CHƯƠNG I: ENZYME, L-ASPARASASE, E.

COLI BL21 (DE3)

1. Giới thiệu về enzyme và lịch sử nghiên cứu enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học (còn được gọi là chất xúc tác sinh học) giúp tăng tốc
độ phản ứng sinh hóa trong các sinh vật sống. Chúng cũng có thể được chiết xuất từ
các tế bào và sau đó được sử dụng để xúc tác cho một loạt các quá trình quan trọng về
mặt thương mại. Ví dụ, chúng có vai trò quan trọng trong việc sản xuất các chất làm
ngọt và sửa đổi kháng sinh, chúng được sử dụng trong bột giặt và các sản phẩm tẩy
rửa khác nhau, và chúng đóng vai trò quan trọng trong các thiết bị phân tích và xét
nghiệm có ứng dụng lâm sàng, pháp y và môi trường.

Từ 'enzyme' lần đầu tiên được sử dụng bởi nhà sinh lý học người Đức Wilhelm
Kühne vào năm 1878, khi ông mô tả khả năng của nấm men sản xuất rượu từ đường,
và nó có nguồn gốc từ các từ Hy Lạp en (có nghĩa là 'bên trong') và zume (có nghĩa là
'men'). Vào cuối thế kỷ XIX và đầu thế kỷ XX, những tiến bộ đáng kể đã được thực
hiện trong việc khai thác, mô tả đặc tính và khai thác thương mại nhiều enzyme,
nhưng phải đến những năm 1920, các enzyme mới được kết tinh, tiết lộ rằng hoạt
động xúc tác có liên quan đến các phân tử protein. Trong khoảng 60 năm tiếp theo,
người ta tin rằng tất cả các enzyme đều là protein, nhưng vào những năm 1980, người
ta thấy rằng một số phân tử axit ribonucleic (RNA) cũng có thể gây ra tác dụng xúc
tác. Những RNA này, được gọi là ribozyme, đóng một vai trò quan trọng trong biểu
hiện gen. Trong cùng một thập kỷ, các nhà hóa sinh cũng đã phát triển công nghệ tạo
ra các kháng thể có đặc tính xúc tác. Những cái gọi là 'abzymes' này có tiềm năng
đáng kể cả dưới dạng chất xúc tác công nghiệp mới và trong trị liệu. Bất chấp những
ngoại lệ đáng chú ý này, phần lớn enzyme học cổ điển,và phần còn lại của bài tiểu
luận này, tập trung vào các protein sở hữu hoạt tính xúc tác. Là chất xúc tác, enzyme
chỉ được yêu cầu ở nồng độ rất thấp và chúng tăng tốc độ phản ứng mà không bị tiêu
thụ trong quá trình phản ứng. Chúng tôi thường mô tả các enzyme có khả năng xúc
tác cho việc chuyển đổi các phân tử chất nền thành các phân tử sản phẩm như hình 1.
[1], [2]
 Enzyme
Cơ chất Sản phẩm

