionale specificiteit van inductie: vb. huid-epitheel -> induceert de condensatie
van dermale cellen. De dermale cellen op hun beurt induceren in het ectoderm lokaal
gedefineerde hoornstructuren. De aard van deze structuren wordt bepaald door de
identiteit van het onderliggende dermale mesenchym
Genetische specificiteit  van inductie: mesenchymale instructies kunnen de barrière
tussen species kruisen. Het antwoord van de responderende weefsels kan echter wel
genetisch vastliggen (= species-specifiek). Dit kan worden aangetoond uit het vb. van
reciproke transplantaties tussen orale ectodermale regio's van salamanders en kikkers
=> het veranderen van een bepaalde inducer kunnen grote evolutionaire veranderingen
plaatsgrijpen
Paracriene factoren
Tussen epitheliale en mesenchymale cellen kunnen er filters bevinden die inducties kunnen
tegenhouden
Twee soorten inductieve signalen: 1) oplosbare factoren (= paracriene interacties); 2) fysieke
interactie tussen twee interagerende cellen (= juxtacriene interacties)
Diffundeerbare factoren die paracriene interacties bewerkstelligen  zijn paracriene
factoren/ groei- en differentiatie factoren
Embryo beschikt over beperkte "toolkit" => gebruikt vaak dezelfde factoren voor de
aanmaak van totaal verschillende organen
Paracriene factoren kunnen in 4 groepen worden geklasseerd
1. Fibroblast Growth Factor (=FGF) familie
Grote familie van paracriene factoren => 12-tal genen gekend in vertebraten, maar
er bestaan wel 100den isovormen (= splice varianten met alternatieve initiatie van
transcriptie)
Processen waarbij FGF's betrokken zijn: angiogenese (FGF2), inductie van het
mesoderm, vorming van de ledenmaten en axon-extensie (FGF8)
FGF's zijn vaak functioneel redundant (FGF's kunnen elkaar vervangen) met een
gerestricteerd expressie patroon
Signaaltransductie gebeurt meestal via RTK pathway of de JAK-STAT pathway
door sommige FGF's
2. Hedgehog familie
Oorspronkelijk geïdentificeerd in Drosophila, zijn er in vertebraten 3 leden gekend:
1) Sonic hedgehog (shh), meest verspreide; 2) Desert hedgehog (dhh),
gesecreteerd door Sertoli cellen van de testes, betrokken in spermatogenese; 3)
Indian hedgehog (ihh), geëxpresseerd  in darm en kraakbeen en betrokken bij
postnatale beengroei
Hedgehog is vaak betrokken bij de inductie van welbepaldde celtypes en het
scheppen van grenzen tussen weefsels
Shh heeft  in vertebraten de meeste biologische functies. Het N-terminale deel van
de ligand wordt slecht 2/3 gesecreteerd. De voornaamste bron van ssh is het
notochord => staat in voor de vorming van de neurale buis => zorgt uiteindelijk
voor de vorming van de dorsale gevoelszenuwen en de ventrale motorzenuwen;
Shh van het notochord is ook betrokken bij de vorming van de somieten => meest
ventrale deel van de somiet dat naast notochord ligt zal het kraakbeen van de
wervels vormen
Shh is verder betrokken bij de vorming van de L-R assymetrie bij de kip, de
vorming van de A-P as in de ledenmaten, inductie van vedervorming en de
specifieke differentiatie van verteringsbuis
Shh speelt ook een rol samen met  Wnt en FGF bij tandvorming
 Hedgehog bind aan de Patched receptor
3. Wnt familie
Cysteïne-rijke glycoproteïnen-familie met minstens 15 gekende leden in
vertebraten
naam is een samentrekking van wingless gen in Drosophila (= betrokken bij
polariteit van de segmenten) en het vertebrate homoloog Integrated gen (= tumor-
inducerend retrovirale integratie in de muis)
Processen waarbij Wnt's betrokken zijn: omvorming van het dorsaal deel van de
somieten in spieren, vastleggen van de polariteit van de ledematen bij insecten en
vertebraten, spelen van een centrale rol bij de ontwikkeling van het urogenitaal
stelsel
Wnt's binden op Frizzled receptoren
4. TGF-ß superfamilie
Grote familie van meer dan 30 leden in vertebraten
Eiwitten worden actief geprocessed dat het C-terminale deel van het mature eiwit
vormt
De peptiden vormen homodimeren ( met zichzelf) of heterodimeren ( met andere
TGF-ß peptiden)
De superfamilie valt uiteen in verschillende kleinere families: TGF-ß familie ,
activine familie, BMP familie, Vg1 familie en GDNF
