2.

3 KỸ THUẬT ĐẠM

Công nghệ DNA tái tổ hợp cho đến nay đã được chứng minh là một công cụ mạnh mẽ trong việc giải
quyết hiệu quả sản xuất enzyme mục tiêu. Việc áp dụng công nghệ này rõ ràng đã mang lại lợi ích trong
việc giảm nhu cầu năng lượng và nguyên liệu thô được sử dụng trong sản xuất enzym, do đó giảm chi phí
sản xuất. Kết quả là, enzyme với vai trò là chất xúc tác sinh học ngày nay đã trở thành khá dễ dàng sẵn có
và điều này tạo điều kiện thuận lợi cho các ứng dụng enzyme trong các ngành công nghiệp khác nhau.

Tuy nhiên, bên cạnh yếu tố chi phí và tính sẵn có, các vấn đề khác liên quan đến enzyme cũng gặp phải.

Có nguồn gốc từ các dạng sống, enzyme thường chỉ hoạt động trên các chất nền cụ thể trong điều kiện
cụ thể. các điều kiện không phải lúc nào cũng phù hợp với tình hình thực tế (công nghiệp); ví dụ, một
enzyme là thường không đủ mạnh: nó sẽ không hoạt động ở điều kiện pH cần thiết hoặc mất đi khả
năng hoạt động dễ dàng ở nhiệt độ cao, độ pH cực cao hoặc khi tiếp xúc với dung môi.

Đôi khi phản ứng không diễn ra tốt chỉ vì enzyme không phù hợp ứng cử viên, có nghĩa là nó không thể
nhận ra chất nền một cách hiệu quả (giá trị Km của enzyme quá lớn) hoặc tốc độ phản ứng (số vòng quay
của enzyme) quá thấp. Để giải quyết những vấn đề này, một cách tiếp cận là bắt tay vào nhiệm vụ sàng
lọc các vấn đề tự nhiên nguồn tài nguyên của vi sinh vật – mặc dù thường tẻ nhạt và căng thẳng – cho
đến khi có loại enzyme phù hợp được tìm thấy. Trong trường hợp này, nhiều nguồn vi sinh vật đáng tin
cậy và phương pháp canh tác phù hợp điều kiện là cần thiết. Một cách tiếp cận khác là cố gắng sửa đổi
những gì đã có sẵn để cải thiện các đặc tính. Quá trình sửa đổi này được gọi là 'kỹ thuật protein'. Bởi vì
về các đặc tính đặc trưng của enzyme, việc thao tác với protein là không khả thi ở trạng thái hình dạng
hoặc cấu trúc sơ cấp của nó một cách tự do mà không làm mất đi các chức năng vật lý.
 Hình 2.4 Chiến lược nhân bản gen mã hóa SMase

Tuy nhiên, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp, việc biến đổi một protein hoặc một enzyme có thể được thực
hiện ở cấp độ di truyền. Gen mã hóa protein có thể được thay đổi theo cách mà một hoặc nhiều axit
amin cụ thể được trao đổi với các axit amin khác.

Ngoài ra, các axit amin mới có thể được thêm vào hoặc xóa đi. Gen bị biến đổi sau đó được biểu hiện ở
vật chủ thích hợp và các đột biến mang gen biến đổi có thể được sàng lọc hoặc lựa chọn để phù hợp

của cải.

2.3.1 Chiến lược kỹ thuật protein

Lựa chọn chiến lược và phương pháp để thu được enzyme có đặc tính mong muốn dựa vào cả mức độ
được biết về protein hiện có và đặc tính mục tiêu là gì yêu cầu. Nếu một enzyme đã được tinh chế, thông
tin cấu trúc của nó sẽ thu được (thông qua tia X tinh thể học hoặc NMR) và vị trí hoạt động được hiểu rõ
ràng, người ta có thể đưa ra giả thuyết khá chính xác axit amin nào là quan trọng để thực hiện các phản
ứng xúc tác hoặc duy trì enzym ổn định. Trong trường hợp đó, phương pháp gây đột biến hợp lý được sử
dụng tốt nhất.

Các phương pháp gây đột biến hợp lý thường được sử dụng còn được gọi là gây đột biến định hướng tại
chỗ, bao gồm cả đột biến bão hòa và cassette. Mặt khác, nếu cấu trúc bậc ba của một enzyme chưa
được xác định, các phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên sẽ là phương pháp duy nhất sự lựa chọn. Thực
tế, điều này thường xảy ra. Các phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên bao gồm cả phương pháp không
tái tổ hợp và tái tổ hợp, với việc sử dụng các kỹ thuật liên quan đến PCR dễ bị lỗi, các chủng vi khuẩn gây
đột biến và xáo trộn DNA, chỉ kể tên một số.

