Machine Translated by Google

Vi sinh (2004), 150, 1085–1093 DOI 10.1099/mic.0.26845-0

Hoạt động của chu trình TCA ở Saccharomyces cerevisiae

là một chức năng của tốc độ tăng trưởng và hấp thu
glucose cụ thể được xác định theo môi trường

Lars M.Blank và Uwe Sauer

Thư tín Viện Công nghệ Sinh học, ETH Zu¨rich, Zu¨rich, Thụy Sĩ
Lars M. Trống

trống@biotech.biol.ethz.ch
Các phản ứng trao đổi chất của Saccharomyces cerevisiae đối với các điều kiện môi trường vật

lý và hóa học khác nhau đã được nghiên cứu trong quá trình nuôi cấy mẻ glucose bằng sự phân bố

đồng vị khối lượng do GC-MS phát hiện trong các axit amin tạo protein từ các thí nghiệm dán nhãn 13C.

Với mục đích này, phân tích tỷ lệ dòng trao đổi chất dựa trên GC-MS đã được mở rộng từ vi khuẩn sang quá

trình trao đổi chất ngăn cách của S. cerevisiae. Nói chung, S. cerevisiae đã được chứng minh là có dòng

dị hóa thấp thông qua con đường pentose phosphate và chu trình axit tricarboxylic (TCA).

Đáng chú ý, các thông lượng chu kỳ TCA hô hấp thể hiện mối tương quan chặt chẽ với tốc độ tăng trưởng

cụ thể tối đa đạt được trong các điều kiện môi trường khác nhau, bao gồm một loạt các nồng độ pH, độ

thẩm thấu, chất khử và muối, nhưng không phải nhiệt độ. Ở các giá trị pH từ 4,0 đến 6,0 với tốc độ

tăng trưởng gần như tối đa, chu trình TCA hoạt động như một con đường phân nhánh để thực hiện các chức

năng sinh tổng hợp độc quyền. Tuy nhiên, việc tăng hoặc giảm độ pH vượt quá phạm vi tối ưu về mặt sinh

lý này sẽ làm giảm tốc độ tăng trưởng và hấp thu glucose nhưng lại làm tăng chế độ hô hấp 'theo chu kỳ'

của hoạt động chu trình TCA đối với quá trình dị hóa. Do đó, kết quả chỉ ra rằng sự ức chế glucose của

chu trình TCA được điều chỉnh bởi tốc độ tăng trưởng hoặc hấp thu glucose, hoặc các tín hiệu bắt nguồn

Nhận ngày 16 tháng 10 năm 2003 từ những điều này. Mặc dù việc cảm nhận nồng độ glucose ngoại bào có ảnh hưởng chung đến hoạt động của

Sửa đổi ngày 19 tháng 12 năm 2003 chu trình TCA in vivo, nhưng sự gia tăng phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng trong hoạt động của chu trình

Chấp nhận ngày 22 tháng 12 năm 2003 TCA hô hấp không phụ thuộc vào cảm biến glucose.

GIỚI THIỆU Escherichia coli (Emmerling và cộng sự, 2002; Fischer & Sauer,
2003b; Jiao và cộng sự, 2003; Sauer và cộng sự, 2004). Mặc dù
Phản ứng mRNA trên toàn bộ bộ gen của nấm men làm bánh mì
khó khăn hơn về mặt khái niệm, phân tích thông lượng cũng đã
Saccharomyces cerevisiae đối với những thay đổi về độ pH, độ
được áp dụng thành công cho các vi khuẩn được ngăn cách như S.
thẩm thấu hoặc nhiệt độ cho thấy biểu hiện khác biệt của hơn
cerevisiae (Christensen và cộng sự, 2002; Dos Santos và cộng
1000 bản phiên mã trong quá trình thích ứng (Causton et al.,
sự, 2003), Saccharomyces kluyveri (Mo¨ller và cộng sự, 2002),
2001; Gasch et al., 2000). Vì những thay đổi trong hệ phiên
Kluyvero myces marxianus (Wittmann và cộng sự, 2002b) và
mã hoặc hệ protein không tiết lộ trực tiếp các kiểu hình của
Penicillium chrysogenum (Van Winden và cộng sự, 2003). Thông
tế bào, nên người ta muốn kết nối những dữ liệu kiểm kê này
thường, phân tích thông lượng trao đổi chất kết hợp dữ liệu
với sinh lý tế bào rõ ràng (Bailey, 1999). Một cách tiếp cận
ghi nhãn 13C với dữ liệu sinh lý định lượng để thu được giải
như vậy là phân tích dòng trao đổi chất, ước tính dòng vật
pháp thông lượng phù hợp nhất. Một phương pháp hơi khác là
chất thông qua các mạng lưới phản ứng sinh hóa, và do đó cung
phân tích tỷ lệ dòng trao đổi chất (METAFoR), định lượng sự
cấp một liên kết trực tiếp đến kiểu hình sinh lý (Hellerstein,
đóng góp tương đối của các con đường hoặc phản ứng hội tụ đối
2003).
với một meta bolite nội bào nhất định (Fischer & Sauer, 2003a).
Không có dữ liệu phù hợp, phương pháp sinh hóa này chỉ dựa vào
Các phương pháp khác nhau để phân tích dòng trao đổi chất dựa
dữ liệu 13C và đã được sử dụng thành công với dữ liệu NMR
trên các thí nghiệm dán nhãn 13C đã được phát triển, cho phép
trong nấm men S. cerevisiae (Maaheimo et al., 2001) và Pichia
định lượng chính xác quá trình chuyển hóa carbon trung tâm
stipitis (Fiaux et al., 2003).
(Sauer, 2004; Wiechert, 2001). Các ứng dụng gần đây bao gồm vi
khuẩn Bacillus subtilis (Dauner và cộng sự, 2001; Zamboni &
Ở đây, chúng tôi mở rộng phân tích METAFoR bằng GC-MS từ E.
Sauer, 2003), Corynebacterium glutamicum (Klapa và cộng sự, coli (Fischer & Sauer, 2003a) sang quá trình chuyển hóa S.
2003; Petersen và cộng sự, 2000; Wittmann & Heinzle, 2002) và cerevisiae được ngăn cách. Trọng tâm đặc biệt của nghiên cứu
này là điều tra tác động của các điều kiện môi trường khác

Chữ viết tắt: MDV, vectơ phân bố khối lượng; METAFoR, tỷ lệ thông lượng
nhau như pH, độ thẩm thấu và nhiệt độ đối với quá trình chuyển

trao đổi chất; PP, pentose photphat; TCA, axit tricarboxylic (đối với các hóa carbon trung tâm của S. cerevisiae trong quá trình tăng
chữ viết tắt khác, xem chú thích của Hình 1). trưởng glucose.

