Οικοτοξικολογική ανταπόκριση του Spirulina

platensis σε συνυπάρχοντα χαλκό και

ψευδάργυρο σε λύματα αναερόβιας χώνευσης

• Ο Zn2+ (>4,0 mg/L) κατά μέσο όρο προάγει την

πρόσληψη Cu2+ από τα κύτταρα S. platensis.
• S. platensis επαρκώς ανακτημένο θρεπτικό
συστατικό
από λύματα αναερόβιας χώνευσης.
• Βαρέα μέταλλα αναερόβιας πέψης
αφαιρέθηκαν με εκροή S. platensis.
• Η αναλογία C18:3 αυξήθηκε κατά 97,04% στο
0,3 mg/L Cu2++2,0 mg/L Zn2+.
• Η βιομάζα από λύματα αναερόβιας χώνευσης
25% και 50% μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωική
τροφοδοσία.

Περίληψη
Το ιόν χαλκού (Cu2+) και το ιόν ψευδάργυρου
(Zn2+) συνυπάρχουν ευρέως στα λύματα
αναερόβιας χώνευσης ως τυπικοί ρυπαντές. Αυτή η
εργασία στοχεύει να διερευνήσει πώς η σύνδεση
Cu2+ - Zn2+ επηρεάζει τις φυσιολογικές ιδιότητες
του S. platensis χρησιμοποιώντας μέσο Schlösser
(SM) και αποστειρωμένο απόβλητο αναερόβιας
χώνευσης (SADE). Η βιωσιμότητα των κυττάρων
μικροφυκών, οι βιοχημικές ιδιότητες, η πρόσληψη
Cu2+ και Zn2+ και η αξιολόγηση κινδύνου που
σχετίζεται με την επαναχρησιμοποίηση της
βιομάζας ως πρόσθετα σε χοίρους αξιολογήθηκαν
διεξοδικά. Η παραγωγή βιομάζας κυμαινόταν από
0,03 έως 0,28 g/L στο SM και 0,63 έως 0,79 g/L
στο SADE λόγω της παρουσίας Cu2+ και Zn2+. Η
μέγιστη τιμή της περιεκτικότητας σε χλωροφύλλη
α και καροτενοειδή κατά τη διάρκεια του
πειράματος μειώθηκε κατά 70 - 100% και 40 -
100% στο SM και κατά 70 - 77% και 30 - 55% στο
SADE. Το επίπεδο της ακατέργαστης πρωτεΐνης
μειώθηκε κατά 4 - 41% στο SM και κατά 65 - 75%
στο SADE. Η αναλογία αναγωγής αυτών των
ενώσεων συσχετίστηκε θετικά με τις
συγκεντρώσεις Cu2+ και Zn2+. Η μέγιστη τιμή
κορεσμένων και ακόρεστων λιπαρών οξέων
ελήφθη και στους 0,3 Cu + 2,0 Zn (50,8% και
22,8%, αντίστοιχα) και 25% SADE αντιδραστήρες
(33,8% και 27,7%, αντίστοιχα). Η πρόσληψη Cu
στη βιομάζα διευκολύνθηκε από τη συγκέντρωση
Zn2+ (> 4,0 mg/L). Ο κίνδυνος βιομάζας S.
platensis που σχετίζεται με Cu2+ ήταν υψηλότερος
από τον Zn2+. Το S. platensis από αντιδραστήρες
SM (Cu2+ ≤ 0,3 mg/L και Zn2+ ≤ 4,0 mg/L) και
αραιωμένο SADE (25% και 50% SADE) θα
μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πρόσθετα
ζωοτροφών χωρίς κανένα κίνδυνο (δείκτης
κινδύνου <1), γεγονός που παρέχει επαρκείς
πρωτεΐνες και λιπαρά οξέα για κατανάλωση
χοίρων. Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν την
πολλά υποσχόμενη εφαρμογή της χρήσης S.
platensis για βιοαποκατάσταση Cu2 + και Zn2+ σε
λύματα αναερόβιας χώνευσης και συλλογή
βιομάζας για πρόσθετα ζωοτροφών.

1. Εισαγωγή

Τα λύματα αναερόβιας χώνευσης (ADE) από την

εντατική κτηνοτροφία περιέχουν υψηλές
συγκεντρώσεις αζώτου (N) και φωσφορικών
αλάτων (P) μαζί με βαρέα μέταλλα όπως ιόν
χαλκού (Cu2+) και ιόν ψευδάργυρου (Zn2+) και οι
συγκεντρώσεις αυτών των ρύπων μερικές φορές
υπερβαίνουν ακόμη και τους περιβαλλοντικούς
κανονισμούς (Baker et al., 2021; Cao et al., 2018).
Η ακατάλληλη απόρριψη του ADE μπορεί να
προκαλέσει σοβαρές συνέπειες, όπως
ευτροφισμό, μόλυνση από παθογόνους
παράγοντες, υποβάθμιση του οικοσυστήματος και
ούτω καθεξής (Praveen et al., 2018). Τα βαρέα
μέταλλα, όπως Cu2+ και Zn2+, που
απελευθερώνονται στο περιβάλλον μπορούν να
μεταναστεύσουν στα υπόγεια και επιφανειακά
ύδατα, ακόμη και να συσσωρευτούν σε εδάφη και
καλλιέργειες, ασκώντας μια βαθιά και αρνητική
επίδραση στο περιβάλλον και την ανθρώπινη
υγεία (Feng et al., 2018). Ως εκ τούτου, είναι
απαραίτητο να αφαιρεθούν αυτά τα θρεπτικά
συστατικά και τα βαρέα μέταλλα από την ADE
πριν απελευθερωθούν στο περιβάλλον (Cai et al.,
2013; Gupta et al., 2022). Πολλές τεχνικές, π.χ.,
βιοαντιδραστήρας μεμβράνης, χημική
κατακρήμνιση και κατασκευασμένοι υγρότοποι,
έχουν αναπτυχθεί για την επεξεργασία ADE, αλλά
όλες αντιμετωπίζουν φιλικά προς το περιβάλλον
και βιώσιμα προβλήματα ή δυσκολίες (όπως
υψηλό κόστος, κατανάλωση ενέργειας, χαμηλή
απόδοση κ.λπ. ) (Monfet et al., 2017).
Η τεχνολογία που βασίζεται σε μικροφύκη δείχνει
μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία της ADE στην
ανάκτηση θρεπτικών ουσιών, η οποία μετατρέπει
το N και P σε ADE μέσα σε βιομάζα για μελλοντική
χρήση (Hasan et al., 2021; Xie et al., 2018; Wang et
al., 2019α, 2019β). Το άζωτο αμμωνίας (NH4+ - N)
στο ADE μπορεί να λειτουργήσει ως κύρια πηγή
αζώτου για τη σύνθεση πρωτεϊνών, ενζύμων και
μεταφοράς ενέργειας και το P μπορεί να
αφομοιωθεί για την παραγωγή φωσφολιπιδίων,
νουκλεϊκού οξέος και ATP κατά τη διάρκεια της
ανάπτυξης των μικροφυκών. (Cheng et al., 2020).
Μια ποικιλία μικροφυκών έχει εφαρμοστεί για την
επεξεργασία ADE συμπεριλαμβανομένων των
Desmodesmus sp., Chlorella sp. και Scenedesmus
sp.. Προηγούμενες αναφορές τεκμηρίωσαν ότι
πάνω από 90% NH4+ - N και 84% ολικό άζωτο από
ADE εξαλείφθηκαν από το Desmodesmus sp. μετά
από 14 ημέρες καλλιέργειας (Li et al., 2021). ενώ
93% NH4+ - N και 100% φωσφορικό άλας (PO34-)
από το ADE αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας
καλλιέργεια μικροφυκών (Chlorella sp. and
Scenedesmus sp.) (Hasan et al., 2021). Μεταξύ των
πολλαπλών μικροφυκών που χρησιμοποιούνται
για τη θεραπεία ADE, το S. platensis τράβηξε την
προσοχή των ερευνητών λόγω του γρήγορου
ρυθμού ανάπτυξής του, της ισχυρής
προσαρμοστικότητας, της συσσώρευσης
μεταβολιτών υψηλής αξίας (Zhou et al., 2021;
Zhou et al., 2018) . Με το S. platensis, έως και 99%
NH4+ - N και 45% PO34- αφομοιώθηκαν για
περαιτέρω μετατροπή σε βιομάζα με τη
συμπλήρωση HCO3- σε ADE, οδηγώντας σε
συγκέντρωση βιομάζας 1,50 g/L μετά από 12
ημέρες ( Matos et al., 2021). Σε σύγκριση με άλλα
μικροφύκη, το S. platensis έχει επίσης την
ικανότητα να αυτο-θρομβώνεται και να επιπλέει
στην επιφάνεια του νερού λόγω της νηματοειδούς
δομής, η οποία διευκολύνει τη συλλογή βιομάζας
για περαιτέρω χρήση (Razak and Sharip, 2020).
Αξίζει να σημειωθεί ότι το S. platensis είναι το πιο
δημοφιλές συμπλήρωμα διατροφής και
ζωοτροφής σε όλο τον κόσμο με την πλουσιότερη
πηγή φυτικών πρωτεϊνών (60–70% του βάρους
του) μεταξύ της βιομάζας των μικροφυκών
(Usharani et al., 2012). Όπως αναφέρθηκε
παραπάνω, τα πλεονεκτήματα της ανάκτησης
θρεπτικών συστατικών, της παραγωγικότητας της
βιομάζας και της δυνατότητας μεταβολιτών
προστιθέμενης αξίας καθιστούν την τεχνολογία
που βασίζεται στα μικροφύκη μια πιο ελκυστική
τεχνική για τον καθαρισμό της ADE.
Εκτός από τα θρεπτικά συστατικά, το ADE διαθέτει
επίσης υψηλές συγκεντρώσεις Cu2+ (<5 mg/L) και
Zn2+ (<10 mg/L) (Jin and Chang, 2011). Αν και τα
Cu2+ και Zn2+ είναι απαραίτητα μικροστοιχεία για
την ανάπτυξη μικροφυκών σε καθαρή
καλλιέργεια, η περίσσεια αυτών των βαρέων
μετάλλων παρουσιάζει μεγάλη αναστολή για την
ανάπτυξη και το μεταβολισμό των μικροφυκών, τα
οποία επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την
παραγωγή βιομάζας και τη μετατροπή των
θρεπτικών συστατικών (El-Din, 2017; Zhou et al. ,
2018). Η προηγούμενη μελέτη παρουσιάζει ότι η
αύξηση της συγκέντρωσης Zn2+ από 0,0 σε 8,0
mg/L στη μέση καλλιέργεια μείωσε την παραγωγή
βιομάζας του S. platensis κατά 70,3% (Zhou et al.,
2018). Η αύξηση της συγκέντρωσης Cu2+ από 0,5
σε 3 mg/L μείωσε επίσης την απόδοση βιομάζας
του S. platensis (El-Din, 2017). Στην ADE με
Coelastrella sp., η αύξηση της συγκέντρωσης Cu2+
από 0,0 σε 3,0 mg/L μείωσε την
αποτελεσματικότητα απομάκρυνσης του NH4+ - N
από 80% σε 39% (Li et al., 2018), αλλά αύξησε το
Zn2+ από 0,0 σε 2,0 mg/L μείωσε την
αποτελεσματικότητα απομάκρυνσης του ολικού
φωσφορικού (TP) κατά 7,7% (Li et al., 2020). Το
πιο σημαντικό είναι πως, το Cu2+ και το Zn2+
συνυπάρχουν συνήθως στην ADE (de Sousa
Oliveira et al. (2021)) Διερευνήθηκαν ταυτόχρονες
παρεμβολές των Cu2+ και Zn2+ σε λίμνες αλγών
υψηλής ταχύτητας (HRAP) και βρέθηκε η
χαμηλότερη απόδοση βιομάζας του Chlorella sp.
στο HRAP με 0,5 mg/L Cu2+ και 5,0 mg/L Zn2+.
Μέχρι σήμερα, η επίδραση τόσο του Cu2+ όσο και
του Zn2+ σε καθαρή καλλιέργεια ή ADE στην
ανάπτυξη του S. platensis παραμένει ασαφής.
Επιπλέον, η έκθεση σε Cu2+ και Zn2+ αλλάζει
επίσης τις βιοχημικές ιδιότητες της βιομάζας των
μικροφυκών. Η αναστολή της συνολικής
περιεκτικότητας σε χλωροφύλλη α και πρωτεΐνη
στη βιομάζα του S. platensis που προκαλείται από
3 mg/L Cu2+ ήταν 65,9% και 63,0% αντίστοιχα (El-
Din, 2017). Η αύξηση του Zn2+ από 2,0 σε 8,0 mg/L
ανέστειλε τη βιοσύνθεση.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Στέλεχος μικροφυκών