Hình 1. Quá trình xúc tác của enzyme

Phần lớn lịch sử của hóa sinh là lịch sử nghiên cứu enzyme. Xúc tác sinh học lần đầu
tiên được công nhận và mô tả vào cuối những năm 1700, trong các nghiên cứu về tiêu
hóa thịt bằng dịch tiết của dạ dày, và nghiên cứu tiếp tục vào những năm 1800 với
các cuộc kiểm tra về sự chuyển đổi tinh bột thành đường bằng nước bọt và các chiết
xuất thực vật khác nhau. Vào những năm 1850, Louis Pasteur kết luận rằng quá trình
lên men đường thành rượu bằng men được xúc tác bởi "quá trình lên men". Ông cho
rằng những quá trình lên men này không thể tách rời khỏi cấu trúc của các tế bào nấm
men sống; Quan điểm này, được gọi là chủ nghĩa sống còn, đã chiếm ưu thế trong
nhiều thập kỷ. Sau đó vào năm 1897, Eduard Buchner phát hiện ra rằng chiết xuất từ
nấm men có thể lên men đường thành rượu, chứng minh rằng quá trình lên men được
thúc đẩy bởi các phân tử tiếp tục hoạt động khi được loại bỏ khỏi tế bào. Frederick
W. Kühne gọi các phân tử này là enzyme. Khi các khái niệm quan trọng về sự sống
bị bác bỏ, việc phân lập các enzyme mới và điều tra các tính chất của chúng đã nâng
cao khoa học hóa sinh. Sự phân lập và kết tinh urease của James Sumner vào năm
1926 đã mang lại một bước đột phá trong các nghiên cứu enzyme ban đầu. Sumner
phát hiện ra rằng tinh thể urease bao gồm hoàn toàn protein, và ông cho rằng tất cả
các enzyme đều là protein. Trong trường hợp không có các ví dụ khác, ý tưởng này
vẫn còn gây tranh cãi trong một thời gian. Chỉ trong những năm 1930, kết luận của
Sumner mới được chấp nhận rộng rãi, sau khi John Northrop và Moses Kunitz kết
tinh pepsin, trypsin và các enzyme tiêu hóa khác và tìm thấy chúng cũng là protein.
 Trong thời kỳ này, J. B. S. Haldane đã viết một chuyên luận mang tên Enzyme. Mặc
dù bản chất phân tử của các enzyme vẫn chưa được đánh giá đầy đủ, Haldane đã đưa
ra gợi ý đáng chú ý rằng các tương tác liên kết yếu giữa enzyme và chất nền của nó
có thể được sử dụng để xúc tác cho phản ứng. Cái nhìn sâu sắc này nằm ở trung tâm
của sự hiểu biết hiện tại của chúng ta về xúc tác enzyme. Kể từ phần sau của thế kỷ
XX, nghiên cứu về enzyme đã được nghiên cứu chuyên sâu. Nó đã dẫn đến việc
thanh lọc hàng ngàn enzyme, làm sáng tỏ cấu trúc và cơ chế hóa học của nhiều người
trong số họ, và hiểu biết chung về cách thức hoạt động của các enzyme. [1]

2. Phân loại enzyme

Enzyme thường có tên chung (thường được gọi là “Tên thông dụng”) đề cập đến
phản ứng rằng chúng xúc tác, với hậu tố -ase (ví dụ oxidase, dehydrogenase,
carboxylase), mặc dù các enzyme phân giải protein riêng lẻ thường có hậu tố -in (ví
dụ: trypsin, chymotrypsin, papain). Thường Tên thông dụng cũng chỉ ra chất nền mà
enzyme hoạt động (ví dụ glucose oxidase, alcohol dehydrogenase, pyruvate
decarboxylase). Tuy nhiên, một số tên thông dụng (ví dụ: invertase, diastase,
catalase) cung cấp ít thông tin về chất nền, sản phẩm hoặc phản ứng liên quan. Do sự
phức tạp ngày càng tăng và không nhất quán trong việc đặt tên cho các enzyme, Hội
Liên minh Hóa sinh Quốc tế đã thành lập Ủy ban Enzyme để giải quyết vấn đề này.
Báo cáo của Ủy ban Enzyme được xuất bản đầu tiên vào năm 1961, và cung cấp cách
tiếp cận có hệ thống cho việc đặt tên các enzyme. Ấn bản thứ sáu được xuất bản năm
1992, chứa thông tin chi tiết về gần 3200 loại enzyme khác nhau và chất bổ sung
được công bố hàng năm, hiện đã mở rộng con số này lên hơn 5000. Trong hệ thống
này, tất cả các enzyme được mô tả bởi Ủy ban Enzyme (EC) gồm bốn phần số. Ví dụ,
enzyme có tên thông dụng lactate dehydrogenase có EC số 1.1.1.27, và được gọi
chính xác hơn là l–lactate: NAD+ oxidoreductase. Phần đầu tiên của số EC đề cập
đến phản ứng mà enzyme xúc tác (Bảng 1). Các chữ số còn lại có ý nghĩa khác nhau
tùy theo bản chất của phản ứng được xác định bằng chữ số đầu tiên. Ví dụ, trong
danh mục oxidoreductase, chữ số thứ hai biểu thị nhà tài trợ hydro (Bảng 2) và chữ số
thứ ba biểu thị chất nhận hydro (Bảng 3). Do đó lactate dehydrogenase với số EC
1.1.1.27 là một oxidoreductase (được chỉ định bằng chữ số đầu tiên) với nhóm rượu
 của phân tử lactate là người hiến tặng hydro (thứ hai chữ số) và NAD + là chất nhận
hydro (chữ số thứ ba), và là enzyme thứ 27 được phân loại trong nhóm này (chữ số
thứ
tư).
[1],
[2]