belangrijkste biologische functies:
TGF-ß 1, 2, 3 en 5 reguleren de vorming van het ECM en zijn betrokken bij
celdeling. TGF-ß1 verhoogt de hoeveelheid ECM die wordt geproduceerd
door de epitheliale cellen doormiddel van inductie van collageen en
fibronectine synthese, en door de inhibitie van matrix degradatie
TGF-ß's zijn verder belangrijk bij het vertakken van epitheliale kanalen
Er treed vaan functionele redundantie en compensatie op tussen leden van
de familie
BMP familie (= bone morphogenic protein): oorspronkelijk factoren die
beenvorming konden induceren, BMP's hebben 7 geconserveerde cysteines
(vs. 9 in TGF-ß's)
BMP's zijn betrokken bij de regulatie van celdeling, apoptose, migratie en
differentiatie
De Nodal factor is betrokken bij de vorming van de L-R as en BMP7 speelt
een belangrijke rol bij de polariteit van de neurale buis, de oogvorming en
celdood
Dpp is de ortholoog van BMP4 in Drosophila 
 5. Andere paracriene factoren: EGF, HGF, SCF en neurotrofines zijn
ontwikkelingsfactoren; cytokines en interleukines staan in voor de ontwikkeling van
bloed
Celoppervlakte receptoren en hun voornaamste signaaltransductiewegen
Receptor tyrosine kinase (=RTK) singaaltransductieweg => voornamelijk gebruikt door
FGF's
Smad signaaltransductieweg
Samentrekking van de naam Sma (van C.elegans) en Mad (= Mothers against
decapentaplegic van Drosophila)
Wordt voornamelijk gebruikt door TGF-B superfamilie
TGF-B zal Smad2 en -3 fosforyleren, BMP zal Smad1 en -5 fosforyleren
JAK-STAT signaaltransductieweg
Transcriptiefactoren zijn STAT (= singal transducer and activator of transcription)
eiwitten, kinasen in deze pathway zijn van de JAK (= janus kinase) familie van
cytoplasmatische tyrosine kinasen
Belangrijke pathway voor de differentiatie van bloedcellen en activatie caseïne gen
gedurende melkproductie
Speelt ook belangrijke rol in regulatie van feutale beengroei
Mutaties in premature activatie van STAT pathway kan leiden tot ernstige
vormen van dwerggroei
FGF receptor 3 => chondrocyten in de groeiplaten van de lange
beenderen, dwingen deze chondrocyten tot het stoppen met
prolifereren en zorgt voor differentiatie
FGFR3 mutatie => G-O-F  fenotype met constitutief geactiveerde
receptor => thanathorpic dysplasia
Andere mutaties resulteren in mildere vormen van dwergroei
Wnt signaaltransductieweg
Activatie in deze pathway is geassocieerd met bepaalde kankers
Hedgehog signaaltransductieweg
Speelt belangrijke rol in de differentiatie van de ledematen en de neurale buis
Mutaties in Shh leiden tot abnormale ledematen en cyclopsie in muizen
Ci orthologen in de mens zijn de Gli eiwitten
Grote truncaties in het GLI3-gen leiden tot een niet functioneel eiwit => Greig
cephalopolysyndactily (= hoog voorhoofd, fusie van vingers en tenen)
Kleine truncaties in het GLI3-gen leiden tot een constitutieve transcriptionele
repressor ( verwijdert activator domein, maar behoud DNA-bindende domein)
=> Pallister-Hall syndroom, een lethaal syndroom dat zowel vingers als
hypofyse, hypothalamus, anus en nieren affecteerd
 Mutaties die de hedgehog pathway ectopisch activeren zijn geassocieerd met
kanker
Somatische mutaties in Patched leiden kunnen leiden tot de ontwikkeling van
basale celcarcinoma's
Overerfbare Patched mutaties induceren het basale vel nervus syndroom =>
zeldzaam autosomaal dominante mutatie gekenmerkt voor de ontwikkeling van
gefusioneerd vingers en ribben, afwijkingen in het aangezicht en vele
kwaadaardige tumoren zoals basale celcarcinoma's
Bij vertebraten is de pathway anders in de centrale betrokkenheid van cilia =>
monocilium (buitenkant) en microtubuline (binnenkant) zijn belangrijk voor de
lokalisatie en de functie van de Smoothened receptor en de Gli eiwitten
Mutaties die leiden tot dysfunctionele cilia leiden tot syndromale
afwijkingen (=ciliopathieën) kunnen afwijkingen un het aantal vingers
veroorzaken alsook mogelijke randomisatie van L-R asymmetrie
Cholesterol speelt een rol in het klieven van het Shh eiwit aan het functionele N-
terminale einde
Cholesterol bind ook aan N-terminle einde en bevondert diffusie van de