Η Spirulina platensis (FACHB: GY-D18),

προμηθεύτηκε από το Ινστιτούτο Υδροβιολογίας
της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, PR Κίνα. Το
στέλεχος μικροφυκών διατηρήθηκε αξονικά σε
φιάλες Erlenmeyer των 3 L που περιείχαν 1,5 L
μέσου Schlösser (SM) (Schlösser, 1982) με τη
σύνθεση που παρέχεται στον Πίνακα S1 στους 25
± 1 °C με συνεχή ένταση φωτός περίπου 1200x. Οι
φιάλες ανακινήθηκαν με το χέρι τρεις φορές την
ημέρα. Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, το
εναιώρημα S. platensis φυγοκεντρήθηκε στις 4000
rpm για 10 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος
και πλύθηκε τρεις φορές με χρήση απιονισμένου
νερού. Στη συνέχεια, κύτταρα μικροφυκών
επαναιωρήθηκαν σε στείρο SM για
ενοφθαλμισμό.

2.2. Ανάπτυξη του S. platensis σε SM με

επεξεργασία δυαδικού μετάλλου Cu-Zn

Τα αποτελέσματα των συγκεντρώσεων συσχέτισης

Cu2+ - Zn2+ στο SM στην ανάπτυξη του S.
platensis αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια
σειρά δοκιμών. 50 mL S. platensis καλλιεργήθηκαν
σε φιάλες Erlenmeyer των 500 mL που περιείχαν
300 mL SM, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν ως
αντιδραστήρες για περαιτέρω επεξεργασία
δυαδικού μετάλλου Cu2+- Zn2+. Στις περισσότερες
ADE, οι συγκεντρώσεις Cu2+ ήταν <5 mg/L και Zn2+
ήταν <10,0 mg/L (Jin and Chang, 2011). Για μίμηση
των συγκεντρώσεων συσχέτισης Cu2+ - Zn2+ σε ADE,
θειικό χαλκό (CuSO4·5H2O) (98% καθαρότητα,
Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Κίνα)
και θειικό ψευδάργυρο (ZnSO4·7H2O)
(καθαρότητα 99%, Aladdin Biochemical
Technology Co., Ltd., China) προστέθηκαν στους
αντιδραστήρες για να επιτευχθούν οκτώ
διαφορετικά σενάρια συγκέντρωσης (Πίνακας 1).
Οι αντιδραστήρες με SM μόνο (χωρίς την
προσθήκη Cu2+ και Zn2+) χρησιμοποιήθηκαν ως
έλεγχος (ControlSM). Τριπλοί αντιδραστήρες σε
κάθε σενάριο συγκέντρωσης επωάστηκαν για 11
ημέρες σε θερμοκρασία 25 ± 1 °C και ένταση
φωτός περίπου 1200 Lux. Οι αντιδραστήρες
ανακινούνταν με το χέρι τρεις φορές την ημέρα.
Η απόδοση ανάπτυξης του S. platensis
υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τις
συγκεντρώσεις βιομάζας. Η δραστηριότητα
φθορισμού χλωροφύλλης α μετρήθηκε κάθε δύο
ημέρες για να αντικατοπτρίζει τη φωτοσυνθετική
δραστηριότητα των κυττάρων S. platensis κάτω
από διαφορετικά σενάρια συγκέντρωσης. Οι
χρωστικές της φωτοσύνθεσης του S. platensis
αντανακλώνται από τις συγκεντρώσεις
χλωροφύλλης α και καροτενοειδών, οι οποίες
μετρώνται κάθε δύο ημέρες κατά τη διάρκεια της
καλλιέργειας. Τα βιοχημικά συστατικά
(ακατέργαστη πρωτεΐνη και λιπαρά οξέα) και η
πρόσληψη Cu2+ και Zn2+ μετρήθηκαν επίσης μετά
τη συλλογή βιομάζας S. platensis την 11η ημέρα.
Οι λεπτομέρειες της αναλυτικής διαδικασίας
περιγράφηκαν στην Ενότητα 2.4.

2.3. Ανάπτυξη του S. platensis παρουσία

αποστειρωμένων λυμάτων αναερόβιας
χώνευσης με Cu2+ - Zn2+

Το ADE συλλέχτηκε από μια φάρμα χοίρων που

βρίσκεται στην πόλη Fengcheng, στην επαρχία
Jiangxi, στην Κίνα. Το ADE φυγοκεντρήθηκε στους
4 °C και 10.000 rpm για 15 λεπτά για τη συλλογή
του υπερκειμένου. Για να ελαχιστοποιηθεί η
συμβολή άλλων μικροοργανισμών στο ADE, το
υπερκείμενο αποστειρώθηκε στους 121 °C για 20
λεπτά. Τα κύρια χαρακτηριστικά των
αποστειρωμένων λυμάτων αναερόβιας χώνευσης
(SADE) προσδιορίστηκαν και φαίνονται στον
Πίνακα 2. Το SADE αραιώθηκε περαιτέρω σε δύο
διαφορετικές συγκεντρώσεις (25% και 50%)
χρησιμοποιώντας απιονισμένο νερό, τα οποία
επισημάνθηκαν ως 25% SADE και 50% SADE
αντίστοιχα. Οι αναλογίες αραίωσης της ADE
επιβεβαιώθηκαν όπως οι προηγούμενες προ-
πειραματικές μελέτες λόγω της προφανούς
διαφοράς στην ανάπτυξη και τη δραστηριότητα
φθορισμού της χλωροφύλλης α (τα δεδομένα δεν
παρουσιάζονται). 250 mL SADE 25%, 50% και
100% (χωρίς αραίωση) μεταφέρθηκαν σε
αποστειρωμένες φιάλες Erlenmeyer των 500 mL
για καλλιέργεια S. platensis και κάθε συγκέντρωση
SADE παρασκευάστηκε εις τριπλούν.
Αξιολογήθηκαν οι μηχανισμοί απόκρισης του S.
platensis σε SADE που περιέχει Cu2+ και Zn2+. 50
mL S. platensis επωάστηκαν σε φιάλες Erlenmeyer
των 500 mL που περιείχαν διαφορετικές
αναλογίες SADE όπως περιγράφεται παραπάνω
για 10 ημέρες και 250 mL SM χρησιμοποιήθηκαν
ως έλεγχος χωρίς την προσθήκη Cu2+ και Zn2+
(ControlSADE). Η συγκέντρωση του ιόντος
μαγνησίου (Mg2+) σε 100% SADE ήταν συγκρίσιμο
με αυτό των αντιδραστήρων SM, γεγονός που
απέτρεψε την επίδραση που προκλήθηκε από το
Mg2+. Οι συνθήκες φωτός και θερμοκρασίας
διατηρήθηκαν σε περίπου 1200 Lux και 25 ± 1 °C,
αντίστοιχα. Όλες οι δοκιμές ανακινήθηκαν με το
χέρι τρεις φορές την ημέρα. Η ακατέργαστη
πρωτεΐνη, τα λιπαρά οξέα και η πρόσληψη Cu2+
και Zn2+ στη βιομάζα του S. platensis μετρήθηκαν
επίσης με τις αναλυτικές λεπτομέρειες που
παρέχονται στην Ενότητα 2.4.

2.4. Αναλυτικές μέθοδοι και στατιστική

ανάλυση
Οι συγκεντρώσεις βιομάζας του S. platensis κατά
την περίοδο καλλιέργειας εκτιμήθηκαν με
μέτρηση του βάρους ξηρών κυττάρων (DCW) της
βιομάζας μικροφυκών στους 105 °C για 24 ώρες
σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στο
Zhou et al. (2021). Ο ρυθμός αναστολής
ανάπτυξης (GIR) του S. platensis υπολογίστηκε ως
εξής:
GIR(%) = [(DCWcontrol – DCWsample)/DCWcontrol] x 100
όπου το δείγμα DCW αντιπροσωπεύει το βάρος
ξηρής κυψέλης (g/L) της βιομάζας σε
αντιδραστήρες με SM ή SADE με την παρουσία
Cu2+ και Zn2+ και το DCWcontrol σημαίνει το βάρος
ξηρών κυττάρων (g/L) της βιομάζας στον
αντίστοιχο έλεγχο, όπως το ControlSM και
ControlSADE.
Η μέγιστη φωτοχημική κβαντική απόδοση του
Photosystem II (PS II) (Fv/Fm) χρησιμοποιήθηκε
για να αναπαραστήσει τη δραστηριότητα
φθορισμού χλωροφύλλης α. Το Fv/Fm
προσδιορίστηκε στο σκοτάδι χρησιμοποιώντας
Water-PAM (WALZ, Γερμανία) και ελήφθη από τις
μετρημένες καμπύλες επαγωγής φθορισμού
χλωροφύλλης α που αναπτύχθηκαν από το
λογισμικό WinControl v.3.2. Το Fv/Fm
υπολογίζεται συνήθως ως εξής (Ramanna et al.,
2014):
Fv = Fm – F0
Fv/Fm = (Fm – F0) /Fm