Bảng 1. Phân loại enzyme: Các phân loại chính của enzyme trong hệ thống EC

Ký tự đầu trong Phân loại Loại phản ứng

hệ thống EC Enzyme

1. Oxidoreductases Phản ứng oxy hóa / khủ

2. Transferases Nguyên tử/ nhóm vận chuyển (bao gồm những

phân loại khác)

3. Hydrolases Phản ứng Hydrolysis (vận chuyển các nhóm

chức năng đến H2O)

4. Lyases Thêm hoặc hình thành liên hết đôi bởi nhóm
loại bỏ (bao gồm nhóm 3.)

5. Isomerases Isomerization (Vận chuyển của các nhóm trong

các phân tử đến dạng đồng phân

6. Ligases Sự tham gia của các phần tử liên kết để phá vỡ

liên kết pyrophophase

Bảng 2. Phân loại enzyme: Phân loại thứ cấp của các enzyme oxidoreductase trong hệ
thống EC.

Ký tự thứ 2 của hệ thống EC Cho hydrogen hoặc electron

1. Alcohol (CHOH)
 2. Aldehyde or ketone (C=O)

3. -CH-CH-

4. Amin sơ cấp (CHNH2 hoặc CHNH3+

5. Amin thứ cấp (CHNH)

6. NADH hoặc NADPH (khi chất xúc tác oxi hóa khử
là chất nhận)

Bảng 3. Hệ thống enzyme: Phân loại cấp 3 của các enzyme oxidoreductase trong hệ
thống EC.

Oxidoreductases: ký tự thứ 3 trong hệ thống Nhận Hydrogen hoặc electron

EC

1. NAD+ hoặc NADP+

2. Fe3+ (ví dụ: cytochromes)

3. O2

4. Khác

3. Cấu trúc enzyme

Cấu trúc enzyme và chất nền liên kết các enzyme dựa trên axit amin là các protein hình
cầu có kích thước từ dưới 100 đến hơn 2000 dư lượng axit amin. Các axit amin này có
thể được sắp xếp thành một hoặc nhiều chuỗi polypeptide được gấp lại và uốn cong để
tạo thành một cấu trúc ba chiều cụ thể, kết hợp một khu vực nhỏ được gọi là vị trí hoạt
động (Hình 2), nơi chất nền thực sự liên kết.
Hình 2. Hình ảnh đại diện sự rang buộc của các hợp chất hoạt động trên khu vực phân
tử enzyme.

Vị trí hoạt động cũng có thể chỉ liên quan đến một số lượng nhỏ (ít hơn 10) axit amin
cấu thành. Đó là hình dạng và tính chất điện tích của vị trí hoạt động cho phép nó liên
kết với một loại phân tử cơ chất duy nhất, do đó enzyme có thể chứng minh tính đặc
hiệu đáng kể trong hoạt động xúc tác của nó. Giả thuyết cho rằng tính đặc hiệu của
enzyme là kết quả của bản chất bổ sung của chất nền và vị trí hoạt động của nó lần đầu
tiên được đề xuất bởi nhà hóa học người Đức Emil Fischer vào năm 1894, và được gọi
là 'giả thuyết khóa và chìa khóa' của Fischer, theo đó chỉ có một chìa khóa có kích thước
và hình dạng chính xác (chất nền) vừa với lỗ khóa (vị trí hoạt động) của khóa (enzyme).
Thật đáng kinh ngạc khi lý thuyết này đã được đề xuất vào thời điểm nó thậm chí còn
chưa được thiết lập.

