TƯƠNG HỢP SINH HỌC

TS TRẦN XUÂN VĨNH

MỤC TIÊU BÀI GIẢNG
1, Trình bày được định nghĩa tương hợp sinh học
2, Trình bày được 3 loại thử nghiệm đánh giá tương hợp sinh học
3, Giải thích được ưu và nhược điểm của các thử nghiệm in vitro
và in vivo
4, Trình bày được thử nghiệm độc tính lên tế bào
5, Trình bày được thử nghiệm độc tính gen
 MỞ ĐẦU

♦ Vật liệu nha khoa tiếp xúc với nhiều mô khác nhau trong cơ thể
♦ Tồn tại trong môi trường đặc biệt phức tạp:
● Sự hiện diện của vi khuẩn
● Tính ăn mòn của dịch sinh lý (nước bọt,…)
● Tiếp xúc với thức ăn, nước uống, sự va chạm cơ học …

♦ Các đặc điểm này đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn,
chế tạo và sử dụng vật liệu.
à Vật liệu cần đạt những yêu cầu cần thiết, cần có tính tương hợp
sinh học.
 ĐỊNH NGHĨA TƯƠNG HỢP SINH HỌC

► Tương hợp sinh học: hòa hợp với sự sống và không gây độc
hoặc thương tổn đến chức năng sinh học.

► Tương hợp sinh học: khả năng mà một vật liệu gây ra một đáp
ứng sinh học thích hợp trong một ứng dụng nhất định trong cơ
thể.

►Tương hợp sinh học: khả năng mà một vật liệu thực hiện một
chức năng cụ thể với một phản ứng thích hợp của cơ thể.
♦ Trước đây, tương hợp sinh học được cho là đồng nghĩa với tính “trơ”
và không độc của vật liệu
Tuy nhiên:
● Đáp ứng của vật chủ
● Sự thoái biến của vật liệu
● Tương tác của vật liệu trong môi trường vật chủ.

♦ Một vật liệu có tương hợp sinh học hay không tùy thuộc vào hoạt
động sinh lý nơi vật liệu được sử dụng và đáp ứng sinh học yêu cầu
bởi nơi đó.
► THSH liên quan đến sự tương tác giữa 3 yếu tố: cơ thể, vật liệu
và chức năng của vật liệu

♦ Vật liệu không “trơ” về mặt sinh học

- VL có tác động lên cơ thể và ngược lại
♦ THSH là một quá trình động, kéo dài theo thời gian
- Đáp ứng của cơ thể có thể thay đổi do bệnh tật, tuổi tác...
- Vật liêu có thể hư hỏng do mài mòn,lực tác động...
♦ THSH là đặc tính của một vật liệu và của môi trường xung quanh
chúng
- THSH phụ thuộc vào tương tác của VL với môi trường xung quanh

* Tính tương hợp sinh học là tính chất của một vật liệu khi tương
tác với môi trường xung quanh nó.
* Đáp ứng sinh học sẽ thay đổi nếu có sự thay đổi trong cơ thể
vật tiếp nhận, sự sử dụng vật liệu, hay do chính vật liệu.
CƠ THỂ

♦ Tương hợp sinh học tốt khi cơ thể đáp ứng và tương tác tốt
với vật được đưa vào
● Không xảy ra phản ứng thải ghép
● Không làm thoái biến vật liệu
● Giúp vật liệu thực hiện chức năng
VẬT LIỆU
♦ Tương hợp sinh học khi vật liệu gây ra 1 đáp ứng sinh học thích
hợp.
● không gây đáp ứng miễn dịch
● không gây độc tế bào
● không gây đột biến gen
● không gây ung thư

