Neerslaan Eiwitten + Iso-elektrisch focusseren

DOEL:
-Het begrijpen hoe we eiwitten in oplossing neerslaan

=> meer specifiek het neerslaan van eiwitten op basis van het iso-elektrische punt

-Het begrijpen van Iso-elektrisch focusseren

-Een praktijkvoorbeeld van Iso-elektrisch focusseren volgen

Op einde van deze tekst staan een aantal vragen, deze peilen of bovenstaande doelstellingen
zijn bereikt. De taak omvat het oplossen van de vragen mbv onderstaande tekst en links naar
video’s.

PRINCIPES:
Eiwitprecipitatie wordt veel gebruikt bij de stroomafwaartse verwerking van biologische
producten om eiwitten te concentreren en te zuiveren van verschillende verontreinigingen.
Het onderliggende mechanisme van precipitatie is om het solvatatiepotentieel van het
oplosmiddel te veranderen, meer specifiek door de oplosbaarheid van de opgeloste stof te
verlagen door toevoeging van een reagens.

Algemene principe oplosbaarheid van een eiwit:

De oplosbaarheid van eiwitten in waterige buffers hangt af van de verdeling van hydrofiele
en hydrofobe aminozuurresiduen op het oppervlak van het eiwit. Hydrofobe residuen
komen voornamelijk voor in de bolvormige eiwitkern, maar sommige komen voor in plekken
op het oppervlak. Eiwitten met een hoog hydrofoob aminozuurgehalte aan het oppervlak
hebben een lage oplosbaarheid in een waterig oplosmiddel (meer details in figuur 1).
Geladen en polaire oppervlakteresiduen interageren met ionische groepen in het
oplosmiddel en verhogen de oplosbaarheid van een eiwit. Kennis van de
aminozuursamenstelling van een eiwit zal helpen bij het bepalen van een ideaal
precipitatieoplosmiddel en methoden.

1
Hoe slaan we een eiwit in oplossing in een waterige buffer neer:

Wat betekent of iets in oplossing is?

Een oplossing is een homogeen mengsel van twee of meer moleculair verdeelde stoffen,
waarbij een van de stoffen - het oplosmiddel - in veel grotere hoeveelheden aanwezig is dan
de andere - de opgeloste stoffen.

Meer specifiek (een eiwit in oplossing):

Dus een eiwit in oplossing in een waterige buffer = het eiwit met een mantel van water
moleculen errond.

-Eiwitten in aggregatie verliezen hun interactie met elkaar omdat water moleculen
interageren met geladen oppervlakteresiduen en hydrofiele aminozuren, zo ontstaat een
watermantel1 aan het eiwit oppervlak.

1
watermantel = meer dichte concentratie van water moleculen t.o.v. van de rest van de
vloeistof

2
Wat betekent of iets neerslaan?

Neerslagvorming:

Een stof niet oplosbaar in water en met een hogere dichtheid, kunnen we neerslaan.

Meer specifiek (een eiwit neerslaan):

Naarmate er meer hydrofobe aminozuurresiduen aan het oppervlakte van het eiwit zijn
interageren eiwitten liever met de andere hydrofobe aminozuurresiduen. Je krijgt hierdoor
aggregatie van eiwitten.

Stap1 = een nucleatiefase , waar submicroscopisch kleine eiwitaggregaten of deeltjes worden

gegenereerd. Groei door toevoeging van individuele eiwitmoleculen.

Stap2= Eiwit aggregaties botsen met elkaar en kleven aan elkaar => en vormen zo nog grotere
clusters => die uiteindelijk kunnen uitvlokken.

Deze stappen gebeuren niet instant en hebben tijd nodig.

3
 DUS HOE SLAAN WE EEN EIWIT NEER:

1) De watermantel rond het eiwit moet worden verminderd. Zodat hydrofobe residuen aan het
eiwit oppervlak met elkaar kunnen interageren. Hierdoor ontstaan grotere complexen die kunnen
uitvlokken.

2) Dit doen we door reagentia toe te voegen die ervoor zorgen dat geladen residuen aan het
eiwit oppervlak geneutraliseerd worden. Het zijn deze geladen aminozuren die de water
moleculen aantrekken en voor de watermantel rond het eiwit zorgt.

Methodes om eiwitten neer te slaan:

Er wordt een precipitatiemiddel toegevoegd, met als doel de oplosbaarheid van de eiwitten
te verlagen.