paracriene factor in weefsel
Patched heeft cholesterol nodig voor zijn werking
Sommige humane cyclopia syndromen zijn geassocieerd met HH-genen of
cholesterol synthese genen
Sommige teratogene stoffen veroorzaken cyclopia door interferentie in
cholesterol synthese => Jervine en  cyclopamine uit V. californicum
veroorzaken cyclopia in foetussen van grazende schapen
Celdood singaaltransductie
Vb cursus => er sterven exact 131 cellen af tijdens de ontwikkeling van C. elegans
Apoptose is een belangrijk proces voor het "sculpturen" van organen
Juxtacriene factoren en signaaltransductiewegen => 3 types
Bij dit soort interacties gaan de eiwitten van de inducerende cel interageren met
receptoren op de naburige responderende cellen zonder te diffunderen van de
producerende cel
1. Een eiwit op een celmembraan bindt met de receptor op de membraan van een
naburige cel
2. Een receptor op een cel bindt met een ligand dat aanwezig is op de extracellulaire
matrix die wordt gescreteerd door een naburige cel
3. Een cycloplasmatisch signaal wordt direct doorgegeven via kleine kanaaltjes
tussen de cellen
Notch signalisatie is belangrijk voor laterale inhibitie bij neurogenese => zie pathway
H6: Vroege ontwikkeling van de zygote nematode C. elegans
Deel I: Klievingen en vormingen van de assen in het ei
Rotationele klieving
klievingen van de zygote zijn holoblastisch en rotationeel, waarbij de eerste klievingen
de founder cellen genereren ( Ab, MS,E,C en D) die gedifferentieerde afgeleiden
produceren en 1 stamcel (P1-4 lijn) => 558 cellen in totaal
1ste klieving genereert anterieure founder cel AB  en posteriere stamcel P1, 2de klieving
deelt AB cel equatoriaal => Aba en ABp cel; P1 cel deelt transversaal in P2 en EMS
Vorming van de A-P as
Geëlongeerde as van het C. elengans ei definieert de toekomstige A-P as => plaats
intrede van de spermatozoïde bepaalt welk uiteinde de anterieure pool vormt
Centriool dat geassocieerd is met pronucleus van spermatozoïde zal via
cytoplasmatische bewegingen de pronucleus duwen naar het meest nabije einde
van het ei => posterieure pool
Spermatozoïde centriool organiseert via microtubuli de maternale componenten
langs de A/P pool
PAR-2 + PAR-1 lokaliseren samen bij de cortex dicht bij het intredepunt van de
spermatozoïde (=posterieur) -> PAR-1 zal lokaal PAR-3 fosoforyleren  -> PAR-3
wordt uit de cortex verdreven en via cytoplasmatische flow (= gevolg van actine
gemedieerde contracties) wordt het naar de anterieure helft geduwd -> PAR-3 en
PAR-6 lokaliseren aan de anterieure helft
Na eerste klieving wordt eicel in 2 cellen verdeeld met in elke cel 2 PAR's
PAR eiwitten werken samen om mitotische spindles te aligneren en te helpen om
de maternale componenten differentieel te lokaliseren
P-Granules: ribonucleoproteïne complexe die kiemcellen specifiëren, worden
gelokaliseerd door PAR eiwitten, bewegen kort na bevruchting naar P pool en
belanden in P-lijn (P1-4), waaruit later de geslachtscellen ontstaan
Vorming van D-V as
Door gebrek aan plaats in de eischaal voor equatoriale klieving van Ab cel zullen de
cellen verschuiven waardoor 1 cel meer anterieur komt te liggen dan de andere => ABp
cel komt bovenop EMS cel te liggen en definieert toekomstige dorsale zijde van embryo.
EMS cel, precursor van spieren en darmcellen, markeer op hierdoor de ventrale zijde
van de embryo
Deel II: Controle van de blastomeer-identiteit
C. Elegans vertoont zowel conditionele als autonome cel-specificatie => experimenteel
bepaald door scheiding eerste 2 blastomeren
P1 cel: Zonder AB cel zal deze cel celautonoom ontwikkelen tot een volledige
posterieure helft
 AB cel: Specificaties AB cel zijn conditioneel en zal dus zonder P1 cel en zal in isolatie
een fractie van de celtypes maken => nood aan inductieve interacties met naburige
cellen
Autonome specificaties => determinatie wordt bepaald door interne cytoplasmatische
factoren
SKN-1, PAL-1 en PIE eiwitten zijn TF die de bestemming (fate) van de 4 somatische
"founder" cellen bepalen afkomstig van P1 cel (MS,E,C en D)
SKN-1 eiwit (= skin  excess mutant): Bepaald de bestemming van de EMS blastomeer.