όπου Fv είναι ο μεταβλητός φθορισμός. Τα Fm και

F0 είναι ο μέγιστος φθορισμός και ο αρχικός
φθορισμός χλωροφύλλης α που μετρήθηκαν στο
S. platensis στο σκοτάδι, αντίστοιχα.
Χρησιμοποιήθηκε ένα φασματοφωτόμετρο
υπεριώδους για τον προσδιορισμό της
συγκέντρωσης χλωροφύλλης α και καροτενοειδών
στη βιομάζα του S. platensis μέσω
φασματοφωτομετρίας στη διαδικασία
καλλιέργειας όπως περιγράφηκε προηγουμένως
(Zhou et al., 2018). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη
του S. platensis παρουσιάστηκε ως ακατέργαστη
πρωτεΐνη (TN × 6,25), η οποία υπολογίστηκε από
το συνολικό άζωτο (TN) χρησιμοποιώντας έναν
παράγοντα μετατροπής (6,25) (Zhou et al., 2021).
Το προφίλ των λιπαρών οξέων αναλύθηκε μέσω
GC-MS (Agilent 7890B\\7000D, USA) όπως
συζητήθηκε στην προηγούμενη μελέτη (Zhou et
al., 2018).
Οι περιεκτικότητες Cu και Zn στη
λυοφιλοποιημένη βιομάζα S. platensis
προσδιορίστηκαν από το ICP-OES (Optima 8000,
Ηνωμένες Πολιτείες), αντίστοιχα. Τα δείγματα
υπέστησαν πέψη με μίγμα ΗΝΟ3 (70%
καθαρότητα, Aladdin Biochemical Technology Co.,
Ltd., Κίνα) και HCl (καθαρότητα 37%, Aladdin
Biochemical Technology Co., Ltd., Κίνα) (HNO3:HCl
= 1:3, v. /ν) σε φούρνο μικροκυμάτων και η
διαδικασία ήταν ως εξής: (1) στους 120 °C για 2
λεπτά, (2) στους 160 °C για 3 λεπτά, (3) στους 180
°C για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, τα δείγματα
αραιώθηκαν σε 1:50 με εξαιρετικά καθαρό νερό
πριν από τη μέτρηση. Στη συνέχεια το αραιωμένο
δείγμα αναλύθηκε με ICP-OES (Zhou et al., 2018).

2.5. Εκτίμηση κινδύνου

Ο κίνδυνος έκθεσης των χοίρων σε Cu και Zn μετά

την κατάποση της βιομάζας μικροφυκών
εκτιμήθηκε από τη μέση ημερήσια πρόσληψη
(ADI) (mg/(kg∙day)) και το πηλίκο κινδύνου (HQ)
ως εξισώσεις κάτω από τις Εξ. (4) και (5)
(Shamsolahi et al., 2019):
ADI = (C x I x EF x ED)/BW x AT)
όπου C σημαίνει τις συγκεντρώσεις Cu ή Zn στα
μικροφύκη (mg/kg). I είναι ο ρυθμός κατάποσης
βιομάζας (kg/ημέρα), 0,075 kg/ημέρα για έναν
χοίρο σε αυτή τη μελέτη (Hugh et al., 1985;
Michalak et al., 2015). EF σημαίνει τη συχνότητα
έκθεσης (ημέρες/έτη), σε αυτήν τη μελέτη, 87
ημέρες/έτη (Michalak et al., 2015). ED σημαίνει τη
διάρκεια έκθεσης (έτος), 1 έτος για αυτήν τη
μελέτη. BW σημαίνει το σωματικό βάρος του
εκτεθειμένου ατόμου (kg), 30 kg για τους χοίρους
σε αυτή τη μελέτη (Šimkus et al., 2013). και AT
σημαίνει τη χρονική περίοδο έκθεσης (ημέρα), ED
× 365 ημέρες (Zheng et al., 2010).
HQ = ADI/RfD
όπου το RfD αντιπροσωπεύει τη δόση αναφοράς
για κατάποση (mg/(kg∙ημέρα)). Οι ημερήσιες
ανάγκες σε Cu και Zn είναι 6,01 mg Cu και 90,2 mg
για έναν χοίρο βάρους 25 - 50 kg, αντίστοιχα
(Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας, 2012). Έτσι, το RfD
ήταν 0,12 mg/(kg∙ημέρα) για τον Cu και 1,80
mg/(kg∙ημέρα) για τον Zn, που προέκυψε
διαιρώντας τις ημερήσιες ανάγκες σε βαρέα
μέταλλα με το σωματικό βάρος (50 kg).
Για ένα μείγμα ρύπων, ο δείκτης κινδύνου (HI)
είναι το άθροισμα των δεικτών κινδύνου για όλα
τα βαρέα μέταλλα σε αυτή τη μελέτη και
υπολογίζεται από την Εξ. (6):
HI = HQCu + HQZn
όπου HQCu και HQZn σημαίνουν την τιμή HQ των Cu
και Zn, αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση όλων
των δεδομένων και η γραφική παράσταση
δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με Microsoft
Excel 2013 και Origin 2017. Η σύγκριση
πραγματοποιήθηκε με One-Way ANOVA
χρησιμοποιώντας IBM SPSS Statistics 26. Το P
<0,05 κρίθηκε στατιστικά σημαντικό.

3. Αποτελέσματα
3.1. Ανάπτυξη βιομάζας

3.1.1. Ανάπτυξη βιομάζας σε SM

Το Σχ. 1 δείχνει την ανάπτυξη και τη

δραστηριότητα φθορισμού χλωροφύλλης (Fv/Fm)
του κυττάρου S. platensis σε διάφορες
επεξεργασίες για 11 ημέρες καλλιέργειας. Η
παρουσία Cu2+ και Zn2+ στο SM μείωσε σημαντικά
την ανάπτυξη βιομάζας του S. platensis (Εικ. 1Α).
Στους αντιδραστήρες ελέγχου, η συγκέντρωση
βιομάζας αυξήθηκε σταθερά στα 0,62 g/L μετά
από 11 ημέρες καλλιέργειας. Σε SM με παρουσία
Cu2+ ή Zn2+, η βιομάζα ήταν 0,03–0,28 g/L μετά
από 11 ημέρες. Αυτή η μείωση της βιομάζας
σχετίζεται άμεσα με την αύξηση της
συγκέντρωσης Cu2+ ή Zn2+. Σε SM με παρουσία 0,3
mg/L Cu2+, η αύξηση του Zn2+ από 0 σε 8,0 mg/L
μείωσε τις συγκεντρώσεις βιομάζας από 0,28 g/L
σε 0,03 g/L. Οι αυξημένες συγκεντρώσεις Cu2+ από
0,3 σε 0,6 mg/L σε σταθερά επίπεδα Zn2+ στο SM
οδήγησαν επίσης σε σημαντική μείωση της
απόδοσης βιομάζας από 0,22–0,28 g/L σε 0–0,12
g/L (P < 0,05). Συγκεκριμένα, η ανάπτυξη σε 0,6 Cu
+ 2,0 Zn αναστάλθηκε σχεδόν πλήρως. Επιπλέον,
παρατεταμένες φάσεις υστέρησης (από 0 σε 3-9
ημέρες) παρατηρήθηκαν στους αντιδραστήρες με
αυξημένο επίπεδο Zn2+ στα 0,3 mg/L Cu2+ ή
αυξημένο επίπεδο Cu2+ σε σταθερή συγκέντρωση
Zn2+. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η
ανάπτυξη του S. platensis κατεστάλη σημαντικά (Ρ
< 0,05) σε SM με την προσθήκη Cu2+ και Zn2+. Αυτό
αντικατοπτρίζεται επίσης από τον ρυθμό
αναστολής ανάπτυξης (GIR) που φαίνεται στο Σχ.
1C. Όταν οι συγκεντρώσεις Zn2+ αυξήθηκαν από
2,0 σε 8,0 mg/L κάτω από 0,3 mg/L Cu2+, το GIR
αυξήθηκε από 63,9% σε 95,9% την 11η ημέρα, το
οποίο ήταν πολύ υψηλότερο από το GIR στο 0,3
Cu2+ (55,5%). Κάτω από 0,6 mg/L Cu2+, η προσθήκη
Zn2+ ενίσχυσε επίσης το GIR από 81,4% σε 99,8%.
Εν τω μεταξύ, αυξήθηκε το GIR από 55,5% σε
99,8% και παρατηρήθηκε αυξανόμενη
συγκέντρωση Cu2+ (από 0,3 σε 0,6 mg/L) υπό
σταθερή συγκέντρωση Zn2+ (0,0 ή 2,0 mg/L) την
11η ημέρα.
Το Fv/Fm χρησιμοποιείται ευρέως ως δείκτης της
δραστηριότητας φθορισμού της χλωροφύλλης για
την αξιολόγηση της τοξικότητας των ρύπων στα
μικροφύκη και η τιμή Fv/Fm μεγαλύτερη από 0,5
σχετίζεται γενικά με μια αποδεκτή φυσιολογική
εγκλιματοποίηση των φυκών στις περιβαλλοντικές
συνθήκες (Ramanna et al., 2014). Η τιμή Fv/Fm
διέφερε όταν το S. platensis υπέστη καταπόνηση
βαρέων μετάλλων (Εικ. 1Ε). Στους αντιδραστήρες
ελέγχου, η τιμή Fv/Fm βελτιώθηκε σταθερά και
έφτασε περίπου στο 0,7 την 11η ημέρα. Σύμφωνα
με την τάση των συγκεντρώσεων βιομάζας, η τιμή
Fv/Fm μειώθηκε με τα αυξημένα επίπεδα Zn2+ από
0,0 σε 8,0 mg/L σε συγκέντρωση Cu2+ 0,3 mg/L σε
SM, κυμαινόμενη από 0,5 έως 0,7 στο τέλος της
καλλιέργειας, υποδεικνύοντας πως το s platensis
εγκλιματίστηκε σε τέτοιες συνθήκες.
Παρατηρήθηκε επίσης μια φαινομενική αρνητική
συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου Cu2+ και της τιμής
Fv/Fm σε σταθερά επίπεδα Zn2+ στο SM,
υποδεικνύοντας αύξηση των επιπέδων Cu2+ σε
σταθερό Zn2+ σε SM με μειωμένη δραστηριότητα
φθορισμού χλωροφύλλης του S. platensis.

