Machine Translated by Google

Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337

Danh sách nội dung có sẵn tại ScienceDirect

Sinh học ma trận

Journalh om epage: www. els ev tức là r. c om / định vị / matbio

Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân hyaluronan được xúc tác bởi hyaluronidase khi có
mặt của protein: Phần I. Khía cạnh kép của sự phụ thuộc vào pH

Hélène Lenormand, Brigitte Deschrevel, Jean-Claude Vincent

⁎
Laboratoire “Polymères, Biopolymères, Surfaces”, FRE 3101 CNRS - Université de Rouen, 76821 Mont-Saint-Aignan cedex, Pháp

thông tin bài viết trừu tượng

Lịch sử bài viết: Quá trình thủy phân hyaluronan (HA) được xúc tác bởi hyaluronidase (HAase) bị ức chế mạnh khi thực hiện ở
Nhận ngày 1 tháng 8 năm 2009 một tỷ lệ HAase thấp so với nồng độ HA và ở cường độ ion thấp. Điều này là do các chuỗi HA dài có thể tạo
Đã nhận ở mẫu sửa đổi ngày 9 tháng 11 năm 2009
thành các phức hợp không hoạt động với HAase. Albumin huyết thanh bò (BSA) có thể cạnh tranh với HAase để
Được chấp nhận ngày 17 tháng 12 năm 2009
tạo phức tĩnh điện với HA để giải phóng HAase, sau đó phục hồi hoạt tính xúc tác của nó. Sự phụ thuộc BSA
này được đặc trưng bởi hai miền chính được phân tách bởi nồng độ BSA tối ưu: dưới nồng độ này, hoạt độ
Từ khóa:
HAase tăng khi tăng nồng độ BSA, trên nồng độ này hoạt tính HAase giảm. Điều này xảy ra với điều kiện là HA
Hyaluronan
tích điện âm và BSA tích điện dương, tức là trong phạm vi pH từ 3 đến 5,25. Giá trị pH càng cao thì nồng độ
Hyaluronidase
Albumin huyết thanh bò BSA tối ưu càng cao. Các protein khác cũng có thể điều chỉnh hoạt động của HAase. Lysozyme, có pI cao hơn
Lysozyme BSA, cũng có thể cạnh tranh với HAase để tạo phức tĩnh điện với HA và giải phóng HAase. Điều này xảy ra trên
Polysaccharide-phức hợp protein phụ một phạm vi pH rộng hơn kéo dài từ 3 đến 9. Những kết quả này có nghĩa là HAase có thể tạo phức với HA và
thuộc vào pH phục hồi hoạt tính enzym của nó ở pH cao đến 9, phù hợp với việc HAase có giá trị pI cao hoặc các mảng tích
Tốc độ thủy phân điện dương trên bề mặt của nó ở pH cao. Cuối cùng, sự phụ thuộc vào pH của hoạt động HAase, do ảnh hưởng
của pH lên cả hoạt tính HAase nội tại và sự hình thành phức hợp giữa HAase và HA, cho thấy mức tối đa ở pH
4 và hoạt độ đáng kể lên đến pH 9. © 2009 Elsevier BV Bảo lưu mọi quyền.

1. Giới thiệu
Hyaluronan (HA) là một polysaccharide hiện diện trong chất nền ngoài
tế bào (ECM) của các mô liên kết, đang phát triển và khối u, nơi nó tham
gia vào quá trình kết dính, di động và biệt hóa của tế bào (Catterall,
1995; Delpech và cộng sự, 1997; Kennedy và cộng sự. , 2002; Laurent,
1987; Rooney và cộng sự, 1995; Girish và Kemparaju, 2007). Nó là một
polyelectrolyte có khối lượng mol cao bao gồm các đơn vị disaccharide
axit D-glucuronic-β (1,3) -N-acetyl D-glucosamine liên kết với nhau thông
qua liên kết β (1,4) glycosidic. HA là cơ chất của hyaluronidase (HAase).
HAase có ở động vật có vú, côn trùng, ký sinh trùng và vi khuẩn (Csóka và
cộng sự, 1997). Trong cơ thể con người, HAase được tìm thấy trong các cơ
quan khác nhau (tinh hoàn, da, gan, thận, tử cung, v.v.) và dịch cơ thể
(huyết tương, tinh trùng, nước tiểu, v.v.). Việc tinh chế HAase đầu tiên
của con người (Frost và cộng sự, 1997) cùng với nhiều nghiên cứu gần đây
đã nâng cao kiến thức của chúng ta về HAase ở người (Csóka và cộng sự,
2001). Tổng quát hơn, có ba loại HAase tồn tại, được phân loại theo cơ
chế phân cắt của chúng (Meyer, 1971); một trong số chúng, thuộc loại tinh
hoàn, bao gồm HAase của người, thủy phân các liên kết glycosidic ở vị
trí β (1,4) để tạo ra, thường là, oligosaccharid. Vì các oligosaccharid
HA (4 đến 25 disaccharid) có tác dụng tạo mạch (Rooney và cộng sự, 1995;
West và cộng sự, 1985; West và Kumar, 1989) trái ngược với HA bản địa
(Deed và cộng sự, 1997), tỷ lệ giữa HA trọng lượng phân tử cao và HA
trọng lượng phân tử thấp đóng một vai trò trong sự phát triển ung thư
(Stern, 2008; Mio và Stern, 2002). Tỷ lệ này ít nhất được kiểm soát một
phần bởi hoạt động của HAase (Delpech và cộng sự, 1997; Mio và Stern,
2002; Cameron, 1966).
Tương tác giữa protein và polyelectrolytes từ lâu đã được quan tâm
trong một số lĩnh vực: kiểm soát kết cấu trong công nghiệp thực phẩm
(Tolstoguzov, 1986), cố định enzyme (Kokufuta, 1992) và tinh sạch protein
(Dubin và cộng sự, 1994). Tương tác giữa DNA và protein cũng đã được
nghiên cứu rộng rãi (Tsodikov và cộng sự, 2001). Hầu hết các nghiên cứu
về phức hợp protein-polysaccharide đã được Schmitt và cộng sự xem xét.
(1998) và Cooper et al. (2005). Hai lớp chính có thể được phân biệt đối
với phức chất tĩnh điện: i) phức chất không hòa tan trung hòa ở sự phân
tách pha khi điện tích dương thuần của một trong các phân tử sinh học bù
chính xác điện tích âm thuần của phân tử kia, và ii) phức mang điện, khi
vượt quá điện tích tồn tại, được duy trì ở dạng huyền phù bằng cách
solvat hóa và có thể tạo ra độ đục. Mặc dù sự liên kết của các
polyelectrolyte tổng hợp với nhau thường liên quan đến các tương tác
không đặc hiệu, sự liên kết của DNA với protein thường liên quan đến các
tương tác cụ thể dẫn đến sự nhận biết; trong trường hợp thứ hai, trình
tự không lặp lại của DNA tạo ra ái lực và tính đặc hiệu của liên kết. HA,
giống như DNA, là một polyanion và một số protein liên kết với HA tồn

⁎ Đồng tác giả. ĐT: +33 2 35 14 67 42; fax: +33 2 35 14 67 04.

tại như CD44 (Kennedy và cộng sự, 2002), Rhamm (Kennedy và cộng sự,
Địa chỉ email: jean-claude.vincent@univ-rouen.fr (J.-C. Vincent).

0945-053X / $ - xem vấn đề phía trước © 2009 Elsevier BV Mọi quyền được bảo lưu.