2.3.1.1 Phương pháp gây đột biến hợp lý

Những nỗ lực để trả lời các câu hỏi như làm thế nào để cải thiện một cách hợp lý khả năng điều nhiệt
hoặc hiệu quả xúc tác của enzyme đối với cơ chất đã được thực hiện cách đây vài thập kỷ. Ví dụ, khi cố
gắng tăng khả năng chịu nhiệt của enzyme, các nghiên cứu ban đầu đã được thực hiện bằng cách so
sánh các enzyme tương đồng có đặc tính rất giống nhau nhưng từ các nguồn khác nhau, chẳng hạn như
các enzyme từ vi khuẩn ưa nhiệt và vi khuẩn ưa nhiệt, để làm sáng tỏ các quy tắc có thể có của trao đổi
axit amin để có khả năng chịu nhiệt tốt hơn. Những nghiên cứu này đã dẫn đến việc phát hiện ra sự thay
thế axit amin như Lys thành Arg, Ser thành Ala, Gly thành Ala, Ser thành Thr, v.v., hầu hết có thể góp
phần làm tăng khả năng chịu nhiệt.22 Sau đó, người ta phát hiện ra rằng khả năng chịu nhiệt tăng có liên
quan nhiều hơn đến độ nén và độ cứng tăng lên của cấu trúc cấp ba của một enzyme. Điều này được gây
ra bởi lực vốn có trong việc điều khiển chuỗi protein về cấu trúc sinh lý của nó. Rõ ràng là lực kỵ nước
tăng lên do sự thay thế axit amin từ Ala thành Gly trong cấu trúc xoắn α của enzyme, có thể dẫn đến
trong việc tăng khả năng chịu nhiệt. Các lực khác như liên kết hydro, tĩnh điện tầm xa và liên kết ion cũng
có một số tác dụng. Số lượng cầu nối disulphide tăng lên giữa Dư lượng cystein không có tác dụng rõ
ràng, mặc dù nó giúp ổn định enzyme trong một cách khác (xem Phần 3.4.1). Vì vậy, để tăng tính ổn định
của enzyme, sự thay thế các axit amin trong cấu trúc xoắn ốc nhằm tăng cường các hoạt động kỵ nước là
một trong những biện pháp hợp lý cần thực hiện. Cố gắng cải thiện các thuộc tính khác, chẳng hạn như
tăng

Tuy nhiên, hiệu quả xúc tác của enzyme đối với một cơ chất cụ thể cao hơn nhiều. phức tap. Nó phụ
thuộc vào cấu trúc và kích thước của cơ chất, cấu trúc và môi trường xung quanh vị trí liên kết cơ chất,
khả năng tương tác giữa các axit amin tại vị trí phản ứng với chất nền, v.v. Thiết kế hợp lý của vị trí đột
biến đôi khi cần sự trợ giúp của mô hình máy tính và mô phỏng toán học.
 Hình 2.5 Sơ đồ phương pháp gây đột biến định hướng tại chỗ. Nguồn: Bộ công cụ gây đột biến định
hướng trang web QuickChangeR II (Stratagene).

Đột biến định hướng tại chỗ Đây là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất trong gây đột biến hợp lý. Một
khi một axit amin (hoặc axit amin) cần thay đổi đã được quyết định, mồi được thiết kế bao gồm DNA mã
hóa trình tự cho axit amin được thay thế (với các trình tự còn lại còn nguyên vẹn). Chúng được áp dụng
để khuếch đại PCR gen đã được tích hợp trên vectơ và phục vụ như là mẫu. Hình 2.5 thể hiện sơ đồ của
phương pháp site-directed gây đột biến bằng kỹ thuật PCR. Với phương pháp này, các axit amin nằm ở
bất kỳ vị trí nào trên gen có thể được trao đổi với 19 axit amin tự nhiên khác. Phương pháp gây đột biến
định hướng tại chỗ trong đó một axit amin quan trọng được trao đổi với tất cả các axit amin khác 19 axit
amin để tìm ra đột biến tốt nhất được gọi là đột biến bão hòa. Các phương pháp gây đột biến định
hướng tại chỗ trên một vùng (với một số axit amin) bao gồm tất cả sự kết hợp có thể xảy ra (băng
cassette) được gọi là đột biến băng cassette.
2.3.1.2 Đột biến ngẫu nhiên