CHỨC NĂNG VẬT LIỆU

♦ Với mỗi chức năng khác nhau của vật liệu, phản ứng sinh học
của cơ thể đối với vật liệu đó khác nhau.
♦ Chức năng của vật liệu sẽ quy định những đặc tính cần thiết và
lý tưởng của vật liệu.
Bác sĩ răng hàm mặt ?
♦ An toàn cho bệnh nhân
♦ An toàn cho bác sĩ, trợ thủ
♦ Tuân thủ các qui định
♦ Trách nhiệm pháp lý
► Đánh giá THSH phải thích hợp với chức năng và vị trí sử dụng
♦ Việc lựa chọn thử nghiệm tương hợp sinh học phù hợp phụ
thuộc vào loại vật liệu cần đánh giá
♦ Đáp ứng của mô đối với vật liệu trong thực hành nha khoa chịu
ảnh hưởng bởi các yếu tố:
- Loại, nồng độ và hình thể vật liệu
- Thể tích vật liệu
- Cách đặt vật liệu
- Độ sâu của xoang trám
- Thời gian tiếp xúc của vật liêu với mô
- Đáp ứng của bệnh nhân trước tác nhân xâm hại
► Việc lựa chọn thử nghiệm phụ thuộc bản chất và thời
gian tiếp xuc của vật liêu
♦ Bản chất tiếp xúc
- Bề mặt bên ngoài: da, niêm mạc (hàm giả tháo lắp), bề mặt
tổn thương, hư hỏng
- Tiếp xúc bề mặt thông bên ngoài một cách gián tiếp như
men, ngà (VL trám)
- Tiếp xúc với xương (VL cấy ghép), mô và dịch mô, máu
♦ Thời gian tiếp xúc
- Tiếp xúc ngắn: ≤ 24h
- Tiếp xúc kéo dài: trên 24 tiếng nhưng dưới 30 ngày
- Tiếp xúc lâu dài: trên 30 ngày
Các thông số kỹ thuật ANSI/ADA 41 (American National Standards
Institute/ American Dental Association) năm 2005

Ba loại thử nghiệm

♦ Thử nghiệm ban đầu: Dựa trên kỹ thuật nuôi cấy tế bào in
vitro
- Tính gây độc tế bào
- Sự ly giải màng tế bào hồng cầu (tán huyết)
- Tính gây đột biến gen
- Tính sinh ung thư
- Tính gây độc hệ thống
 ♦ Thử nghiệm cấp hai: trên các động vật nhỏ (in vivo)
về khả năng gây viêm hay tạo miễn dịch
- Kích thích da, dưới da
- Kích thích niêm mạc
- Thử nghiệm quá mẫn
- Cấy ghép
♦ Thử nghiệm ứng dụng: in vivo trên các động vật như
khỉ, chó, heo...

Sau cùng là sự chấp thuận của Tổ chức kiểm soát thực

phẩm và dược phẩm trên người.
Thử nghiệm in vitro

♦ Ưu điểm:
- Nhanh
- Rẻ tiền hơn
- Có thể lặp lại
- Cho phép đánh giá một cách riêng biệt tác dụng sinh học của
mỗi thành phần của vật liệu

♦ Nhược điểm:
- Ít liên quan với lâm sàng
- Rất nhạy
Thử nghiệm in vivo
♦ Ưu điểm:
- Liên quan gần với lâm sàng
- Đánh giá tính độc của các chất chuyển hóa
Thực tế một vật liệu có tính THSH, nhưng khi sản phẩm thoái hóa
của nó mỗi khi được chuyển hóa bởi cơ thể trở nên nguy hiểm
- Việc diễn giải kết quả thường dễ hơn vì mối liên quan với lâm
sàng rõ ràng hơn

♦ Nhược điểm:
- Thực hiện trên động vật của phòng thí nghiệm có thể không liên
quan với loài người
- Có thể khó khăn mô phỏng các bệnh lý như sâu răng, sang
thương nha chu
 Phối hợp các thử nghiệm

Không có một thử nghiệm riêng lẻ nào đủ để mô tả tính

tương hợp sinh học của một vật liệu một cách hoàn hảo
Đánh giá tính tương hợp sinh học của một vật liệu trong quá
trình tạo ra nó và sử dụng trên lâm sàng

Đánh giá tính tương hợp sinh học của một vật liệu là một quá
trình tiếp diễn
Mối liên quan thử nghiệm in vitro, thử nghiệm trên
động vật và thử nghiệm ứng dụng