doi: 10.1016 / j.matbio.2009.12.007

Machine Translated by Google
H. Lenormand và cộng sự. / Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337
2002), TSG-6 (Parkar và cộng sự, 1998), và hyaluronectin (Delpech và cộng
sự, 1993). Tuy nhiên, cấu trúc cơ bản lặp đi lặp lại của HA cũng có thể cho
phép liên kết không đặc hiệu với protein, như trường hợp của các poly
saccharide khác (Seyrek và cộng sự, 2003; Lào và cộng sự, 2007).
Khả năng tạo phức không đặc hiệu của HA và protein từ lâu đã được biết
đến. Phương pháp ngăn chặn khe Mucin (Robertson và cộng sự, 1940) và phương
pháp đo độ đục (Dorfman và Ott, 1948) đã được phát triển để kiểm tra HAase
bằng cách đo sự biến mất của độ đục do các phức chất hình thành giữa chuỗi
HA dài và albumin trong điều kiện axit. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã xác
định đặc điểm của các phức hợp hình thành giữa HA và albumin huyết thanh bò
(BSA). Xu và cộng sự. (2000) đã nghiên cứu hỗn hợp HA và BSA và cho thấy cả
bản chất tĩnh điện của tương tác giữa hai phân tử và ảnh hưởng mạnh mẽ của
pH đến độ hòa tan của phức HA-BSA. Phức hợp HA – BSA cũng được nghiên cứu
bởi Grymonpré et al. (2001) người đã đặc biệt tập trung vào ảnh hưởng của
cả độ pH và cường độ ion đối với sự tồn tại và độ hòa tan của các phức chất.
Cũng đã có báo cáo rằng BSA có thể kích hoạt HAase.
Gacesa và cộng sự. (1981) phát hiện ra rằng protein huyết thanh tăng cường
hoạt động xúc tác của HAase và albumin có tác dụng lớn nhất. Gold (1980)
quan sát thấy BSA có thể kích hoạt cả HAase gan người và HAase tinh hoàn bò
ở pH 4. Maingonnat et al. (1999) cho thấy BSA và các protein khác như
hyaluronectin, hemoglobin và immunoglobulin có thể tăng cường hoạt động
HAase của khối u ở pH 3,8 và do đó làm tăng độ nhạy phát hiện HAase. Sự tăng
cường hoạt động của HAase như vậy cũng phụ thuộc vào nồng độ của các protein
này (Maingonnat và cộng sự, 1999).
Do đó, polysaccharid và protein có thể tạo phức trong vùng pH được phân
định rõ ràng (Schmitt và cộng sự, 1998) bằng cách thiết lập các liên kết tĩnh
điện giữa polysaccharid tích điện âm và protein tích điện dương. HAase tinh
hoàn của bò, có bán trên thị trường và thuộc cùng loại với HAase ở người,
đã được chọn làm mô hình cho các nghiên cứu của chúng tôi (Vincent và cộng
sự, 2003; Lenormand và cộng sự, 2008; Deschrevel và cộng sự, 2008). Chúng
tôi đã chỉ ra rằng ở pH 4, HA và HAase, ngoài việc tạo thành phức chất loại
enzyme - cơ chất cho phản ứng xúc tác, có thể tạo thành phức không đặc hiệu
vì HA là âm và HAase là dương (Lenormand et al., 2008; Deschrevel et al. .,
2008). Mặc dù các phức hợp loại cơ chất - enzyme được ổn định bằng các liên
kết hydro, tương tác tĩnh điện và tương tác Van der Waals, các phức chất
không đặc hiệu chủ yếu được ổn định bằng tương tác tĩnh điện. Người ta
cũng chỉ ra rằng HAase không còn hoạt tính xúc tác khi chỉ tạo phức với HA
thông qua tương tác tĩnh điện (Deschrevel và cộng sự, 2008; Lenormand và
cộng sự, 2007; Astériou và cộng sự, 2006). Khi HA dư thừa, HAase ưu tiên
tạo phức tĩnh điện không đặc hiệu với HA và hoạt độ HAase là không. Khi HAase
dư thừa, tất cả các phân tử HA được tạo phức tĩnh điện với HAase, và các
enzym HAase có hai lớp: lớp thứ nhất tương ứng với HAase tạo phức tĩnh điện
không hoạt động và lớp thứ hai tương ứng với HAase tự do có thể xúc tác quá
trình thủy phân HA. phân tử electrostati phức tạp hóa bởi HAase. Do đó, hoạt
động của HAase phụ thuộc vào sự tập trung của chất nền của nó theo một cách
rất bất thường (Astériou và cộng sự, 2006). Cơ chế gây ra điều này đã được
thể hiện rõ ràng bằng mô hình hóa (Lenormand và cộng sự, 2007; Vincent và
Lenormand, 2009). Trong văn bản sau, trừ khi được đề cập khác, bởi “phức
hợp” chúng tôi có nghĩa là “phức hợp tĩnh điện không đặc hiệu” và “HAase”
chúng tôi có nghĩa là “HAase tinh hoàn của bò”.
BSA cũng có thể tạo phức với HA và cạnh tranh với HAase khi hai protein
có mặt đồng thời: việc bổ sung BSA trong môi trường chứa HAase và HA dư
thừa sẽ giải phóng HAase khỏi phức hợp và phục hồi. hoạt tính xúc tác của nó
(Lenormand và cộng sự, 2008; Deschrevel và cộng sự, 2008). Chúng tôi đã chỉ
ra ở pH 4 rằng hoạt động của HAase phụ thuộc vào nồng độ BSA theo một cách
rất cụ thể: ở nồng độ BSA thấp, tốc độ thủy phân HA tăng lên đến tối đa khi
nồng độ BSA tăng lên và ở nồng độ BSA cao, HA
331
tốc độ thủy phân giảm khi tăng nồng độ BSA (Lenormand và cộng sự, 2008;
Deschrevel và cộng sự, 2008; Lenormand và cộng sự, 2009). Do đó, BSA có thể
làm phức tạp HA để tăng cường hoặc ngăn chặn hoạt động của HAase. Ở nồng độ
thấp, BSA tạo phức với HA và ngăn cản sự tạo phức của HAase. Nồng độ BSA càng
cao, hoạt tính HAase càng cao. Ở nồng độ cao hơn nhiều, BSA tạo thành phức
hợp đậm đặc hơn với HA do đó che lấp số lượng ngày càng tăng các vị trí có
thể thủy phân trên phân tử HA và do đó làm giảm hoạt tính của HAase. Ở pH
5,25, hoạt động của BSA tương tự nhưng kém hiệu quả hơn ở pH 4 (Lenormand
và cộng sự, 2009) vì pH này gần với điểm đẳng điện (pI) của BSA (pI = 5,2
(Xu và cộng sự, 2000 )) và do đó số lượng điện tích dương trên phân tử BSA
cho phép tạo phức tĩnh điện với phân tử HA đa chức là thấp. Tuy nhiên, theo
một số tác giả, sự tạo phức này có thể xảy ra ở các giá trị pH cao hơn do
các mảng tích cực trên bề mặt protein (Mattison và cộng sự, 1998; Park và
cộng sự, 1992). Điều này đặt ra câu hỏi: liệu BSA có thể tạo phức tĩnh điện
với HA dưới pH sinh lý và điều này có liên quan đến các bản vá tích cực
không?
Sự gia tăng hoạt tính HAase khi có mặt các protein không có xúc tác có
hai yêu cầu: i) protein phải có khả năng tạo phức với HA và ii) phức chất
này phải bền hơn phức tĩnh điện được hình thành giữa HA và HAase. . Sẽ rất
thú vị khi tìm hiểu xem liệu việc kiểm soát hoạt động của HAase bởi các
protein có thể xảy ra trong các điều kiện sinh lý gần hay không, ít nhất là
về độ pH.
Lysozyme (LYS) có thể tạo phức với HA ở pH 7,5 (Van Damme và cộng sự, 1994;
Moss và cộng sự, 1997) và protein này có trong ECM của sụn cũng chứa HA. Vai
trò chính xác của nó trong mô này vẫn chưa được xác định. LYS có pI gần
10,5 (Hoon Han và Lee, 1997) , cao hơn nhiều so với BSA. Theo Van Damme et
al. (1994), sự hình thành phức HA-LYS phụ thuộc vào cường độ ion và tối ưu
ở muối 5–10 mM mặc dù phức vẫn hình thành ở 60 mM. Hằng số phân ly thấp của
phức hợp này (Kd = 1–2 10 8 M) cho phép LYS ngăn chặn hoặc đảo ngược sự hình
thành phức hợp liên kết-protein-HA (Blanco và Pita, 1985). Điều này đặt ra
câu hỏi liệu LYS có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược sự hình thành phức hợp HA-
HAase và do đó tăng cường hoạt động của HAase ở pH sinh lý hay không.
Ở đây chúng tôi điều tra một cách có hệ thống mối quan hệ giữa
Hoạt động của HAase và pH được điều chỉnh bởi hai protein, BSA và LYS.
2. Kết quả
Các kết quả liên quan đến ảnh hưởng kép của pH và nồng độ protein đến
hoạt động của HAase. Các thử nghiệm báo cáo mối quan tâm của BSA, sau đó là
LYS.
2.1. Kiểm soát hoạt động HAase của BSA
2.1.1. BSA phụ thuộc vào hoạt tính HAase ở các giá trị pH khác nhau
Một loạt các thí nghiệm thủy phân HA bằng enzym được thực hiện với HAase
với sự hiện diện của các nồng độ BSA khác nhau, trong các điều kiện cường
độ ion thấp (không thêm muối), ở 37 ° C và ở các giá trị pH khác nhau. Nồng
độ của HA trong môi trường phản ứng là 1 g L 1 của HAase là 0,5 g L 1 ,
và nồng độ BSA nằm trong khoảng từ 0 đến 4 g L 1 Đối với mỗi loạt, pH
. mỗiđến
được điều chỉnh thímột giá trị
nghiệm, chính
nồng xác bao
độ chuỗi HA gồm
đượcgiữa 3 và cách
đo bằng 5,25.sử
Đối vớixét
dụng
nghiệm cuối khử N-acetyl-D-glucosamine như một hàm của thời gian, để xác định
tốc độ thủy phân ban đầu, như được mô tả trong phần Quy trình thí nghiệm .
Tốc độ thủy phân HA được vẽ biểu đồ dựa trên nồng độ BSA xác định sự phụ
thuộc BSA của hoạt tính HAase. Hình 1 cho thấy các yếu tố phụ thuộc BSA của
hoạt động HAase có hình dạng tương tự bất kể giá trị pH nằm trong khoảng từ
3,5 đến 4,5. Nói chung, sự phụ thuộc BSA của HAase cho thấy hai miền chính
(Hình 2) được phân tách bằng nồng độ BSA tối ưu mà quá trình thủy phân
Machine Translated by Google

332 H. Lenormand và cộng sự. / Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337

giá trị pH đã được tăng lên. Ở pH 3, hoạt độ HAase rất thấp và ở pH

cao hơn 4,5, hoạt tính tăng nhẹ khi tăng nồng độ BSA. Bất kể nồng độ
BSA, tốc độ thủy phân cao nhất thu được đối với pH 4.