Do kỹ thuật xác định cấu trúc cấp ba của enzyme vẫn chưa hiệu quả đủ và thường không có thông tin về
việc nên thay đổi axit amin nào, đột biến ngẫu nhiên là sự lựa chọn hiển nhiên. Một thư viện chứa càng
nhiều người đột biến càng tốt được tạo ra và các đột biến có đặc tính mong muốn sau đó sẽ được chọn
hoặc sàng lọc. Có nhiều các phương pháp được phát triển để tạo hiệu quả các thư viện đột biến với kích
thước đủ lớn cho tìm kiếm các đột biến tiềm năng. Chúng bao gồm các phương pháp không tái tổ hợp và
tái tổ hợp.

Các phương pháp không tái tổ hợp bao gồm PCR dễ xảy ra lỗi và sử dụng các chủng vi khuẩn gây đột biến

nhằm tạo ra các đột biến ngẫu nhiên trong chuỗi gen. Phương pháp tái tổ hợp liên quan đến việc nối và
nối lại các trình tự DNA giống hệt nhau hoặc rất giống nhau (tương đồng tái tổ hợp) hoặc các trình tự
DNA khác nhau rõ rệt (tái tổ hợp không tương đồng).

Các thư viện được xây dựng sau đó được sàng lọc hoặc lựa chọn bằng các phương pháp thích hợp cho
đột biến enzyme mục tiêu. Phương pháp tái tổ hợp còn được gọi là tiến hóa có định hướng. có thể được
thực hiện cả in vivo và in vitro.

PCR dễ bị lỗi

Enzym DNA polymerase, thực hiện các phản ứng khuếch đại DNA, thường có độ trung thực rất cao. Tuy
nhiên, đôi khi các nucleotide sai có thể được kết hợp ở một tần số theo thứ tự 10−4 (chẳng hạn như Taq-
polymerase trong Tài liệu tham khảo [24]. Các điều kiện phản ứng, chẳng hạn như nồng độ MgCl2 hoặc
nồng độ cơ chất của dCTP và dTTP hoặc lượng của enzyme Taq, có thể được điều chỉnh để đạt được tỷ lệ
lỗi mong muốn, lý tưởng nhất là đạt được một hoặc hai thay đổi axit amin trên mỗi gen.

Các chủng vi khuẩn đột biến

Một số vi khuẩn như E. coli hoang dã có khả năng đột biến tự phát với tốc độ 2,5 × 10−4 đột biến trên
1000 nucleotide DNA được mang trên plasmid sau 30 thế hệ của sự tăng trưởng. Những chủng này được
sử dụng làm tác nhân gây đột biến. Gen của enzyme mục tiêu là nhân bản vào một plasmid và sau đó
plasmid này được đưa vào chủng gây đột biến. Sau đó canh tác, một quần thể chủng có nhiều đột biến
khác nhau sẽ được tạo ra và sau đó được sàng lọc đối với các đột biến mong muốn.

Xáo trộn DNA

Stemmer25 lần đầu tiên đưa ra khái niệm về kỹ thuật này. Quần thể DNA ban đầu các chuỗi được phân
mảnh ngẫu nhiên và tập hợp lại thành các chuỗi có chiều dài đầy đủ, ảo tưởng bằng cách PCR. Trình tự
DNA ban đầu có thể từ cùng một họ và có tính tương đồng cao (còn gọi là xáo trộn gia đình). Cái gọi là
xáo trộn gen đơn là để phân chia phần khởi đầu gen và tạo ra các đột biến trong khi tập hợp lại gen bằng
cách tận dụng lợi thế của chức năng lỗi của polymerase trong phản ứng PCR trong các điều kiện cụ thể.
So với PCR dễ bị lỗi, việc xáo trộn gen đơn lẻ có thể dẫn đến nhiều đột biến hơn trong khi gia đình việc
xáo trộn cho phép trao đổi các đoạn trình tự lớn giữa các gen, do đó đáng kể đẩy nhanh hiệu quả của
quá trình biến đổi enzyme. Phương pháp này đã được mở rộng để tái tổ hợp các trình tự DNA không
tương đồng bao gồm cả việc xáo trộn toàn bộ bộ gen. hoặc ít hơn tương ứng với đột biến cổ điển bằng
cách nhân giống. Hình 2.6 thể hiện sơ đồ của xáo trộn DNA.
 Hình 2.6 Sơ đồ xáo trộn DNA.