0002-6845 G 2004 SGM In tại Vương quốc Anh 1085

Machine Translated by Google
LM Blank và U. Sauer
PHƯƠNG PHÁP
Chủng nấm men và điều kiện sinh trưởng. Các chủng S. cerevisiae đơn bội được
sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 1. Các đột biến hxk2,
rgt2 và snf3 được tạo ra bằng cách sử dụng băng kanMX4 hiện có (Winzeler et
al., 1999). Các băng cassette được khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi
nằm ở vị trí ~ 500 bp ngược dòng và xuôi dòng của codon bắt đầu và kết thúc
của gen tương ứng. Nuôi cấy mẻ 20 ml được thực hiện trong các bình Erlenmeyer
có vách ngăn 500 ml trên máy lắc quay ở 30 oC và 225 vòng/phút, đảm bảo các
điều kiện được sục khí đầy đủ, trong môi trường tối thiểu men (Verduyn et
al., 1992) chứa (mỗi lít) 5 g ( NH4)2SO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4.7H2O, 4,5
mg ZnSO4.7H2O, 0,3 mg CoCl2.6H2O, 1,0 mg MnCl2.4H2O, 0,3 mg CuSO4.5H2O, 4?
5 mg CaCl2.2H2O, 3,0 mg FeSO4.7H2O, 0,4 mg NaMoO4.2H2O, 1,0 mg H3BO3, 0,1 mg
KI, 15 mg EDTA, 0,05 mg biotin, 1,0 mg canxi pantothenate , 1,0 mg axit
nicotinic, 25 mg inositol, 1,0 mg pyridoxine, 0,2 mg axit p-aminobenzoic và
1,0 mg thiamin. Để tránh thay đổi pH do hấp thu amoniac và tạo axetat, môi
trường được bổ sung 100 mM kali hydro phthalate. Đối với tất cả các thí
nghiệm ở giá trị pH từ 6 trở lên, 100 mM MOPS đã được sử dụng làm chất đệm
thay thế. Độ pH cuối cùng của môi trường nuôi cấy trong tất cả các thí nghiệm
nằm trong khoảng 0,05 so với giá trị trước khi cấy. Glucose khử trùng qua bộ
lọc đã được thêm vào trước thí nghiệm ở nồng độ cuối cùng là 5 g l21
.
Quy trình phân tích và các thông số sinh lý. Sự tăng trưởng của tế
bào được theo dõi bằng cách theo dõi OD600. Các mẫu để xác định chất
chuyển hóa bổ sung của tế bào được ly tâm ở tốc độ 14 000 vòng/phút
trong máy ly tâm đặt trên bàn Eppendorf để loại bỏ các tế bào. Nồng
độ glucose và glycerol trong phần nổi phía trên được xác định bằng bộ
dụng cụ enzyme thương mại [Triglyceride 337-40A, Sigma; Thử nghiệm D-
Glucose (E0716251), R-Biopharm AG]. Các thông số sinh lý tốc độ tăng
trưởng cụ thể tối đa, năng suất sinh khối đối với glucose và tốc độ
tiêu thụ glucose cụ thể đã được tính toán trong giai đoạn tăng trưởng
theo cấp số nhân (Sauer et al., 1999).
Thí nghiệm dán nhãn 13C. Tất cả các thí nghiệm ghi nhãn đã được thực hiện
trong các đợt nuôi cấy giả định các điều kiện trạng thái ổn định giả trong
giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân (Fischer & Sauer, 2003a; Sauer và
cộng sự, 1999; Wittmann & Heinzle, 2001). Việc đánh dấu 13C của các axit
amin tạo protein đã đạt được bằng cách tăng trưởng trên 5 g glucose l21 ở
dạng hỗn hợp gồm 80 % (w/w) không ghi nhãn và 20 % (w/w) glucoza [U-13C]
được đánh dấu đồng nhất (13C, >98 % ; Isotech). Các tế bào từ môi trường
nuôi cấy tối thiểu qua đêm được rửa sạch và sử dụng để cấy
dưới OD600 là 0,03. Các phần nhỏ sinh khối được đánh dấu bằng nhãn 13C đã
được thu hoạch trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân ở mức OD600 là ¡1.
Tại thời điểm này, nồng độ glucose còn lại nằm trong khoảng từ 1 đến 3 g /
, chủng
l21 , do đó rõ ràng cao
S. cerevisiae
hơn ngưỡng CEN.PK
ức chế 113-7D
invertase
(Herwig
0,5gl21
et al.,
được 2001).
báo cáoCác
ở có thể tính được MDVM của OAA14mit
tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm, rửa sạch một lần
Bảng 1. Các chủng nấm men được sử dụng trong công trình này
Sự căng thẳng
kiểu gen
CEN.PK113-7D MATa MAL2-8c SUC2
LMB45 CEN.PK 113-7D hxk2 : : kanMX4
LMB179 CEN.PK 113-7D snf3 : : kanMX4 CEN.PK
LMB243 113-7D rgt2 : : kanMX4 CEN.PK 113-7D
CEN.PK513-3A grr1 : : loxP-kanMX4-loxP W303-1A MATa ade2-1
MMB4 can1-100 his3-11,15 leu2 -3,112 trp1-1 ura3-1 snf3 : : HIS3 rgt2 : :
leu2 mth1 : : trp1 gpr1 : : kanMX4
* Lưu trữ Saccharomyces cerevisiae của Châu Âu để Phân tích Chức năng (euroscarf@em.uni-frankfurt.de).
1086
bằng nước vô trùng và thủy phân trong 500 ml HCl 6 M ở 105 uC trong
24 giờ. Dịch thủy phân được làm khô trong khối gia nhiệt ở 80 oC
dưới luồng không khí không đổi. Các axit amin tự do được tạo dẫn
xuất ở 85 uC trong 1 giờ bằng cách sử dụng 25 ml dimethylformamide
và 25 ml N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide
(Dauner & Sauer, 2000; Wittmann et al., 2002a).
Phân tích GC-MS đã được thực hiện như đã báo cáo gần đây (Fischer
& Sauer, 2003a) bằng cách sử dụng mạng lưới phản ứng sinh hóa đã mô
tả trước đó (Maaheimo et al., 2001). Sự tổng hợp alanine tế bào
được mô tả gần đây trong các thí nghiệm đồng chuyển hóa glucose/
acetate không được thấy trong các thí nghiệm glucose của chúng tôi
(Dos Santos et al., 2003). Kiểu ghi nhãn của phosphoenolpyruvate
(PEP) có nguồn gốc từ tyrosine và phenylalanine khác với kiểu ghi
nhãn của pyruvate ty thể được gọi từ valin. Tuy nhiên, các kiểu ghi
nhãn của alanine và valine rất giống nhau, cho thấy rằng alanine
thực sự được tổng hợp từ pyruvate của ty thể trong các điều kiện
thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu này.
Phân tích METAFoR sử dụng dữ liệu đồng vị khối lượng axit amin.
Dữ liệu GC-MS đại diện cho các tập hợp cụm ion, mỗi cụm biểu thị
sự phân bố khối lượng đồng vị của một đoạn axit amin nhất định.
Đối với mỗi đoạn a, một vectơ phân phối đồng vị khối lượng (MDV)
đã được chỉ định,
(m0)
2 3
6 (m1) 7
6 7
MDV~
6
(m2) 7
với Xmi~1 ð1Þ
6 7
...
6 7
6 7
4 (mn)5
với m0 là hàm lượng phân số của khối lượng thấp nhất và mi>0 là hàm lượng
phân tử của phân tử có khối lượng cao hơn. Để có được sự phân bố đồng vị
khối lượng độc quyền của khung carbon, việc hiệu chỉnh các đồng vị xuất hiện
tự nhiên trong thuốc thử tạo dẫn xuất và các axit amin đã được thực hiện như
mô tả trước đó (Fischer & Sauer, 2003a), tiếp theo là tính toán các vectơ
phân bố khối lượng cho các axit amin (MDVAA) và chất chuyển hóa (MDVM). Tỷ
lệ thông lượng trao đổi chất được tính toán từ MDVM như được mô tả cho E.
coli (Fischer & Sauer, 2003a) với các ngoại lệ sau, chiếm mạng lưới phản ứng
sinh hóa được ngăn cách của S. cerevisiae. Vì aspartate aminotransferase của
ty thể có thể không hoạt động trong các điều kiện được sử dụng (Maaheimo et
al., 2001), nên không thể truy cập trực tiếp vào sự phân phối hàng loạt
oxaloacetate của ty thể (Hình 1). Thay vào đó, MDV của đoạn oxaloacetate ty
thể bốn carbon C-1–C-2–C-3–C-4 của oxaloacetate (OAA14mit) (xem Hình 1 để
biết các chữ viết tắt) được truy cập bằng cách giả định rằng chỉ có phản ứng
mất hấp thu và chu trình TCA đóng góp vào mô hình ghi nhãn của nó. Như vậy
Nguồn hoặc tài liệu tham khảo
Khăn quàng cổ châu Âu*
Nghiên cứu
này Nghiên
cứu này Nghiên
cứu này P. Ko¨tter, pers. liên lạc.
JM Gancedo, cá nhân. liên lạc.
Vi sinh 150
Machine Translated by Google

Hoạt động chu kỳ TCA là một hàm của tốc độ tăng trưởng

OAA23mit+acetyl-CoA12 và OGA12 bằng OAA34mit. Sự đóng góp tương đối

của chu trình TCA vào quá trình tổng hợp OAA sau đó cũng có thể được
định lượng bằng:

OAAmit OAA23mit{(GLU1U|GLU1U)
~1{ ð4Þ
thông qua chu kỳ TCA PEP23{(GLU1U|GLU1U)

Vì các phương trình độc lập 3 và 4 cho kết quả rất giống nhau trong tất cả
các phân tích được mô tả ở đây, nên chỉ những kết quả thu được từ phương
trình 4 được báo cáo sau đây.