- Mỗi hình thức thử nghiệm được thiết kế để xác định các phương
diện khác nhau của đáp ứng sinh học
- Sự tương quan không phải luôn luôn xảy ra
 Các tiêu chuẩn quy định việc đánh
giá tính tương hợp sinh học
♦ 1926: American Dental Association (ADA) lần đầu tiên thiết lập
bảng hướng dẫn về các vật liệu nha khoa
National Bureau of Standards (NBS)/National Institute of
Science and Technology (NIST) phát triển các thông số kỹ
thuật cho amalgam nha khoa

♦ Tuy nhiên, không theo kịp sự phát triển kỹ thuật của VLNK do:
◊ Sự tiến bộ nhanh chóng của sinh học phân tử và tế bào,
◊ Nhiều TN để đánh giá tính tương hợp sinh học của các VL
◊ Thiếu sự chuẩn hóa các thử nghiệm này.

♦ 1972, Hội đồng ADA về Vật liệu nha khoa, Các dụng cụ và
thiết bị đã chấp thuận bảng các thông số kỹ thuật số 41
 Thử nghiệm độc tính trên tế bào
Mục đích: Đánh giá tác động của vật liệu lên hình thái và hoạt
động của tế bào nuôi cấy

I. Chọn thử nghiệm: phụ thuộc bản chất vật liệu, ví trí sử dụng...
1. Dòng tế bào:
♦ Dòng tế bào đã thiết lập:
- Không liên quan tế bào đích gặp trong lâm sàng.
- Dễ nuôi cấy và có sẵn
- Ví dụ CCL 1(NCTC clone 929), CCL 63

♦ Tế bào nuôi cấy nguyên sơ:

- Gần với tế bào đích, từ mô sống có khả năng sinh sản
- Thời gian sống giới hạn
- Ví dụ : Nguyên bào sợi tủy, Nguyên bào sợi nướu....
2. Mẫu nghiện cứu: sản phẩm hoàn chỉnh, chiết xuất
3. Kiểu tiếp xúc với tế bào
Ca (OH)2 và fibroblast dây chằng nha chu
II. Đánh giá độc tính:
1. Định tính: hình dạng tế bào, xuất hiện không bào, mất bám dính
hoặc tiêu tế bào, mất nguyên vẹn màng tế bào
Thang đáng giá:
0 : không độc tính
1 : độc tính nhẹ
2 : độc tính trung bình
3 : độc tính nặng

Nhuộm May Grunwald đối với nguyên bào sợi hay khung bào
actin (cytosquellete) đối với tế bào tạo xương. Sau đó quan sát
dưới kính hiển vi quang học hoặc điện tử
2. Định lượng:

- Số lượng tế bào hoặc tế bào chết. (TC50 liên quan với nồng độ
dẫn đến 50% tế bao bị chết)
- Ức chế tăng trưởng tế bào
- Sự tăng sinh tế bào (thử nghiệm Alamar Blue™)
(Thử nghiệm Alamar Blue™ dựa trên phản ứng oxy hóa khử chỉ
hoạt động chuyển hóa của tế bào. Nếu ở pha hoạt động mạnh, môi
trường khử, màu xanh không huỳnh quang trở nên đỏ huỳnh
quang. Đo huỳnh quang tại bước sóng 590nm sau 1, 3,7 ngày)
- Táo khúm TB và di trú của tế bào
- Sự dính tế bào
- Tỉ lệ protéine (vd ostéocalcine…), ADN, ARN (Nồng độ
osteocalcine là chỉ dấu của hoạt động tế bào của nguyên bào xương,
nguyên bào ngà)
- Phóng thích enzyme, chất màu sống, chất trung gian hoặc
hormone (GAG, TGF…)
- Hoạt động enzyme như : phosphate alcalin nội bào hay
succinate déshydrogénase ti thể (Nhuộm MTT, MTT [3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]
- Nhuộm MTT dựa trên nguyên tắc là MTT tham gia phản ứng
oxy hóa khử với ty thể tế bào và tạo thành formazan dạng tinh thể.
Sau đó dùng dung dịch khác hoà tan các tinh thể formazan và đo
độ hấp thụ quang học của các dung dịch này.