2.3.2 Hệ thống biểu hiện gen

Các gen biến đổi được tạo ra bằng tất cả các loại phương pháp cần phải được biểu hiện ở các vật chủ
phù hợp để được sàng lọc hoặc lựa chọn cho các thuộc tính mong muốn. Máy chủ được sử dụng phổ
biến nhất là một loại vi khuẩn gram âm E. coli vì người ta đã tích lũy được một lượng kiến thức khổng lồ
về hệ thống này. Các hệ thống khác bao gồm vi khuẩn gram dương Bacillus, Clostridium, Lactococcus,
Staphylococcus và Streptomyces, và các hệ thống nhân chuẩn như nấm men và hệ thống adenovirus
Nguyên tắc lựa chọn máy chủ biểu thức phù hợp cũng giống như được mô tả ở phần 2.2 trên cơ thể vật
chủ.
2.3.3 Lựa chọn và sàng lọc

Để phân loại protein đột biến có đặc tính quan tâm, cần có chiến lược lựa chọn hoặc phương pháp sàng
lọc là rất quan trọng. Lựa chọn bao gồm việc áp dụng một hoặc nhiều quy trình trong xét nghiệm hệ
thống sao cho chỉ còn lại những đột biến mong muốn. Sàng lọc đặt tất cả các đột biến được biểu hiện
theo một hệ thống khảo nghiệm cho đặc tính mong muốn. Kết quả của các xét nghiệm này được so sánh
và những đột biến có hiệu suất tốt nhất sẽ được chọn. Rất thường những đột biến được chọn là không
tốt đủ, do đó quá trình gây đột biến cần phải được lặp lại. Trong mỗi đợt đột biến, một lượng nhỏ những
thay đổi được tích lũy cho đến khi cuối cùng một dị nhân trở thành một ứng cử viên ưng ý.

Có thể có những quy tắc áp dụng cho các phương pháp lựa chọn đối với những đặc tính mong muốn
nhất định, ví dụ về khả năng chịu nhiệt Đột biến có thể được xử lý ở nhiệt độ cần thiết trong một thời
gian nhất định sao cho sau khi xử lý, chỉ những cá thể đột biến sống sót mới có khả năng ổn định nhiệt
như mong muốn.

Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, các phương pháp lựa chọn hoặc sàng lọc phải được điều chỉnh
cho phù hợp với từng cá nhân. enzyme cho các yêu cầu cụ thể về tính chất của chúng được cải thiện.

2.3.3.1 Sàng lọc thông lượng cao

Bởi vì hầu hết các đột biến là tiêu cực và chỉ một phần nhỏ của những thay đổi tinh vi mới dẫn đến sự cải
tiến thực sự của một loại enzyme, cần phải có một thư viện có đủ số lượng đột biến được xây dựng và
sàng lọc để tìm ra các đột biến mong muốn. Nếu một hệ thống phát hiện dễ dàng sẵn có, chẳng hạn như
xác định các đột biến dương tính bằng thuốc thử màu, có thể áp dụng thiết bị tự động để sàng lọc hiệu
quả. Ngày nay, sàng lọc thông lượng cao đã trở thành hoạt động thường lệ tại các cơ sở nghiên cứu liên
quan đến việc phát triển các sản phẩm khả thi về mặt công nghiệp enzym.

2.3.4 Ứng dụng của kỹ thuật protein – một phương pháp mạnh mẽ công cụ để phát triển enzyme như
chất xúc tác sinh học ứng dụng

2.3.4.1 Ví dụ về cải thiện khả năng chịu nhiệt và thay đổi độ pH tối ưu

Enzyme công nghiệp cần phải ổn định trong môi trường làm việc. Để cải thiện một enzyme sự ổn định ở
nhiệt độ cao là một trong những nỗ lực sớm nhất của kỹ thuật protein. MỘT đánh giá của
Goodenough26 đã tổng hợp các yếu tố liên quan đến khả năng chịu nhiệt. Bằng sự hiểu biết về tính chất
hóa học của quá trình gấp và mở của protein, người ta tìm thấy lực kỵ nước là động lực chính để gấp, do
đó có vai trò chính trong khả năng chịu nhiệt. Kỹ thuật xử lý protein, bằng cách tăng lực kỵ nước của các
cấu trúc xoắn ốc thứ cấp, đã đã chứng minh một chiến lược khả thi để tăng khả năng chịu nhiệt của cấu
trúc protein đã biết.