2.1.2. Phụ thuộc pH của hoạt tính HAase ở các nồng độ BSA
khác nhau.
Dữ liệu tương tự cũng được sử dụng để rút ra sự phụ thuộc vào pH
của phản ứng thủy phân HA được xúc tác bởi HAase khi có các nồng độ
BSA khác nhau. Hình 3 cho thấy sự chồng chất của các phụ thuộc pH
. có
này đối với nồng độ BSA nằm trong khoảng từ 0 đến 4 g L-1 Khi không
BSA, tốc độ thủy phân HA rất thấp và pH tối ưu là 4,25. Đối với nồng
độ BSA cao nhất, tức là 4 g L-1 , tốc độ thủy phân HA cao hơn, chút
một
và pH tối ưu cũng là 4,25. Đối với tất cả các nồng độ BSA trung
gian, tốc độ thủy phân HA rõ ràng cao hơn và độ pH tối ưu gần bằng
4. Dù độ pH từ 3,5 đến 4,5, tốc độ thủy phân HA là tối đa đối với
nồng độ BSA bao gồm từ 0,5 đến 1 g L-1 Đối với BSA nồng độ 0 và 4 g
L-1 thì tỷ lệ này rất thấp. Ở pH 5,25, hoạt độ HAase tối đa.thu
đối được
với
, nồng
nồng độ BSA gần 4 g L-1 vì pH gần với độ
pI BSA
của nằm
BSA,trong
trongkhoảng
khi ở từ
pH 0,5
4,
đến 1 g L 1

Hình 1. Sự chồng chất của các yếu tố phụ thuộc BSA của hoạt tính HAase ở các giá trị pH khác
nhau: tốc độ thủy phân HA ban đầu được vẽ biểu đồ dựa trên nồng độ BSA đối với nồng độ HAase .
là 0,5 gL-1 , nồng độ HA là 1 gL-1 và các
3,5 (■), giá( trị
3,75 ), pH
4 (khác
), nhau
4,25 dao
(•),động
4,5 từ 3 đến
( ), 5,25:
4,75 ( ),3 5,25
(•),
( ).
2.2. Kiểm soát hoạt động của HAase bởi các protein ở pH 5,25

tỷ lệ tối đa (điểm B); dưới nồng độ này, sự gia tăng nồng độ BSA 2.2.1. Sự phụ thuộc BSA của hoạt tính HAase ở pH 5,25 đối với các
làm tăng hoạt tính của HAase; trên nồng độ này, sự gia tăng nồng độ nồng độ HA khác nhau Các thí nghiệm tương tự đã được thực hiện ở pH
BSA làm giảm hoạt động của HAase. Ở B, tất cả các phân tử HAase đều
5,25 với nồng độ HA và BSA
tự do trong dung dịch và tất cả các phân tử HA được tạo phức với BSA nồng độ thay đổi từ 0,25 đến 1 g L 1 từ ,
với tỷ lệ BSA trên HA đặc trưng được ghi nhận là ψmin (Lenormand et 0 đến 10 g L .đầuđộđược
1 Tốc thủyxác
phân HA ban
định như trên và được vẽ đồ thị
al., 2009). Theo Hình 1, trong miền chính đầu tiên, tương ứng với dựa trên nồng độ BSA cho các nồng độ HA khác nhau (Hình 4). Hình cho
nồng độ BSA nằm trong khoảng từ 0 đến xấp xỉ 1 g L-1 , tốc độ thủy thấy hoạt động của hệ thống HA / HAase / BSA bậc ba ở pH 5,25 giống
phân HA tăng lên đến giá trị lớn nhất. Trong, tương
miền chính thứ nồng
ứng với hai, độ như ở pH 4 (Lenormand et al., 2009). Có một nồng độ BSA tối ưu
BSA nằm trong khoảng từ 1 đến 4gL-1 , tốc độ thủy phân ban đầu giảm tương ứng với mức tối đa trong tốc độ thủy phân HA ban đầu.
khi nồng độ BSA tăng lên và đạt giá trị rất thấp đối với nồng độ BSA
bằng 4 g rằng
L 1 A kiểm
nồng tratối
độ BSA chiưu,
tiếttức
hơnlà,
cácnồng
đường congtương
độ BSA này cho
ứngthấy
với Do đó, tùy thuộc vào nồng độ của nó, BSA có thể được coi là chất
điểm B, tăng nhẹ khi hoạt hóa hoặc chất ức chế quá trình thủy phân HA do HAase xúc tác ở
. pH 5,25.

Hình 3. Sự chồng chất của các yếu tố phụ thuộc pH của hoạt tính HAase khi có các nồng độ BSA
Hình 2. Sự phụ thuộc BSA tổng quát của hoạt động HAase với hai miền chính cách nhau bởi điểm khác nhau: tốc độ thủy phân HA ban đầu được vẽ biểu đồ dựa trên pH đối với nồng độ HAase là
B (Lenormand et al., 2009). Vùng 1 với sự gia tăng hoạt tính HAase khi tăng nồng độ BSA, vùng 0,5 gL-1 , nồng độ HA là 1 gL-1 và BSA khác nhau 1nồng
1 (■), gL độ1 từ
( 0),đến
2 g4 Lg L 1 (1 :
) 0
và(•),
4 g 0,5
L gL
1
2 với sự giảm hoạt tính HAase khi tăng nồng độ BSA. (•).
Machine Translated by Google

H. Lenormand và cộng sự. / Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337 333

Hình 4. Sự chồng chất của các yếu tố phụ thuộc BSA của hoạt tính HAase ở pH 5,25 và đối với Hình 5. Sự chồng chất của các yếu tố phụ thuộc LYS của hoạt động HAase ở pH 5,25 và đối với

các nồng độ HA khác nhau: tốc độ thủy phân HA ban đầu được lập biểu đồ dựa trên sự tập trung các nồng độ HA khác nhau: tốc độ thủy phân HA ban đầu được vẽ biểu đồ dựa trên nồng độ LYS

BSA cho nồng độ HAase 0,5 gL-1 và các nồng độ HA khác nhau từ 0,25 đến 1 g L 1 : 0,25 g L đối với nồng độ HAase là 0,5 gL-1 và các nồng độ HA khác nhau từ 0,25 đến 1 g L 1 : 0,25 gL

1 (•), 0,5 g L 1 (■), 1 gL 1 ( ). 1 (•), 0,5 g L 1 (■), 1 gL 1 ( ).