Na 1ste klieving bezit enkel de posterieur gelokaliseerde P1 blastomeer de mogelijkheid
om in isolatie celautonoom faryngeale spiercellen te produceren. Na de klieving van de
P1 cel bezit enkel de EMS blastomeer deze capaciteit. Wanneer deze op zijn beurt de
EMS cel deelt kan enkel de MS cel de faryngeale cellen vormen. Cytoplasmatische
componenten die asymmetrisch worden overgeërfd bepalen de faryngeale bestemming.
Embryo's van homozygoot skn-1 deficiënte moeders maken geen faryngeale en darm
celtypes en lichaamswand weefsel op plaatsen waar normaal farynx en darm zou
moeten gevormd worden =>  EMS cellen zijn gedifferentieerd als C cellen
PAL-1: vereiste voor de differentiatie van de P1 cellijn => activiteit is nodig voor normale
ontwikkeling van de somatische afgeleiden van de P2 blastomeer. Embryo's zonder PAL-
1 mankeren de somatische celtypes die afgeleid zijn van C en D stamcellen. PAL-1 staat
onder negatieve controle van SKN-1
PIE-1: Noodzakelijk voor de bestemming van de kiemcel. Werd gelokaliseerd in de P
blastomeren via activiteit van het PAR-1 eiwit. Kan PAL-1 en SKN-1 eiwitten inhiberen in
de P2 en verder afgeleide kiemcellen. Mutaties in het maternale pie-1 gen resulteren in
het converteren van de kiemcellen naar een somatisch celtype => PIE-1 verhindert
somatische celbestemming en is belangrijk voor het behoud van de totipotentie in
kiemcellijn
Conditionele specificatie
Treed op bij de ontwikkeling van de endodermale cellijn
Tijdens 4-cel stadium ontvangt EMS cel een signaal van P2 blastomeer => splitsing in
MS en E cel ( zie pg 6.4)
Zonder P2 zal EMS cel splitsen in 2 MS cellen en zal er geen endoderm worden
gemaakt ( bij hercombineren van P2 zal weer endoderm worden aangemaakt)
P2 cel ook verantwoordelijk voor signaal dat ABp en ABa cellen van elkaar
differentiëren, contact tussen beide cellen is hiervoor vereist
Inductieve interactie wordt gemedieerd door GLP-1 (= Notch receptor) op de ABp
cel en APX-1 eiwit (=delta ligand) op de P2) => juxtacriene signalisatie
Deel III: Gastrulatie => begint in 24 cel stadium
 Ep en Ea migreren van de ventrale zijde naar het centrum van de embryo en vormen daar de
darm bestaand uit 20 cellen => ontstaan kleine blastoporus
Doorheen de blastoporus migreert vervolgens P4 cel (= precursor kiemcellen) naar een
positie onder het darm primordium
Migratie mesodermale cellen: nakomelingen MS cellen migreren naar binnen vanaf de A-zijde,
de van de C- en D-cel afkomstige spierprecursoren komen van de P-zijde => cellen flankeren
de darmtubus langs L- en R-zijde
AB-afgeleide cellen gaan naar binnen om de farynx te vormen.  De rest vormt de hypoblast
cellen en deze bewegen naar de ventrale zijde via epibolie en sluiten blastoporus ( met
behulp van E-cadherines)
Deling van de cellen en differentiëren tot organen duurt ong 6u, waarbij de balvormige
embryo zich uitstrekken tot een worm
Na 4 vervelingen is de worm seksueel matuur en bevat het 959 somatische cellen
H8: Vorming van het vertebrate lichaamsplan en lichaamsassen - Amfibia
Deel I: Bepaling van de lichaamsassen
Alle vertebraten hebben een gelijkaardige lichaamsbouwplan volgens A-P as => op deze as
onderscheiden we ook de D-V as en bilaterale symmetrie (= L-R as)
Vertebraten delen ook een gemeenschappelijk stadium => fylotypisch stadium:
duidelijke kop, neurale buis volgens dorsale middenlijn met daaronder de notochord,
mesodermale somieten
Voor en na dit gemeenschappelijk stadium zijn er telkens verschillen => Voor: vb. dooier
of extraëmbryonale structuren; Na: vb. poten-vinnen-vleugels-haren-veren-schubben
De animale-vegetale as in X. laevis is matenaal bepaald
Onbevruchte Xenopus ei heeft duidelijke animale-vegetale as met het dooiermateriaal
geconcentreerd in de vegetale helft => 1e klieving bepaald toekomstige middenlijn