Không thể định lượng được sự đóng góp tương đối của các con
đường tổng hợp khác nhau vào acetyl-CoA khô trong ty thể và tế
bào chất, bởi vì MDVAA của LEU12 không thể truy cập được bằng
tác nhân tạo dẫn xuất được sử dụng và LYS12 không thể truy cập
được bằng quy trình được sử dụng. Do đó, MDVM của acetyl-CoA tế
bào không có sẵn để so sánh với MDVM acetyl-CoA ty thể được tính
toán từ OGA.

Từ MDV của oxaloacetate, người ta có thể tính toán OAAcyt tế

bào thu được từ pyruvate tế bào:

OAAcyt từ pyruvatecyt~OAA24cyt{OAA24mit ð5Þ

PEP13{OAA24mit

Hơn nữa, người ta có thể xác định hoạt động của dòng trao đổi
thuận nghịch giữa oxaloacetate và fumarate hoặc succinate:

Phiên bản OAAmit : từ fumaratemit~

Hình 1. Chuyển hóa carbon trung tâm của S. cerevisiae trong quá
OAA24mit{pyruvate23mit|MDVCO2 (0:5
trình tăng trưởng hiếu khí trên glucose. Mũi tên có đầu rắn biểu thị ð6Þ
pyruvate13mitz0:5 (pyruvate23mit|MDVCO2 ){pyruvate23mit|MDVCO2
khả năng đảo ngược phản ứng được xem xét. Các mũi tên có đầu mở làm
nổi bật các con đường sinh tổng hợp axit amin cho phép đưa ra kết
Phiên bản OAAcyt : từ fumaratecyt~
luận trực tiếp về kiểu ghi nhãn 13C của tế bào và các phân tử tiền
mit
chất chuyển hóa trong tế bào chất và ty thể thân
được của
xem chúng. Các
xét Tham
trong loại
khảo
phânđến
OAA24cyt{PEP23|MDVCO2 ð7Þ

tích METAFoR. Các chất nền và sản phẩm ngoại bào được viết hoa. Chữ
(0:5 PEP13z0:5 (PEP23|MDVCO2 ){PEP23|MDVCO2
viết tắt: C1, đơn vị một carbon từ chuyển hóa C1 ; E4P, hồng cầu 4-
Do enzyme malic nằm trong ty thể (Boles et al., 1998), nên các
photphat; OAA, oxaloacetate; OGA, 2-oxoglutarate; PEP,
nhóm pyruvate và oxaloacetate trong ty thể được sử dụng để tính
phosphoenolpyruvate; P5P, pentose 5-photphat; S7P, sedoheptulose 7-
toán giới hạn dưới và trên của hoạt động của enzyme malic:
photphat.

Pyruvatemit từ malate ~ pyruvate23mit{PEP23

ð8Þ
(giới hạn dưới) (GLU1U|GLU1U){PEP23

Pyruvatemit từ malate (giới hạn trên)~

với phương trình sau:
pyruvatemit từ malate (giới hạn dưới) ð9Þ
1{OAAmit
OAA14mit~ OAAmit thông qua chu trình TCA
qua chu trình TCA !.(PEP13|MDVCO2 )z qua chu
ð2Þ Sự đóng góp của con đường pentose phosphate (PP) không oxy hóa
OAAmit thông qua transketolase vào quá trình tổng hợp nhóm triose có
thể được ước tính từ MDV của PEP12, cho thấy tỷ lệ các bộ ba
trình TCA !.OGA25
được sắp xếp lại giữa carbon C-1 và C-2 do tác động của
Phần OAAmit thu được thông qua chu trình TCA thu được transketolaza. Các phân tử PEP12 còn lại bắt nguồn từ một đơn vị
từ: glucose C2 không bị phá vỡ có nguồn gốc từ quá trình đường phân.

PEP12{GLU2U
OAAmit thông qua chu trình TCA~
PEP thông qua transketolase~ ð10Þ
GLU1U|GLU1U{GLU2U
OGA25{(GLU2U|GLU1U|GLU1U) ð3Þ
1{
(GLU2U|GLU2U){(GLU2U|GLU1U|GLU1U) Giới hạn trên cho sự đóng góp của con đường PP vào quá trình tổng
hợp các bộ ba có thể được tính toán bằng cách giả sử rằng năm bộ ba
trong đó GLU1U và GLU2U lần lượt là các đoạn glucoza 1- và 2- carbon được tạo ra từ ba pentose và ít nhất hai trong số các bộ ba này được
được đánh dấu đồng nhất. Cách tiếp cận này giả định rằng liên kết
sắp xếp lại bởi một transketolase:
giữa các nguyên tử carbon 2 và 3 của mỗi oxaloacetate bị phá vỡ mỗi
vòng trong chu trình TCA. Con đường PEP thông qua PP~5 =2?PEP thông qua transketolase ð11Þ

Một phương trình độc lập thứ hai để tính phần OAAmit thông qua chu Vì sự đóng góp của con đường PP vào quá trình tổng hợp PEP là giới hạn
trình TCA có thể được lập bằng cách giả định rằng OGA15 tương ứng với trên, nên chúng tôi trình bày kết quả từ phương trình 11 bằng cách bao
OAA24mit+acetyl-CoA12. Như vậy, OGA25 bằng gồm khoảng lỗi.