Tuy nhiên, tác dụng của BSA ở pH 5,25 thấp hơn nhiều so với ở pH 4 BSA ít dương hơn nhiều so với LYS vì pH rất gần với pI của BSA. Hình 5 cũng
(Lenormand et al., 2009) vì cần nhiều BSA hơn để đạt được tốc độ thủy phân chỉ ra rằng ở pH 5,25, tốc độ thủy phân HA với LYS cao hơn so với BSA (7
tối đa, tức là để ngăn chặn sự tạo phức của các phân tử HAase với HA. (điểm µmol L-1 phút-1 đối với BSA và 11 µmol L-1 phút-1 đối với LYS khi nồng độ
B). Ví dụ, khi nồng độ HA là 0,25 g L 1 , [BSA] min bằng 4 g L 1 ở pH HA là 0,5 g L 1 ).
5,25 thay vì 0,15 g L 1 ở pH 4 16
(Lenormand
ở pH 5,25etthay
al.,vì2009).
0,65 ởDopHđó4.ψmin bằng
Do đó, Tuy nhiên, chất nền không giống nhau trong hai trường hợp, vì HA được tạo

nồng độ BSA cần thiết để ngăn chặn sự tạo phức HAase cao hơn 25 lần ở pH phức bởi BSA trong trường hợp đầu tiên và bởi LYS trong trường hợp thứ hai.
5,25 so với ở pH 4. Lý do là điện tích thực của BSA ít hơn nhiều dương ở Hơn nữa, theo các giá trị ψmin , mỗi phân tử HA được bao quanh bởi rất
5,25 so với ở pH 4 vì giá trị pI của nó gần bằng 5,2 (Wang và cộng sự, 1996; nhiều phân tử BSA trong trường hợp đầu tiên và một vài phân tử LYS trong
Xu và cộng sự, 2000)). Hình 4 cũng cho thấy tốc độ thủy phân HA ở pH 5,25 trường hợp thứ hai.

thấp hơn nhiều so với ở pH 4 (Hình 1). Tuy nhiên, các thí nghiệm hiện tại
cho thấy rõ ràng rằng, ngay cả ở pH này, các phức chất tĩnh điện đã được 2.3. Kiểm soát hoạt động HAase của LYS
hình thành giữa HA và BSA có khả năng ngăn chặn sự hình thành phức HA-HAase.
2.3.1. Sự phụ thuộc LYS của hoạt tính HAase ở các pH khác nhau
Một loạt các thí nghiệm thủy phân HA bằng enzym được thực hiện với
HAase với sự hiện diện của các nồng độ LYS khác nhau, trong các điều kiện
Điều này có thể là do sự hiện diện của các mảng tích cực trên bề mặt của cường độ ion thấp (không thêm muối), ở 37 ° C và các giá trị pH khác nhau.
phân tử BSA (Mattison và cộng sự, 1998; Park và cộng sự, 1992). Nồng độ của HA trong môi trường phản ứng là 1 g L 1 của HAase là 0,5 g ,
L 1 và, đối với BSA, nồng độ LYS nằm trong khoảng từ 0 đến 4 g L 1 Đối
2.2.2. Sự phụ thuộc LYS của hoạt động HAase ở pH 5,25 đối với các nồng độ . 9.một
với mỗi loạt, pH được điều chỉnh để giá6 trị
Hình cho chính xác bao
thấy rằng các gồm
phụ từ 3 đến
thuộc
HA khác nhau Các thí nghiệm tương tự cũng được thực hiện với LYS, một LYS khác nhau của hoạt động HAase có hình dạng rất giống nhau bất kể giá
protein có pI cao hơn BSA. Một loạt các thí nghiệm được thực hiện ở pH trị pH nào và cũng tương tự như các phụ thuộc BSA với hai miền chính đối
5,25 với nồng độ HA thay đổi từ 0,25 đến 1 g L-1 và nồng độ LYS khác nhau với LYS nồng độ. Sự phụ thuộc LYS của HAase cho thấy nồng độ LYS tối ưu
từ 0 đến 4 g L-1 . Tốc độ thủy phân HA ban đầu được xác định như trên và gần 1gL-1 ; dưới nồng độ này, sự gia tăng nồng độ LYS làm tăng hoạt tính
. thấynhau
vẽ đồ thị dựa trên nồng độ LYS cho nồng độ HA khác hoạt(Hình
động 5).
của Hình cho
hệ thống của HAase; trên nồng độ này, sự gia tăng nồng độ LYS làm giảm hoạt động của
HA / HAase / LYS bậc ba ở pH 5,25 giống như hoạt động của hệ HA / HAase / HAase. Đối với BSA, nồng độ LYS tối ưu tăng nhẹ khi giá trị pH được tăng
BSA bậc ba. Có nồng độ protein tối ưu tương ứng với mức tối đa trong tốc lên. Dù nồng độ LYS như thế nào, tốc độ thủy phân cao hơn thu được đối với
độ thủy phân HA ban đầu và nồng độ protein tới hạn mà trên đó tốc độ thủy pH 4, nhưng tốc độ thủy phân đáng kể thu được đối với pH cao hơn 6, lên
phân HA ban đầu là rất thấp. Tùy thuộc vào nồng độ của nó, LYS do đó có thể đến pH 9.
được coi là chất hoạt hóa hoặc chất ức chế sự thủy phân HA do HAase xúc
tác ở pH 5,25.

2.3.2. Sự phụ thuộc pH của hoạt tính HAase ở các nồng độ LYS
Tuy nhiên ở pH 5,25, tác dụng của LYS cao hơn nhiều so với BSA vì cần khác nhau Sự chuyển vị của dữ liệu thứ hai trong các đường
ít LYS hơn BSA nhiều để đạt được tốc độ thủy phân tối đa, tức là để ngăn cong phụ thuộc vào pH (Hình 7) cho thấy rằng pH tối ưu của quá trình
chặn sự tạo phức của các phân tử HAase với HA (điểm B). Ví dụ, khi nồng độ thủy phân HA được xúc tác bởi HAase khi có mặt LYS là bằng 4. của protein,
HA là 0,25 g L 1 , [LYS] min bằng 0,25 g L 1 trong khi [BSA] min bằng ít nhất là liên quan đến BSA hoặc LYS, không làm thay đổi độ pH tối ưu của
4 g L 1 . Do đó ψmin ởbằng 1 đốiđiện
pH 5,25 với tích
LYS thay
thực vì
của16 đối với BSA. Lý do là HAase. Nó cũng cho thấy rằng tốc độ thủy phân đáng kể thu được đối với pH
cao hơn 6 khi có mặt LYS trong khi không phát hiện thấy hoạt tính HAase.
Machine Translated by Google

334 H. Lenormand và cộng sự. / Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337

Hình 6. Sự chồng chất của các yếu tố phụ thuộc LYS của hoạt tính HAase ở các giá trị pH khác
Hình 8. Sự chồng chất của các thành phần phụ thuộc pH của hoạt tính HAase khi có mặt của
nhau: tốc độ thủy phân HA ban đầu được vẽ biểu đồ dựa trên nồng độ LYS đối với nồng độ HAase
protein, BSA hoặc LYS: tốc độ thủy phân HA ban đầu được vẽ biểu đồ dựa trên pH đối với nồng
là 0,5 gL-1 , nồng độ HA là 1 gL-1
( ),và5,25
các (giá),trị pH khác
6 (•), 7 ( nhau
), 8 từ
( 3),đến
9 (9: ).
3 (•), 3,5 (■), 4
độ HAase là 0,5 gL-1 , nồng độ HA là trống)
hiệu 1 gL-1 khác
và các nồngtừđộ0 BSA
nhau, đến (ký
4 g hiệu
L đầy
1 đủ)
: 0 hoặc
(•), LYS
0,5 gL (ký 1
(■), 1 gL 1 ( ), 2 gL 1 ( ) và 4 gL 1 (•) cho BSA, và 0 (•), 0,5 gL 1 ( ), 1 gL
1 ( ), 2 g L 1 ( ) và 4 gL 1 ( ) cho LYS. Đường đầy đủ đại diện cho sự phụ thuộc
không có LYS. Với sự có mặt của LYS, hoạt động của HAase được tiết lộ lên đến
pH toàn cầu của hoạt động HAase khi có mặt của protein.
pH 9. Dù giá trị pH nào thì nồng độ LYS tối ưu là từ 1 đến 2 g L-1 Điều đó
. đến
có nghĩa là HAase được tạo phức9 bởi
ĐiềuHAđóở cũng
bất kỳ
có độ pH nào
nghĩa trong
là LYS đã khoảng
có thể từ 3
cạnh
tranh với HAase để tạo phức HA và có thể tạo ra sự giải phóng HAase ở bất kỳ Hoạt động của HAase khi có mặt của protein. Tuy nhiên, điểm B thu được ở pH
độ pH nào trong phạm vi pH đó. thấp hơn hoặc bằng 4 với BSA khác với điểm B tương ứng thu được với LYS. Sự
khác biệt có thể là do phối tử của HA là BSA trong trường hợp đầu tiên và LYS
trong trường hợp thứ hai. Điều này cho thấy cấu trúc của HA tạo phức với LYS
2.4. Sự phụ thuộc vào pH toàn cầu của hoạt động HAase và cấu trúc của HA tạo phức với BSA là không giống nhau.