3.1.2. Ανάπτυξη βιομάζας στο ΣΑΔΕ

Η απόδοση βιομάζας του S. platensis παρουσίασε

μια συνεχή ανοδική τάση για καλλιέργεια 10
ημερών, λαμβάνοντας 0,99 g/L σε αντιδραστήρες
ελέγχου και 0,63 – 0,79 g/L σε αντιδραστήρες με
SADE (Εικ. 1Β). Η συγκέντρωση βιομάζας σε 100%
SADE αυξήθηκε προφανώς σε 0,45 g/L την πρώτη
ημέρα, ενώ η απόδοση βιομάζας σε 25% και 50%
SADE ήταν σημαντικά χαμηλότερη από το 100%
SADE (Εικ. 1Β). Είναι πιθανό να υπήρχαν
περισσότερα άφθονα θρεπτικά συστατικά στους
αντιδραστήρες 100% SADE από το αραιωμένο
SADE, τα οποία θα μπορούσαν να καταναλωθούν
από το S. platensis για τη συσσώρευση βιομάζας.
Διαπιστώθηκε ότι υψηλότερες αναλογίες SADE
στους αντιδραστήρες οδήγησαν σε χαμηλότερο
GIR τις πρώτες 3 ημέρες, που αντιστοιχεί σε
−304,9% έως −106,2% σε αντιδραστήρες 100%
SADE, −107,1% έως −15,8% σε αντιδραστήρες
SADE 50% και −42,2 % έως −15,8% σε 25% SADE
(Εικ. 1D), υποδηλώνοντας την επίδραση
προαγωγής του SADE στην ανάπτυξη του S.
platensis στην αρχή του πειραματισμού. Μετά
από 3 ημέρες, το GIR αυξήθηκε αργά και στη
συνέχεια έτεινε να είναι σταθερό 21,8% στο 25%
SADE, 20,3% στο 50% SADE και 36,5% στο 100%
SADE. Ωστόσο, η τιμή Fv/fm σε αντιδραστήρες
100% SADE μειώθηκε σημαντικά στο 0,2 (Ρ < 0,05)
(Εικ. 1 ΣΤ), υποδηλώνοντας ότι η ανάπτυξη των
κυττάρων S. platensis ανεστάλη. Η τιμή Fv/fm
κυμαινόταν από 0,5 έως 0,6 σε αντιδραστήρες
SADE 25%, αλλά από 0,3 έως 0,5 σε
αντιδραστήρες SADE 50%, υποδηλώνοντας ότι τα
κύτταρα S. platensis δεν εγκλιματίστηκαν σε
αντιδραστήρες SADE 50%.

3.2. Συσσώρευση ενδοκυτταρικών βιοχημικών

συστατικών

3.2.1. Φωτοσυνθετικές χρωστικές

Οι συγκεντρώσεις των φωτοσυνθετικών
χρωστικών σε διαφορετικούς αντιδραστήρες
φαίνονται στο Σχ. 2. Στο ControlSM, οι
συγκεντρώσεις χλωροφύλλης α και
καροτενοειδών της βιομάζας του S. platensis
αυξήθηκαν σταδιακά κατά τη διάρκεια της
καλλιέργειας, φτάνοντας τις μέγιστες τιμές στα
3,49 mg/L και 1,51 mg/ L τη 10η ημέρα, αντίστοιχα
(Εικ. 2Α και Β). Η παραγωγή χλωροφύλλης α και
καροτενοειδούς ανεστάλη πλήρως στους 0,6 Cu +
2,0 Zn τη 10η ημέρα. Η αύξηση της συγκέντρωσης
Cu2+ από 0,3 σε 0,6 mg/L σε σταθερό Zn2+ μείωσε
τα επίπεδα χλωροφύλλης α και καροτενοειδών
κατά 32,5 – 100% και 49,3 – 100% τη 10η ημέρα,
αντίστοιχα. Όταν η συγκέντρωση Zn2+ αυξήθηκε
από 0,0 mg/L σε 8,0 mg/L στα 0,3 mg/L Cu2+, τα
μέγιστα επίπεδα χλωροφύλλης α και
καροτενοειδών αυξήθηκαν από 0,77 και 0,67 mg/L
σε 1,03 και 0,91 mg/L και στη συνέχεια μειώθηκαν
σε 0,13 και 0,16 mg/L, αντίστοιχα. Οι μέγιστες
τιμές της χλωροφύλλης α και του καροτενοειδούς
επιτεύχθηκαν σε 0,3 Cu + 4,0 Zn και 0,3 Cu + 2,0
Zn, αντίστοιχα, οι οποίες ήταν σημαντικά
χαμηλότερες από αυτές στο ControlSM (P < 0,05).
Αυτό σημαίνει ότι το Cu2+ και το Zn2+ στο SM
μπορούν να αλλάξουν τη βιοσύνθεση της
χλωροφύλλης α και του καροτενοειδούς στο S.
platensis. Πιο σημαντικό, η παρουσία των Cu2+ και
Zn2+ στο SM επιτάχυνε τον χρόνο που απαιτείται
για την επίτευξη της κορυφής των επιπέδων
χλωροφύλλης α και καροτενοειδών. Στο
ControlSM, η κορύφωση έφτασε τη 10η ημέρα. Η
αύξηση του Zn2+ από 0,0 σε 8,0 mg/L στα 0,3 mg/L
Cu2+ και η αύξηση του Cu2+ από 0,3 σε 0,6 mg/L σε
σταθερές συγκεντρώσεις Zn2+ μείωσαν και τα δύο
τον χρόνο που απαιτείται για την κορυφή των
επιπέδων χλωροφύλλης α και καροτενοειδών από
10 ημέρες σε 4 μέρες.
Όπως απεικονίζεται στα Σχ. 2Γ και Δ, οι
συγκεντρώσεις χλωροφύλλης α και
καροτενοειδών στα κύτταρα S. platensis
συσσωρεύτηκαν με το χρόνο καλλιέργειας και
έφτασαν σε μέγιστη τιμή 10,17 mg/L και 2,87
mg/L την ημέρα 10 στο ControlSADE αντίστοιχα.
Ομοίως, για το 50% SADE και το 100% SADE, η
παραγωγή χλωροφύλλης α και καροτενοειδούς
αυξήθηκε αργά και έφτασε σε μέγιστη τιμή την
ημέρα 10. Σε σύγκριση με το ControlSADE, οι
μέγιστες τιμές της χλωροφύλλης α και του
καροτενοειδούς μειώθηκαν κατά 70,7 – 77,2% και
38,8 – 55,4% σε 50% SADE και 100% SADE,
αντίστοιχα. Στους αντιδραστήρες με 25% SADE, η
μέγιστη τιμή της χλωροφύλλης α και του
καροτενοειδούς μειώθηκε κατά 70,0% και 30,3%
σε σύγκριση με το ControlSADE, αντίστοιχα. Όπως
αναφέρθηκε παραπάνω, η αύξηση της
περιεκτικότητας σε SADE μείωσε σαφώς την
παραγωγή χλωροφύλλης α και καροτενοειδούς.

3.2.2. Βιοχημική σύνθεση βιομάζας μικροφυκών

Οι βιοχημικές συνθέσεις της βιομάζας S. platensis

μπορούν να αντικατοπτρίζονται σε
περιεκτικότητα σε ακατέργαστες πρωτεΐνες και
προφίλ λιπαρών οξέων (Εικ. 3). Στο SM, η
παρουσία Cu2+ και Zn2+ μείωσε σημαντικά την
παραγωγή ακατέργαστης πρωτεΐνης στη βιομάζα
S. platensis κατά 5,0 – 41,1% (P < 0,05) (Εικ. 3Α) σε
σύγκριση με το ControlSM. Κάτω από το ίδιο Cu2+,
η αύξηση του Zn2+ από 0,0 σε 8,0 mg/L μείωσε την
παραγωγή ακατέργαστης πρωτεΐνης από 70,0% σε
43,4%. Κάτω από τον ίδιο Zn2+, η αύξηση του Cu2+
(0,3 – 0,6 mg/L) μείωσε τη σύνθεση της
ακατέργαστης πρωτεΐνης από 70,0% σε 46,9%.
Ομοίως, σε αντιδραστήρες με SADE, ανεξάρτητα
από την αναλογία αραίωσης του SADE, η
ακατέργαστη πρωτεΐνη που παρήχθει στη βιομάζα
του S. platensis μειώθηκε κατά 65,1 – 75,3% σε
σύγκριση με το ControlSADE (Εικ. 3C). Μια
υψηλότερη αναλογία αραίωσης SADE συνέβαλε
σε μια ελαφρά αύξηση 36,1% - 41,4% στα επίπεδα
ακατέργαστης πρωτεΐνης σε σύγκριση με 100%
SADE.
Τα Σχ. 3Β και Δ αποκαλύπτουν τη σύσταση
κατανομής των λιπαρών οξέων που εξάγονται από
τη βιομάζα του S. platensis, όπου τα C16-C18 ήταν
τα κύρια συστατικά. Τα προφίλ λιπαρών οξέων
των κυττάρων S. platensis σε 0,3 Cu + 8,0 Zn και
0,6 Cu + 2,0 Zn δεν ανιχνεύθηκαν λόγω της
εξαιρετικά χαμηλής βιομάζας. Στους
αντιδραστήρες SM, ο C16:0 ήταν κυρίαρχος και
ακολουθήθηκε από τους C18:0, C18:2, C18:3,
C18:1 και C16:1 (Εικ. 3Β). Τα ακόρεστα λιπαρά
οξέα (UFA) αποτελούνται από μονοακόρεστα
λιπαρά οξέα (MUFA) και πολυακόρεστα λιπαρά
οξέα (PUFA). Παρά το γεγονός ότι τα C16:0 είναι
τα κυρίαρχα λιπαρά οξέα στο SM, το μεγαλύτερο
ενδιαφέρον εστιάζεται στα πολυακόρεστα λιπαρά
οξέα (PUFA) με δύο ή περισσότερους διπλούς
δεσμούς (όπως γ-λινολενικό οξύ) λόγω του ευρέος
φάσματος εφαρμογών στα πρόσθετα τροφίμων.
(Tonietto et al., 2014). Η ποσότητα SFA και UFA
στο ControlSM ήταν 41,5% και 19,0%, αντίστοιχα,
όπου το κλάσμα PUFA ήταν περίπου διπλάσιο σε
αφθονία από το MUFA. Η παρουσία Cu2+ και Zn2+
στο SM επέδειξε αμελητέα επίδραση στην
ποσότητα MUFA και άλλαξε το κλάσμα των SFA,
PUFA και UFA. Με την αύξηση της συγκέντρωσης
Cu2+ από 0,0 σε 0,6 mg/L στην απουσία Zn2+ του
SM, η αναλογία του SFA (κυρίως C16:0) και UFA
(κυρίως C18:2 και C18:3) μειώθηκαν κατά 14,0%
και 29,3%, αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι το Cu2+
θα μπορούσε να μειώσει τον κορεσμό των C16 και
C18, κάτι που ήταν αντίθετο από το συμπέρασμα
των Li et al. (2018) ότι η αναλογία των C16:0 και
C18:0 αυξήθηκε με την αυξημένη συγκέντρωση
Cu2+ (1 – 3 mg/L) σε αναερόβια χωνευμένα λύματα
χοίρων (ADSW). Με την αύξηση των επιπέδων Zn2+
από 0,0 σε 6,0 mg/L σε SM κάτω από 0,3 mg/L
Cu2+, το κλάσμα των SFA, PUFA και UFA αυξήθηκε
προφανώς σε 0,3 Cu + 2,0 Zn με μέγιστες τιμές
50,8% SFA, 19,3 % PUFA και 22,8% UFA, και στη
συνέχεια μειώθηκε αργά. Το ποσοστό των C18:2
και C18:3 κορυφώθηκε επίσης στο 0,3 Cu + 2,0 Zn,
το οποίο αυξήθηκε κατά 30,7% και 97,1% σε
σύγκριση με το ControlSM, αντίστοιχα. Αυτό
σημαίνει ότι μια κατάλληλη συγκέντρωση Zn2+ θα
μπορούσε να μετριάσει την αρνητική επίδραση
του Cu2+ στη βιοσύνθεση συγκεκριμένων λιπαρών
οξέων στη βιομάζα S. platensis.
Σε αντιδραστήρες με SADE, η ποικιλία των
λιπαρών οξέων στη βιομάζα αυξήθηκε με τη
συνεχή αραίωση του SADE (Εικ. 3D). Σε 100%
SADE, τα κύτταρα S. platensis περιείχαν μόνο
C16:0, που αντιστοιχεί σε ποσότητα 8,1% SFA. Το
προφίλ λιπαρών οξέων σε αντιδραστήρες SADE
50% περιελάμβανε C16:0 (28,6%) και C20:3
(18,9%), ενώ C16:0 (31,9%), C18:2 (9,7%) και C18:3
(18,0%) ήταν τα κύρια λιπαρά οξέα σε
αντιδραστήρες SADE 25%. Αυτό δείχνει ότι το
MUFA εξαφανίστηκε στη βιομάζα που
καλλιεργήθηκε σε αντιδραστήρες SADE. Εν τω
μεταξύ, η ποσότητα C20:3 σε αντιδραστήρες SADE
50% βελτιώθηκε κατά 91,4% σε σύγκριση με το
ControlSADE. Αξιοσημείωτα, μια υψηλότερη
αναλογία αραίωσης συσχετίστηκε με υψηλότερα
κλάσματα SFA, UFA και PUFA, τα οποία
αυξήθηκαν σε 33,8%, 27,7% και 27,7% σε
αντιδραστήρες SADE 25%, αντίστοιχα (Εικ. 3D).
Αυτό πιθανότατα σχετίζεται με μείωση της
συνδυασμένης τοξικότητας των Cu2+ και Zn2+ λόγω
της αραίωσης του SADE.