Liu và Wang27 đã báo cáo về kỹ thuật tạo glucoamylase từ Aspergillus awamori để tăng khả năng chịu
nhiệt. Glucoamylase (EC3.2.1.3) là một trong những enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghiệp
thực phẩm. Nó xúc tác cho phản ứng thủy phân các phân tử tinh bột từ đầu không giảm. Điều kiện sử
dụng enzyme đòi hỏi nhiệt độ cao, cải thiện tốc độ phản ứng, giảm độ nhớt của xi-rô để dễ chế biến và
giảm nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn. Cấu trúc bậc ba và bậc hai của enzyme có đã được xác định, nhưng mối
quan hệ cấu trúc-chức năng của chúng vẫn chưa rõ ràng. Lưu và Vương đã thực hiện cái gọi là 'mô phỏng
động lực phân tử' và phát hiện ra rằng thế hệ thứ 11 Chuỗi xoắn α trong số 13 chuỗi xoắn α nằm trên bề
mặt của vùng xúc tác là rất không ổn định. Khi enzym bị giải phóng ở nhiệt độ biến tính, vị trí của Bazơ
xúc tác đã được chuyển khỏi phần kỵ nước bên trong được cung cấp bởi chuỗi xoắn thứ 12 và 13 Lên bề
mặt. Các vị trí (dư lượng axit amin) cần được thay đổi cho kỹ thuật enzyme để tăng khả năng chịu nhiệt
của nó đã được xác định. Theo trước đó nghiên cứu cho thấy rằng việc đưa vào các liên kết disulphide
giữa các vùng linh hoạt rất có thể góp phần vào khả năng chịu nhiệt, các đột biến thu được tạo thành
disulphide liên kết trên chuỗi xoắn thứ 11 và tăng khả năng chịu nhiệt của enzyme. Trao đổi một số Dư
lượng Gly gần chuỗi xoắn thứ 12 và 13 thành Ala, nhằm tăng tính kỵ nước của khu vực này, cũng dẫn đến
tăng khả năng chịu nhiệt.

Ngành công nghiệp enzyme thực phẩm liên tục cố gắng cải thiện toàn bộ quá trình thủy phân tinh bột
sang xi-rô có hàm lượng fructose cao. Quá trình này liên quan đến hoạt động của ít nhất ba enzym: một
α-amylase để hóa lỏng tinh bột, glucoamylase nói trên để giải phóng glucose đơn vị và một enzyme đồng
phân glucose (chính xác là xyloza isomerase) để chuyển đổi glucose thành fructose.

Những enzyme này xuất hiện tự nhiên và có độ pH tối ưu ở mức 5,5–6,0, 4–4,5 và 7,0–8,0, tương ứng.
Do đó, theo truyền thống, ba bước này phải được thực hiện riêng biệt và giữa các phản ứng, độ pH phải
được điều chỉnh để mỗi enzyme hoạt động tốt nhất. Cái này gây ra sự gia tăng nồng độ muối không cần
thiết và phải tuân theo các thủ tục bổ sung để loại bỏ hoặc thanh lọc. Vì cấu trúc bậc ba của một số
enzyme glucoamylase đã được xác định, kỹ thuật xử lý protein là một phương pháp thuận tiện để thay
đổi enzyme thành chất xúc tác sinh học phù hợp hơn. Fang và Ford đã báo cáo về kỹ thuật tạo ra
glucoamylase từ A. awamori để thay đổi độ pH tối ưu của nó.28 Enzim này có hai gốc Glam (ở 179 và
400) tại vị trí xúc tác. Một trong số chúng đóng vai trò là axit xúc tác, cái còn lại đóng vai trò là bazơ xúc
tác. Sự phụ thuộc pH của enzyme được xác định bởi sự ion hóa của các nhóm xúc tác bị ảnh hưởng bởi
các tương tác khác nhau xung quanh môi trường vi mô của chúng.