Enzyme là protein. Khi nhiều người được tìm hiểu về cấu trúc enzyme thông qua các kỹ
thuật như tinh thể học tia X, rõ ràng enzyme không phải là cấu trúc cứng nhắc, nhưng
trên thực tế khá linh hoạt về hình dạng. Theo phát hiện này, vào năm 1958, Daniel
Koshland đã mở rộng ý tưởng của Fischer và trình bày 'mô hình phù hợp cảm ứng' về
chất nền và liên kết enzyme, trong đó phân tử enzyme thay đổi hình dạng một chút để
phù hợp với sự liên kết của chất nền. Sự tương tự thường được sử dụng là 'mẫu găng tay
trong tay', trong đó bàn tay và găng tay có hình dạng bổ sung rộng rãi, nhưng găng tay
được đúc xung quanh bàn tay khi nó được chèn vào để mang lại sự kết hợp hoàn hảo. Vì
nó là vị trí hoạt động một mình liên kết với chất nền, nên thật hợp lý khi hỏi vai trò của
phần còn lại của phân tử protein là gì. Câu trả lời đơn giản là nó hoạt động để ổn định vị
trí hoạt động và cung cấp một môi trường thích hợp cho sự tương tác của trang web với
phân tử chất nền. Do đó, vị trí hoạt động không thể tách rời khỏi phần còn lại của
protein mà không làm mất hoạt động xúc tác, mặc dù các nghiên cứu tiến hóa dựa trên
phòng thí nghiệm đã chỉ ra rằng đôi khi có thể tạo ra các enzyme nhỏ hơn để duy trì
hoạt động. Cần lưu ý rằng mặc dù một số lượng lớn enzyme chỉ bao gồm protein, nhiều
enzyme cũng chứa một thành phần phi protein, được gọi là đồng yếu tố, cần thiết cho
hoạt động xúc tác của enzyme. Một đồng yếu tố có thể là một phân tử hữu cơ khác,
trong trường hợp đó nó được gọi là coenzyme, hoặc nó có thể là một phân tử vô cơ, điển
 hình là một ion kim loại như sắt, mangan, coban, đồng hoặc kẽm. Một coenzyme liên
kết chặt chẽ và vĩnh viễn với protein thường được gọi là nhóm nhân tạo của enzyme.
Khi một enzyme yêu cầu một đồng yếu tố cho hoạt động của nó, thành phần protein
không hoạt động thường được gọi là apoenzyme và apoenzyme cộng với đồng yếu tố
(tức là enzyme hoạt động) được gọi là holoenzyme (Hình 3). Nhu cầu về khoáng chất và
vitamin trong chế độ ăn uống của con người một phần là do vai trò của chúng trong quá
trình trao đổi chất như đồng yếu tố và coenzyme.

became known as Fischer’s ‘lock

Hình 3. Các thành phần của holoenzyme

Hiện nay, enzyme thường được sử dụng cho một loạt các ứng dụng như: bột giặt (ví dụ
như protease, lipase, amylase), sản xuất dệt may (amylase và catalase để loại bỏ tinh
bột), công nghiệp da (protease để thủy phân protein), công nghiệp giấy, cải thiện môi
trường, sản xuất thực phẩm (phô mai / bơ biến tính enzyme), chế biến (glucose oxidase
để tăng cường bột) và bảo quản, và ứng dụng y tế. Theo các báo cáo hiện tại, một số
enzyme được sản xuất công nghiệp và có những ứng dụng quan trọng trong ngành công
nghiệp thực phẩm (45% sử dụng), công nghiệp chất tẩy rửa (35%), công nghiệp dệt may
(10%) và công nghiệp da (3%). Chi tiết về các ứng dụng của các enzyme riêng lẻ được
cung cấp trong bảng 4. [3]

Bảng 4. Sản xuất công nghiệp các enzyme từ các nguồn thực vật và các ứng dụng của
chúng.