Cuối cùng, ở mỗi giá trị pH, có một lượng protein tối ưu, BSA hoặc LYS,
mà tốc độ thủy phân là tối đa.
Trong các điều kiện này (điểm B), tất cả các phân tử HAase đều tự do trong
dung dịch (Lenormand và cộng sự, 2009), và do đó nồng độ HAase là giống nhau
trong mọi trường hợp. Do đó, đường cong liên kết các điểm B khác nhau (Hình
8) tương ứng với sự phụ thuộc vào pH thực tế của
Vì vậy, bản chất của protein có tầm quan trọng lớn, đặc biệt là kích thước,
cấu trúc và mật độ điện tích của nó. Điều này ảnh hưởng đến mức độ phức tạp
của phân tử HA bởi protein, và khả năng tiếp cận và hoạt động của HAase.
Đường cong phụ thuộc pH toàn cầu gợi ý rõ ràng ba nhận xét: i) khi có
LYS, HAase hoạt động ở pH 7, ii) không có bất kỳ protein nào, HAase tạo phức
với HA ở pH 7, và iii) LYS có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược sự tạo phức của
HAase với HA ở pH 7 là pH sinh lý.

3. Thảo luận và kết luận

Sự tăng cường / ngăn chặn hoạt động của HAase bởi BSA - sự phụ thuộc của
BSA - được phát hiện ở đây xảy ra ở các giá trị pH dao động từ 3,5 đến 4,5.
Trong phạm vi pH này, các yếu tố phụ thuộc BSA tương tự nhau bất kể giá trị
pH nào. Về cơ bản có hai loại hành vi: i) ở nồng độ BSA thấp, hoạt tính HAase
tăng khi nồng độ BSA tăng, và ii) ở nồng độ BSA cao, hoạt tính HAase giảm khi
nồng độ BSA tăng. Sự tăng cường / ức chế HAase như vậy cũng được tìm thấy
đối với LYS. Giống như các phụ thuộc BSA, các phụ thuộc LYS tương tự như
nhau trong phạm vi pH. Thực tế là LYS có thể tăng cường hoạt động của HAase
trên một miền pH rộng (từ 3 đến 9) có nghĩa là: i) LYS có thể cạnh tranh với
HAase để tạo phức với HA, ii) HAase có thể tạo phức với HA trên toàn bộ miền
pH này, iii ) HAase hoạt động xúc tác trên toàn bộ miền pH này khi LYS giới
hạn sự tạo phức của nó với HA, và iv) hoặc pI của HAase tinh hoàn bò cao hoặc
các mảng dương tính trên bề mặt HAase cho phép hình thành phức HA-HAase tĩnh
điện ở pH cao các giá trị. Mặc dù pH tối ưu của HAase trong ống nghiệm rõ
ràng là gần bằng 4, nhưng enzym này hoạt động trên một miền pH nằm trong
khoảng từ 3 đến 9.
Hình 7. Sự chồng lấn của các yếu tố phụ thuộc pH của hoạt tính HAase khi có các nồng độ LYS
khác nhau: tốc độ thủy phân HA ban đầu được vẽ biểu đồ dựa trên pH đối với nồng độ HAase là
0,5 g L 1 và nồng độ HA là 1 ,g LL 11 (■),
và khác
1 gLNồng 1độ( LYS từg 0L đến 14 (g L) và 14 :gL0 (•),
), 2 0,5 .g
1 (•)
Cần lưu ý rằng hoạt động thủy phân của HAase bị suy yếu bằng cách sử dụng
xét nghiệm cuối quá trình khử N-acetyl mà không cho
Machine Translated by Google
H. Lenormand và cộng sự. / Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337
thông tin về hoạt động transglycolytic của HAase (Gorham và cộng sự,
1975). Cuối cùng, thực tế là LYS có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược sự
giao phối của phức HA – HAase tĩnh điện có nghĩa là hằng số phân ly
của phức HA – HAase cao hơn hằng số phân ly của phức HA – LYS bằng
10 8 M (Van Damme và cộng sự, 1994).
Theo hiểu biết của chúng tôi, nghiên cứu này là minh chứng đầu
tiên cho thấy HAase có hoạt tính thủy phân ở pH cao tới 9. Trong tài
liệu, các giá trị pH tối ưu của HAase đã được báo cáo nằm trong
khoảng từ 3,5 đến 6 theo nguồn HA và xét nghiệm. các phương pháp
được sử dụng (Gacesa và cộng sự, 1981; Gorham và cộng sự, 1975). Độ
pH tối ưu là 4,5 được đo cho HAase bằng phương pháp ELSA (Delpech
và cộng sự, 1987). Bằng phép đo độ nhớt, De Salegui và cộng sự.
(1967) đã quan sát thấy độ pH tối ưu thay đổi từ 3,5 đến 6 tùy thuộc
vào độ trễ trước lần đảm bảo đầu tiên. Sử dụng xét nghiệm cuối khử
N-acetyl, Gorham et al. (1975) báo cáo độ pH tối ưu là 5,2, và De
Salegui et al. (1967) đã đề cập đến hoạt động của HAase ở pH 7,6.
đặc hiệu.M.Cả hai đều kiểm soát khả năng xúc tác thủy phân HA của
Trong tất cả các nghiên cứu trên, hoạt động được đo khi có cường độ ion 0,1-0,15
Trong trường hợp không có muối và protein, Gorham et al. (1975) báo
cáo pH tối ưu là 6,0 cho HAase khi HA bản địa là chất nền và 5,2 khi
hexasaccharide là chất nền. Trong trường hợp thứ hai, các tác giả
cũng đề cập rằng quá trình thủy phân được ưu tiên khi pH thấp hơn
5,2 và quá trình chuyển hóa glycosyl được ưu tiên khi pH cao hơn
5,2. Gorham và cộng sự. (1975) cũng báo cáo rằng độ pH tối ưu ở 6,0
được quan sát trong điều kiện không có muối được chuyển thành 5,2
khi có mặt 0,15 M NaCl. Gacesa và cộng sự. (1981) cũng quan sát thấy
sự dịch chuyển của pH tối ưu từ 4,8 đến 3,8 khi cường độ ion tăng
từ 0,17 đến 0,44 M NaCl. Theo các tác giả này, sự dịch chuyển của pH
tối ưu với cường độ ion là kết quả của đặc tính tĩnh điện một phần
của các tương tác giữa HA và HAase.
Krishnapillai và cộng sự. (1999) báo cáo rằng đối với một HAase khác,
HAase tôm hùm Na Uy, sự phụ thuộc vào độ pH phụ thuộc rất nhiều vào
hệ thống đệm được sử dụng và hoạt động của HAase được giới hạn
trong phạm vi pH 3–7,5. Cuối cùng, không có báo cáo nào về hoạt động
HAase ở pH trên 7,6: tất cả các báo cáo đều đồng ý về độ pH có tính
axit tối ưu. Tuy nhiên, các báo cáo này dựa trên các phương pháp
xét nghiệm và các điều kiện thí nghiệm khác nhau (ví dụ, tỷ lệ HAase
trên HA). Nhìn chung, các tác giả đã không kiểm soát được khả năng
tạo phức của enzym với HA và do đó kết quả của họ có thể tương ứng
với các nồng độ enzym hoạt động khác nhau ở các giá trị pH khác nhau.
Ngược lại, chúng tôi đã phân biệt được giữa hoạt động xúc tác và sự
tạo phức của enzyme, và do đó có thể xác định chắc chắn hoạt tính
của HAase ở nồng độ không đổi của enzyme hoạt động.
Mặt khác, HAase có pH axit tối ưu, gần bằng 4, và không có hoạt
tính ở pH cao hơn 5,5 ở nồng độ muối rất thấp khi không có BSA hoặc
LYS. Mặt khác, HAase hoạt động ở pH 7 và thậm chí ở pH cao tới 9 khi
có mặt các protein có giá trị pI cao.
HAase khối u, một HAase có trong các tế bào ung thư, cũng có độ pH
tối ưu gần 4 (Maingonnat và cộng sự, 1999) và không hoạt động ở pH
cao hơn 5,5, ngay cả khi cường độ ion gần 150 mM. Vì HAase này có
thể đóng một vai trò quan trọng trong bệnh ung thư, nhiều nhà nghiên
cứu quan tâm đến việc tìm hiểu cách HAase khối u hoạt động trong ECM
của các tế bào khối u. Một khả năng là các phức chất tĩnh điện có
thể được hình thành giữa HA và HAase và các phức chất này có thể bị
đảo ngược bởi các protein khác có trong ECM có khả năng tạo phức
tương tự với HA. Sự đảo ngược này có thể xảy ra không chỉ ở cường
độ ion thấp mà còn ở cường độ ion sinh lý (Lenormand và cộng sự,