http://mic.sgmjournals.org 1087
Machine Translated by Google
LM Blank và U. Sauer
ND ND
Hình 2. Nguồn gốc của các chất trung gian trao đổi chất ở S.
cerevisiae trong quá trình sinh trưởng trong các mẻ nuôi cấy ở
30 6C và pH 5,5 được xác định bằng NMR (thanh màu xám) và GC-MS
(thanh màu trắng). Dữ liệu dựa trên NMR được lấy từ Maaheimo et
al. (2001). Độ lệch chuẩn được ước tính từ phân phối khối lượng dư thừa
butions. ND, Không xác định.
KẾT QUẢ
Phân tích METAFoR bằng GC-MS của S. cerevisiae trong nuôi
cấy mẻ glucose
Để thiết lập một phương pháp nhanh chóng và mạnh mẽ để phân tích
thông lượng, chúng tôi đã mở rộng phân tích METAFoR bằng GC-MS
từ quá trình chuyển hóa của vi khuẩn (Fischer & Sauer, 2003a;
Fischer et al., 2004; Zamboni & Sauer, 2003) sang quá trình
chuyển hóa ngăn cách của S. cerevisiae . Đầu tiên, chúng tôi
nhận thấy sự phân bố đồng vị khối lượng trong các axit amin tạo
protein được phân tích bằng GC-MS nhìn chung phù hợp với phân
tích mạng trước đó (Christensen et al., 2002; Maaheimo et al.,
2001; Van Winden, 2002) của axit amin sinh tổng hợp ở S.
cerevisiae (dữ liệu không được hiển thị). Tiếp theo, chúng tôi
so sánh phân tích METAFoR dựa trên GC MS của nuôi cấy mẻ S.
cerevisiae nuôi cấy trong bình lắc trên glucose ở 30 uC và pH
5,5 với phân tích METAFoR dựa trên NMR trong các điều kiện gần
như giống hệt nhau (Maaheimo et al., 2001) . Thật vậy, các kết
quả rất giống nhau như lộ trình PP thấp và các hoạt động chu
trình TCA đã được tìm thấy (Hình 2). Do việc giải thích mẫu ghi
nhãn 13C trong axit amin bằng các phân tích MS và NMR chỉ được
kết nối bởi mạng lưới sinh hóa giả định, tính nhất quán này cung
cấp bằng chứng cho việc định lượng trung thực và đáng tin cậy
các tỷ lệ thông lượng trao đổi chất bằng một trong hai phương pháp.
Sự khác biệt nhỏ về tỷ lệ thông lượng có thể được quy cho thành
phần môi trường tối thiểu khác nhau và một số tốc độ tăng trưởng
thấp hơn của môi trường nuôi cấy được phân tích bằng NMR
(Maaheimo et al., 2001).
Tác động của pH và nhiệt độ đến cấu hình dòng trao đổi chất
Để nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số môi trường vật lý và
hóa học đến chuyển hóa carbon trung tâm
1088
trong điều kiện lên men hiếu khí, chúng tôi nuôi S. cerevisiae ở
25, 30 và 37 uC và ở các giá trị pH là 3,5, 5,0 và 6,0.
16 tỷ lệ thông lượng trao đổi chất được xác định ổn định một
cách đáng ngạc nhiên trong mọi điều kiện và các thông lượng
tương đối thông qua chu trình TCA và con đường PP vẫn khá thấp (Hình 3).
Nhìn chung, hoạt động của chu trình TCA thấp và việc sản xuất
ethanol đồng thời được mong đợi đối với S. cerevisiae lên men hô
hấp (Alexander & Jeffries, 1990). Các ước tính trước đây về
thông lượng con đường PP dị hóa tương đối thành các bộ ba thay
đổi trong khoảng từ 0 đến 4% (Fiaux và cộng sự, 2003; Maaheimo
và cộng sự, 2001) và 14% (Gombert và cộng sự, 2001). Trong các
thí nghiệm được mô tả ở đây, chúng tôi quan sát thấy giới hạn
trên là 7 % đối với phần PEP thu được qua con đường PP từ các
thí nghiệm glucoza được dán nhãn thống nhất (Hình 3). Vì vậy,
chúng tôi kết luận rằng hoạt động con đường dị hóa PP của S.
cerevisiae trong các mẻ nuôi cấy thực sự thấp hơn so với ví dụ
như ở E. coli (Fischer & Sauer, 2003a).
Tốc độ tăng trưởng của S. cerevisiae tương quan với dòng chu
trình TCA hô hấp tương đối trong nuôi cấy theo mẻ
Phần OAAmit tăng lên thu được từ chu trình TCA trong môi trường
nuôi cấy pH 3,5 cho thấy hoạt động của chu trình TCA hô hấp tăng
lên đáng kể, khi so sánh với hoạt động của chu trình TCA sinh
tổng hợp (Hình 3b). Vì độ pH thấp này cũng làm giảm 10 % tốc độ
tăng trưởng cụ thể tối đa, nên chúng tôi không thể phân biệt
giữa tốc độ tăng trưởng và ảnh hưởng của điều kiện môi trường
đối với hoạt động của chu trình TCA.
Để định lượng ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến tốc độ
tăng trưởng cụ thể tối đa và phản ứng thông lượng nội bào, chúng
tôi đã nuôi cấy theo mẻ trong điều kiện lên men hiếu khí, với sự
hình thành ethanol rộng rãi ở các giá trị pH, độ thẩm thấu,
nhiệt độ, muối và nồng độ tách rời khác nhau. Như thể hiện trong
Hình 4, sự đóng góp của chu trình TCA vào quá trình tổng hợp
OAAmit thường tăng lên khi tốc độ tăng trưởng giảm. Quan sát này
dường như độc lập với nhiều điều kiện tinh thần môi trường được
sử dụng để giảm tốc độ tăng trưởng. Ngoại lệ duy nhất là nhiệt
độ, chỉ có tác động khiêm tốn đến dòng chu trình TCA (Hình 3 và
4), mặc dù tốc độ tăng trưởng đã giảm đáng kể. Vì tốc độ hấp thu
glucose cụ thể có tương quan chặt chẽ với tốc độ tăng trưởng cụ
thể (Diderich et al., 1999; Van Hoek et al., 1998)
(Hình 5a, b), không có gì đáng ngạc nhiên khi tốc độ hấp thu
glucose cũng tương quan với dòng chu trình TCA tương đối (dữ
liệu không được hiển thị). Mặc dù chúng tôi không thể loại trừ
rằng hoạt động của chu trình TCA bị ảnh hưởng trực tiếp bởi các
điều kiện tinh thần môi trường đã chọn, nhưng phạm vi rộng của
các điều kiện khiến cho hầu như không chắc rằng tất cả chúng đều
có tác động tương tự và cụ thể đối với dòng chu trình TCA. Hơn
nữa, gần đây người ta đã chứng minh rằng hoạt động chu trình TCA
của C. glutamicum không thay đổi theo độ thẩm thấu của môi
trường (Varela et al., 2003).
Nhóm OAAcyt cần thiết cho quá trình ngưng hấp thụ của chu trình
TCA và sinh tổng hợp axit amin thuộc họ aspartate được tổng hợp
độc quyền thông qua pyruvate carboxylase (OAAcyt từ pyruvatecyt)
trong hầu hết các thí nghiệm. chỉ tại
Vi sinh 150
Machine Translated by Google

Hoạt động chu kỳ TCA là một hàm của tốc độ tăng trưởng

(Một)

NĐ NĐ

(b)

Hình 3. Nguồn gốc của các chất trung gian trao đổi

chất ở S. cerevisiae trong quá trình sinh trưởng

trong các mẻ nuôi cấy. (a) Ở nhiệt độ 25 6C (vạch

đen), 30 6C (vạch trắng) và 37 6C (vạch xám), ở pH 5?

0; (b) ở các giá trị pH là 3,5 (thanh màu đen), 5,0

NĐ NĐ (thanh màu trắng) và 6,0 (thanh màu xám), ở 30 6C. Độ

lệch chuẩn được ước tính từ phân phối khối lượng dư
thừa

butions. Hoạt tính của enzym malic chỉ có thể được

xác định trong môi trường nuôi cấy có ít hơn 5 %

Hoạt động chu kỳ TCA và được dán nhãn không xác định
(ND) trong tất cả các trường hợp khác.

tốc độ tăng trưởng dưới 0,2 h21 có thể một phần đáng kể trong
số 7–22 % bắt nguồn từ nhóm OAAmit , có thể được xúc tác bởi
hoạt động của chất vận chuyển OAA ty thể Oac1p, do quá trình vận
chuyển được chứng minh là hai chiều (Palmieriet al.,
1999). Sự thay đổi tỷ lệ thông lượng này cũng không phụ thuộc
vào điều kiện môi trường làm giảm tốc độ tăng trưởng.
Tuy nhiên, trái ngược với hai tỷ lệ thông lượng ở trên, không
có tỷ lệ thông lượng nào trong số 10 tỷ lệ thông lượng được phát

hiện khác thể hiện mối tương quan rõ rệt với tốc độ tăng trưởng
(dữ liệu không được hiển thị). Ví dụ, enzyme malic hoạt động
mạnh hơn ở pH axit, nhưng không hoạt động ở pH 7,5, mặc dù tốc
0. 5
độ tăng trưởng cao hơn (0,19 h21 ) so với ở pH 3,0 (0,07 h21 ).
Mô hình hoạt động in vivo đảo ngược được xác định cho phản ứng
0. 4 tạo đường được xúc tác bởi PEP carboxykinase, phản ứng này chỉ
được phát hiện ở các giá trị pH 7,0 và 7,5.