Với enzyme này, các biến đổi của Glam179 và Glam400 ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của chúng
(được biểu thị bằng pK1 và pK2 tương ứng) có thể sẽ thay đổi độ pH tối ưu của nó. Bằng cách so sánh
cấu trúc của enzyme với cấu trúc từ các nguồn khác, chẳng hạn như Arxula adeninivorans, S. cerevisiae,
S. diastaticus và Saccharomycopsis, người ta phát hiện ra rằng axit amin ở vị trí 411 gần vị trí xúc tác có
sự khác biệt về enzyme với các vi sinh vật khác nhau: một số enzyme có Gly ở vị trí này, trong khi Ser
được tìm thấy ở các enzyme từ vị trí khác. nguồn. Vì các enzyme từ các nguồn khác có độ pH tối ưu ít
nhiều chuyển sang về mặt kiềm, S411 được ước tính đóng vai trò quan trọng trong việc xác định độ pH
tối ưu của enzym. Vì lý do đó, chất cặn này được chọn làm vị trí mục tiêu cho quá trình gây đột biến.

Đột biến được tạo ra bao gồm S411G, S411A, S411C, S411H và S411D có dư lượng serine lần lượt được
thay thế bằng Gly, Ala, Cys, His và Asp. S411G, S411A và S411C được tạo ra nhằm loại bỏ liên kết hydro
giữa SER411 và Glam400 của bazơ xúc tác làm cho dạng ion cacboxylat bị mất ổn định, dẫn đến hiện
tượng pK1 tăng. Các đột biến với His và Asp thay thế serine nhằm mục đích loại bỏ liên kết hydro và tạo
ra các điện tích dương hoặc âm. Kết quả là S411H và Cả S411D đều có pK1 tăng nhưng pK2 giảm. Cái
trước có thể được giải thích vì điện tích dương của histidine ổn định tương tác tĩnh điện giữa đó của
histidine và axit xúc tác của Glam179, chất sau do kích thước của bên tăng lên xích. Lực tĩnh điện cũng
được coi là có một số ảnh hưởng đến tính chất pH của enzim.

Những ví dụ này cho thấy sự hiểu biết về cấu trúc protein rất quan trọng trong việc xác định các vị trí xảy
ra đột biến và gây đột biến định hướng tại chỗ là một cách hiệu quả để cải thiện khả năng hoạt động của
enzyme tài sản phù hợp hơn với các ứng dụng công nghiệp.
2.3.4.2 Ví dụ về tăng hiệu suất xúc tác

Một ví dụ được đưa ra bởi Toyama et al.29 chứng minh cách sử dụng phương pháp gây đột biến trực
tiếp để thiết kế Streptomyces cholesterol oxydase để tăng hiệu quả xúc tác của nó. Cholesterol oxidase
(EC1.1.3.6) xúc tác quá trình oxy hóa cholesterol thành 5-cholesten-3-one cũng như quá trình đồng phân
hóa steroid với mối nối vòng A:B chuyển hóa để tạo ra 4-cholesten-3-one.

Enzyme này rất hữu ích trong việc phát hiện mức cholesterol trong huyết thanh người và phân tích hàm
lượng steroid của nguyên liệu thực phẩm. So sánh trình tự sơ cấp và trình tự thứ ba đã biết tiết lộ cấu
trúc của Streptomyces cholesterol oxidase với Brevibacteria sterolicum rằng hai enzyme có tính tương
đồng rất cao (độ đồng nhất 59% và độ tương tự 92%). Các axit amin ở vị trí liên kết cơ chất giống hệt
nhau nhưng có một số axit amin ở gần đó trang web này là khác nhau Các axit amin này tạo thành một
vòng có vẻ như hoạt động như một cái nắp trên trang web đang hoạt động. Bởi vì Streptomyces
cholesterol oxidase có kcat/Km cao hơn thế rất nhiều của enzyme từ B. sterolicum, cho thấy hiệu quả xúc
tác tốt hơn, những chất tạo vòng này axit amin được cho là quan trọng đối với các hoạt động liên kết cơ
chất. Những đột biến được tạo ra ở đây các vị trí sử dụng phương pháp gây đột biến định hướng vị trí
được đánh giá về hiệu quả xúc tác. Hai đột biến (V145Q và S379T) có hoạt động thay đổi. V145Q cho
thấy hoạt động thấp hơn đối với tất cả các chất nền trong khi S379T cho thấy kcat cao hơn một chút và
Km nhỏ hơn, dẫn đến hiệu suất gấp 1,8 lần hoạt tính xúc tác cao hơn đối với cholesterol cơ chất và hoạt
động xúc tác cao hơn 6 lần hướng tới pregnenolone.

Hiệu suất xúc tác là yếu tố quyết định khả năng cạnh tranh của phản ứng enzyme với các phản ứng được
thực hiện bởi các chất xúc tác hóa học. Khả năng cải thiện chất xúc tác

Tính chất của enzyme có tác động cơ bản đến việc mở rộng ứng dụng enzyme như chất xúc tác.