Men vi sinh Nguồn (Các) ứng dụng

Β-amylase Lúa mạch, đậu nành Nướng, chuẩn bị xi-rô

 maltose

Bromelain Dứa Nướng

Esterase Lúa mì Thủy phân ester

Ficin Thịt vả Chất làm mềm

Papain · Đu đủ Chất làm mềm thịt, thuộc

da, nướng bánh

Peroxidase Ngựa redish Chẩn đoán

Urease Đậu jack Chẩn đoán

4. Emzyme Asparaginase
L-Asparaginase (một hydrolase chuyển đổi L-asparagine thành L-aspartic acid) là
enzyme đầu tiên được sử dụng trong thực hành lâm sàng như một chất chống ung thư
sau khi được phê duyệt vào năm 1978 như là một thành phần của phác đồ điều trị bệnh
bạch cầu lymphoblastic cấp tính ở trẻ em. Các đặc tính cấu trúc và sinh hóa của L-
asparaginase đã được nghiên cứu rộng rãi trong nửa thế kỷ qua, cung cấp một mô tả
cấu trúc chính xác của enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, cũng như làm
rõ cơ chế hoạt động của nó. Đánh giá này cung cấp một đánh giá quan trọng về tình
trạng kiến thức hiện tại về cấu trúc chủ yếu, nhưng cũng có các tính chất sinh hóa được
lựa chọn của L-asparaginase 'loại vi khuẩn' từ các sinh vật khác nhau. Các thành viên
được nghiên cứu rộng rãi nhất của họ enzyme này là L-asparaginases rất tương đồng
với một trong hai enzyme từ Escherichia coli (thường được gọi là EcAI và EcAII). Các
thành viên của họ enzyme này, mặc dù thường được gọi là L-asparaginase loại vi
khuẩn, cũng đã được xác định trong các sinh vật khác nhau như vi khuẩn cổ hoặc sinh
vật nhân chuẩn. Hơn 100 mô hình cấu trúc của L-asparaginases đã được gửi vào Ngân
hàng dữ liệu protein trong suốt 30 năm qua. Một trong những thành tựu chính của các
phương pháp tiếp cận tập trung vào cấu trúc là làm sáng tỏ các chi tiết về cơ chế hoạt
động của enzyme của hydrolase độc đáo này sử dụng một chuỗi threonine bên làm
nucleophile chính. Cơ sở phân tử của các tính chất quan trọng khác của các enzyme
này, chẳng hạn như tính đặc hiệu cơ chất của chúng, vẫn đang được đánh giá. Kết quả
của các nghiên cứu cấu trúc và cơ học của L-asparaginases đang được sử dụng trong nỗ
lực để cải thiện các tính chất lâm sàng của loại thuốc chống ung thư quan trọng này. [4]
L-asparaginase (EC3.5.1.1 hoặc EC3. 5.1.38; còn được gọi là ASNase) xúc tác thủy
phân L-Asn thành L-Asp theo phản ứng:
ASNase + L-Asn + H2O → ASNase + L-ASP + NH3
 Hình 4. Cấu trúc của L-asparagine (EC 3.5.1.1).
Mặc dù có sự phân kỳ đáng kể trong chuỗi axit amin của ASNase, cấu trúc bậc ba của
chúng, cũng như kiến trúc và thành phần của các túi hoạt động của chúng, được bảo tồn
cao. Các đặc điểm cấu trúc của một protomer ASNase được minh họa trong Hình 5, sử
dụng cấu trúc của EcAII làm đại diện cho cả gia đình. [4]

Hình 5. EcAll (PDB ID 3eca) như là một ví dụ cho một enzyme ASNase type II.
Asparaginase là một enzyme được phân lập từ vi khuẩn Escherichia coli hoặc vi khuẩn
Erwinia carotovora có hoạt tính chống bạch cầu. Asparaginase thủy phân L-asparagine
thành axit L-aspartic và amoniac trong tế bào bạch cầu, dẫn đến sự suy giảm
asparagine, ức chế tổng hợp protein, bắt giữ chu kỳ tế bào trong giai đoạn G1 và
apoptosis trong quần thể tế bào bạch cầu nhạy cảm. Asparagine rất quan trọng đối với
quá trình tổng hợp protein trong các tế bào bạch cầu; Một số tế bào bạch cầu không
thể tổng hợp axit amin de novo này do sự biểu hiện vắng mặt hoặc thiếu hụt của
enzyme asparagine synthase. Các Dạng asparaginase có nguồn gốc từ carotovora
thường được dành riêng cho các trường hợp quá mẫn cảm với asparaginase.
 Asparaginase là một enzyme vi khuẩn được sử dụng như một chất chống ung thư,
phần lớn trong điều trị bệnh bạch cầu lymphocytic cấp tính. L-asparaginase có nhiều
tác dụng phụ, một trong số đó là tổn thương gan được đặc trưng bởi sự ức chế tổng
hợp protein gan và nhiễm mỡ, có thể nghiêm trọng và dẫn đến tử vong do suy gan.
4.1 Asparagine và Aspartate
Asp được vận chuyển vào các tế bào T. cruzi epimastigote và trypomastigote và rất
quan trọng đối với quá trình siêu hình học. Hơn nữa, Asp được chuyển đổi thành
oxaloacetate bởi enzyme aspartate aminotransferase (ASAT, EC 2.6.1.1), và tham gia
vào quá trình sản xuất ATP thông qua chu trình TCA và phosphoryl hóa oxy hóa tiếp
theo. T. cruzi và T. brucei trình bày hai đồng phân của enzyme Asp aminotransferase,
một là cytosolic (cASAT) và một là ty thể (mASAT). Trong T. brucei, cASAT được
thể hiện một cách cấu thành và mASAT được điều chỉnh xuống trong BSF, trong khi ở
T. cuzi, mASAT được biểu thị dọc theo toàn bộ vòng đời và cASAT được thể hiện cụ
thể trong các giai đoạn động vật có vú. Asp cũng có thể được tổng hợp từ oxaloacetate
trung gian chu trình TCA và bằng cách khử Asn (Hình 6).