0. 3
Để làm rõ liệu tốc độ tăng trưởng có tương quan với bất kỳ đặc
OAAmit
trình
thông
TCA
chu
qua

tính sinh lý nào khác hay không, chúng tôi đã định lượng sinh
lý tăng trưởng trên một loạt các giá trị pH (Hình 5).
0. 2
Đối với các điều kiện tiêu chuẩn (nồng độ glucose cao, 30 uC,
nuôi cấy mẻ có sục khí, pH 5–6), các thông số này (Hình 5) phù
0. 1 hợp tốt với các báo cáo trước đây về các chủng S. cerevisiae
CEN.PK (Smits et al., 2000 ; van Dijken và cộng sự, 2000; van
Maris và cộng sự, 2001). Gần giống với tốc độ tăng trưởng tối

0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 đa (Hình 5a), tốc độ hấp thu glucose cụ thể giảm đáng kể bên

Tốc độ tăng trưởng cụ thể tối đa (h_1 )
Hình 4. Tỷ lệ OAAmit thu được từ chu trình TCA là một hàm của tốc độ tăng
trưởng cụ thể tối đa của glucose được nuôi cấy S. cerevisiae trong các điều
ngoài phạm vi pH tối ưu là 4,0–6? (Hình 5b). Ngược lại, năng
suất sinh khối khá ổn định và không có mối tương quan với tốc
độ tăng trưởng (Hình 5c). Tốc độ sản xuất glycerol cụ thể cho
thấy mối tương quan tích cực nói chung với pH nuôi cấy, tức là

kiện môi trường khác nhau trong nuôi cấy theo mẻ. Độ lệch chuẩn của hoạt
dẫn đến tốc độ sản xuất cao nhất ở pH 7?5 (Hình 5d).

động chu trình TCA được ước tính từ các phân phối khối lượng dự phòng và
Mối tương quan tích cực này có thể phản ánh một phản ứng tương
lỗi tốc độ tăng trưởng được ước tính bằng SigmaPlot 8.0 (SPSS). tự như đã được báo cáo về độ thẩm thấu cao, trong đó việc sản
DNP, 2,4-dinitrophenol. xuất glycerol thẩm thấu chính được tăng lên trong nấm men (Hohmann,

http://mic.sgmjournals.org 1089
Machine Translated by Google

LM Blank và U. Sauer

(Một) (b)

(c) (d)

Hình 5. Ảnh hưởng của pH ngoại bào đến tốc độ tăng trưởng cụ thể tối đa (a), tốc độ hấp thu glucose cụ thể (b), năng
suất sinh khối (c) và tốc độ sản xuất glycerol cụ thể (d) trong các mẻ nuôi cấy S. cerevisiae. Độ lệch chuẩn được ước
tính bằng SigmaPlot 8.0 (SPSS) và định luật lan truyền lỗi Gaussian.

2002). Cần lưu ý rằng việc sản xuất etanol đáng kể đã không được
báo cáo vì tốc độ bay hơi cao trong các bình lắc đã ảnh hưởng đến
quá trình phân tích định lượng kỹ lưỡng.
Cảm biến glucose là không cần thiết để tăng thông lượng chu trình
TCA tương đối trong quá trình tăng trưởng chậm
dòng chu kỳ TCA tương đối dựa trên sự điều biến môi trường của tốc
độ tăng trưởng cụ thể với độ thẩm thấu cao (Hình 6).
Những kết quả này cho thấy mạnh mẽ rằng cảm biến glucose ngoại bào
không liên quan đến sự gia tăng thông lượng chu trình TCA tương
đối với tốc độ tăng trưởng chậm trong nuôi cấy theo đợt. Tuy
nhiên, thông lượng chu kỳ TCA cao hơn trong các đột biến grr1 và MMB4, khi

Mặc dù nồng độ glucose ban đầu giống hệt nhau trong tất cả các thí
nghiệm trên, nhưng chúng tôi không thể loại trừ rằng cảm biến
glucose có liên quan đến việc điều chỉnh thông lượng chu trình TCA
tương đối. Do đó, chúng tôi đã tạo ra các đột biến đồng phân của
hai cảm biến glucose Snf3p và Rgt2p (Ozcan et al., 1996). Nếu cảm
biến glucose ngoại bào đóng một vai trò quan trọng trong việc điều
chỉnh thông lượng chu trình TCA, thì người ta sẽ không mong đợi sự
gia tăng thông lượng khi tốc độ tăng trưởng giảm do môi trường ở
cả hai đột biến. Tuy nhiên, hoạt động của chu trình TCA tăng lên
ở cả hai đột biến với tốc độ tăng trưởng thấp hơn (Hình 6). Để
tiếp tục loại trừ khả năng chồng chéo một phần chức năng của các
cảm biến nồng độ glucose cao và thấp, Rgt2p và Snf3p, tương ứng,
chúng tôi đã sử dụng hai đột biến khác. Chủng MMB4 hoàn toàn không
thể cảm nhận được glucose ngoại bào do xóa SNF3, RGT2 và cảm biến

kết hợp G-protein màng plasma GPR1. Để cho phép tăng trưởng trên
glucose, chủng này cũng mang gen xóa MTH1. Chủng thứ hai đã bị xóa
trong GRR1, điều cần thiết cho việc cảm nhận glucose từ đường dẫn
truyền tín hiệu Snf3p và Rgt2p. Mặc dù cả hai chủng đã thể hiện
dòng chu trình TCA hô hấp cao trong điều kiện tiêu chuẩn với tốc
độ tăng trưởng lần lượt là 0,39 và 0,26 h21 đối với MMB4 và đột
biến grr1, nhưng chúng vẫn làm tăng
Hình 6. Phần OAAmit thu được từ chu trình TCA ở S. cerevisiae
đột biến bị suy giảm khả năng cảm nhận glucose. Các giá trị
được xác định trong các điều kiện lô tiêu chuẩn (thanh màu
trắng) và ở 0,75 M NaCl (thanh màu xám), làm giảm tốc độ tăng
trưởng cụ thể tối đa từ 40–60 %. Lỗi thử nghiệm của hoạt động
chu trình TCA được ước tính từ các phân phối khối lượng dự
phòng.

1090 Vi sinh 150

Machine Translated by Google

Hoạt động chu kỳ TCA là một hàm của tốc độ tăng trưởng

so với loại hoang dã ở cùng tốc độ tăng trưởng, cho thấy cảm biến hoạt động hô hấp tương đối của chu trình TCA tăng lên cùng với việc

glucose có tác dụng ức chế bổ sung. giảm tốc độ tăng trưởng và/hoặc tốc độ hấp thu glucose ở nồng độ glucose

ngoài tế bào trong khoảng từ 1 đến 5 g l21 tương quan độc lập với. bốn
Cái này

thông số hóa học khác nhau được sử dụng để điều chỉnh tốc độ tăng trưởng.
Thông lượng chu trình TCA có tương quan với tốc độ tăng trưởng hoặc

hấp thu glucose không?