Các tinh thể formazan bên trong

TB chứng tỏ MTT đã được
chuyển hóa bởi ti thể của tế bào
 Thử nghiệm độc tính trên gen
Mục đích: Đánh giá thay đổi số lượng chromosome, đột biến gen
hoặc tổn thương ADN của tế bào nuôi cấy sau khi tiếp xúc với VL
I. Thử nghiệm Ames
- Mẫu dưới dạng chiết xuất
- 5 lớp tế Samonella typhimurium
- Men gan chuột
Nguyên tắc: Samonella typhimurium cần histidine để sinh trưởng vì
nó không có khả năng tổng hợp histidine. Ngược lại, vi khuẩn bị đột
biến có thể tăng trưởng trong môi trương không có histidine
Kết quả có ý nghĩa: thử nghiệm có thể lặp lại và số lượng vk
đếm được sau 72 h của nhóm NC ít hơn 2 lần nhóm chứng
Thử nghiệm Ames
II. Thử nghiệm tiếp xúc với lymphosyste người
1. Thử nghiệm bất thương nhiễm sắc thể
- Mẫu dưới dạng chiết xuất
- Lymphocyste
- Men gan chuột
*Phân tích bất thường nhiễm sắc thể gây nên bởi các tế bào bị tắc
nghẽn ở metaphase nhờ nhuộm Giemsa
*Đếm và so sánh các TB bất thương giữa nhóm NC và chứng

2. Thử nghiệm micronoyaux: đánh giá độ thiệt hại nhiễm sắc thể
gây ra bởi tác nhân gây độc trên gen

III. Thử nghiệm điện di (comet assay/single cell electrophoresis

assay-SCGE): nhạy và đơn giản, đánh giá tổn thương ADN ở mức
độ cá thể tế bào
 Thử nghiệm cấp hai
I. Độc tính tại chổ
1. Kích ứng: đánh giá phản ứng viêm khu trú sau khi đặt vật liệu
trên cơ thể động vật ở vị trí thích hợp
1.1. Thử nghiệm kích ứng da trên động vật: đánh giá phản ứng
viêm sau khi đặc vật liệu trên cơ thể động vật ở vị trí thích hợp

Vật liêu được đặt vùng lưng (băng hở) với 1 hoặc nhiều mẫu dưới
dạng bột, dung dịch, chiết xuất, rắn. Kết quả đánh giá các mụn đỏ
trên da và sưng phù sau 1, 24, 48, 72 giờ
Thang đánh giá:
0: không phản ứng
1: phản ứng (+) nhẹ: đỏ nhẹ và/hoặc vùng tiếp xúc khô ráo
2: phản ứng (+) trung bình: đỏ rõ ràng hoặc khô ráo, có thể lan ra khỏi
vùng tiếp xúc VL
3: phản ứng (+) nặng: mụn đỏ lan rộng với phù nề và/hoặc hoại tử
1.2. Thử nghiệm kích ứng trên bề mặt đặc hiệu trên động vật:

Đánh giá phản ứng trong da, trên niêm mạc miệng (Galia CR
2008)
Chiết xuất vật liêu được bơm trong da bên mạng sườn thỏ. Đánh
giá sự xuất hiện mụn đỏ, phù nề hoặc hoại tử sau 24, 48, 72 giờ

1.3. Thử nghiệm kích ứng trên da ở người

Một liệu duy nhất được đặt trực tiếp lên da bình thường và được
bảo vệ bởi băng kín. Đánh giá sau vài phút đến 72h dựa trên sự
khô ráo và đỏ da, lan rộng của sang thương này, thậm chí sưng nề
hoặc hoại tử
2. Tính nhạy cảm

2.1 Thử nghiệm tối đa hóa trên chuột bạch

- Phương pháp chính xác nhất, thích hợp cho các sản phẩm hóa học
đơn giản
- Pha cảm ứng: tiêm trong da và băng kín
- Pha phát động: sau 14 ngày sau kết thúc pha cảm ứng, bằng cách
đặt vật liệu lên vùng cảm ứng