waarlangs symmetrie optreedt, 3e verdeelt het embryo in een animale en vegetale helft
Maternale mRNA's asymmetrisch verdeeld volgens de A-V as => deze RNA's coderen
voor kandidaat eiwitten die een rol spelen in de vroegere polarisatie en inductie van het
mesoderm
Paracriene factor Vg1 mRNA in vegetale cortex v/d oöcyt
Transcript factor VegT mRNA
Wnt11 mRNA -> preferentieel in vegetale pool
A-V as komt overeen met toekomstige  A-P as waarbij de pool de kop van het embryo 
zal vormen => exacte positie van de A-P as wordt bepaald door de bevruchting , hierna
wordt de D-V as vastgelegd
Spemann  afsnoeringsexperimenten => bepalen van de inherente asymmetrie van het
embryo van amfibia: afsnoering doorheen grijze sikkel en volgens eerste klieving van
embryo zorgt voor het ontstaan van 2 identieke embryo's, afsnoering loodrecht op
eerste klieving zorgt voor het ontstaan van een normaal embryo + buikstuk
Grijze sikkel is essentieel voor initiatie gastrulatie = dorsale lip blastoporus
Verdere experimenten bij het overdragen van dorsale lip naar ander embryo zorgt
voor ontstaan siamese tweeling
Organisator : Is zowel in staat om ventraal weefsel te induceren tot de vorming
van de neurale buis en dorsaal mesoderm, als het induceren van een embryo in
gastheerweefsel met een duidelijke A-P as als een D-V as
Mechanismen van asvorming in amfibia
Bij het aanleggen van co-culturen van de animale en vegetale kap ontstaan
verschillende mesodermale structuren:
Ventraal mesoderm: mesenchym , bloed
Intermediair mesoderm: spier, nier
Dorsal mesoderm: somieten, notochord
Identiteit van het vegetale weefsel bepaald grotendeels de aard van het
geïnduceerde mesoderm
Nieuwkoop centrum: gelegen in in de dorsale-vegetale blastomeren, induceerd in
overliggend ectoderm de ontwikkeling van dorsaal mesoderm, kan ook UV-schade
in embryo's herstellen en een tweede lichaamsas induceren in het 32-64 cel
blastula stadium
Positie nieuwkoop centrum in vegetale regio wordt bepaald bij de bevruchting =>
intreden spermatozoïden zorgt voor corticale rotatie (= microtubuli gedreven) ,
hierdoor worden de dorsale determinanten gelokaliseerd in vegetale regio
tegenover het intredenpunt van de spermatozoïde
Bestraling van eitjes met UV veroorzaken vergelijkbare mutaties als Spemann's
"bauchstück"
Inductie van mesoderm-vorming in ectoderm wordt veroorzaakt door verschillende
inducers: TF brachyury (=Xbra), Vg1 en Nodal-related
Enkel dorsaal endoderm ( Nieuwkoop centrum) kan dorsaal mesoderm
induceren =>  ß-catenine speelt belangrijke rol
ß-catenine: anker voor cadherines, centraal component voor Wnt
signalisatieweg => negatieve regulatie door GSK3
ß-catenine staat ook centraal bij de vorming en functie van het Nieuwkoop
centrum =>
Na de bevruchting en klieving treedt accumulatie op van het ß-catenine
eiwit in het Nieuwkoop centrum
 Depletie van ß-catenine door antisense oligoʼs verhindert dorsalisatie
Ventrale injectie van ß-catenine induceert dorsalisatie (2e dorsale as)
Dominant negatief GSK3 induceert dorsalisatie
Accumulatie ß-catenine in de cellen van het Nieuwkoop centrum zijn het
gevolg van vesikels waarmee Dsh(= Dishevelled, Wnt-signalisatie) is
geassocieerd worden door de corticale rotatie getransporteerd van de
vegtale naar de toekomstige dorsale-vegetale regio
GSK3 zorgt ventraal voor afbraak van ß-catenine, Dsh dorsaal zorgt voor de
inactivatie van GSK3 => accumulatie van ß-catenine dat transloceert naar de
nucleus => zie figuur 8.9 !
ß-catenine bezit een transcriptioneel transactivatiedomein (in C-terminus) en
bindt met de N-terminus van transcriptiefactoren van de LEF/TCF familie die
een DNA bindende domein (maar geen transactievatiedomein) bezitten. Het
heterodimeer (ß-catenine + TCF) vormt eenfunctionele transcriptiefactor.