Hình 6. Chuyển hóa asparagine, aspartate và alanine.

Enzyme: AS: asparagine synthetase (EC 6.3.1.1); ASN: asparaginase (EC 3.5.1.1); AdesS:
adenylosuccinate synthetase (EC 6.3.4.4); ACT: aspartate carbamoyl transferase (EC 2.1.3.2); ASAT:
aspartate aminotransferase (EC 2.6.1.1); ALAT: alanine aminotransferase (EC 2.6.1.2); TAT: tyrosine
aminotransferase (EC 2.6.1.5); AlaR: alanine racemase (EC 5.1.1.1).
Các chất chuyển hóa: α-KG: α-ketoglutarate, Glu: L-glutamate, Gln: L-glutamine.
Người ta đã chỉ ra rằng, trong T. brucei BSF, Asp là tiền chất của quá trình sinh tổng hợp
pyrimidine thông qua các enzyme Asp carbamoyl transferase (ACT, EC 2.1.3.2) và
adenylosuccinate synthetase (AdesS, EC 6.3.4.4). Asp cũng có thể được chuyển đổi thành
Asn bởi enzyme Asp ammonia ligase (EC 6.3.1.1) xúc tác cho sự hình thành Asn từ Asp
và NH4+, hoặc Asn synthetase (AS, EC 6.3.1.1), có thể sử dụng NH4 + hoặc Gln (EC
6.3.5.4) làm nhà tài trợ nitơ, cả hai phản ứng đều phụ thuộc vào ATP. Ngoài ra, ký sinh
trùng này trở thành auxotrophic cho Asn khi biểu hiện AS bị hạ gục.
 Leishmania có thể tổng hợp cả Asp và Asn từ oxaloacetate bằng ASAT ty thể và AS. Asp
có thể hỗ trợ tăng trưởng và Asn là không cần thiết khi ký sinh trùng được nuôi cấy với sự
có mặt của glucose. Tương tự như những gì xảy ra ở T. cruzi và T. brucei, Leishmania
cũng có AS hoạt động có thể sử dụng NH4+ hoặc Gln làm nhà tài trợ nitơ. Enzyme này
không cần thiết cho sự phát triển của ký sinh trùng, khả năng lây nhiễm hoặc khả năng
sống sót trong điều kiện canh tác bình thường. Gần đây, một asparaginase (ASN, EC
3.5.1.1) đã được đặc trưng ở Leishmania. Enzyme này chuyển đổi Asn thành Asp và
amoniac. ASN cũng đã được chứng minh là có liên quan đến việc gây kháng thuốc
amphotericin B ở cả dạng amastigote và promastigote được trồng trong điều kiện axenic.
Asparagine thuốc nhóm axit amin phân cực không tích điện, là những axit amin dễ tan
trong nước và rất ưa nước (do khả năng hình thành nhiều liên kết hydro). Serine, thronine,
cysteine và glutamine cũng được tìm thấy trong nhóm các axit amin phân cực không tích
điện. Tất cả đêìu là những hợp chất “zwiiterionics”. Vì chúng có một nhóm phân cực
trong chuỗi R của chúng, góp phần vào việc trung hòa điện tích. Tất cả các axit amin phân
cục không tích điện đều không thể ion hóa ở pH gần bằng 7 (trung tính) nghĩa là chúng
không mang điện tích dương hoặc âm. Tuy nhiê, trong môi trường axit và bazo, các nhóm
thế ion hóa và thu được điện tích.
Trong sinh tổng hợp: Tất cả các sinh vật nhân thực đều đồng hóa amoniac và biến đổi nó
thành glutamate, glutamine, carbamyl phosphate và asparagine. Asparagine có thể được
tổng hợp từ các chất trung gian đường phân, trong chu trình axit xitric (từ oxaloacetate)
hoặc từ các tiền chất được tiêu thụ trong chế độ ăn uống. Enzyme asparagine synthetase là
một amidotransferase phụ thuộc vào glutamine và ATP phân cắt ATP thành AMP và
pyrophosphate vô cơ (PPi) và sử dụng amoniac hoặc glutamine để xúc tác phản ứng amid
hóa và chuyển hóa aspartate thành asparagin. Cả vi khuẩn và động vật đều có men tổng