3.3. Πρόσληψη Cu και Zn σε βιομάζα S. Platensis

Οι ικανότητες πρόσληψης του S. platensis σε

διαφορετικές συγκεντρώσεις Cu2+ και Zn2+
προσδιορίστηκαν στο τέλος της καλλιέργειας (Εικ.
4). Η πρόσληψη Cu2+ και Zn2+ στη βιομάζα S.
platensis στα 0,6 Cu + 2,0 Zn δεν ήταν ανιχνεύσιμη
λόγω της εξαιρετικά χαμηλής βιομάζας. Στο
ControlSM, οι περιεκτικότητες σε Cu και Zn ήταν
περίπου 24,3 mg/kg ξηρού βάρους και 29,7 mg/kg
ξηρού βάρους, αντίστοιχα. Κάτω από 0,3 mg/L
Cu2+ σε SM, η πρόσληψη Zn στη βιομάζα αυξήθηκε
από 87,7 σε 1031,7 mg/kg ξηρού βάρους στα 0,0 –
6,0 mg/L Zn2+ και στη συνέχεια μειώθηκε απότομα
στα 213,3 mg/kg ξηρού βάρους στα 8,0 mg/ L Zn2+
(Ρ < 0,05) (Εικ. 4Α). Στην απουσία Zn2+ στο SM, η
αύξηση του Cu2+ από 0,3 σε 0,6 mg/L διευκόλυνε
την πρόσληψη Cu στη βιομάζα από 118,0 σε 301,3
mg/kg ξηρού βάρους (Ρ < 0,05). Επιπλέον, η
αύξηση της συγκέντρωσης Zn2+ από 0,0 σε 4,0
mg/L στα 0,3 mg/L Cu2+ σε SM έδειξε αμελητέες
επιπτώσεις στην πρόσληψη περιεχομένων Cu
(99,0 έως 118,0 mg/kg ξηρού βάρους) αλλά
επιτάχυνε την πρόσληψη Cu2 σε βιομάζα σε 386,3
mg/kg ξηρού βάρους από 4,0 έως 8,0 mg/L,
υποδεικνύοντας ότι η ικανότητα του S. platensis
να προσλαμβάνει Cu2+ ενισχύθηκε παρουσία Zn2+
> 4,0 mg/L (Εικ. 4Α). Ο συντελεστής
βιοσυγκέντρωσης (BCF) είναι ένας δείκτης για την
αξιολόγηση της ικανότητας των μικροφυκών να
συσσωρεύουν βαρέα μέταλλα κατά τη διαδικασία
βιοσυγκέντρωσης. Μια παρόμοια τάση του BCF
του Cu παρατηρήθηκε επίσης όπου το BCF
παρέμεινε περίπου 330,0 έως 393,3 σε
συγκέντρωση Zn2+ 0,0 – 4,0 mg/L, αλλά αυξανόταν
συνεχώς φτάνοντας το 1287,8 σε συγκέντρωση
Zn2+ 8,0 mg/L υπό Cu2+ 0,3 mg/L (Εικ. S2). Οι
διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις Zn2+ που
δοκιμάστηκαν για S. platensis άλλαξαν επίσης την
τιμή BCF του Zn (Εικ. S2). Κάτω από 0,3 mg/L Cu2+
σε SM, οι τιμές BCF του Zn παρέμειναν 120,7 –
171,9 στα 2,0 – 6,0 mg/L Zn2+ αλλά μειώθηκαν σε
26,7 σε συγκέντρωση 8,0 mg/L Zn2+.
Σε αντιδραστήρες με SADE, υψηλότερος λόγος
αραίωσης συσχετίστηκε με χαμηλότερες
περιεκτικότητες σε Cu και Zn στη βιομάζα (Εικ.
4Β). Οι ικανότητες πρόσληψης της βιομάζας S.
platensis μειώθηκαν σημαντικά από 113,0 σε
100% SADE σε 27,4 mg/kg ξηρού βάρους σε 25%
SADE για Cu και από 1377,3 σε 373,4 mg/kg ξηρού
βάρους για Zn με συνεχή αραίωση SADE (P <
0,05).

3.4. Εκτίμηση κινδύνου

Τα μικροφύκη θα μπορούσαν να θέτουν

κινδύνους για την υγεία μέσω της μεταφοράς
βαρέων μετάλλων που σχετίζονται με τα
μικροφύκη στα ζώα και στον άνθρωπο μέσω
τροφικών αλυσίδων όταν καταναλώνονται σε
μεγάλες ποσότητες ταυτόχρονα ή σε μικρές
ποσότητες για μεγάλο χρονικό διάστημα, ακόμη
και αν οι συγκεντρώσεις των βαρέων μετάλλων
στη βιομάζα είναι χαμηλές ή κάτω από τα τοξικά
επίπεδα (Roleda et al., 2019). Έτσι, διερευνήθηκε
ο κίνδυνος χρήσης βιομάζας S. platensis με
μέταλλα ως πρόσθετο πρώτης ύλης για τους
χοίρους.
Όπως φαίνεται στα Σχ. 5Α και Γ, μια ημερήσια
κατανάλωση 0,075 kg S. platensis που συλλέγεται
από τους αντιδραστήρες 2,0 – 4,0 mg/L Zn2+ σε 0,3
mg/L Cu2+ οδήγησε σε υψηλότερο HQ για Cu2+
(0,49 – 0,97). από το Zn2+ (0,08 – 0,34), παρά το
γεγονός ότι οι τιμές ADI του Zn2+ (0,14 – 0,61
mg/(kg·ημέρα)) ήταν πολύ υψηλότερες από το
Cu2+ (0,06 – 0,12 mg/(kg·ημέρα)). Η τιμή HI ήταν το
άθροισμα των τιμών HQ για Cu και Zn, το οποίο
ήταν κάτω από 1 σε αντιδραστήρες χαμηλής
συγκέντρωσης (0,3 mg/L Cu2+ και Zn2+ ≤ 4,0 mg/L),
αλλά μεγαλύτερο από 1 στους αντιδραστήρες
υψηλής συγκέντρωσης (0,3 Cu + 6,0 Zn, 0,3 Cu +
8,0 Zn και 0,6 Cu). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι τιμές
ADI για Cu (0,016 – 0,067 mg/(kg∙ημέρα)) και Zn
(0,22 – 0,81 mg/(kg∙ημέρα)) του S. platensis που
αναπτύχθηκε σε SADE ήταν όλες εντός των
επιτρεπόμενων ορίων (0,12 mg/(kg∙ημέρα) για Cu
και 1,80 mg/(kg∙ημέρα) για Zn (Εθνικό Συμβούλιο
έρευνας, 2012)) (Εικ. 5Β). Η τιμή HI ξεπέρασε 1
στους 100% αντιδραστήρες SADE, ενώ οι τιμές HI
σε άλλους αντιδραστήρες SADE ήταν πολύ
μικρότερες από 1 (Εικ. 5D), υποδεικνύοντας ότι η
βιομάζα S. platensis που αναπτύχθηκε σε 25% και
50% SADE ήταν αποδεκτή για κατανάλωση
χοίρων. Επιπλέον, το HQCu ήταν υψηλότερο από
το HQZn τόσο στους αντιδραστήρες SM όσο και
στους αντιδραστήρες SADE (Εικ. 5C και D), αν και
οι τιμές ADI για το Cu ήταν χαμηλότερες από τον
Zn. Αυτό υποδηλώνει ότι το HQCu είναι ο κύριος
συνεισφέρων στην τιμή HI.