2 modellen die de activatie van het ß-catenine/Tcf complex bij de vorming
van de Spemann organisator verklaren
1. Hele equatoriale regio van het embryo (dorsaal + ventraal) signalen
ontvangt vanuit het endoderm, waarbij TF VegT de factoren Vg1 en
Nodal induceert
Activatie van ß-catenine/Tcf3 complex in dorsale equatoriale
regio -> inductie TF Siamois -> inductie Vg1 en Nodal ( in
mesoderm) -> inductie van expressie Goosecoid -> Spemann
organisator -> dorsaliserende signalen naar mesoderm ->
regionalisatie mesoderm
2. TF VegT + Vg1 ( expressie in volledige vegetale hemisfeer) + activatie ß-
catenine/Tcf3 complex -> gradiënt opgesteld van de expressie van
Nodal-related (1,2,4) factoren -> inductie overliggende equatoriale
regio mesoderm -> cellen die een lage, intermediaire en hoge
concentratievan Nodal-related ontvangen ontwikkelen tot ventraal,
lateraal en dorsaal mesoderm -> expressie Goosecoid in dorsaal
mesoderm
Deel II: De functies van de Spemann organisator
Nieuwkoop centrum: endodermaal gelokaliseerd, maken zelf geen deel uit van de dorsale as
van het embryo
Spemann organisator: dorsale lip van blastoporus, vormen onderdeel van de dorsale axiale
structuren
functionele kenmerken: 1) vermogen tot omvorming dorsaal mesoderm  (prechordale
plaat, notochord- mesoderm, etc.); 2) vermogen om het omliggend mesoderm te
dorsaliseren tot lateraal en intermediair mesoderm; 3) vermogen om het bovenliggende
ectoderm om te zetten tot neuraal ectoderm; 4) vermogen om migraties tijdens
gastrulatie te initiëren; 5) vermogen om neurale plaat om te zetten tot neurale buis
In Xenopus zal eerst de D-V as worden gevormd, daarna vorm het involuerend
mesoderm de A-P as => timing van het mesoderm doorheen de dorsale lip bepaald de
vorming van de A (eerst) en P (laatst) structuren
Gastrulatiebewegingen zijn een mix van epibolie, involutie en convergente extensie
Draag zelf bij tot de vorming van 4 celtypes ( zie fig. 8.12):
Faryngeaal endoderm : initieert de migratie van organisator weefsel en is
betrokken bij de inductie van de voor-/middenhersenen
Hoofd mesoderm (prechordale plaat) : idem
Dorsaal mesoderm (notochord) : betrokken bij de inductie van de achterhersenen
en de romp
Dorsale blastoporus lip : vormt dorsaal mesoderm en het scharnierpunt tussen de
notochord en de neurale plaat/buis groeit uit tot de staartpunt
Belangrijk doelwit van het Nieuwkoop centrum is de goosecoid TF
goosecoid mRNA valt samen met organisator domein
LiCl verhoogt organisator mesoderm in de marginale zone dit valt samen met
goosecoid mRNA inductie
UV behandeling verhindert goosecoid expressie
Goosecoid mRNA injectie in ventrale blastomeren (Figuur 8.13)
Initiatie migraties tijdens gastrulatie
Dorsale mesodermale bestemmingen
Recrutering van naburige cellen in de dorsale as
Goosecoid activeert direct of indirect de transcriptie van paracriene factoren
transfilterstudies: dorsale lip + competent gastrula ectoderm
Neurale structuren (1961, 1975, 1976, Toivonen)
Resulaten van e aard van de paracriene factroren
Ectoderm wordt geïnduceerd om epidermaal te worden (!) (1997)
Default-state van het ectoderm is om neuraal te worden de organisator
verhindert de werking van epidermale inducers
Secretie van bone morphogenic proteins in het ectoderm zorgt voor
epidermale vorming -> organisator secreteert BMP inhibitors (Noggin,
Chordin, Nodal-related 3, Follistatin)
Verschillende BMP inhibitoren
Chordin
 1994, cDNA bank substractie gedorsaliseerde en geventraliseerde
embryoʼs
mRNA in dorsale lip en notochord
Chordin bindt BMP4 en 2 ( zebravis )
Nodal-related 3 (Xnr-3)
Gesynthetiseerd door deoppervlakkige cellen van de organisator
Blokkeert BMP4
Noggin
1992, cDNA bank van LiCl gedorsaliseerde gastrulaʼs, expressie
clonering door injectievan mRNA en rescue van UV-ventralisatie
Noggin: dorsaliseert het embryo induceert dorsaal ectoderm tot
neurulatie
Noggin bindt BMP4 en BMP2 en verhindert hun binding op een receptor
(Figuur 8.14)
Follistatine
1992, 1994 Follistatine werd per toeval ontdekt als dominant negatief
activine (lid TGFß superfamilie) dat blijkbaar ook BMP kan inhiberen en
in de organizator tot expressie komt
Bij overexpressie follistatin : inductie van neurulatie over gans het
ectoderm !