2008) và do đó có thể tăng cường hoạt động của HAase.
Trên thực tế, bất kể cường độ ion, HA tạo thành hai loại phức
với HAase: loại đầu tiên là phức chất cơ chất - enzyme xúc tác cổ
điển bao gồm các liên kết hydro, tương tác tĩnh điện và Van der
Waals theo một cách sắp xếp 3D chính xác và loại thứ hai là phức hợp
không đặc hiệu mà HA có thể hình thành với nhiều loại protein, chẳng
hạn như BSA, LYS và HAase (Lenormand và cộng sự, 2008; Deschrevel và
cộng sự, 2008; Lenormand và cộng sự, 2007; Astériou và cộng sự .,
2006) chỉ thông qua tương tác tĩnh điện. Trong trường hợp
335
HAase, enzyme mất hoạt tính xúc tác khi tạo phức tĩnh điện với HA
(Lenormand et al., 2008; Deschrevel et al., 2008); điều này là do
HAase tốt hơn là tạo phức không đặc hiệu với HA. Kết quả là sự ức
chế HAase được tăng cường bởi nồng độ HA cao, và chúng ta không cần
phải công nhận bất kỳ tác dụng gây dị ứng nào hoặc sự hiện diện của
một vị trí ức chế cụ thể trên phân tử HAase.
Hành vi này có thể được tổng quát hóa cho các hệ thống khác liên
quan đến các enzym phân giải polysaccharide / polysaccharide. Hai
loại phức hợp trong hệ thống HA / HAase cũng tương tự như hệ thống
protein / DNA liên kết axit nucleic, được nghiên cứu sâu rộng bởi
nhóm Record nhằm tìm hiểu sự điều hòa biểu hiện gen của RNA
polymerase; trong hệ thống này, các protein liên kết axit nucleic
thường biểu hiện hai phương thức tương tác cạnh tranh với axit
nucleic: đặc hiệu và không đặc hiệu (Tsodikov và cộng sự, 2001).
Do đó, sự phụ thuộc vào pH thực nghiệm của hoạt tính HAase là kết
quả của hai yếu tố phụ thuộc pH sau: sự phụ thuộc vào pH nội tại của
hoạt động enzym và sự phụ thuộc vào pH của sự tạo phức HA-HAase không
HAase. Loại đầu tiên phụ thuộc vào HAase và là một chức năng của cấu
trúc enzyme chủ yếu thay đổi theo cường độ ion và độ pH. Phương
pháp thứ hai phụ thuộc vào cường độ ion, pH và HAase đối với phép
đo phân tầng HA, mặc dù nó cũng có thể tính đến sự hiện diện của các
protein không xúc tác khác có thể tạo phức HA và do đó là một hàm
của phép đo phân vị, pI, kích thước và mật độ điện tích của các
protein này. Do đó, sự phụ thuộc vào pH quan sát được trong thực
nghiệm và cực đại trong xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào cường độ
ion, pH, protein đến phép đo phân tử HA, cũng như pI, kích thước và
mật độ điện tích của các protein không xúc tác, đặc trưng cho các
điều kiện thực nghiệm. Điều này giải thích tại sao rất nhiều giá trị
khác nhau cho độ pH tối ưu của HAase đã được báo cáo trong tài
liệu. Điều này cũng giải thích tại sao sự phụ thuộc vào pH của HAase
có thể thay đổi theo các điều kiện thí nghiệm, chẳng hạn như đệm pH (Gacesa và
Để hiểu rõ hơn về hệ thống, điều quan trọng là phải nghiên cứu chi
tiết sự hình thành của cả protein tăng cường HA và phức hợp HA –
HAase như một hàm của pH (trong quá trình chuẩn bị).
Có thể nghi ngờ sự liên quan sinh lý của cường độ ion thấp được
sử dụng trong các thí nghiệm được báo cáo ở đây. Trong bối cảnh này,
cần lưu ý rằng cường độ ion thấp được sử dụng ở đây tối đa hóa sự
đóng góp tĩnh điện so với các tương tác khác, nhưng cũng phục vụ để
tăng cường các tương tác tĩnh điện để hiểu đúng cách chúng có thể
điều chỉnh hoạt động của HAase. Điều đó nói lên rằng, ở cường độ ion
sinh lý, các tương tác tĩnh điện này yếu hơn nhưng vẫn tồn tại
(Lenormand và cộng sự, 2008). Cũng cần lưu ý rằng các điều kiện
cường độ ion thấp có thể được tìm thấy trong các hệ thống sống, đặc
biệt là ở các khớp, nơi HA và LYS có ở nồng độ cao. Trong các ngăn
như vậy, cường độ ion được ước tính là 40 mM (Moss và cộng sự,
1997) do nồng độ cao của các đại phân tử tích điện.
Kết quả của chúng tôi về sự tạo phức HA-protein cho phép dự đoán
số lượng chính xác của protein không xúc tác cần thiết để giải phóng
tất cả các phân tử HAase và tránh sự tạo phức của HAase. Điều này
cho phép đo hoạt tính của enzym mà không có bất kỳ sự phức tạp nào.
Do đó, sự phụ thuộc vào pH quan sát được trong các điều kiện này là
ảnh hưởng của pH thực đến hoạt động thủy phân của enzyme. Điều này
có tầm quan trọng nhất định vì mức HAase được coi là dấu hiệu khối
u, ví dụ mức HAase trong nước tiểu là dấu hiệu cho bệnh ung thư
bàng quang (Lokeshwar và cộng sự, 1997; Lokeshwar và Selzer, 2008).
Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy HAase có thể tạo phức tĩnh điện
với HA ở pH cao tới 9 và điều này có nghĩa là khi có mặt LYS, HAase
hoạt động xúc tác ở pH này. Theo hiểu biết của chúng tôi, hoạt động
HAase chưa bao giờ được quan sát thấy ở độ pH này ở nồng độ muối
thấp hoặc cao. Cuối cùng, cơ chế tăng cường / ức chế hoạt động HAase
của protein có thể xảy ra ở pH thường phổ biến trong ECM. Vì HAase
tinh hoàn của bò thuộc cùng lớp với HAase ở người, nên có thể mong
đợi rằng HAase ở người có các đặc điểm tương tự như HAase tinh hoàn
của bò. Theo Girish và Kemparaju (Girish
Machine Translated by Google
336 H. Lenormand và cộng sự. / Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337
và Kemparaju, 2007), tất cả các HAase của động vật có vú đều là các en zyme hoạt
tính với axit với độ pH tối ưu từ 3 đến 4, phù hợp với vị trí của lysosome ngoại trừ
PH20 và Hyal2 hoạt động trong phạm vi pH tối ưu rộng. Tuy nhiên, người ta thường
thừa nhận rằng một enzym có pH tối ưu có tính axit có hoạt tính đáng kể trong cơ thể
sống, tức là ở pH trung tính hoặc ở pH của ECM. Kết quả của chúng tôi cho thấy rõ ràng
khả năng này vì hoạt độ HAase cao ở pH 4 có liên quan đến hoạt tính thấp nhưng đáng
kể trên miền pH rộng từ 3 đến 9. Theo Mio và Stern (2002), quy định về kích thước và
nồng độ của HA chuỗi hoạt động hiệu quả hơn về mặt động học và năng lượng thông qua
con đường dị hóa hơn là con đường đồng hóa. Trên thực tế, HAase có thể hiện diện
trong các mô cùng với các chất tăng cường và ức chế có thể cho phép HAase nhanh chóng
được kích hoạt hoặc bất hoạt. Theo cách đó, các polyelectrolytes, chẳng hạn như HA
và protein có trong ECM, là những ứng cử viên tốt để điều hòa HAase.
4. Quy trình thí nghiệm
4.1. Vật liệu
HAase tinh hoàn bò (H 3884, lô 38H7026), BSA (A 3675, lô 78H1399), LYS (L 6876,
lô 051K7028) và natri hyaluronate từ dây rốn người (H 1876, lô 127H0482) được lấy từ
Sigma. Khối lượng mol của HA gần bằng 1 Mda. Chính xác hơn, số-khối lượng mol trung
bình (Mn) của HA là 0,967 106 gmol-1 và chỉ số đa phân tán của nó, đại diện cho mức
độ đồng nhất của nó, là 1,45. Khối lượng mol của BSA là 69 103 gmol 1 và của LYS