3. Συζήτηση

4.1. Επιδράσεις των Cu2+ και Zn2+ στην ανάπτυξη

του S. platensis
Αυτή η με=λέτη έδειξε ότι το Cu2+ (0,3 – 0,6 mg/L)
και το Zn2+ (0,0 – 8,0 mg/L) στο σύστημα SM και
SADE ανέστειλαν την παραγωγή βιομάζας S.
platensis.
Αυτό πιθανότατα σχετίζεται με τις μειωμένες
συγκεντρώσεις φωτοσυνθετικής χρωστικής και
την αυξημένη περιεκτικότητα σε βαρέα μέταλλα
στα κύτταρα μικροφυκών (Εικ. 2 και 4). Στους
αντιδραστήρες SM, η παρουσία Cu2+ και Zn2+
ανέστειλε τη βιοσύνθεση της χλωροφύλλης α και
του καροτενοειδούς (Εικ. 2Α και Β). Το
αποτέλεσμα αναστολής συνδέθηκε επίσης θετικά
με τις συγκεντρώσεις Cu2+ και Zn2+. Παρομοίως,
μειωμένα επίπεδα χλωροφύλλης α και
καροτενοειδών παρατηρήθηκαν επίσης στο SADE
με την εγγενή παρουσία Cu2+ και Zn2+ στο SADE,
όπου η μείωση μετριάστηκε με την αραίωση του
SADE (Εικ. 2C και D). Το μειωμένο επίπεδο
χλωροφύλλης α στα μικροφύκη είναι τυπικό
σημάδι δηλητηρίασης μετάλλων (de Filippis et al.,
1981). Αυτό πιθανότατα οφείλεται στην
αντικατάσταση των ατόμων μαγνησίου στον
δακτύλιο της χλωροφύλλης πορφυρίνης από Cu2+
και Zn2+ (Kowalewska et al., 1987; Zhou et al.,
2018). Οι Cu2+ και Zn2+ σε υψηλές συγκεντρώσεις
αναστέλλουν επίσης τη μεταφορά
φωτοσυνθετικών ηλεκτρονίων στην οξειδωτική
πλευρά του PS II και αδρανοποιούν ορισμένα
κέντρα αντίδρασης PS II (Yang et al., 2015),
μειώνοντας κατά συνέπεια τη φωτοσύνθεση και
αναστέλλοντας την ανάπτυξη μικροφυκών. Το
αποτέλεσμα της μείωσης της χλωροφύλλης α
λόγω Cu2+ και Zn2+ συμφωνούσε με τη μειωμένη
συγκέντρωση χλωροφύλλης στα Coelastrella sp.
κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε ADSW με
αυξημένα επίπεδα Cu2+ (0,1 – 3 mg/L) (Li et al.,
2018). Το καροτενοειδές, που δρα ως
αντιοξειδωτικό, συντίθεται γενικά σε μεγάλες
ποσότητες σε κύτταρα μικροφυκών για να
προστατεύει τα κύτταρα από οξειδωτική βλάβη
λόγω της ενισχυμένης παραγωγής ενεργών ειδών
οξυγόνου (ROS) υπό δυσμενείς συνθήκες
ανάπτυξης, όπως όταν εκτίθενται σε βαριά
μέταλλα (Foyer και Mullineaux, 1994). Σε αυτή τη
μελέτη, η παραγωγή καροτενοειδών ανεστάλη
λόγω της τοξικότητας από Cu2+ και/ή Zn2+ και
στους αντιδραστήρες SM και SADE, όπου οι
συγκεντρώσεις καροτενοειδών στους
αντιδραστήρες SM και SADE ήταν σημαντικά
χαμηλότερες από τους αντίστοιχους
αντιδραστήρες ελέγχου (P < 0,05). Παρόμοια
παρατήρηση βρέθηκε επίσης από τους Kondzior
και Butarewicz (2018) ότι ο Zn2+ σε 6,25 – 100
mg/L και Cu2+ σε 0,025 – 0,15 mg/L σε μπλε-
πράσινο μέσο (BG 11) μείωσαν και τα δύο την
περιεκτικότητα σε καροτενοειδή στα κύτταρα
Chlorella vulga.
Εκτός από το καροτενοειδές, η δισμουτάση
υπεροξειδίου (SOD) δρα επίσης ως το
αντιοξειδωτικό ένζυμο πρώτης γραμμής που
υπερασπίζεται το ROS (Saha et al., 2013). Μια
ελαφρά αύξηση (7,0%) της συγκέντρωσης
καροτενοειδών παρατηρήθηκε από την ημέρα 8
έως την ημέρα 10 σε αντιδραστήρες SADE 25%
(χαμηλότερες συγκεντρώσεις Cu2+ (περίπου 0,17
mg/L) και/ή Zn2+ (περίπου 0,45 mg/L) τόσο μεταξύ
SM όσο και SADE αντιδραστήρες) σε σύγκριση με
το ControlSADE. Αντίθετα, τη 10η ημέρα, η
δραστηριότητα του SOD μειώθηκε κατά 12,4%
στους αντιδραστήρες SADE 25%, αλλά αυξήθηκε
κατά 8,2% και 3,6% στους αντιδραστήρες SADE
50% και 100% SADE σε σύγκριση με το
ControlSADE, αντίστοιχα, (Εικ. S2). Λαμβάνοντας
υπόψη τις χαμηλότερες συνθήκες αρχικής
καλλιέργειας Cu2+ και Zn2+ σε αντιδραστήρες SADE
25% και τη συσσώρευση Cu και Zn από την
υδατική φάση στη βιομάζα, είναι πιθανό ότι το
SOD έπαιξε τον κύριο ρόλο στην ανακούφιση του
οξειδωτικού στρες από το ROS όταν η παραγωγή
καροτενοειδών ανεστάλη σε υψηλότερες
συγκεντρώσεις Cu2+ και Zn2+ (δηλαδή 50% και
100% SADE), ενώ η αύξηση της παραγωγής
καροτενοειδών σε χαμηλότερες συνθήκες Cu2+ και
Zn2+ (δηλαδή 25% SADE στο μεταγενέστερο στάδιο
της καλλιέργειας) μείωσε το οξειδωτικό στρες και
την έκφραση SOD (Gauthier et al., 2020). Ωστόσο,
καθ' όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας, οι
συγκεντρώσεις χλωροφύλλης α, καροτενοειδούς
και βιομάζας στους αντιδραστήρες SM και SADE
με Cu2+ και/ή Zn2+ μειώθηκαν σε σύγκριση με τους
αντίστοιχους αντιδραστήρες ελέγχου,
υποδηλώνοντας μειωμένη φωτοσυνθετική
δραστηριότητα των κυττάρων S. platensis (Εικ. 1Β,
Εικ. 2Γ και Δ). Αυτές οι παρατηρήσεις
υποδηλώνουν ότι η τοξικότητα των Cu2+ και Zn2+
σε όλους τους αντιδραστήρες SM και SADE είχε
δυνητικά υπερβεί τη συνολική ικανότητα
παραγωγής αντιοξειδωτικών του S. platensis σε
αυτή τη μελέτη.
Στους αντιδραστήρες SM, η αύξηση της
συγκέντρωσης Cu2+ (0,0 – 0,6 mg/L) και Zn2+ (0,0 –
6,0 mg/L) διευκόλυνε την πρόσληψη της
περιεκτικότητας σε Cu και Zn στη βιομάζα,
αντίστοιχα. Αυτό είναι σύμφωνο με τους
αντιδραστήρες SADE με Cu2+ (0,17 – 0,67 mg/L) και
Zn2+ (0,45 – 1,78 mg/L), όπου η πρόσληψη Cu και
Zn στη βιομάζα συσχετίστηκε θετικά με τις
συγκεντρώσεις Cu και Zn, αντίστοιχα. Αυτό είναι
πιθανό ότι υπήρχαν επαρκείς ενεργές θέσεις στην
επιφάνεια των κυττάρων S. platensis για να
συνδεθούν με Cu2+ και Zn2+. Όσο υψηλότερη είναι
η συγκέντρωση των εκτεθειμένων Cu2+ και Zn2+,
τόσο περισσότερο Cu2+ και Zn2+ απορροφώνται
στην επιφάνεια του κυττάρου. Επιπλέον, στους
αντιδραστήρες SM, η συγκέντρωση Zn2+ > 4,0 mg/L
προώθησε την πρόσληψη Cu στη βιομάζα,
υποδεικνύοντας τη βελτιωμένη εκλεκτικότητα για
Cu2+. Αυτό πιθανότατα σχετίζεται με την
υπεροξείδωση των λιπιδίων της μεμβράνης και τη
βελτιωμένη διαπερατότητα της μεμβράνης που
προέκυψε από την αύξηση του επιπέδου Zn2+, και
έτσι περισσότερη ουσία, όπως το Cu2+, εισήλθε
στο κύτταρο και εσωτερικεύτηκε. Παρόμοια
αποτελέσματα αναφέρθηκαν από τους Flouty και
Estephane (2012) ότι τα υψηλά επίπεδα Pb2+ (>10
− 6 M) προώθησαν τη βιοσυσσώρευση Cu2+ από
τα κύτταρα Chlamydomonas reinhardtii, ενώ τα
χαμηλά επίπεδα Pb2+ (≤ 5 × 10 − 7 M) δεν είχαν
καμία επίδραση στη βιοσυσσώρευση Cu2+. Αυτό
σχετίζεται κυρίως με την παρουσία δύο θέσεων
πρόσληψης Cu, δηλαδή μιας θέσης υψηλής
συγγένειας ανεξάρτητης από Pb και μιας θέσης
χαμηλής συγγένειας που εξαρτάται από το Pb
(Flouty and Estephane, 2012). Ωστόσο, Zn2+ ≥ 8,0
mg/L σε 0,3 mg/L Cu2+ ανέστειλε την πρόσληψη
Zn, είναι πιθανό ότι η δομή των κυττάρων S.
platensis είχε καταστραφεί.
Οι Cu2+ και Zn2+ που συσσωρεύτηκαν στα κύτταρα
βρέθηκε ότι συσχετίζονται αρνητικά με τη
βιοσύνθεση της πρωτεΐνης (Εικ. 3Α και Γ). Η
παραγωγή ακατέργαστης πρωτεΐνης μειώθηκε με
την αύξηση των συγκεντρώσεων Cu2+ και Zn2+
στους αντιδραστήρες SM (Εικ. 3Α). Η αραίωση του
SADE αύξησε το επίπεδο ακατέργαστης
πρωτεΐνης, σε σύγκριση με το 100% SADE (Εικ.
3Β). Αυτό υποδηλώνει ότι η παραγωγή πρωτεΐνης
διακυβεύτηκε υπό την παρουσία των επιπέδων
Cu2+ και Zn2+ σε αυτή τη μελέτη. Αυτό πιθανότατα
οφείλεται στο ότι τα Cu2+ και Zn2+ ανταγωνίζονται
με άλλα μέταλλα για τις θέσεις δέσμευσης στις
πρωτεΐνες μετά τη σειρά Irving-Williams (Mg2+ και
Ca2+ (ασθενέστερη δέσμευση) < Mn2+ < Fe2+ < Co2+
< Ni2+ < Cu2+ > Zn2+) (Waldron και Robinson, 2009),
που οδηγεί σε δομική καταστροφή, διαταραχή της
πρωτεϊνικής λειτουργίας και, σε ορισμένες
περιπτώσεις, αποικοδόμηση πρωτεΐνης (Huertas
et al., 2014). Προηγούμενες μελέτες έδειξαν
επίσης ότι στην παραγωγή πρωτεϊνών στο
Coelastrella sp τα κύτταρα μειώθηκαν στο ADSW
με την αυξημένη περιεκτικότητα σε Cu2+ (Li et al.,
2018). Η αλλαγή των λιπαρών οξέων που
προκαλείται από Cu2+ και Zn2+ πιθανότατα άσκησε
επίδραση στις κυτταρικές πλασματικές μεμβράνες
(Wu et al., 2006), επηρεάζοντας στη συνέχεια την
ανάπτυξη του S. platensis. Ο βαθμός κορεσμού
των λιπαρών οξέων σχετίζεται με τη ρευστότητα
των μεμβρανών και μπορεί να επηρεάσει την
απόκριση των μικροφυκών στους ρύπους (Rocha
et al., 2021), δηλαδή, η μείωση των PUFA μπορεί
να μειώσει τη ρευστότητα των φωτοσυνθετικών
μεμβρανών (Wacker et al., 2016) για να οδηγήσει
σε μεταβολή του ρυθμού φωτοσύνθεσης
(Spijkerman and Wacker, 2011). Το κλάσμα των
PUFA μειώθηκε κατά 11,4 –3 9,5% σε 25%, 50%
και 100% SADE και κατά 4,8 – 27,2% σε 0,3 Cu, 0,3
Cu + 6,0 Zn και 0,6 Cu σε σύγκριση με τον
αντίστοιχο μάρτυρά τους (Εικ. 3B και D ). Η
ανάπτυξη του S. platensis που παρατηρήθηκε
στους αναφερθέντες αντιδραστήρες ήταν επίσης
χαμηλότερη από τον αντίστοιχο μάρτυρά τους
(Εικ. 1Α και Β). Μια μείωση της ποσότητας C18:3
(ω3) οδήγησε σε χαμηλότερη ενσωμάτωση της
πρωτεΐνης D1, η οποία είναι υπεύθυνη για τη
διατήρηση της δραστηριότητας του PS II
(Anderson et al., 1997). Το C18:3 (ω3)
εξαφανίστηκε στο 50%, 100% SADE και μειώθηκε
κατά 20,6% στο 0,6 Cu σε σύγκριση με το
ControlSM. Παρά την αύξηση του C18:3 σε 25%
SADE, 0,3 Cu + 2,0 Zn, 0,3 Cu + 4,0 Zn και 0,3 Cu +
6,0 Zn, αυτό δεν ήταν αρκετό για να αποφευχθεί η
βλάβη των Cu2+ και Zn2+ στους
φωτοπροστατευτικούς μηχανισμούς. Ως εκ
τούτου, η μείωση των PUFA, που προκαλείται από
Cu2+ και Zn2+ στους αντιδραστήρες SM και SADE,
εξασθένησε επίσης τη φωτοσυνθετική απόδοση
και εμπόδισε την ανάπτυξη μικροφυκών του S.
platensis.
Επιπλέον, η ανάπτυξη του S. platensis που
παρατηρήθηκε την ημέρα 11 σε 0,6 Cu (GIR:
81,4%, και απόδοση βιομάζας: 0,12 g/L) ήταν
συγκρίσιμη με εκείνη που επιτεύχθηκε σε 0,3 Cu +
6,0 Zn (GIR: 85,1% και απόδοση βιομάζας : 0,09
g/L). Τα επίπεδα χλωροφύλλης (0,67 mg/L σε 0,3
Cu + 6,0 Zn έναντι 0,52 mg/L σε 0,6 Cu) και
ακατέργαστης πρωτεΐνης (58,4% L σε 0,3 Cu + 6,0
Zn έναντι 60,7% 0,6 Cu) ήταν επίσης συγκρίσιμα
μεταξύ αυτών των δύο αντιδραστήρες, που
υποδηλώνουν ότι το S. platensis υπέστη
συγκρίσιμη τοξικότητα βαρέων μετάλλων όταν
εκτέθηκε σε 0,3 Cu + 6,0 Zn και 0,6 Cu. Αυτό
δείχνει ότι το S. platensis ήταν πιο ευαίσθητο στο
Cu2+ από το Zn2+. Γενικά, οι αλλαγές των
μεταβολιτών, όπως οι φωτοσυνθετικές χρωστικές,
οι πρωτεΐνες και τα λιπαρά οξέα στα κύτταρα,
μπορούν να θεωρηθούν ως προσπάθεια των
μικροφυκών να διατηρήσουν τους ρυθμούς
ανάπτυξής τους ή να αυξήσουν τις πιθανότητές
τους να επιβιώσουν κάτω από αντιξοότητες (Li et
al., 2018; Rocha et al., 2021· Zhou et al., 2018).