Dit betekent dat binding van activine/BMP receptor neurulatie verhindert
“default model of neurulation”, neurulatie wordt actief geblokkeerd
Organisator produceert moleculen die de inhibitor van neurulatie
blokkeert
Dit komt overeen met vroegere observaties dat geïsoleerde “animale
kap” weefsel spontaan overgaat tot epidermaal weefsel terwijl
gedissocieerde animale kap cellen daarentegen neuraalweefsel vormen
(omdat de epidermaliserende factor (= BMP) wordt uitverdund)
Neurulatie wordt dus actief geïnhibeerd (<->70 jaar oude
werkhypothese)
Molecules die zorgen voor epidermale inductie en ventralisatie van mesoderm
BMP4 mRNA injectie > alle mesoderm wordt ventrolateraal mesoderm > geen
involutie t.h.v. dorsale lip
Dominant negatief BMP receptor > tweede dorsale as
BMP4 induceert ectoderm tot epidermaal weefsel
Noggin, Chordin, Nodal-related 3 (Xnr-3), Follistatin blokkeren BMP activiteit
BMP4 → ectodermale inductie van msx1 → epidermaal-specifieke genen
(inhibitie van deze genen induceert neurulatie)
 BMP4 → mesodermale inductie van Xvent1 → ventraal mesoderm
Laag [BMP4] → spier mesoderm (lateraal)
Intermediair [BMP4] → nier mesoderm (ventrolateraal)
Hoog [BMP4] → bloed en bindweefsel mesoderm (ventraal)
Gradiënt ontstaat door secretie van BMP4 inhibitoren vanuit organizator
Dus BMP4 is inducer van ventraal ectoderm (epidermis)
BMP4 ventraliseert mesoderm (bloed en bindweefsel)
Neurulatie ontstaat door inhibitie van BMP4
Default conversie van ectoderm naar neurale plaat
Tot nog toe factoren besproken die verhinderen dat ectoderm → epidermis
Welke factoren zijn vervolgens effectief verantwoordelijk voor transformatie
ectoderm → neuraal
In afwezigheid van BMP > TFs neurogenine verschijnen → o.a. TF NeuroD →
structurele neuro-specifieke genen
In aanwezigheid van BMP → Msx1 ┤neurogenine
Noggin of Cerberus induceert Xenopus brain factor 2 (XBF-2)
→ repressie van epidermale differentiatie
Balans van inducerende en represserende effecten
De functies van organisator : secretie Wnt inhibitoren
Vroeger werd gesteld dat inductie van voorhersenen t.h.v. neuraal ectoderm
gebeurde door het meest vooraangelegen deel van het dorsale mesoderm van de
organizator (de notochord). Maar onder meest vooraan gelegen deel van hoofd en
hersenen ligt niet de notochord, maar faryngeaal endoderm en prechordaal (hoofd)
mesoderm (endomesoderm)
Endomesoderm is leidende rand van de dorsale blastoporus lip
Endomesoderm induceert hoofdstructuren door inhibitie van de Wnt-reactieweg
én van BMP4
Dorsale zygotische (na de MBT) Wnt8 overexpressie inhibeert vorming meest
anterieure structuren
Wnt8 wordt geproduceerd door marginaal mesoderm behalve t.h.v. dorsale lip
Naast BMP4 is Wnt8 dus een tweede anti-neuraliserende factor afkomstig van niet-
organisatormesoderm
Cerberus
Promoot vorming van cementklier, ogen, olfactorische plakodes
Expressie in endomesoderm < diepe cellen in vroege dorsale lip - cerberus mRNA
Injectie in ventraal blastomere → ectopische hoofdstructuren (Figuur 8.18)
Cerberus blokkeert BMPs en Wnt8 (en Xnr-3)
Frzb en Dickkopf (1997)
 Frzb (= sFRP) is oplosbare vorm van Frizzled, de Wnt receptor (Figuur 8.18)
Expressie in endomesoderm, niet in notochord
Overexpressie van Frzb blokkeert ventraliserende Wnt signalisatie
Geen ventrale structuren > “kopjes” zonder romp
Dickkopf interageert direct met Wnt en met de Wnt-co-receptor LRP-5, en LRP-6
neutraliserende antilichamen tegen Dickkopf in blastocoel
inducerengedeformeerde kopjes zonder voorhersenen + recenter ook rol voor Tiki
(verhindert ook binding van Wnt aan zijn receptor) en IGF (pathway interfereert
met BMP en Wnt signalisatie)
Inductie van rompstructuren is een gevolg inhibitie van BMP, om hoofdstructuren
te krijgen moeten zowel BMP als Wnt geblokkeerd worden. Deze blokkering wordt
verzorgd door het endomesoderm, de meest anterieure structuur van de
organisator
Regionale verschillen in de neurale inductie
Gradiënt van een posteriorizerende factor specifieert de romp en staartweefsels.