là 14,3 103 gmol 1 . HA, BSA, LYS và HAase đã được sử dụng mà không cần tinh chế
thêm. Các hóa chất được sử dụng trong các thử nghiệm là: natri tetraborat (Prolabo 27
727-297), axit sulfuric (Sigma S 1526), carbazole (Sigma C 5132), axit boric (Sigma B
7660), p-dimethyla minobenzaldehyde (DMAB) (Sigma D 8904), axit axetic băng (Sigma A
6283).
Độ hấp thụ được đo bằng máy quang phổ Uvikon 860 Kontron được trang bị buồng
kiểm soát nhiệt độ và được kết nối với máy tính. Điều chỉnh độ pH được thực hiện
bằng cách sử dụng máy đo pH Metrohm 632 được trang bị điện cực XC161 phân tích bằng
máy đo bức xạ.
4.2. Phương pháp
4.2.1. Xét nghiệm axit uronic
Dung dịch mẹ HA (nặng 10 g L-1 ) được chuẩn bị trong nước Milli-Q và được thử
nghiệm bằng phương pháp được mô tả bởi Dische (1947) và được sửa đổi bởi Bitter và
Muir (1962). Phương pháp này đã được mô tả nhiều trong các bài báo trước đây
(Astériou và cộng sự, 2001; Vincent và cộng sự, 2003) và được hiệu chuẩn bằng cách sử
dụng natri glucuronat (Sigma G 8645).
4.2.2. Xét nghiệm đầu cuối khử N-acetyl-D-glucosamine Việc
đo nồng độ của các đầu khử N-acetyl-D-glucosamine cho phép xác định nồng độ chuỗi
HA. Nó được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Reissig et al. (Năm 1955). Do
sự hiện diện của protein trong các mẫu, độ đục và màu sắc xuất hiện đồng thời và chúng
tôi đã sử dụng cải tiến của phương pháp Reissig được mô tả bởi Astériou et al.
(2001). Quy trình thử nghiệm sử dụng DMAB được trình bày chi tiết trong các bài báo
trước đây của chúng tôi (Astériou và cộng sự, 2001; Vincent và cộng sự, 2003). N-
acetyl D-glucosamine (Sigma A 8625) được sử dụng để hiệu chuẩn.
4.2.3. Động học của quá trình thủy phân HA
Một thể tích thích hợp của dung dịch mẹ HA được cho vào bình phản ứng, được pha
loãng đến nồng độ mong muốn bằng nước Milli-Q, được điều chỉnh đến pH mong muốn bằng
HCl (hoặc KOH), khuấy và duy trì ở 37 ° C. Nếu cần, trước khi điều chỉnh pH, một thể
tích thích hợp của dung dịch BSA hoặc LYS đậm đặc (b10 g L-1 trong nước Milli-Q) đã
được thêm vào. Sau 2 phút, phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm một lượng vừa đủ
thể tích của dung dịch HAase đậm đặc được điều chỉnh pH (b10 g L-1 trong Milli-Q
nước). Tại mỗi thời điểm, một lượng 200 μL hỗn hợp phản ứng được lấy ra khỏi lò phản
ứng và được thử nghiệm bằng cách sử dụng thử nghiệm cuối khử N acetyl-D-glucosamine.
Đối với mỗi động học, phản ứng thủy phân được theo sau trong 3 giờ và nồng độ của các
chất khử HA kết thúc được vẽ đồ thị theo thời gian. Do đó, phương pháp đã đưa ra sự
phát triển theo thời gian của nồng độ chuỗi HA; hệ số góc của tiếp tuyến với đường
cong đó biểu thị trực tiếp tốc độ phản ứng. Sau đó, đường cong động học được trang
bị bởi mô hình hàm số mũ được phát triển trong (Vincent và cộng sự, 2003) và tốc độ
phản ứng ban đầu được tính bằng giá trị của đạo hàm bậc nhất của hàm đó tại thời điểm
số không.
Sự nhìn nhận
Chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ Annie Steinchen-Sanfeld và Tiến sĩ Wiswas Purohit vì
những bài đọc quan trọng của bản thảo. Chúng tôi rất cảm ơn Bộ Nghiên cứu và Công nghệ
Pháp đã trao học bổng cho Tiến sĩ.
Hélène Lenormand.
Người giới thiệu
Astériou, T., Deschrevel, B., Delpech, B., Bertrand, P., Bultelle, F., Merai, C., Vincent, J.-
C., 2001. Một thử nghiệm cải tiến cho N-acetyl-D -glucosamin làm giảm phần cuối của
polysaccharid khi có sự hiện diện của protein. Hậu môn. Hóa sinh. 293, 53–59.
Astériou, T., Vincent, J.-C., Tranchepain, F., Deschrevel, B., 2006. Ức chế quá trình thủy phân
hyaluronan được xúc tác bởi hyaluronidase ở nồng độ cơ chất cao và cường độ ion thấp. Ma
trận Biol. 25, 166–174.
Bitter, T., Muir, HM, 1962. Một phản ứng carbazole axit uronic biến đổi. Hậu môn. Hóa sinh. 4,
330–334.
Blanco, LN, Pita, JC, 1985. Nghiên cứu tán xạ ánh sáng về ảnh hưởng của liên kết glycoprotein
và lysozyme lên cấu trúc phân tử hyaluronate trong dung dịch. Vòm.
Hóa sinh. Lý sinh. 239, 296–304.
Cameron, E., 1966. Hyaluronidase và ung thư. Pergamon, Oxford.
Catterall, JB, 1995. Axit hyaluronic, sự kết dính và di căn của tế bào. Ung thư J. 8, 320–324.
Cooper, CL, Dubin, PL, Kayimazer, AB, Turksen, S., 2005. Polyelectrolyte – protein
các phức hợp. Curr. Opin. Chất keo 10, 52–78.
Csóka, AB, Frost, GI, Stern, R., 2001. Sáu gen giống hyaluronidase ở người
và bộ gen của chuột. Ma trận Biol. 20, 499–508.
Csóka, TB, Frost, GI, Stern, R., 1997. Hyaluronidases trong xâm lấn mô. Invas. Siêu nhân.
17, 297–311.
De Salegui, M., Plonska, H., Pigman, W., 1967. So sánh giữa hyaluronidase trong huyết thanh và
tinh hoàn. Vòm. Hóa sinh. Lý sinh. 121, 548–554.
Chứng thư, R., Rooney, P., Kumar, P., Norton, JD, Smith, J., Freemont, AJ, Kumar, S., 1997.
Tín hiệu gen đáp ứng sớm được gây ra bởi các oligosaccharid tạo mạch của hyaluronan trong
tế bào nội mô. Ức chế bởi hyaluronan trọng lượng phân tử cao, nonangiogenic. Int. J. Ung
thư 71, 251–256.
Delpech, B., Bertrand, P., Chauzy, C., 1987. Một thử nghiệm mô phỏng enzym gián tiếp cho
hyaluronidase. J. Immunol. Phương pháp 104, 223–229.
Delpech, B., Girard, N., Bertrand, P., Courel, M.-N., Chauzy, C., Delpech, A., 1997. Hyaluronan:
các nguyên tắc cơ bản và ứng dụng trong ung thư. J. Thực tập sinh. Med. 242, 41–48.
Delpech, B., Maingonnat, C., Girard, N., Chauzy, C., Olivier, A., Maunoury, R., Tayot, J.,
Creissard, P., 1993. Hyaluronan và hyaluronectin trong ma trận ngoại bào của khối u não
người. Eur. J. Ung thư 29, 1012–1017.
Deschrevel, B., Lenormand, H., Tranchepain, F., Levasseur, N., Astériou, T., Vincent, JC, 2008.
Hoạt động của hyaluronidase được điều chỉnh bằng cách tạo phức với nhiều polyelec trolyte
bao gồm hyaluronan. Ma trận Biol. 27, 242–253.
Dische, Z., 1947. Một phản ứng màu cụ thể mới của axit hexuronic. J. Biol. Chèm. 167,
189–198.
Dorfman, A., Ott, ML, 1948. Phương pháp đo độ đục để xét nghiệm hyaluronidase. J. Biol.
Chèm. 172, 367–375.
Dubin, PL, Gao, J., Mattison, KM, 1994. Tinh chế protein bằng cách tách pha chọn lọc với
polyelectrolytes. Separ. Purif. Xem lại 23, 1–16.
Frost, GI, Cso´ka, TB, Wong, T., Stern, R., 1997. Thanh lọc, nhân bản và biểu hiện Hyaluronidase
trong huyết tương người. Hóa sinh. Lý sinh. Res. Commun. 236, 10–15.
Gacesa, P., Savitsky, MJ, Dodgson, KS, Olavesen, AH, 1981. Một quy trình được khuyến nghị để
ước tính hyaluronidase của tinh hoàn bò khi có mặt trong huyết thanh người. Hậu môn. Hóa
sinh. 118, 76–84.
Girish, KS, Kemparaju, K., 2007. Keo thần kỳ hyaluronan và hyaluronidase tẩy của nó: tổng quan