Uitzouten:

Uitzouten is de meest gebruikte methode om een eiwit neer te slaan. Toevoeging van een
neutraal zout2 comprimeert de watermantel en verhoogt de eiwit-eiwitinteracties. Naarmate
de zoutconcentratie van een oplossing wordt verhoogd, interageren de ladingen op het
oppervlak van het eiwit met het zout en dus niet meer met water moleculen. Hierdoor
ontstaan meer hydrofobe plekken op het eiwitoppervlak en het eiwit wordt minder
oplosbaar in water en heeft grotere affiniteit met andere hydrofobe plekken van andere
eiwitten. Als er eiwit-eiwit aggregaties ontstaan kunnen deze neerslaan.

Iso-elektrische neerslag:

Wat is het iso-elektrisch punt (pI): het iso-elektrisch punt is de pH van een oplossing waarbij
de netto primaire lading van een eiwit nul wordt.

Een eiwit bevat verschillende aminozuur residuen, sommige zijn basisch andere zijn zuur. Elk
heeft een zeker pKa waarde, zijnde de evenwichtsconstante voor de dissociatie (splitsing)
van een zuur-basereactie. Zie voorbeeld figuur 3, voor de 2 zure aminozuren asparstaat en
glutamaat, die bij neutrale pH geladen zijn en bij zure pH niet geladen. Het pI wordt dus
bepaald door de pKa van de verschillende aminozuur residuen aanwezig.

Bij een pH van de oplossing die boven de pI ligt, is het oppervlak van het eiwit overwegend
negatief geladen en daarom zullen gelijk geladen moleculen (bijvoorbeeld hetzelfde eiwit)
afstotende krachten vertonen. Evenzo is bij een pH van de oplossing die onder de pI ligt, het

2
een zout dat bij ontbinding in water een neutrale oplossing vormt (met een pH-waarde van 7).

4
oppervlak van het eiwit overwegend positief geladen en treedt via hetzelfde principe
afstoting op.

Bij de een pH gelijk aan de pI heffen de negatieve en positieve ladingen zich echter op
(evenveel + als -), zo worden de afstotende elektrostatische krachten verminderd. Ook het
aantrekken van een watermantel is het minst optimaal. Bij dit punt kunnen de
aantrekkingskrachten (van de hydrofobe interacties) tussen dezelfde eiwitten overheersen.
Dit resulteert in aggregatie van de eitwitten en er zal een neerslag ontstaan.

Iso-elektrische puntprecipitatie is een onomkeerbare denaturatie. Om deze reden wordt iso-

elektrische puntprecipitatie meestal gebruikt om verontreinigende eiwitten neer te slaan,
terwijl het doeleiwit in oplossing blijft. We kunnen de pH zo kiezen dat dat deze gelijk is aan
de pI van het verontreinigend eiwit en dus iso-elektrische neerslaat, terwijl de netto lading
van de andere eiwitten in het mengsel bij deze pH overwegend negatief of positief zijn en
dus in oplossing blijven

Iso-elektrisch focusseren (IEF):

Basis = bij IEF worden eiwitten gescheiden volgend een pH gradiënt tot hun pI waar ze
neerslaan.

Bekijk (theorie): https://www.youtube.com/watch?

v=qtOCQQrPEv8&t=3s

In de praktijk worden IPG strips gebruikt: Dit zijn strips waarin we eiwitten kunnen op
aanbrengen. De strip bevat een pH gradiënt afhankelijk van het scheidingsbereik en resolutie
dat we willen (bijvoorbeeld een gradiënt van pH 4 tot 7; of een gradiënt van pH 3 tot 8).

Bekijk (praktijk)

5
https://www.youtube.com/watch?v=3wFh0z7so8w&t=299s

Dit is een filmpje van iets meer dan 17 min omtrent 2D gel analyse. Dit is een techniek om
een eiwit mengsel te scheiden in 2 dimensies. In de eerste dimensie wordt IEF toegepast, om
de eiwitten te scheiden in de eerste dimensie. Dus je moet het filmpje voor deze taak enkel
bekijken tot ongeveer minuut 6.