De activiteit van deze factor is hoogst in het posterieure deel van het embryo en
zwakt af anterieur.
De voornaamste posteriorizerende factor is vermoedelijk Wnt8: Een gradiënt van
Wnt eiwitten is noodzakelijk voor de specificatie van de posterieure neurale plaat
Wnt signalisatie is het hoogst posterieur en afwezig anterieur (zie Fig)
Additie Wnt8 aan ontwikkelende embryo
→ ruggemerg-specifieke neuronen meer anterieur aanwezig
→ meest anterieure merkers van de voorhersenen afwezig
Suppressie Wnt signalisatie (bv. door Frzb of Dkk)
→ ectopische expressie van anterieure neurale merkers in meer posterieure
posities.
=> 2 voorname activiteits-gradiënten actief in gastrula van amfibieën :
Een BMP gradient : specifieert de dorsale-ventrale as
Een Wnt gradient : specifieert de anterieure-posterieure as
Naast Wnt factoren ook FGFs en Retinoïnezuur (RA) betrokken bij specificatie
anterieure-posterieure as. De activiteit van beide paracriene factoren is het
hoogst posterieur.
De interactie tussen FGF, RA en Wnt is nog steeds onduidelijk.Vermoedelijk gecoördineerde
actie van de drie factoren nodig voor correcte polarisatie van de AP as waarbij :
Wnt direct betrokken is bij de regionalisatie van het ruggemerg
FGF belangrijk is voor de respons op de Wnt signalen
RA vooral belangrijk is voor de patroonvorming in de achterhersenen
Specificaties van de L-R as
 Bepaalde organen zijn asymmetrisch georiënteerd bv. hart en darm
Cruciaal in alle vertebraten is de expressie van een nodal gen in L laterale
plaatmesoderm (LPM) : bijXenopus Xnr-1
Microinjectie Xnr-1 aan de rechterkant
Willekeurige oriëntatie van organen
Wat bepaalt L-expressie van Xnr-1 ? Recentduidelijke evidentie voor cruciale rol voor
motielecilia(-> asymmetrische vloeistofstroom zorgt voor deonderdrukking van een
Nodal inhibitor (Dand5/Coco) in linker LPM
Xnr-1 induceert Pitx2 (persisteert in L deel van hetembryo terwijl hart en darmen
ontwikkelen)
De vroege ontwikkeling bij amfibiën: samenvatting (I)
De dorsale lip van de blastoporus vormt het organisator weefsel. Dit weefsel dorsaliseert de
ectoderm, transformeert het tot neuraal weefsel en transformeert ventraal mesoderm tot
lateraal mesoderm.
De organisator bestaat uit het faryngeaal endoderm, hoofd mesoderm, chorda en dorsaal
blastoporus lip. De organisator functioneert door secretie van oplosbare eiwitten (Noggin,
Chordin, Follistatin) die het BMP signaal blokkeren, dat anders het mesoderm zou
ventraliseren en de epidermale genen in het ectoderm zou induceren. In de hoofdstreek
blokkeren Cerberus, Frzb en Dickkopf de Wnt signalisatie vanuit het ventraal en lateraal
mesoderm.
De organisator wordt geïnduceerd door het Nieuwkoop centrum, gelokaliseerd in de meest
dorsaal gelegen vegetale blastomeren. Dit centrum wordt gevormd door de corticale reactie,
die zorgt voor de translocatie van Dishevelled proteïn naar de dorsale zijde van de zygote.
Dishevelled stabiliseert Beta-catenine in de dorsale cellen van het embryo. Dus het
Nieuwkoop centrum ontstaat door accumulatie van Beta-catenine, dat complexeert met Tcf3
en het siamois gen activeert.
Siamois en een TGF-Beta signaal (Vg-1) activeren goosecoid gen in de organizator.
Goosecoid activeert andere genen die de organisator laten functioneren.
Andere posterioriserende signalen beïnvloeden A-P specificatie van de neurale buis (FGF, RA,
Wnt8).
De L-R as wordt geïnitieerd door de asymmetrische vloeistofstroom gemedieerd door motiele
cilia in het dak van het archenteron. Dit activeert de expressie van Nodal in het linkerdeel.
Zoals in andere vertebraten activeert Nodal de expressie van Pitx2, dat kritisch is voor het
onderscheid tussen links- en rechtshandigheid van hart en darm