sinh học. Khoa học đời sống. 80, 1921–1943.
Gold, EW, 1980. Sự tương tác của albumin với axit hyaluronic và chondroitin sulfate: một nghiên
cứu về sắc ký ái lực và sự lưỡng sắc hình tròn. Chất tạo màng sinh học 19, 1407–1414.
Gorham, SD, Olavesen, AH, Dodgson, KS, 1975. Ảnh hưởng của cường độ ion và độ pH đối với tính
chất của Hyaluronidase tinh hoàn của bò tinh khiết. Kết nối mô Res 3, 17–25.
Grymonpré, KR, Stprismeier, BA, Dubin, PL, Mattison, KW, 2001. Xác định bằng mô hình máy tính
tích hợp và nghiên cứu tán xạ ánh sáng của vị trí liên kết albumin-axit hyaluronic trong
huyết thanh tĩnh điện. Phân tử sinh học 2, 422–429.
Machine Translated by Google
H. Lenormand và cộng sự. / Ma trận Sinh học 29 (2010) 330–337
Hoon Han, J., Lee, CH, 1997. Xác định điểm đẳng điện của protein mô hình và protease trung tính của
Bacillus subtilis bằng cách phân vùng chéo sử dụng hệ thống hai pha nước poly (ethylene
glycol) / Dextran. Bề mặt keo B 9, 31–137.
Kennedy, JF, Phillips, GO, Williams, PA, 2002. Hyaluronan. Nhà xuất bản Woodhead, Wrexham, Wales.
Kokufuta, E., 1992. Chất xúc tác sinh học cố định chức năng. Ăn xin. Đa hình. Khoa học. 17, 647–697.
Krishnapillai, AM, Taylor, KDA, Morris, AEJ, Quantick, PC, 1999. Đặc điểm hyaluronidase của tôm hùm
Na Uy (Nephrops norvegicus) và so sánh với hyaluronidase của tinh hoàn cừu và bò. Thực phẩm
Chem. 65, 515–521.
Lào, K., Brownsey, GJ, Ring, SG, 2007. Tương tác giữa furcellaran và các protein hình cầu, albumin
huyết thanh bò và β-lactoglobulin. Carbohydr. Đa hình. 67, 116–123.
Laurent, TC, 1987. Hóa sinh của hyaluronan. Acta Tai mũi họng. Suppl. (Cổ phiếu) 442,
7–24.
Lenormand, H., Deschrevel, B., Tranchepain, F., Vincent, JC, 2008. Tương tác tĩnh điện giữa
hyaluronan và protein ở pH 4: Chúng điều chỉnh hoạt động của hyaluronidase như thế nào. Chất
tạo màng sinh học 89, 1088–1103.
Lenormand, H., Deschrevel, B., Vincent, JC, 2007. Tương tác tĩnh điện có thể thay đổi hành vi động
học của enzym Michaelis-Menten như thế nào. Ứng dụng vào hệ thống hyaluronane / hyaluronidase.
J. Biol. Thể chất. Chèm. 7, 129–134.
Lenormand, H., Tranchepain, F., Deschrevel, B., Vincent, JC, 2009. Phức hợp protein hyaluronan ở
cường độ ion thấp: Hoạt động của hyaluronidase được kiểm soát như thế nào bởi albumin huyết
thanh bò. Ma trận Biol. 28, 365–372.
Lokeshwar, VB, Obek, C., Soloway, MS, Block, NL, 1997. Axit hyaluronic liên quan đến khối u: một dấu
hiệu nước tiểu đặc hiệu và nhạy cảm mới đối với ung thư bàng quang. Ung thư Res. 57, 773–777.
Lokeshwar, VB, Selzer, MG, 2008. Hyaluronidase: vừa là chất thúc đẩy khối u vừa là chất điều chỉnh
siêu vi. Bán hàng. Biol ung thư. 18, 281–287.
Maingonnat, C., Victor, R., Bertrand, P., Courel, M.-N., Maunoury, R., Delpech, B., 1999.
Kích hoạt và ức chế hyaluronidase của tế bào ung thư ở người bởi protein. Hậu môn.
Hóa sinh. 268, 30–34.
Mattison, KW, Dubin, PL, Brittain, IJ, 1998. Sự hình thành phức hợp giữa albumin huyết thanh bò và
polyelectrolytes mạnh: ảnh hưởng của mật độ điện tích polyme. J.
Thể chất. Chèm. 102, 3830–3836.
Meyer, K., 1971. Hyaluronidases. Trong: Boyer, PD, Boyer, PD (Eds.), The Enzymes, 5,
trang 307–320.
Mio, K., Stern, R., 2002. Thuốc ức chế hyaluronidase. Ma trận Biol. 21, 31–37.
Moss, JM, Van Damme, MP, Murphy, WH, Preston, BN, 1997. Sự phụ thuộc của nồng độ muối vào tương tác
glycosaminoglycan-lysozyme trong sụn. Vòm.
Hóa sinh. Lý sinh. 348, 49–55.
337
Park, JM, Muhoberac, BB, Dubin, PL, Xia, J., 1992. Ảnh hưởng của tính dị hình điện tích protein
trong phức hợp protein-polyelectrolyte. Đại phân tử 25, 290–295.
Parkar, A., Kahmann, J., Howat, S., Bayliss, M., Day, A., 1998. TSG-6 tương tác với hyalu ronan và
aggrecan theo cách phụ thuộc pH thông qua một yếu tố chức năng chung: ý nghĩa đối với quy định
của nó trong sụn bị viêm. FEBS Lett. 428, 171–176.
Reissig, J., Strominger, J., Leloir, J., 1955. Một phương pháp so màu sửa đổi để ước tính đường N-
acetylamino. J. Biol. Chèm. 217, 959–966.
Robertson, W., Ropes, M., Bauer, W., 1940. Mucinase: một loại men vi khuẩn thủy phân chất lỏng hoạt
dịch mucin và các chất nhầy khác. J. Biol. Chèm. 133, 261–276.
Rooney, P., Kumar, S., Ponting, J., Wang, M., 1995. Vai trò của hyaluronan trong khối u
tân mạch hóa. Int. J. Ung thư 60, 632–636.
Schmitt, C., Sanchez, C., Desobry-Banon, S., Hardy, J., 1998. Cấu trúc và đặc tính kỹ thuật của phức
hợp protein-polysaccharide: đánh giá. Crit. Rev. Khoa học thực phẩm. 38, 689–753.
Seyrek, E., Dubin, PL, Tribet, C., Gamble, E., 2003. Sự phụ thuộc cường độ ion của tương tác protein
- polyelectrolyte. Phân tử sinh học 4, 273–282.
Stern, R., 2008. Hyaluronidase trong sinh học ung thư. Bán hàng. Biol ung thư. 18, 275–280.
Tolstoguzov, VB, 1986. Tính chất chức năng của hỗn hợp protein-polysaccharide. Trong: Mitchell, JR,
Ledward, DA (Eds.), Thuộc tính chức năng của các đại phân tử.
Khoa học Ứng dụng Elsevier, London, trang 385–415.
Tsodikov, OV, Holbrook, JA, Shkel, IA, Record Jr., MT, 2001. Các đẳng nhiệt liên kết phân tích mô tả
các tương tác cạnh tranh của phối tử protein với các vị trí cụ thể và không đặc hiệu trên cùng
một oligomer DNA. Lý sinh. J. 81, 1960–1969.
Van Damme, MPI, Moss, JM, Murphy, WH, Preston, BN, 1994. Tính chất liên kết của glycosaminoglycans
với lysozyme - ảnh hưởng của muối và trọng lượng phân tử. Vòm.
Hóa sinh. Lý sinh. 310, 16–24.
Vincent, J.-C., Asteriou, T., Deschrevel, B., 2003. Động học của quá trình thủy phân hyaluronan được
xúc tác bởi hyaluronidase. Xác định tốc độ phản ứng ban đầu và các thông số động học. J. Biol.
Thể chất. Chèm. 3, 35–44.
Vincent, J.-C., Lenormand, H., 2009. Cách phức hợp hyaluronan-protein điều chỉnh hoạt động của
hyaluronidase: mô hình. Lý sinh. Chèm. 145, 126–134.
Wang, YF, Gao, JY, Dubin, PL, 1996. Tách protein thông qua quá trình đông tụ polyelectrolyte: tính
chọn lọc và hiệu quả. Công nghệ sinh học. Ăn xin. 12, 356–362.
West, DC, Hampson, IN, Arnold, F., Kumar, S., 1985. Sự hình thành mạch gây ra bởi các sản phẩm thoái
hóa của axit hyaluronic. Khoa học 228, 1324–1326.
West, DC, Kumar, S., 1989. Hyaluronan và sự hình thành mạch. Trong: Evered, D., Whelan, J. (Eds.),
The Biology of Hyaluronan, vol. 143. John Wiley và các con trai, Chichester, trang 187–207.
Xu, S., Yamanaka, J., Sato, S., Miyama, I., Yonese, M., 2000. Đặc điểm của phức hợp bao gồm natri
hyaluronate và albumin huyết thanh bò. Chèm. Dược phẩm. Bò đực. 48, 779–783.