2.3.4.3 Ví dụ về thay đổi tính đặc hiệu của cơ chất

Gần đây, nhóm của Iwasaki tại Đại học Nagoya ở Nhật Bản đã báo cáo về việc thay đổi chất nền tính đặc
hiệu của Streptomyces PLD đáng kể do đột biến bão hòa định hướng tại chỗ.30

PLD là một enzyme quan trọng được sử dụng để tổng hợp các phospholipid chức năng từ tự nhiên.
lecithin của đậu nành hoặc lòng đỏ trứng, với sự có mặt của rượu (xem Phần 2.2.4.1). Tuy nhiên, enzyme
này không có khả năng tổng hợp phosphatidylinositol, một loại phospholipid quan trọng có chức năng
làm giảm nồng độ triacylglycerol trong huyết thanh và gan.31 Một enzyme PLD từ kháng sinh
Streptomyces đã được tinh chế và xác định cấu trúc bậc ba với enzyme nguyên vẹn và dạng không hoạt
động của nó (đột biến H168A) khi tạo phức với dihexanylphosphatidylcholine. Cấu trúc bậc ba và kiến
thức về cơ chế phản ứng của enzyme đã được sử dụng để dự đoán ba vị trí, W187, Y191 và Y385, rất
quan trọng để nhận dạng cơ chất. So với các phân tử rượu khác, inositol khá cồng kềnh.

Vì vậy, chiến lược gây đột biến được thiết kế để tạo ra các đột biến ở ba vị trí này. sẽ có không gian rộng
hơn để các phân tử cồng kềnh tiếp cận dễ dàng hơn. Đột biến bão hòa phương pháp đã được áp dụng
để tạo thư viện đột biến.

Đột biến đồng thời ở ba vị trí tạo ra 203 = 8000 biến thể (20 amino tự nhiên axit). Để đạt được độ bao
phủ 95% trong sàng lọc, cần sàng lọc 23 694 khuẩn lạc. Các Phương pháp hiện tại để phát hiện
phosphatidylinositol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc sắc ký lớp mỏng (TLC) tốn nhiều thời
gian và gần như không thể sàng lọc kích thước thư viện này bằng các hệ thống xét nghiệm thông thường.
Vì vậy, một phương pháp phù hợp để phát hiện các đột biến có hoạt tính tổng hợp phosphatidylinositol
là được thiết kế. Trong phương pháp này, sản phẩm (phosphatidylinositol) được oxy hóa bằng Periodat
để tạo thành aldehyd lipid, chất này phản ứng với 4-hydrazino-7-nitrobenzofurazan (NBDhydrazine) để
tạo thành NBD-hydrazone phát huỳnh quang mạnh. Bằng phương pháp này, năng suất cao sàng lọc đã
được thực hiện và khoảng 10.000 đột biến đã được sàng lọc. Trong đó có 25 dương tính đã được phát
hiện để có thể tổng hợp phosphatidylinositol và các dạng đồng phân khác nhau của nó. Ví dụ này không
chỉ chứng minh tầm quan trọng của việc dự đoán chính xác axit amin dư lượng là mục tiêu gây đột biến
nhưng cũng có tầm quan trọng của một hệ thống phát hiện thích hợp để lựa chọn hoặc sàng lọc các đột
biến mong muốn. Cả hai đều quan trọng để sửa đổi hiệu quả của một enzym. Để làm được điều này, sự
kết hợp tối ưu giữa kiến thức về vật lý, cấu trúc và enzyme hóa học là cần thiết.

2.3.4.4 Ví dụ về thay đổi độ chọn lọc

Một số enzyme nhận biết và hoạt động trên nhiều cơ chất trong khi một số khác thực hiện các phản ứng
phụ.