4.2. Σύγκριση προτύπου ανάπτυξης του S.

platensis σε διαφορετικά υποστρώματα

Σε αυτή τη μελέτη, η ανάπτυξη του S. platensis

διέφερε μεταξύ των αντιδραστήρων SADE και των
αντιδραστήρων SM με συγκρίσιμες συγκεντρώσεις
Cu2+ και Zn2+ (δηλαδή 100% SADE έναντι 0,6 Cu +
2,0 Zn και 50% SADE έναντι 0,3 Cu ή 0,3 Cu + 2,0
Zn). . Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, η
συγκέντρωση βιομάζας του S. platensis σε 100%
SADE (0,63 g/L) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από
0,6 Cu + 2,0 Zn που αναστέλλεται πλήρως από τα
βαρέα μέταλλα (P < 0,05). Παρόμοιο φαινόμενο
εμφανίστηκε μεταξύ 50% SADE και 0,3 Cu ή 0,3 Cu
+ 2,0 Zn. Αυτό είναι πιθανό ότι τα μικροφύκη
προτιμούν να χρησιμοποιούν το NH4+ - N στο SADE
παρά το νιτρικό άζωτο στο SM ως πηγή αζώτου
για τη συσσώρευση βιομάζας (Cai et al., 2013).
Παρά τα διαφορετικά πρότυπα παραγωγής
βιομάζας μεταξύ των αντιδραστήρων SADE και
SM, παρόμοιες τάσεις Fv/Fm παρατηρήθηκαν στις
δύο ομάδες αντιδραστήρων: (1) 100% SADE και
0,6 Cu + 2,0 Zn, (2) 50% SADE και 0,3 Cu ή 0,3 Cu +
2,0 Zn, υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα S. platensis
υπέφεραν παρόμοια από συνδυασμένη
τοξικότητα Cu2+ και Zn2+ και στους δύο τύπους
αντιδραστήρων. Οι συγκεντρώσεις χλωροφύλλης-
α και καροτενοειδών στους αντιδραστήρες SADE
ήταν 73,2% - 100% και 62,1% - 100% μεγαλύτερες
από τους αντίστοιχους αντιδραστήρες SM με
συγκρίσιμα επίπεδα Cu2+ και Zn2+, αντίστοιχα. Τα
επίπεδα χλωροφύλλης α και καροτενοειδών
συσχετίστηκαν με τη συγκέντρωση βιομάζας. Οι
αποδόσεις βιομάζας του S. platensis στο SADE
ήταν υψηλότερες από τους αντιδραστήρες SM με
συγκρίσιμα επίπεδα Cu2+ και Zn2+, οδηγώντας σε
βελτιωμένες συγκεντρώσεις χρωστικών. Το SADE
είναι μια σύνθετη μήτρα με ορισμένες ουσίες
όπως τα αντιβιοτικά τετρακυκλίνης, τα οποία
μπορεί να προάγουν τη σύνθεση χρωστικών (Tong
et al., 2020; Zhou et al., 2021). Εξάλλου, η
περιεκτικότητα σε στοιχείο Ν στο SADE είναι πολύ
χαμηλότερη από αυτή στους αντιδραστήρες SM
(2,50 g/L). Η N ασιτία διέγειρε τη διαδικασία
λιπόλυσης για την παραγωγή ακετυλο-CoA, το
οποίο ήταν πρόδρομος για τη σύνθεση
καροτενοειδών (Kand and Nagarajan, 2013). Το
επίπεδο ακατέργαστης πρωτεΐνης σε
αντιδραστήρες SADE 50% και 100% ήταν 61,1% -
64,9% χαμηλότερο από τους αντίστοιχους
αντιδραστήρες SM με συγκρίσιμα επίπεδα Cu2+
και Zn2+. Το προφίλ λιπαρών οξέων 0,6 Cu + 2,0 Zn
δεν αναλύθηκε λόγω της χαμηλής βιομάζας και
δεν δόθηκε σύγκριση μεταξύ SFA και UFA μεταξύ
100% SADE και 0,6 Cu + 2,0 Zn σε αυτή τη μελέτη.
Η αναλογία των SFA και UFA σε αντιδραστήρες
SADE 50% ήταν 40,9% και 17,1% χαμηλότερη από
αυτή σε 0,3 Cu + 2,0 Zn, αντίστοιχα. Το N και το P
είναι οι κύριες ουσίες για τη βιοσύνθεση των
πρωτεϊνών και των λιπαρών οξέων. Η ανεπάρκεια
N και P στο SADE μπορεί να προκαλέσει την
αλλαγή των μεταβολικών οδών του S. platensis
και η πρωτεΐνη μπορεί να μετατραπεί σε άλλα
βιοχημικά προϊόντα (Kusmayadi et al., 2022).
Επιπλέον, διαφορετικές πηγές αζώτου μπορεί να
είναι ένας άλλος λόγος για την παραγωγή
λιπαρών οξέων. Η ποσότητα C18:3 σε 0,3 Cu + 2,0
Zn (8,8%) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από 50%
SADE (0%). Οι Ronda et al. (2014) ανέφεραν
επίσης ότι το NO3 - N είναι το πιο κατάλληλο για
την παραγωγή γ - λινολενικού οξέος (C18:3) του S.
platensis από το NH4+ - N. Επιπλέον, διαπιστώθηκε
ότι λιγότερη περιεκτικότητα σε Cu και
περισσότερες περιεκτικότητες Zn συσσωρεύτηκαν
σε βιομάζα 50% που καλλιεργήθηκε σε SADE από
ότι σε 0,3 Cu και 0,3 Cu + 2,0 Zn. Αν και οι τιμές
ADI ήταν και οι δύο εντός του επιτρεπόμενου
εύρους, οι τιμές HI στο 0,3 Cu και 0,3 Cu + 2,0 Zn
ξεπέρασαν κατά πολύ το 50% SADE. Μέσω
πειραματικής εφαρμογής και χημικής ή
βιολογικής ανάλυσης, διαπιστώθηκε ότι η
ανάπτυξη και η βιοχημική σύνθεση του S.
platensis που αναπτύχθηκε σε SADE
διαφοροποιήθηκε με SM. Πιθανότατα
επηρεάζεται από τη σύνθεση του μέσου
καλλιέργειας (de Sousa Oliveira et al., 2021).
Λαμβάνοντας υπόψη την πιθανή διαφορά μεταξύ
SM και SADE με συγκρίσιμα επίπεδα Cu2+ και Zn2+,
η μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί
περισσότερο στην εφαρμογή στην ADE. Επιπλέον,
προηγούμενη μελέτη εντόπισε ότι η
βιοπροσρόφηση και η βιοσυσσώρευση είναι οι
μηχανισμοί απομάκρυνσης βαρέων μετάλλων από
το S. platensis (Arunakumara et al., 2008; Liliana et
al., 2021; Nikokherad et al., 2022), όπου
βρίσκονται τα βαρέα μέταλλα εσωτερικεύεται στα
κύτταρα του S. platensis μέσω βιοσυσσώρευσης.
Αυτή η μελέτη στοχεύει να αξιολογήσει τη
σκοπιμότητα χρήσης βιομάζας S. platensis που
καλλιεργείται υπό έκθεση σε Cu2+ - Zn2+ ως
πρόσθετα ζωοτροφών για χοίρους, τους
λεπτομερείς μηχανισμούς και τη συμβολή της
βιοπροσρόφησης και της βιοσυσσώρευσης για τις
συγκεντρώσεις Cu και Zn που δεν έχει εντοπιστεί,
και απαιτεί μελλοντικές έρευνες.