2.2. Thử nghiệm hệ thống đóng trên chuột bạch (Buehler)

2.3. Thử nghiệm tại chổ trên hạch lympho của chuột:
- Đo sự xâm nhập của méthyl thimidine-3H bởi lymphocystes trong
hạch lympho phơi nhiễm với vật liệu (pha cảm ứng). Thử nghiệm
này không bao gồm pha phát động
- Hạch sẽ lấy ra sau khi làm chết chuột, đánh giá tỉ lệ sự xâm nhập
thymidine trong hạch giữa nhóm nghiên cứu và chứng
A: nhủ tương 50:50 ( thể tích)
B: dung môi (nhóm chứng)
C: 50A:50B
3 Cấy ghép:

- Đánh giá hiệu ứng bệnh lý tại chổ trên mô sống bị phơi nhiễm
với vật liệu ở cấp độ đại thể và vi thể
- Cấy ghép có thể là dưới da, trong cơ hoặc xương
- Đánh giá kết quả ngắn hạn sau 1, 4, 12 tuần hoặc dài hạn sau 12,
26, 52, 78 tuần
- Kết quả bao gồm định tính và định lượng đáp ứng mô tại các thời
điểm nghiên cứu và so sánh với nhóm chứng.
II. Độc tính toàn thân (ISO 10993-11)
Khi một vật liệu phóng thích các thành phần trong cơ thể thì chúng
có thể gây nên độc tính toàn thân hay hệ thống
•Độc tính cấp: hiệu quả (-) đến trong vòng 24 giờ theo sau tiếp xúc
vật liệu
Vị trí có thể là miệng, da, tĩnh mạch, màng bụng hoặc bằng đường
hít
•Độc tính bán cấp: hiệu quả (-) đến trong giai đoạn giữa 14 và 28
ngày sau tiếp xúc thường trực với vật liệu
•Độc tính mãn: hiệu quả (-) đến sau tiếp xúc thường trực với vật
liệu trong giai đoạn ít nhất 10% đời sống của đông vật thí nghiệm
(ví dụ 90 ngày đối với chuột)
Thử nghiệm thường thực hiện song song với thử nghiệm sinh ung
thư. Nó ít được yêu cầu thực hiện trong lĩnh vực nha khoa
 Thử nghiệm ứng dụng
Mục đích là đánh giá trong tình huống chức năng trên mẫu động vật.
Rất đặc trưng đối với vật liệu nha khoa (trong chữa răng nội nha)
Động vật: chuột, thỏ, chó, heo, khỉ

♦ Thử nghiệm ứng dụng trám răng: đánh giá tương hợp sinh học của
vật liệu với tủy và ngà răng
- Mô phỏng xoang sâu răng được trám với vật liệu cần đánh giá. -
Phản ứng ngà tủy sẽ được đánh giá tại các thời điểm khác nhau bằng
kỹ thuật mô học
♦ Thử nghiệm ứng dụng che tủy: đánh giá tương hợp sinh học của
vật liệu với tủy răng
- Mô phỏng xoang sâu lô tủy được che tủy với vật liệu cần đánh.
♦ Thử nghiệm ứng dụng nội nha: đánh giá tương hợp sinh học với
mô tủy chóp còn lại hay mô quanh chóp
Lộ tủy Biodentine™
7 DAY
Ca(OH)2 MTA Biodentine™

M M M
* rd
* p *
rd
rd p p

M M
M

p p
14 DAY
Ca(OH)2 MTA Biodentine™
M M d rd
d M

rd
p rd
db db
db p p

30 DAY
Ca(OH)2 MTA Biodentine™
M dr M M
p rd

dr dr
rr
dr p p
 Kết luận

♦ Việc lựa chọn thử nghiệm thích hợp phụ thuộc vào loại vật liệu
♦ Các đáp ứng mô đối với vật liệu trong thực hành nha khoa ảnh
hưởng bởi:
* Kích thước san thương ở mức độ men, ngà, tủy hay xương
* Cách thức đặt vật liệu
* Khả năng đáp ứng của bệnh nhân trước các yếu tố xâm hại