Kỹ thuật protein cũng có thể được áp dụng để thay đổi tính chọn lọc của enzyme. PLA2 tuyến tụy lợn đã
được sửa đổi để có tính chọn lọc tốt hơn đối với các chất mang điện tích âm bởi đột biến định hướng tại
chỗ.32 PLA2, như được mô tả trong Phần 2.2.4.2, là một enzyme hữu ích không chỉ trong công nghiệp
thực phẩm mà còn trong sản xuất phospholipid loại hóa chất tốt cho hệ thống phân phối thuốc. Enzym
nhận biết và thủy phân nhiều phospholipid với nhóm đầu mang điện tích âm hoặc điện tích âm. Cấu trúc
tinh thể của enzyme đã được xác định và dư lượng axit amin trong vùng để liên kết với đầu nhóm
phospholipid được phân tích. Ở vùng này, hai axit amin tích điện dương các nhóm Arg53 và Arg43 được
cho là chịu trách nhiệm liên kết thuận lợi với tiêu cực phospholipid tích điện. Liền kề với vùng này là
Glam46 tích điện âm được xác định thêm là dư lượng có thể ảnh hưởng bất lợi đến liên kết với cực âm.
nhóm đầu tích điện của phospholipid. Một dị nhân đã trao đổi Glam thành Lys (E46L) được giới thiệu bởi
đột biến định hướng tại chỗ. Người đột biến này thực sự đã được phát hiện là có khả năng liên kết hiệu
quả hơn đối với các chất nền có nhóm đầu tích điện âm.

Một ví dụ khác về việc thay đổi tính chọn lọc của enzyme bằng kỹ thuật protein là giảm hoạt tính thủy
phân của men tổng hợp malto-oligotrehalose so với hoạt động tổng hợp của nó nhằm tăng hiệu suất sản
xuất trehalose. Malto-oligosyltrehalose synthase (EC 5.4.99.15, MTSase) xúc tác cho phản ứng chuyển
hóa nội phân tử thành tạo ra malto-oligosyltrehalose không khử bằng cách chuyển đổi liên kết α-1,4-
glucosidic ở đầu khử của malto-oligosaccharide thành liên kết α,α-1,1-glucosidic. Maltooligosyltrehalose
sau đó có thể bị thủy phân bởi malto-oligosyltrehalose trehalohydrolase (EC 3.2.1.141, MTHase) để sản
xuất trehalose, một loại đường được sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản, chất ổn định thực phẩm và
thành phần mỹ phẩm. Bên cạnh phản ứng tổng hợp, MTSase còn thực hiện phản ứng thủy phân các
phân tử tinh bột để tạo ra glucose thay vì malto-oligosyltrehalose.

Tỷ lệ thủy phân so với quá trình chuyển hóa glycosyl ảnh hưởng đến năng suất sản xuất trehalose.

Một nỗ lực nhằm biến đổi enzyme nhằm giảm tính chọn lọc trong quá trình thủy phân là báo cáo của
Fang et al.33–35 Enzim được chọn từ Sulfolobus solfataricus. Enzym nghiên cứu động học cho thấy dư
lượng axit amin có thể có (Asp228, Glam255 và Asp443) trong vị trí hoạt động, rất quan trọng cho các
phản ứng xúc tác. Dư lượng axit amin gần địa điểm này (+1 và −1) được đề xuất là chịu trách nhiệm lựa
chọn các phản ứng xúc tác hướng tới chuyển hóa hoặc hướng tới thủy phân. Do đó, phương pháp gây
đột biến định hướng tại chỗ tại các vùng này đã được chọn để cố gắng tăng cường tính chọn lọc đối với
quá trình chuyển hóa glycosyl. Một người đột biến ở vùng +1, F405Y, được cho là làm giảm quá trình
thủy phân. Trao đổi từ Phe tới Tyr làm giảm tương tác kỵ nước giữa phân tử enzyme và cơ chất.

Đột biến tiếp theo ở vùng này được thực hiện để hiểu biết chung về quy luật nhằm tạo ra các đột biến ít
chọn lọc trong quá trình thủy phân để phục vụ sản xuất công nghiệp trehalose có thể được cải thiện rất
nhiều. Những đột biến này, bao gồm F405M, F405S và F405W, cho thấy sự giảm tương tác kỵ nước giữa
enzyme và cơ chất thực sự, nói chung, dẫn đến tính chọn lọc tốt hơn đối với quá trình chuyển hóa
glycosyl so với quá trình thủy phân.

Tuy nhiên, với đột biến F405Y thì thu được hiệu suất trehalose cao nhất, chứng tỏ rằng nó là một chất
xúc tác sinh học có khả năng phù hợp hơn. Tuy nhiên, các đột biến được thiết kế để giảm tương tác kỵ
nước giữa enzyme và cơ chất ở vùng −1 không tạo ra một đột biến tích cực, cho thấy sự phức tạp của
các lực và sự tương tác tồn tại trong môi trường vi mô của cấu trúc ba chiều của enzyme.