Là ngoại lệ duy nhất, những thay đổi về tốc độ tăng trưởng do nhiệt độ
Tốc độ tăng trưởng và hấp thu glucose cụ thể được kết hợp trong các thí gây ra phản ứng chu kỳ TCA ít rõ rệt hơn nhiều.
nghiệm hàng loạt được thực hiện; do đó, chúng tôi không thể phân biệt

liệu một hoặc cả hai tỷ lệ có tương quan với thông lượng chu kỳ TCA Mối tương quan được quan sát ở đây giữa tốc độ tăng trưởng và/hoặc hấp

tương đối hay không. Để giải quyết câu hỏi này, chúng tôi đã sử dụng thu glucose và dòng chu trình TCA hô hấp tương đối trái ngược với quan
một đột biến thiếu hexokinase II thể hiện sự ức chế glucose được giảm điểm chung về chu trình TCA bị ức chế dị hóa trong các mẻ nuôi cấy S.

nhẹ trong môi trường nuôi cấy mẻ glucose (Diderich et al., 2001). Khi cerevisiae thừa glucose (Gancedo, 1998; Rolland et al ., 2002). Trong

so sánh với thể dại, tốc độ tăng trưởng cụ thể của đột biến hxk2 chỉ các điều kiện lô tiêu chuẩn, chu trình TCA hoạt động như một lộ trình

thấp hơn một chút, nhưng tốc độ hấp thu glucose cụ thể thấp hơn khoảng phân nhánh để duy trì các yêu cầu về tiền chất sinh khối (Gombert et

45 %. al., 2001). Mặc dù sự biểu hiện của phần lớn các gen trong chu trình

Thông lượng chu trình TCA tương đối trong đột biến này không biểu hiện TCA chịu sự ức chế glucose (DeRisi và cộng sự, 1997) ở nồng độ glucose

mối tương quan với tốc độ tăng trưởng nhưng tương quan tốt hơn nhiều, ngoại bào có thể thấp tới 0?1gl21 (Yin và cộng sự, 2003), ở đây chúng

mặc dù yếu, với tốc độ hấp thu glucose (Hình 7). Điều này gợi ý rằng tôi chỉ ra rằng tương đối hoạt động hô hấp in vivo của chu trình TCA có

tốc độ hấp thu glucose cụ thể chứ không phải tốc độ tăng trưởng cụ thể thể tăng ngay cả ở nồng độ glucose cao, miễn là tốc độ tăng trưởng hoặc

tương quan với dòng chu trình TCA tương đối ở S. cerevisiae hoang dại. tốc độ hấp thu glucose bị suy giảm bởi các thông số môi trường khác.

THẢO LUẬN

Bằng cách sử dụng phân tích METAFoR dựa trên GC-MS mới được phát triển,
Trong khi các con đường điều hòa chính của sự ức chế glucose đã được
chúng tôi đã định lượng các phản ứng thông lượng nội bào của S.
biết đến (Rolland và cộng sự, 2002), các cơ chế phân tử bắt đầu sự ức
cerevisiae đối với một loạt các điều kiện môi trường trong quá trình
chế vẫn còn khó nắm bắt và một số yếu tố kích hoạt có nguồn gốc từ
nuôi cấy theo lô. Trái ngược với tất cả các tỷ lệ thông lượng được theo dõi khác,
chuyển hóa đã được thảo luận (Carlson, 1999; Gancedo, 1998; Rolland và
cộng sự ., 2002). Kết quả đột biến cảm biến glucose của chúng tôi loại

trừ rằng sự ức chế glucose của chu trình TCA chỉ được trung gian bằng

cách cảm nhận nồng độ glucose ngoại bào, được biết là ức chế một số gen
_1
Tốc độ tăng trưởng riêng (h ) HXT (Rolland et al., 2002). Sự gia tăng thông lượng chu trình TCA tương

0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 đối ở bốn đột biến khác nhau bị suy giảm khả năng cảm nhận glucose cho
0. 6
thấy mạnh mẽ rằng tác nhân kích hoạt trao đổi chất để ức chế chu trình

TCA phải là tín hiệu có nguồn gốc từ nội bào, chuyển hóa. Quan điểm này
0. 5
phù hợp với việc tăng tốc độ tiêu thụ oxy khi giảm di truyền tốc độ

tăng trưởng và tốc độ hấp thu glucose (Ye et al., 1999). Ngoài ra, có
0. 4
sự ức chế phụ thuộc vào nồng độ vì các thể đột biến hoàn toàn không có

cảm giác glucose (ví dụ: grr1 và MMB4) biểu hiện thông lượng chu trình
0. 3
TCA cao hơn dự kiến từ tốc độ tăng trưởng của chúng.
OAAmit
trình
thông
TCA
chu
qua

0. 2

0. 1

Nói chung, người ta mong đợi tín hiệu đàn áp có liên quan đến tốc độ
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
hấp thu glucose hơn là tốc độ tăng trưởng, nhưng cả hai được kết hợp
_1
Tốc độ hấp thu glucose cụ thể (mmol g_1 h )
trong tất cả các điều chế môi trường. Tuy nhiên, trong đột biến hxk2,
hai tham số đã được tách rời và thông lượng chu trình TCA tương đối

tương quan tốt hơn với sự hấp thu so với tốc độ tăng trưởng, do đó cung
Hình 7. Tỷ lệ OAAmit thu được qua chu trình TCA là một hàm của tốc độ tăng
cấp một số bằng chứng cho tín hiệu ức chế glucose liên quan đến thông
trưởng cụ thể tối đa ($) và sự hấp thu glucose (#) trong các mẻ nuôi cấy S.
lượng của chu trình TCA. Sự hấp thu không hoàn hảo – mối tương quan giữa
cerevisiae với độ pH khác nhau (xem thêm Hình 4). Kết quả từ hai đợt thí

nghiệm trên các môi trường khác nhau và thêm vào đó là một thí nghiệm với chu trình TCA ở đột biến hxk2, với sự ức chế chu trình TCA yếu hơn so

đột biến hxk2 trong môi trường tiêu chuẩn được hiển thị. Lỗi thử nghiệm của với dự kiến từ các thí nghiệm pH với tốc độ tăng trưởng tương tự, có

hoạt động chu trình TCA được ước tính từ các phân phối khối lượng dư thừa thể liên quan đến vai trò điều tiết của Hxk2p trong việc ức chế glucose,

và các lỗi tốc độ tăng trưởng và hấp thu glucose được ước tính bằng SigmaPlot điều này cũng sẽ ảnh hưởng đến dòng ( Carlson, 1999; Gancedo,

8.0 (SPSS).