6
Vragen:
1) Wat is de pI van Alfa-S1-caseine van een rund? Bepaal via de
https://web.expasy.org/compute_pi/

De eiwit sequentie is:

MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSESTEDQ
AMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERL
HSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNP
IGSENSEKTTMPLW

Om de pI te bepalen ga naar https://web.expasy.org/compute_pi/ en plak de lettercode

van het eiwit in het open veld.

de pI van Alfa-S1-caseine van een rund is: Theoretical pI/Mw: 4.98 / 24528.94

2) Vervallen melk smaakt zuur. Dit komt omdat zuurvormende bacteriën groeien in
de melk. Vervallen melk vlokt ook uit. Kan je zeggen bij welke pH dit ongeveer zal
gebeuren, als ik erbij vertel dat caseïne (zie pI vraag 1) een zeer hoge concentratie
heeft in melk.

pH van 5

3) Waarom vlokt caseïne uit bij deze pH (van vraag 2). Leg uit in maximaal 6 lijnen.

Beneden de pH van 5 is de afstoting van caisine zodanig gering dat de deeltjes gaan
samenklonteren. Daarbij vormen ook losse vlokkige structuren die er de oorzaak van zijn dat
de eerst er dunvloeibare melk is en daarna dikvloeibaar word.

4) Als ik 10 g van een eiwitmengsel oplost in 100mL water krijg ik een homogeen
mengsel (= is mengsel A). Als ik 29,5g ammonium sulfaat in 100mL water breng, krijg
ik een homogene 2M oplossing. Zowel het eiwit en het zout zijn dus oplosbaar in
water.
Als ik 29,5 ammonium sulfaat in mengsel A doe, vlokken verschillende eiwitten uit.
Het eiwit is niet meer oplosbaar. Welk principe speelt hier? Verklaar (in maximaal 5
lijnen).

Iso-elektrische neerslag.
het iso-elektrisch punt is de pH van een oplossing waarbij de netto primaire lading
van een eiwit nul wordt. Het pI wordt dus bepaald door de pKa van de
verschillende aminozuur residuen aanwezig. Bij een pH van de oplossing die boven
de pl ligt, zal het oppervlak van het eiwit overwegend negatief geladen zijn en dit
zal ervoor zorgen dat gelijk geladen moleculen afstonde krachten vertonen. Is bij
een pH van de oplossing die onder de pl ligt, zal het oppervlak van het eiwit
overwegend positeif zijn en dit zorgt onder het zelgde pricincpe ervoor dat er
afstoting optreedt.
7
 5) Welk peptide heeft de hoogste pI
A) HSCHHAAFPGGHGAA -> Theoretical pI/Mw: 7.09 / 1456.56
B) ASCHGAAFPGGGGAA -> Theoretical pI/Mw: 6.78 / 1230.32

6) Welk eiwit heeft de hoogste pI

A) Eiwit met vooral zure aminozuren
B) Eiwit met vooral basische aminozuren

7) Rond minuut 4 in de video wordt de IPG strip in de focussing tray gelegd. Je ziet
metalen draden aan de uiteinden van de tray. Waarvoor dienen deze?

Voor de geleiding naar en van de positieve elektrode. Dus om een elektrisch

veld te kunnen bekomen.

8) Tijdens rehydratie van IPG strip worden de eiwitten in de stip geladen. Daarna
worden ze gescheiden door een elektrisch veld aan te leggen op de uiteinden van de
strip. Kan de strip in een willekeurige richting in de focussing tray gelegd worden?
Waarom wel? OF waarom niet?

Neen want de strips hebben een positieve kant die dus aan de kant van de positieve
elektrode moet lliggen. Wanneer dit niet gebeurt zullen niet de jiuste
waarnemingen kunne plaatsvinden.
9) Welke van de volgende uitspraken zijn juist (minimaal 1 uitspraak is juist, minimaal 1
uitspraak is fout) voor een eiwit A met pI = 7 (omcirkel juiste uitspraken)
a) Bij de pH = 7 heeft eiwit A geen lading
b) Bij een pH = 7 heeft zowel positieve en negatieve ladingen
c) Bij pH = 7 is de netto lading van het eiwit A gelijk aan 0
d) Op een IPG strip met een gradiënt van pH 4 naar pH 8 zal het eiwit A enkel naar
links migreren.
e) Op een IPG strip met een gradiënt van pH 4 naar pH 8 zal het eiwit A enkel naar
rechts migreren.
f) Op een IPG strip met een gradiënt van pH 4 naar pH 8 zal het eiwit A in beide
richtingen migreren.

TEKST IS AANPASSINGEN VAN:

https://stringfixer.com/nl/Protein_precipitation