hợp asparagin, tuy nhiên, ở vi khuẩn, enzym này sử dụng ion amoni làm chất cho nitơ,
trong khi ở động vật có vú, asparagine synthetase sử dụng glutamine làm chất cho chính
nhóm nitơ. Sự phân hủy enzym của phân tử ATP thành AMP và pyrophosphat vô cơ
(PPi), cùng với glutamine là chất cho nhóm amide, là những khác biệt chính đối với quá
trình sinh tổng hợp L-glutamine giữa các sinh vật khác nhau.
Về suy thoái: Hầu hết các nghiên cứu về sự chuyển hóa của asparagin đều được thực hiện
ở thực vật, vì các nghiên cứu trên động vật có vú ban đầu bị cản trở do thiếu các phương
pháp luận đủ nhạy cho các xét nghiệm axit amin ở cấp độ của các hệ thống phức tạp hơn.
L-asparagin liên tục bị thủy phân ở động vật có vú bởi L-asparaginase để tạo ra axit
aspartic và amoni. Nó được sử dụng để tổng hợp glycoprotein và là một trong những tiền
chất oxaloacetate chính cho chu trình axit xitric. Enzyme asparaginase xúc tác quá trình
thủy phân asparagin thành aspartat, sau đó aspartat được chuyển hóa với α-ketoglutarate
để tạo ra glutamat và oxaloacetate. Asparagine synthetase, còn được gọi là aspartate-
amoniac ligase, được tìm thấy rất nhiều trong các tế bào của não trưởng thành của động
vật có vú. Khi mức độ thấp của enzyme này được cảm nhận trong cơ thể, cái được gọi là
“aminoacidopathies” được hình thành, do các chất nền tiền thân tích tụ trong tế bào chất
của tế bào não.
5. Giới thiệu về Escherichia coli BL21 (DE3) và vector pET-15b
5.1. Escherichia coli BL21 (DE3)
Escherichia coli BL21 và BL21 (DE3), được tạo ra bởi F. William Studier và Barbara A.
Moffatt, là các chủng phòng thí nghiệm phổ biến để sản xuất protein tái tổ hợp. Việc thiếu
các protease lon và ompT, thường được coi là đặc điểm chung giữa các dòng B, đã thúc
đẩy sự phát triển của các chủng đó đối với vật chủ biểu hiện protein. Chủng vi khuẩn E.
coli BL21 (DE3), một dẫn xuất của BL21, có lẽ được sử dụng rộng rãi nhất trong biểu
hiện cấp cao của protein tái tổ hợp, và nó chứa một prophage DE3 có nguồn gốc từ vi
khuẩn λ, mang gen RNA polymerase T7 dưới sự kiểm soát của chất xúc tiến lacUV5.
Chủng vi khuẩn E. coli BL21 đã được sử dụng thường xuyên cho biểu hiện không phải
T7, và gần đây nó cũng đã được sửa đổi để sản xuất vắc-xin DNA plasmid, do hiệu suất
tốt hơn trong nuôi cấy hàng loạt cho ăn mật độ tế bào cao so với các chủng K-12.
Về nguyên tắc, trình tự bộ gen của BL21 sẽ giống hệt với trình tự của BL21 (DE3), ngoại
trừ prophage DE3. Tuy nhiên, các biến thể có thể có ý nghĩa nghiêm trọng đối với các thử
nghiệm [6].
Bảng 5. Tổng hợp cấu trúc bộ gen và hê phiên mã của E.coli BL21 (DE3) [6]

Cấu trúc bộ gen

Kích thước 4 558 953 bp

ORFsa 4336 ea

Genes được thêm 37 ea

ncRNAs được thêm 66 ea

TISs được điều chỉnh (88 ea)

Tổng hợp các tính năng 4439 ea

Cấu trúc hệ phiên mã

Độ bao phủ TU (tổng cộng)b 3 461 841 (75.9%)

Độ bảo phủ TU (strand phía trước) 1 766 138 bp (38.7%)

Độ bao phủ TU (strand đảo ngược) 1 879 144 (41.2%)

TUs 1609 ea
5.2. Bản đồ gen của vector vận chuyển pET-15b, hình 7. [5]

Hình 7. Bản đồ vector pET-15b [5]