http://mic.sgmjournals.org 1091
Machine Translated by Google
LM Blank và U. Sauer
1998; Rolland và cộng sự, 2002). Rõ ràng, sự ức chế glucose
của chu trình TCA thể hiện một mô hình khác và có lẽ cũng sử
dụng các tín hiệu khác so với gen ức chế glucose mô hình
SUC2 (Meijer et al., 1998; Rolland et al., 2002). Sự phụ
thuộc chung của các dòng chu trình TCA tương đối vào các
điều kiện môi trường chính xác cũng có thể giải thích những
khác biệt nhỏ trong hoạt động của chu trình TCA thu được từ
các thí nghiệm dán nhãn 13C trước đó (Christensen và cộng
sự, 2002; Fiaux và cộng sự, 2003; Gombert và cộng sự, 2001 ;
Maaheimo và cộng sự, 2001).
Phương pháp được mô tả để lập hồ sơ dòng trao đổi chất dựa
trên dữ liệu GC-MS về các axit amin tạo protein trong nấm
men là mạnh mẽ, nhanh chóng và cũng có thể áp dụng cho các
hệ thống canh tác nhỏ. Hầu hết các tỷ lệ thông lượng được
báo cáo chỉ thay đổi trong một phạm vi khá hẹp. Điều quan
trọng là, dòng thông qua con đường PP, enzyme malic và phản
ứng tạo đường được xúc tác bởi PEP carboxykinase thấp và
thay đổi rất ít khi xem xét các tác động sinh lý nghiêm trọng
của điều kiện môi trường được sử dụng. Các trường hợp ngoại
lệ duy nhất là thông lượng chu trình TCA hô hấp và thông
lượng trao đổi ty thể giữa oxalo axetat và fumarate. Điều
này cho thấy sự mạnh mẽ chung của quá trình trao đổi chất
nội bào đối với các điều kiện môi trường trên một chất nền
nhất định. Mặc dù tốc độ glucose đi vào tế bào có thể thay
đổi trong một phạm vi rộng, nhưng sự phân bố tương đối của
dòng carbon trong tế bào vẫn khá ổn định.
SỰ NHÌN NHẬN
Các tác giả xin cảm ơn Juana Maria Gancedo và Peter Kotter đã cung cấp các
chủng nấm men. Lars M. Blank xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ tài chính của
Deutsche Akademie der Naturforscher Leopoldina (BMBF-LPD/8-78).
NGƯỜI GIỚI THIỆU
Alexander, MA & Jeffries, TW (1990). Hiệu quả hô hấp và phân chia chất chuyển
hóa như hiện tượng điều tiết trong nấm men. Enzyme Microb Technol 12, 2–19.
Bailey, JE (1999). Bài học từ kỹ thuật trao đổi chất cho bộ gen chức năng và
khám phá thuốc. Công nghệ sinh học Nat 17, 616–618.
Boles, E., de Jong-Gubbels, P. & Pronk, JT (1998). Xác định và mô tả đặc tính
của MAE1, gen mã hóa gen cấu trúc Saccharomyces cerevisiae của ty thể. J
Bacteriol 180, 2875–2882.
Carlson, M. (1999). Ức chế glucose trong men. Curr Opin Microbiol 2, 202–207.
Causton, HC, Ren, B., Koh, SS & 7 tác giả khác (2001).
Tu sửa biểu hiện bộ gen của nấm men để đáp ứng với những thay đổi về tinh
thần của môi trường. Tế bào Mol Biol 12, 323–337.
Christensen, B., Gombert, AK & Nielsen, J. (2002). Phân tích các ước tính
thông lượng dựa trên các thí nghiệm ghi nhãn 13C. Hóa chất Eur J 269,
2795–2800.
Dauner, M. & Sauer, U. (2000). Phân tích axit amin GC-MS nhanh chóng cung cấp
thông tin phong phú để cân bằng đồng vị.
Chương trình Công nghệ sinh học 16, 642–669.
1092
Dauner, M., Bailey, JE & Sauer, U. (2001). Phân tích dòng trao đổi chất với mô
hình đồng vị toàn diện trong Bacillus subtilis.
Công nghệ sinh học Bioeng 76, 144–156.
DeRisi, JL, Iyer, VR & Brown, PO (1997). Khám phá sự kiểm soát trao đổi chất
và di truyền biểu hiện gen trên quy mô bộ gen. Khoa học 278, 680–686.
Diderich, JA, Schepper, M., van Hoek, P. & 8 tác giả khác (1999). Động học hấp
thu glucose và phiên mã gen HXT trong môi trường nuôi cấy hóa trị của
Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 274, 15350–15359.
Diderich, JA, Raamsdonk, LM, Kruckeberg, AL, Berden, JA
& Vân Đàm, K. (2001). Đặc tính sinh lý của Saccharomyces cerevisiae mà
hexokinase II đã bị loại bỏ. Appl Vi sinh vật môi trường 67, 1587–1593.
Dos Santos, MM, Gombert, AK, Christensen, B., Olsson, L. & Nielsen, J. (2003).
Xác định các hoạt động của enzyme in vivo trong quá trình chuyển hóa glucose
và axetat của Saccharomyces cerevisiae bằng cách sử dụng chất nền có nhãn 13C.
Tế bào nhân chuẩn 2, 599–608.
Emmerling, M., Dauner, M., Ponti, A., Fiaux, J., Hochuli, M.,
Szyperski, T., Wu¨ thrich, K., Bailey, JE & Sauer, U. (2002).
Phản ứng của dòng trao đổi chất đối với việc loại bỏ pyruvate kinase ở
Escherichia coli. Vi khuẩn J 184, 152–164.
Fiaux, J., Cakar, ZP, Sonderegger, M., Wu¨ thrich, K., Szyperski, T.
& Sauer, U. (2003). Hồ sơ thông lượng trao đổi chất của nấm men Saccharo
myces cerevisiae và Pichia stipitis. Tế bào nhân chuẩn 2, 170–180.
Fischer, E. & Sauer, U. (2003a). Hồ sơ thông lượng trao đổi chất của các đột
biến Escherichia coli trong chuyển hóa carbon trung tâm bằng cách sử dụng GC-MS.
Eur J Biochem 270, 880–891.
Fischer, E. & Sauer, U. (2003b). Một chu trình trao đổi chất mới xúc tác quá
trình oxy hóa glucose và quá trình ngưng tụ ở Escherichia coli đói. J Biol
Chem 278, 46446–46451.
Fischer, E., Zamboni, N. & Sauer, U. (2004). Phân tích thông lượng trao đổi
chất thông lượng cao dựa trên phép đo khối phổ sắc ký khí thu được các giới
hạn 13C . Anal Biochem (trên báo chí).
Gancedo, JM (1998). Men ức chế dị hóa carbon. Microbiol Mol Biol Rev 62, 334–
361.
Gasch, AP, Spellman, PT, Kao, CM, Carmel-Harel, O., Eisen, MB, Storz, G.,
Botstein, D. & Brown, PO (2000). Các chương trình biểu hiện bộ gen trong phản
ứng của tế bào nấm men với những thay đổi môi trường. Tế bào Mol Biol 11, 4241–
4257.
Gombert, AK, Moreira dos Santos, M., Christensen, B. & Nielsen, J. (2001).
Nhận dạng mạng và định lượng thông lượng trong quá trình chuyển hóa trung tâm
của Saccharomyces cerevisiae trong các điều kiện ức chế glucose khác nhau. J
Bacteriol 183, 1441–1451.
Hellerstein, MK (2003). Phép đo thông lượng in vivo thông qua các con đường
trao đổi chất: liên kết còn thiếu trong nghiên cứu dược phẩm và gen chức năng.
Annu Rev Nutr 23, 379–402.
Herwig, C., Dorries, C., Marison, I. & von Stockar, U. (2001).
Phân tích định lượng sơ đồ điều hòa biểu hiện invertase ở Saccharomyces
cerevisiae. Công nghệ sinh học Bioeng 76, 247–258.
Hohmann, S. (2002). Tín hiệu căng thẳng thẩm thấu và phản ứng thẩm thấu trong
nấm men. Microbiol Mol Biol Rev 66, 300–372.
Jiao, Z., Baba, T., Mori, H. & Shimizu, K. (2003). Phân tích các phản ứng trao
đổi chất và sinh lý đối với việc loại bỏ gnd ở Escherichia coli bằng cách sử
dụng thí nghiệm đánh dấu C-13 và đo lường hoạt động của enzyme. FEMS Microbiol
Lett 220, 295–301.