4.3. Επίπτωση για το S. platensis στη θεραπεία της

ADE
Τα αποτελέσματα, μας έδειξαν την πολλά
υποσχόμενη δυνατότητα χρήσης της ADE ως
οικονομικής επιλογής για την καλλιέργεια και τη
συγκομιδή κυττάρων S. platensis ως πρώτη ύλη
για την κατανάλωση χοίρων. Η οικονομική
βιωσιμότητα αυτού του συστήματος βασίζεται
επίσης στο ότι το S. platensis έχει αποδειχθεί ως
αποτελεσματικό συμπλήρωμα σε τακτικές
ζωοτροφές για τη βελτίωση της ανοσολογικής
απόκρισης των ζώων και την ενίσχυση της
ποιότητας του κρέατος παρέχοντας πρωτεΐνες και
απαραίτητα λιπαρά οξέα (Dineshbabu et al. ,
2019· Zhang et al., 2019). Με βάση τη διατροφική
εκτίμηση, το S. platensis που καλλιεργείται σε
SADE μπορεί να παρέχει μια ποικιλία θρεπτικών
συστατικών που χρειάζονται για τους χοίρους και
η ακατέργαστη πρωτεΐνη (~ 24%) ήταν ισοδύναμη
με τις παραδοσιακές πηγές φυτικής πρωτεΐνης,
όπως τα μπιζέλια (~ 22%) και οι αποξηραμένοι
σπόροι απόσταξης με διαλυτά (~ 27%)
(Moheimani et al., 2018). Τα επίπεδα PUFA,
ιδιαίτερα C18:2 (9,7%) και C18:3 (18,0%) σε
βιομάζα 25% που καλλιεργήθηκε σε SADE ήταν
συγκρίσιμα με αυτά που καλλιεργήθηκαν σε
χημικά, παρέχοντας έτσι στους χοίρους άφθονη
PUFA. Ο κίνδυνος που σχετίζεται με τη χρήση της
βιομάζας με συσσώρευση βαρέων μετάλλων
αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Οι τιμές ADI του
Cu και του Zn στη βιομάζα S. platensis που
αναπτύχθηκε σε συστήματα SADE ήταν όλες κάτω
από τα όρια και οι τιμές HQ για Cu και Zn ήταν
επίσης μικρότερες από 1 (Εικ. 5B και D). Οι τιμές
HI του αραιωμένου SADE (50% ή 25% αραίωση)
ήταν επίσης κάτω από 1, αλλά η τιμή HI στο 100%
SADE ήταν ελαφρώς πάνω από 1, υποδηλώνοντας
ότι η βιομάζα από αραιωμένο SADE ήταν
αποδεκτή για τους χοίρους ως ζωοτροφές. Αυτό
πιθανότατα σχετίζεται με το υψηλό Cu2+ (0,67
mg/L) και Zn2+ (1,78 mg/L) στο 100% SADE, όπου
μια σταθερά υψηλότερη τιμή HI παρατηρήθηκε σε
αντιδραστήρες SM με Cu2+ ≥ 0,3 και Zn2+ > 4,0
mg/L. Έτσι, συγκεντρώσεις Cu2+ < 0,3 mg/L και Zn2+
< 4,0 mg/L συνιστώνται για την εφαρμογή ADE,
όπου οι κατάλληλες αραιώσεις μπορεί να είναι
απαραίτητες.
Με βάση τα αποτελέσματα των εργαστηριακών
δοκιμών μας, μια συγκρίσιμη ποσότητα βιομάζας
μπορούσε να παρατηρηθεί όταν το S. platensis
αναπτύχθηκε σε 25% SADE (0,78 g/L) και
ControlSADE (0,88 g/L) (Εικ. 1Β). Έτσι, η ανάπτυξη
μικροφυκών σε αραιωμένο SADE απέδωσε
συγκρίσιμη βιομάζα με χαμηλότερη χημική χρήση
και οικονομική εισροή σε σύγκριση με το
ControlSADE. Από την άλλη πλευρά, η καλλιέργεια
σε SADE επιτρέπει τη μείωση του κόστους
συγκομιδής λόγω της αυτόματης κροκίδωσης της
βιομάζας. Το δυναμικό ζήτα των κυττάρων S.
platensis μειώθηκε κατά 14,2 – 71,3% στους
αραιωμένους αντιδραστήρες SADE και αυξήθηκε
κατά 14,1% στο 100% SADE σε σύγκριση με το
ControlSADE (Εικ. S3). Τα σωματίδια με
χαμηλότερες τιμές δυναμικού ζήτα έδειξαν
υψηλότερη τάση για προσκόλληση και
συσσωμάτωση (Novoa et al., 2020). Επομένως, η
αυτόματη κροκίδωση των κυττάρων S. platensis
είναι δυνητικά ευκολότερη σε 25% SADE από
100% SADE και ControlSADE λόγω των
χαμηλότερων τιμών δυναμικού ζήτα που
φαίνονται στο Σχήμα S3, καθιστώντας εφικτή τη
μείωση του κόστους συλλογής του S. platensis
βιομάζας. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι
αντιδραστήρες SADE 25% καθιστούν το μειωμένο
κόστος παραγωγής και συγκομιδής βιομάζας
τεχνικά βιώσιμο.
Μια έννοια «κυκλικής οικονομίας» στην ADE
βασισμένη στην προτεινόμενη τεχνολογία
μικροφυκών καθιερώθηκε στο Σχ. 6, βασιζόμενη
στην ικανότητα του S. platensis για ανάκτηση
θρεπτικών ουσιών και αφαίρεση βαρέων
μετάλλων σε ADE και παραγωγή βιομάζας που
χρησιμοποιείται για την κτηνοτροφία. Στη μελέτη
μας, το S. platensis αφομοίωσε 56,2 – 82,9% NH4+ -
N από αντιδραστήρες SADE (Πίνακας 3) για
παραγωγή βιομάζας μαζί με την πρόσληψη
βαρέων μετάλλων (27,4 – 113,0 mg/kg για Cu2+ και
377,4 – 1373,3 mg/kg για Zn2+) (Εικ. 4Β). Αυτό
είναι σύμφωνο με την αποτελεσματικότητα
αφαίρεσης του NH4+ - N (περίπου 38 – 93%) στο
ADE που αναφέρθηκε σε προηγούμενες
δημοσιεύσεις (Hasan et al., 2021; Li et al., 2021; Li
et al., 2018) . Τα υπολείμματα Cu2+ και Zn2+ ήταν
κάτω από 0,11 και 0,04 mg/L σε επεξεργασμένη
ADE, αντίστοιχα (Πίνακας 3), η οποία ήταν
κατάλληλη για άρδευση (World Health
Organization, 2006). Το συσσωρευμένο Cu και Zn
στη βιομάζα (Εικ. 4) υποδεικνύει ότι τα κύτταρα S.
platensis μπορούν να είναι ένας αποτελεσματικός
βιο-προσροφητής, τα βαρέα μέταλλα που
μεταφέρουν δακτύλιους σχηματίζουν υδατικά
διαλύματα στην επιφάνεια και το εσωτερικό των
κυττάρων (Chan et al., 2014). Αυτά υποδηλώνουν
ότι η καλλιέργεια του S. platensis σε ADE μπορεί
να είναι μια πιθανή στρατηγική για την
απομάκρυνση της αμμωνίας και των βαρέων
μετάλλων από την ADE και την ελαχιστοποίηση
των ρύπων που σχετίζονται με την απόρριψη ADE
στο περιβάλλον. Το επεξεργασμένο ADE μπορεί
επίσης να ανακυκλωθεί για καθαρισμό
χοιροτροφείων ή συμπλήρωμα νερού για
αραίωση ADE και καλλιέργεια μικροφυκών για να
εκτονωθεί η πίεση στο νερό και να
πραγματοποιηθεί η κυκλοφορία του νερού (Εικ.
6). Επιπλέον, αυτή η μελέτη εφάρμοσε καθαρά
είδη S. platensis με αποστειρωμένα εργαστηριακά
περιβάλλοντα καλλιέργειας (δηλαδή μέσο
καλλιέργειας, αποστειρωμένα υλικά ADE και
κωνικές φιάλες) με αυστηρό ασηπτικό χειρισμό
για την πρόληψη μικροβιακών μολύνσεων κατά
την καλλιέργεια. Σε εγκαταστάσεις μεγαλύτερης
κλίμακας, ενδέχεται να προκύψουν πιθανές
μικροβιακές μολύνσεις κατά τη διάρκεια της
καλλιέργειας, η επίπτωση των οποίων απαιτεί
μελλοντικές έρευνες.

4. Συμπέρασμα

Αυτή η μελέτη διερεύνησε τις φυσιολογικές και

βιοχημικές ιδιότητες του S. platensis που
καλλιεργείται σε συνυπάρχοντα Cu2+ και Zn2+ των
αντιδραστήρων SM και SADE. Αυτό οδήγησε στα
ακόλουθα ευρήματα:
• Η παρουσία Cu2+ και Zn2+ σε SM και SADE είχε ως
αποτέλεσμα τη μείωση της συγκέντρωσης
βιομάζας, χλωροφύλλης α και καροτενοειδών και
παραγωγή πρωτεϊνών και λιπαρών οξέων στη
βιομάζα. Η αναλογία αναγωγής αυτών των
ενώσεων συσχετίστηκε θετικά με τις
συγκεντρώσεις Cu2+ και Zn2+.
• Το S. platensis εμφάνισε την ικανότητα
ανάκτησης θρεπτικών συστατικών (56,2 – 82,9%
NH4+ - N)και βαρέων μετάλλων removalinADE.
mg/kg σε SM και 373,4 – 1377,3 mg/kg σε SADE
για Zn, αντίστοιχα.
• Η χρήση ADE για την καλλιέργεια του S. platensis
και η συλλογή της βιομάζας ως πρόσθετη
τροφοδοσία είναι πολλά υποσχόμενη με
οικονομική σκοπιμότητα (και περιορισμένο
περιβαλλοντικό αποτύπωμα), αν και η κατάλληλη
αραίωση του ADE σε Cu < 0,3 mg/L και Zn < 2,0
είναι απαραίτητη.