Klapa, MI, Aon, JC & Stephanopoulos, G. (2003). Định lượng có hệ thống các
mạng thông lượng trao đổi chất phức tạp bằng cách sử dụng các đồng vị ổn định
và phép đo phổ khối. Eur J Biochem 270, 3525–3542.
Maaheimo, H., Fiaux, J., Cakar, ZP, Bailey, JE, Sauer, U. & Szyperski, T.
(2001). Chuyển hóa carbon trung tâm của Saccharomyces
Vi sinh 150
Machine Translated by Google
cerevisiae được khám phá bằng cách ghi nhãn phân đoạn 13C sinh tổng hợp của
các axit amin phổ biến. Eur J Biochem 268, 2464–2479.
Meijer, MM, Boonstra, J., Verkleij, AJ & Verrips, CT (1998).
Sự ức chế glucose ở Saccharomyces cerevisiae liên quan đến nồng độ glucose
hơn là dòng glucose. J Biol Chem 273, 24102–24107.
Mo¨ ller, K., Christensen, B., Fo¨rster, J., Piskur, J., Nielsen, J. & Olsson,
L. (2002). Chuyển hóa glucose hiếu khí của Saccharomyces kluyveri: tăng
trưởng, sản xuất chất chuyển hóa và định lượng dòng trao đổi chất. Công nghệ
sinh học Bioeng 77, 186–193.
Ozcan, S., Dover, J., Rosenwald, AG, Wolfl, S. & Johnston, M.
(1996). Hai chất vận chuyển glucose trong Saccharomyces cerevisiae là các cảm
biến glucose tạo ra tín hiệu kích thích biểu hiện gen. Proc Natl Acad Sci USA
93, 12428–12432.
Palmieri, L., Vozza, A., Agrimi, G., De Marco, V., Runswick, MJ, Palmieri, F.
& Walker, JE (1999). Xác định chất vận chuyển ty thể của nấm men cho
oxaloacetate và sulfat. J Biol Chem 274, 22184–22190.
Petersen, S., de Graaf, AA, Eggeling, L., Mo¨ llney, M., Wiechert, W.
& Sahm, H. (2000). Định lượng in vivo các thông lượng song song và hai chiều
trong quá trình khử trùng của Corynebacterium glutamicum. J Biol Chem 275,
35932–35941.
Rolland, F., Winderickx, J. & Thevelein, JM (2002). Cơ chế cảm nhận và truyền
tín hiệu glucose trong nấm men. FEMS Men Res 2, 183–201.
Sauer, U. (2004). Hiện tượng thông lượng cao: phương pháp thử nghiệm để lập
bản đồ từ thông. Curr Opin Biotechnol 15 (trên báo chí).
Sauer, U., Lasko, DR, Fiaux, J., Hochuli, M., Glaser, R., Szyperski, T., Wu¨
thrich, K. & Bailey, JE (1999). Phân tích tỷ lệ thông lượng trao đổi chất của
các biến đổi di truyền và môi trường của quá trình chuyển hóa carbon trung
tâm của Escherichia coli. Vi khuẩn J 181, 6679–6688.
Sauer, U., Canonaco, F., Heri, S., Perrenoud, A. & Fischer, E.
(2004). Các transhydrogenase hòa tan và gắn màng UdhA và PntAB có các chức
năng khác nhau trong chuyển hóa meta NADPH của Escherichia coli. J Biol Chem
(trên báo chí). DOI 10.1074/ jbc.M311657200; PMID 14660605.
Smits, PH, Hauf, J., Muller, S., Hobley, TJ, Zimmermann, FK, Hahn-
Hagerdal, B., Nielsen, J. & Olsson, L. (2000). Sự biểu hiện quá mức
đồng thời của các enzym ở phần dưới của quá trình đường phân có thể
nâng cao khả năng lên men của Saccharomyces cerevisiae. Men 16, 1325–
1334. van Dijken, JP, Bauer, J., Brambilla, L. & 20 tác giả khác
(2000).
Một so sánh liên phòng thí nghiệm về các mối quan hệ phù hợp về sinh lý và
di truyền của bốn chủng Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb Technol 26,
706–714.
Van Hoek, P., Van Dijken, JP & Pronk, JT (1998). Ảnh hưởng của tốc độ sinh
trưởng riêng đến khả năng lên men của men bánh mì. Appl Vi sinh vật môi trường
64, 4226–4233.
van Maris, AJ, Bakker, BM, Brandt, M., Boorsma, A., Teixeira de Mattos, MJ,
Grivell, LA, Pronk, JT & Blom, J. (2001). điều chế
http://mic.sgmjournals.org
Hoạt động chu kỳ TCA là một hàm của tốc độ tăng trưởng
sự phân bố của các thông lượng giữa quá trình hô hấp và lên men bằng cách
biểu hiện quá mức HAP4 trong Saccharomyces cerevisiae. FEMS Men Res 1, 139–149.
Van Winden, W. (2002). Xác minh các con đường sinh tổng hợp giả định, tiền
chất trao đổi chất và ước tính sai số đo lường của axit amin, trehalose và
axit levulinic bằng cách sử dụng 2D dự phòng [ 13C, 1 H]
Dữ liệu COSY NMR. Trong Khoa Công nghệ Xử lý Sinh học, trang 229–245. Delft:
Đại học Công nghệ Delft.
Van Winden, WA, Van Gulik, WM, Schipper, D., Verheijen, PJ, Krabben, P.,
Vinke, JL & Heijnen, JJ (2003). Dòng trao đổi chất và phân tích mạng lưới
trao đổi chất của Penicillium chrysogenum sử dụng 2D [ 13C,
1
H] Các phép đo COSY NMR và mô phỏng liên kết cộng gộp tích lũy. Công nghệ
sinh học Bioeng 83, 75–92.
Varela, C., Agosin, E., Baez, M., Klapa, M. & Stephanopoulos, G.
(2003). Phân phối lại thông lượng trao đổi chất trong Corynebacterium glutamicum để
đối phó với căng thẳng thẩm thấu. Ứng dụng Công nghệ sinh học Microbiol 60, 547–555.
Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, WA & Van Dijken, JP (1992).
Tác dụng của axit benzoic đối với các dòng trao đổi chất trong nấm men: một
nghiên cứu nuôi cấy liên tục về điều hòa hô hấp và lên men rượu. Men 8, 501–
517.
Wiechert, W. (2001). Phân tích thông lượng trao đổi chất 13C . Metab Eng 3,
195–206.
Winzeler, EA, Shoemaker, DD, Astromoff, A. & 22 tác giả khác (1999). Đặc tính
chức năng của bộ gen S. cerevisiae bằng cách xóa gen và phân tích song song.
Khoa học 285, 901–906.
Wittmann, C. & Heinzle, E. (2001). Ứng dụng MALDI-TOF MS để sản xuất lysine
Corynebacterium glutamicum: một phương pháp mới để phân tích thông lượng trao
đổi chất. Eur J Biochem 268, 2441–2455.
Wittmann, C. & Heinzle, E. (2002). Lập hồ sơ phả hệ thông qua cải thiện chủng
bằng cách sử dụng phân tích mạng lưới trao đổi chất: phả hệ dòng trao đổi
chất của một số thế hệ vi khuẩn coryne sản xuất lysine. Appl Vi sinh vật môi
trường 68, 5843–5859.
Wittmann, C., Hans, M. & Heinzle, E. (2002a). Phân tích in vivo về ghi nhãn
axit amin nội bào bằng GC/MS. Thuốc sinh học hậu môn 307,
379–382.
Wittmann, C., Hans, M. & Bluemke, W. (2002b). Sinh lý trao đổi chất của
Kluyveromyces marxianus tạo mùi thơm. Men 19, 1351–1363.
Ye, L., Kruckeberg, AL, Berden, JA & van Dam, K. (1999).
Sự tăng trưởng và ức chế glucose được kiểm soát bởi sự vận chuyển glucose
trong các tế bào Saccharomyces cerevisiae chỉ chứa một chất vận chuyển
glucose. Vi khuẩn J 181, 4673–4675.
Yin, Z., Wilson, S., Hauser, NC, Tournu, H., Hoheisel, JD & Brown, AJ (2003).
Glucose kích hoạt các phản ứng toàn cầu khác nhau trong nấm men, tùy thuộc
vào độ mạnh của tín hiệu và tạm thời ổn định các mRNA protein ribosome. Mol
Microbiol 48, 713–724.
Zamboni, N. & Sauer, U. (2003). Loại bỏ enzym cytochrom aa3 oxidase liên kết
cao làm giảm dòng chu trình TCA ở Bacillus subtilis.
FEMS Microbiol Lett 226, 121–126.
1093